JPH0471491A - 酵素固定化用担体及び固定化酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、酵素固定化用担体、並びに油脂及び脂肪酸誘
導体の加水分解、エステルの合成及び交換反応に適した
固定化酵素の製造方法に関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕近年、
各方面で酵素としてリパーゼを利用した油脂及びエステ
ル類の合成・交換反応の研究或いは工業化が活発化して
きている。

例えば、リパーゼを効率的に使用する目的で、リパーゼ
を固定化する試みが行われてきた。リパーゼの固定化に
より期待される利点は次の通りである。即ち、（ｉ）従
来リパーゼを水溶液の状態で使用すると油中に均一に混
合・分散することが困難であったが、リパーゼを不溶性
担体表面に固定化することにより油中に容易に分散可能
となり、かつ担体に適当量の水分を保持できるため、低
水分下でのエステル合成・交換反応が行いやすくなる。

Ｇｉ）触媒としてコストの高いリパーゼの回収再使用が
しやすく、エステル合成反応又は交換反応の工業的実施
においても反応装置の連続化が容易となる等である。

しかし、以上のような利点を有する固定化酵素において
も、リパーゼの合成活性増大のために必要な水分量を保
持することと、逆反応である加水分解の抑制とを両立す
るには至っていない。

以上のように、エステル合成及び交換反応においては、
よりエステル合成及び交換活性の高い耐熱性に優れた固
定化酵素の開発が望まれている。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等は酵素と担体との結合を強め、従来の水酸基
を含む担体よりも酵素の活性発現、耐熱性に富む固定化
担体を見出すべく種々検討した結果、より好適な担体と
して４級アミン■型樹脂にくらべて水酸基が多く、かつ
グルカミン基という鎖長の長い置換基を有するキレート
性弱塩基性イオン交換樹脂であるグルカミン型キレート
樹脂を見出し、本発明を完成させた。

即ち本発明は、グルカミン型キレート樹脂よりなり且つ
多孔性であることを特徴とする酵素固定化用担体、及び
この固定化用担体と、脂質分解酵素の水溶液とを接触さ
せることを特徴とする固定化酵素の製造方法を提供する
ものである。

本発明に係るグルカミン型キレート樹脂はスチレンの重
合体よりなる母核高分子体にグルカミン基を導入した次
の様な化学構造を有するキレート性弱塩基性イオン交換
樹脂である。

ＣＨ３−Ｎ−ＣＨ２べ−ＣＨ−）Ｔ−ＣＨ２０Ｈこのグ
ルカミン型キレート樹脂は従来の水酸基を含む担体より
も、リパーゼの活性発現及び耐熱性に富む固定化担体と
なり得るものである。

例えば４級アミン■型樹脂に比べ水酸基が多く、かつグ
ルカミン基として鎖長が長いために、酵素に対しより水
素結合が多く、又フレキシブルに対応し、酵素を安定に
吸着固定化し得ることがわかった。

本発明に係る担体の形状としては、粉末状、顆粒状、繊
維状、スポンジ状等種々あるが、そのいずれでも使用で
きる。そして比表面積の大きい多孔性のものが好適であ
る。特に工程操作上の面からは４００〜１０００μｍの
粒径を有し、細孔径１００〜１５００人の多孔性樹脂よ
りなるものを用いるのが良い。

本発明において酵素と称するものは、トリプシン、キモ
トリプシン、ペプシン、プロナーゼ（商品名）、プロメ
ライン、パパイン等の蛋白質分解酵素、多糖分解酵素及
び糖関連酵素、リパーゼ、ホスホリパーゼ等の脂質分解
酵素、５′−ホスホジェステラーゼ、ホスホモノエステ
ラーゼ、アデニル・デアミナーゼ、リボシターゼ等の核
酸分解及び核酸関連酵素、グルタミナーゼ、アスパラギ
ナーゼ等のアミノ酸関連酵素など作用機作及び基質特異
性の如何を問わず総称し、微生物（糸状菌、酵母、細菌
、担子菌又は藻類など）、植物、動物などの起源由来に
拘りなく、またその精製程度の如何も問わないが、特に
脂質分解酵素が好適である。

本発明に用いる脂質分解酵素としては、リパーゼ、ホス
ホリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、スフィンゴ
ミエリナーゼ及び各種のエステラーゼが挙げられる。こ
れらのうちリパーゼとしては、グリセリドの１．３位に
のみ反応し、位置選択性に優れたリゾプス（Ｒｈｉｚｏ
ｐｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
）属、ム：］　−ル（Ｍｕｃｏｕｒ）属、脂肪酸特異性
を有するジオ）　ＩＪケム（Ｇｅｏｔｒ　ｉｃｈｕｍ）
属、特異性を示さないキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）
属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ペ
ニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、り０モバク
テリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）属等の
微生物起源のリパーゼ及び膵臓リパーゼ等の動物リバー
ゼが挙げられる。これらのうち、特に合成活性の増加し
易いリパーゼとしては、中鎖以上のアルキル基に活性の
強いリゾプス属、ムコール属、クロモバクテリウム属起
源のリパーゼが一層好ましい。コレステロールエステラ
ーゼノ例としては、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属
等の微生物起源のものが挙げられる。また、ホスホリパ
ーゼの例としては、キャベツ、ビーナツツ、ニンジン、
大豆、菜種等の植物やコケ植物由来のホスホリパーゼＤ
１ストレプトマイセス属等の微生物起源のボスホリバー
ゼＤ１ホスホリパーゼＣ１さらには酵母由来のホスホリ
パーゼＡ１毒蛇由来のホスホリパーゼＡ２などが挙げら
れる。

酵素の固定化は、前述した多孔性のグルカミン型キレー
ト樹脂を使用し、好ましくはこの担体に疎水基を導入し
たものを酵素の安定ｐＨで平衡化し、酵素水溶液と接触
させ酵素を吸着させて行われる。酵素水溶液は炭素数１
〜６の１価アルコール或いは多価アルコールの溶剤や、
塩化ナトリウム、硫酸アンモニウムなど、一般的に酵素
処理剤として用いられる塩の混合溶液であってもよい。

本発明において固定化を行う温度としては、脂質分解酵
素の失活の起きない温度であればよく、０〜６０℃、好
ましくは２５〜４０℃がよい。また脂質分解酵素水溶液
のｐＨは脂質分解酵素の変性が起きないような範囲であ
ればよ＜、ｐＨ３〜９が好ましい。特に至適ｐＨが酸性
とされているリパーゼを用いる場合に最大の活性を得る
には、ｐＨ４〜６とすることがよい。また酵素水溶液に
用いる緩衝液の種類は特に限定しないが、一般的な酢酸
緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等を用いるこ
とができる。

本発明による酵素の固定化に際して、水溶液中の酵素濃
度は特に規定しないが、固定化効率の点から前証脂質分
解酵素の溶解度以下で、かつ十分な濃度であることが望
ましい。また必要に応じて不溶部を遠心分離により除去
し、上澄を使用しても良い。また酵素と固定化担体の使
用割合（重量比）は固定化担体１部に対して酵素０．０
１〜１部が好ましいが、特にこれに限定されるものでは
ない。

本発明の実施に際し更に好ましくは、固定化前の担体に
ついて多官能性試薬を用いて架橋することにより、固定
化酵素の繰り返し使用におけるより一層の耐久性向上を
図ることができる。

多官能性の架橋試薬としては、グリオキザール、グルタ
ルアルデヒド、マロンアルデヒド、スクシニルアルデヒ
ドなどのポリアルデヒド類が好ましく、ヘキサメチレン
ジチオイソシアネート、Ｎ、Ｎ”−エチレンビスマレイ
ミドなども使用可能である。また、カルボジイミド類も
使用できる。

また、固定化後にＰＶＡやキトサン等によって包括し、
より一層の安定性の向上も図ることができる。

また、固定化前もしくは固定化と同時にグルカミン型キ
レート樹脂を脂肪酸、脂肪酸誘導体、リン脂質、アルコ
ール類、エーテル類、カルボニル化合物類、並びにハロ
ゲン化アルキル類から選ばれる１種もしくは２種以上の
油溶性化合物で吸着処理することにより、高活性、高耐
久性の固定化酵素が得られる。その際、不純物の混入を
防止するため、前処理、即ち揮発性溶剤にこれらの油溶
性化合物を溶解し、この溶液をグルカミン型キレート樹
脂と接触させ、濾別後乾燥するのが好ましい。前記油溶
性化合物と固定化担体の比率は、固定化担体１重量部に
対し油溶性化合物０．００１〜１重量部が適当であるが
、これに限定されるものではない。過剰量の前記油溶性
化合物は固定化担体に吸着されず溶液中に遊離して酵素
を吸着するため、固定化担体上への固定化収率の低下を
引き起こすことになるため有効ではない。適当な吸着温
度としては０〜６０℃、好ましくは５〜３０℃が適当で
ある。吸着時間としては５分〜２時間が適当である。以
上の温度・時間は何れもこれらに限定されるものではな
い。

本発明でグルカミン型キレート樹脂処理に用いられる脂
肪酸としては、炭素数４〜２４の直鎮状の飽和脂肪酸、
不飽和脂肪酸或いは分岐脂肪酸等が挙げられる。好まし
い脂肪酸としては、例えばオレイン酸、リシノール酸、
リノール酸などが挙げられる。

本発明でグルカミン型キレート樹脂処理に用いられる適
当な脂肪酸誘導体としては、脂肪酸残基が炭素数８〜２
４の直鎮状の飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸或いは分岐脂肪
酸であるモノグリセリド、ジグリセリド、及びその誘導
体、トリグリセリド、或いはプロピレングリコーノペポ
リグリセリン等の多価アルコール脂肪酸エステノベ蔗糖
脂肪酸エステル等の糖エステノベソルビタ：／脂１ｉ７
［エステル等の糖アルコールエステル等が挙げられる。

本発明でグルカミン型キレート樹脂処理に用いられるア
ルコール類としては、炭素数８〜２４の直鎖又は分岐鎖
の脂肪族１価アルコール、炭素数２〜６の多価アルコー
ルが挙げられる。このほかに、フェノール化合物、ステ
ロール類、炭素数１０〜２０のテルペンアルコール類、
脂溶性ビタミン類も有効である。

本発明でグルカミン型キレート樹脂処理に用いられるエ
ーテル類の例としては、炭素数１０〜１８のエーテル類
、炭素数１２〜１８のグリセリルエーテル類、又は炭素
数１０〜１８のグリシジルエーテル等のグリセリド類似
化合物、ポリオキシ化合物、前記アルコールのシリコン
化合物が挙げられる。

本発明でグルカミン型キレート樹脂処理に用いられるカ
ルボニル化合物の例としては、炭素数１０〜１８の脂肪
族アルデヒド順、或いは脂肪族ケトン類等が挙げられる
。

本発明でグルカミン型キレート樹脂処理に用いられるハ
ロゲン化アルキルの例としては、炭素数８〜１８のアル
キルハライド等が挙げられる。

上記の油溶性化合物はいずれも常温で液状であることが
工程操作上好ましいが、これに限定されるものではない
。また、これらは単独で用いてもよいが、適当な組み合
わせにより一層の効果が発揮されることもある。

本発明で得られる固定化酵素を用いた脂質類の反応とし
ては、固定化リパーゼを用いるエステル交換反応が挙げ
られ、かかるエステル交換反応としては、例えばエステ
ルと脂肪酸によるアシドリシス反応、エステルとアルコ
ールによるアルコリシス反応、エステル同士によるイン
ターエステル化反応等が挙げられる。

また本発明で得られる固定化酵素を用いたエステル交換
反応の基質の例としては、大豆油、オリーブ油、パーム
油等の植物油脂、牛脂、豚腸、魚油などの動物油脂が挙
げられる。これらの油脂は単独で用いてもよいが、２種
以上の油脂を用いるか、油脂と高級脂肪酸あるいは油脂
と高級脂肪酸の低級アルコールエステル間でエステル交
換することが好ましい。特定の油脂と他の油脂、脂肪酸
もしくはその誘導体間でエステル交換する場合、両者の
量比は特定の油脂１重量部に対し他物質は０．０５〜２
０重量部、好ましくは０．１〜１０重量部でないと油脂
の改質効果は得られにくい。特に好ましくは、パーム油
等の２位にオレイン酸残基を多く有する油脂とステアリ
ン酸とのエステル交換である。この反応においてはステ
アリン酸の融点が高く、油脂の粘度が高いため、カラム
反応で連続エステル交換反応を無溶剤で行うためには、
反応系の温度を６０〜９０℃に保つ必要がある。本発明
の固定化酵素はこの目的に好適であり、また得られる油
脂はチョコレート用として有用なものである。

本発明で得られる固定化ホスホリパーゼを用いるエステ
ル交換反応の他の例としては、天然リン脂質と各種脂肪
族アルコール、多価アルコール類、テルペンアルコール
類、ａｍ、ａアルコール類、ステロール類等の他、グア
ニン、アデニン、チミン、ウラシル等の塩基とのトラン
スホスファチシレージョン等が挙げられる。

更に本発明で得られる固定化酵素を用いたエステル合成
反応の例としては、通常のメタノール、エタノール、プ
ロパツール、オレイルアルコール等の１価アルコール、
ないしはプロピレングリコール、グリセリン、ソルビト
ール及びポリグリセリン等の多価アルコール、又はゲラ
ニオール、シトロネローノペメントール等のテルペンア
ルコーノへあるいはコレステロール等のステロールと、
炭素数２〜２４の脂肪酸とのエステル化反応が挙げられ
る。

エステル合成反応は２０℃〜９０℃、より好ましくは３
０〜８０℃で無溶剤、もしくは炭化水素、エーテル等の
不活性溶剤中で行う。またアルコールと脂肪酸の量はこ
れらの価数、目的物に応じ適宜調整する。例えばジグリ
セリドの合成を目的とする場合はグリセリン１モルに対
し脂肪酸約２モル、モノグリセリドの合成を目的とする
ときはグリセリン１モルに対し脂肪酸約１モルを反応さ
せる。

これらのエステル交換反応、エステル化反応あるいはト
ランスホスファチシレージョン等の反応に於いては、固
定化酵素中の水分量も含め、反応系中の水分量を５重量
％以下、好ましくは０．１〜１重量％に保持するのが好
ましい。

尚、本発明で得られる固定化脂質分解酵素は、脂質分解
酵素本来の性質を利用して、油脂或いは各種脂質の加水
分解反応にも好適に利用できる。

〔発明の効果〕

本発明方法の固定化で得られた固定化脂質分解酵素を用
いた場合、例えば固定化リパーゼを用いた油脂のエステ
ル交換或いはグリセリドのエステル化反応では、リパー
ゼの活性発現及び耐久性が顕著に向上することにより、
経済的効果が一層増進される。

さらに、本発明の固定化酵素は耐熱性にも優れることか
ら反応が５０〜８０℃の温度で実施できるため、反応溶
剤が不要であること、反応速度が高まる等の工業的な実
施を図る上で大きな経済的効果が得られる。

〔実　施　例〕

以下に本発明をエステル交換反応とエステル合成反応に
ついてそれぞれ実施例、比較例をもって詳細に説明する
。

実施例１ 表１に示した市販の樹脂各１０ｇ（乾燥重量として）を
ｐＨ６に調整した後、リシノール酸１０％の酢酸緩衝液
中で攪拌混合しリシノール酸を吸着させた樹脂と、この
処理を行わないものをリパーゼの吸着固定化に使用した
。

ｐＨ６で、リパーゼ１００ｒｄ（２００００１Ｊ／ｍｉ
りを樹脂１０ｇと２時間接触させ濾別、減圧乾燥を行い
、固定化酵素を得た。

酵素吸着率は、固定化後の濾液中のリパーゼ活性を、固
定化に使用した全リパーゼ活性から引いたものの比で表
した。エステル交換活性はパーム油中融点部の油脂１０
ｇと、ステアリン酸１０ｇを７０℃中でエステル交換反
応を行い、理論平衡率（ステアリン酸の取り込み率）に
対する反応の進行を百分率で表した。その結果を表１に
示す。

表　　　　１ （註）１）ダイヤイオンＣＲＢＯ２：グルカミン型キレ
ート樹脂 ２）デュオライト＾７：弱塩基性陰イオン交換樹脂 ３）−は処理せず、＋は処理を示す。

実施例２ １．３位置選択性のリパーゼとしてＲｉｚｏｐｕｓｊａ
ｐｏｎｉｃｕｓ由来のリパーゼサイケン１００を用い、
実施例１の方法で下記の表２に示した市販の樹脂をリシ
ノール酸処理後、これに前記リパーゼサイケン１００を
吸着固定化せしめた。

得られた固定化酵素とグリセリン１０ｇ及び脂肪酸６０
ｇを減圧下、４０℃で９５％まで反応後、その反応液中
の１．３−ＤＧ（ジグリセリド）純度を選択率とした。

尚、ＤＧが最終的に合成されるようにした。その結果を
表２に示す。

表　　　　２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　グルカミン型キレート樹脂よりなることを特徴とす
   る酵素固定化用担体。 ２　キレート樹脂が多孔性である請求項１記載の酵素固
   定化用担体。 ３　脂質分解酵素の水溶液を、請求項１又は２記載の固
   定化用担体と接触させることを特徴とする固定化酵素の
   製造方法。 ４　脂質分解酵素を固定化するにあたり、脂肪酸、脂肪
   酸誘導体、リン脂質、アルコール類、エーテル類、カル
   ボニル化合物類、並びにハロゲン化アルキル類から選ば
   れた１種もしくは２種以上の化合物の存在下で固定化す
   ることを特徴とする請求項３記載の固定化酵素の製造方
   法。 ５　脂質分解酵素がリパーゼ、ホスホリパーゼ、並びに
   コレステロールエステラーゼより選ばれたものである請
   求項３又は４記載の固定化酵素の製造方法。