JPH01153090A - 固定化酵素および固定化酵素を用いたエステル合成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、脂質分解酵素（リパーゼ、ホスホリパーゼ、
コレステロールエステラーゼ等、以後酵素と略称する場
合もある）を用いた、エステル結合の合成および交換反
応に適した固定化酵素およびそれを用いたエステル合成
方法に関するものである。

〔従来の技術〕

エステル類の合成反応は、脂肪族１価アルコールと脂肪
酸によるワックスエステルの合成、モノグリセリド、ポ
リグリセリン脂肪酸エステル、糖エステルといった多価
アルコールと脂肪酸によるエステル合成、コレステリル
パルミテート等のステロイドエステル類、ゲラニルブチ
レート等のテルペンアルコールエステル類の製造方法と
して重要な技術である。

リン脂質についても、通常トランスホスファチシレージ
ョンとして知られる塩基交換反応は有用な生理活性物質
等の製造方法として重要な技術である。

脂質分解酵素の１種であるリパーゼは温和な条件下で反
応すること、位置選択性、アルキル選択性等の特異性を
有することを利用して油脂及びエステル類の合成・交換
反応に利用されている。しかし、これらの反応はリパー
ゼ本来の加水分解反応と異なり水分の限定された系での
み進みうる反応である。一方リパーゼのエステル合成活
性や交換活性を増大せしめるためには、酵素として少量
の水分を特徴とする特開昭５５−７１７９７号公報に開
示された低水分系の反応では、充分な反応速度が得られ
ず、また反応速度を増大させるために必要以上の水分を
与えると、エステルの分解反応が優先的に進行するとい
う問題点がある。また特開昭６０−１９４９５号公報及
び特開昭６０−２０３１９６号公報に開示された、反応
を多水分系の分解工程と、水分を除去する合成工程の二
段階に分けて行う方法の提案もあるが、後者の合成反応
速度は通常のエステル交換速度に比して充分であるとは
言えず、工程操作の複雑化も避けられない。

以上の問題点を解決し、かつリパーゼを効率的に使用す
る目的で、リパーゼを固定化する試みが行われてきた。

リパーゼの固定化により期待される利点は次の通りであ
る。従来リパーゼを水溶液の状態で使用すると油中に均
一に混合・分散することが困難であったが、リパーゼを
不溶性担体表面に固定化する事により油中に容易に分散
可能となり、かつ担体に適当量の水分を保持できるため
、低水分下でのエステル合成・交換反応が行いやすくな
る。また触媒としてコストの高いリパーゼの回収再使用
がしやすく、エステル合成反応または交換反応の工業的
実施においても反応装置の連続化が容易となる点等であ
る。

しかし、以上のような利点を有する固定化酵素において
も、リパーゼの合成活性増大のために必要な水分量を保
持する事と、逆反応である加水分解の抑制とを両立する
には至っていない。

例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　ｏ
ｉｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔ’５Ｓｏｃｉｅｔｙ、第６０巻、
　２９１−２９４（１９８３）にも微量な水分を与えた
場合加水分解反応が進行することが指摘されている。ま
た、水に代えてグリセリンのような多価アルコールを添
加した場合では加水分解反応はある程度抑制されるが、
エステル合成・交換反応は遅くなる。また、酵素水分の
保持を狙い多孔質担体、高吸水性樹脂をキトサンで包括
結合後、粉砕した担体を用いる方法（特開昭５９−２１
３３９０号公報）によっても固定化酵素のエステル合成
・交換反応と分解反応を両立させるため、二段階反応法
（特開昭６０−２０３１９６号公報）を採用している。

また特開昭６０−９８９８４号公報および特開昭６１−
２０２６８８号公報には耐熱性を持ち８０℃までの反応
が可能なエステル交換、エステル合成を目的とした固定
化酵素についての開示もあるが、その特徴とする６０°
Ｃ〜８０°Ｃという温度では、ジグリセリドの１，２位
から１．３位への酵素的および非酵素的転移が速く、カ
カオ脂に類似したグリセリドの２位にオレイン酸を多く
含有する対称型油脂の製造を目的とする場合には、より
エステル交換反応速度の速い固定化酵素の開発が望まれ
る。

〔発明が解決しようとする問題点〕

以上のようにエステル合成および交換反応においては反
応系内の水分を確実にコントロールするか、またはより
エステル合成および交換活性の高い固定化酵素の開発が
望まれる。

エステル合成反応についてみると、従来の方法ではほと
んどの例がリパーゼを水溶液として使用しており、分解
と合成の平衡関係が大きく分解にかたよっており、目的
とするエステルの収量は低いものにとどまっている（特
開昭５１−７７５４号公報、特開昭６１−１８７７９５
号公報）。しかし固定化酵素によって反応を行えば、よ
り低水分条件下においてもエステル合成が行われ、酵素
の回収も容易であるが、この場合においても通常の化学
的方法と同等の反応速度を得るためには、より高活性な
固定化酵素の開発が望まれる。

リパーゼのエステル合成およびエステル交換活性を増加
させる方法として、特開昭６０−２５１８８４号公報に
開示されたリパーゼに油脂を加え加水分解反応をさせる
ことにより、油脂と脂肪酸の共存下で固定化を行う方法
や、特開昭６２−１３４０９０号公報に開示された脂肪
Ｍ誘導体の共存下に乾燥する方法があるが、こうした方
法により得られた固定化リパーゼのエステル合成活性お
よびエステル交換活性は前述の工業的実施にあたっては
実質的には未だ充分であるとは言えない。

一方酵素固定化における、活性収率の面から見ると、特
開昭５２−８７２９３号公報に開示されたイオン交換樹
脂の有機金属誘導体を担体としてリパーゼを固定化する
方法や、特開昭５３−２７７８７号公報に開示された多
糖類の高級脂肪酸エステルを担体としてリパーゼを固定
化する方法、あるいはＥｕｒ、　Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。

に記載されたＹ、　Ｋｉｍｕｒａ等のイオン交換樹脂に
リパーゼを単にイオン結合により固定化する方法等の従
来の方法ではいずれも低収率にとどまり、他の夾雑物の
共存下でリパーゼを選択的に固定化することは極めて困
難であると考えられていた。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで、本発明者らは脂質分解酵素のエステル合成及び
エステル交換活性を増大させる因子について鋭意研究を
重ねた結果、脂質分解酵素に脂肪酸又はその誘導体を共
存させることによりエステル合成及びエステル交換活性
の増大が見られる事実を発見した。更に本発明者らはこ
の事実をもとに、脂肪酸又はその誘導体を種々の不溶性
担体上に吸着させる事に応用し、本発明を完成するに到
ったのである。

即ち、本発明は、脂肪酸またはその誘導体を予め吸着処
理して得た不溶性担体と、脂質分解酵素とを水性媒体中
で吸着固定化して得られるエステル交換活性およびエス
テル合成活性の高い固定化酵素に係わるものである。

従来、リパーゼと脂肪酸又はその誘導体との関係につい
ては、醗酵生産において誘導基質として添加されたり、
ある種の不飽和脂肪酸または脂肪酸誘導体がある種のリ
パーゼの分解活性を活性化することが報告されているに
すぎない。

詳細には、サツカロマイセス　リボリティ力のリパーゼ
の分解活性をオレイン酸（Ａｇｒｉｃ、　Ｒｉｏｔ。

Ｃｈｅｍ、、　４６．２８８５（１９８２））やヒドロ
キシ脂肪酸（３゜５−ジヒドロキシ−７−テトラデセン
酸）が活性化すること（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ
ｈｅｍ、、５０＋　　２５２３（１９８６））　、ヒマ
種子中のリパーゼがヒドロキシ脂肪酸誘導体（リシルレ
ート・テトラマー（Ｒｉ−ｃｉｎｏｌｅａｔｅ　Ｌｅｔ
ｒａｍｅｒ））の分解活性発現に必要なことが報告され
ているにすぎない。

また、リパーゼとリン脂質との関係についても、岩井ら
により１９６９年の日本化化学会において報告されて以
来、多（の報告がなされたが、加水分解反応での基質特
異性の変化についてか、または醗酵生産の安定化、誘導
についてのみであり、エステル合成およびエステル交換
反応での活性化についての報告はほとんど見られない。

これに対し本発明においては、具体的には脂質分解酵素
を含む溶液に不溶性担体を添加し該担体上に脂質分解酵
素を固定化する際に、予め不溶性担体に脂肪酸又はその
誘導体を吸着させた後、乾燥もしくは乾燥せずそのまま
酵素を固定化させる事により、酵素の選択的吸着とエス
テル合成活性およびエステル交換活性の著しい上昇が見
られたのである。

本発明の方法の最も好ましい点としては、第一に酵素を
含む培養液など他の夾雑蛋白質や他の物質の中から酵素
を短時間かつ高収率に固定化できる点である。

第二にリパーゼ等の脂質分解酵素においては、当然のこ
とながら水と油脂の界面で働くため、水溶液で使用した
場合には、界面と水溶液中にリパーゼの分散する平衡が
存在すると考えられ、水溶液中の酵素を全て有効に使用
できない。しかし固定化により担体表面上に並べること
ができれば、用いた酵素を効率良く利用する事が可能と
なる。

第三に担体に脂肪酸又はその誘導体を吸着させておくこ
とにより脂質分解酵素を活性化して固定化できる事がわ
かった。これは、前述した様に界面で働く脂質分解酵素
は、界面に配向した時に活性を発現する高次構造をとる
。このため、界面に配向しかつ活性化した状態で酵素を
固定化する事が重要である。この高活性な状態を作り出
すのに必要な水不溶性の物質として脂肪酸又はその誘導
体が非常に良好であり、かっただ単にヘキサンのような
非極性の界面を作る物質ではその効果が無いことも分か
った。またこの様にして製造した固定化酵素は従来難し
いとされていた固定化酵素中の水分が２％以下でも十分
に活性を発現する。

すでに本発明者らはこれらの知見を応用して、少量の水
と油脂の共存下でリパーゼと不溶性担体を接触させ、界
面に配向させると同時に固定化を行うという発明を完成
し特許出願した（特開昭６０−２５１８８４号公報）、
今回本発明者らは、さらにこれらの事実を解明し、各種
の不溶性担体に脂肪酸又はその誘導体を予め吸着させる
ことに応用し、該担体と酵素を接触固定化する際に、酵
素を活性化すると同時に短時間でかつ高濃度に該担体上
に固定化が可能となり、高活性な固定化酵素を製造でき
るという本発明の完成に至ったものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明の方法においては、水不溶性の担体に脂肪酸又は
その誘導体を水又は有機溶剤中で接触させる事により該
担体上に吸着処理し、必要に応じて該溶液から濾過した
後乾燥するか、またはそのまま酵素水溶液もしくは酵素
を含む培養液と接触させる。接触時間としては１分〜２
０時間、好ましくは３０分〜２時間がよい。次いで該溶
液より不溶性担体を濾過し水または緩衝液により洗浄す
る。こうして得られた固定化酵素を乾燥させ本発明の固
定化酵素を得る。

本発明に用いる脂質分解酵素としては、リパーゼ、ホス
ホリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、スフィンゴ
ミエリエーゼおよび各種のエステラーゼが挙げられる。

これらのうちリパーゼとしては、グリセリドの１．３位
にのみ反応し、位置選択性に優れたリゾプス（ＲｈＬｚ
ｏｐｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉ　１１
ｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｕｒ）属、脂肪酸特異性
を有するジオトリケム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、特
異性を示さないキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、シ
ェードモナス（Ｐｓｅｕ−ｄｏｍｏｎａｓ）属、ペニシ
リウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、クロモバクテリ
ウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属等の微生物
起源のリパーゼ及び膵臓リパーゼ等の動物リパーゼが挙
げられる。これらのうち、特に合成活性の増加し易いリ
パーゼとしては中鎖以上のアルキル基に活性位の強いリ
ゾプス属、ムコール属、クロモバクテリウム属起源のリ
パーゼが一層好ましい。

コレステロールエステラーゼの例としては、キャンディ
ダ（Ｃａｎｄ　１ｄａ）属等の微生物起源のものが挙げ
られる。また、ホスホリパーゼの例としては、キャベツ
、ビーナツツ、ニンジン等の植物やコケ植物由来のもの
、およびストレプトマイセス属等の微生物起源のものな
どが挙げられる。

本発明に用いられる不溶性の担体としては、水およびア
ルコール、各種有機溶剤、油脂類に不溶性の担体なら何
れでも良く、セライト、ケイソウ土、カオリナイト、モ
レキュラーシーブ、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシ
ウム、セラミックス等の無機担体、およびセルロースパ
ウダー、ポリビニルアルコール、キトサン、イオン交換
樹脂、吸着樹脂等の有機高分子の様なリパーゼ活性に影
響を与えず、操作上から物理的・化学的に安定なもので
あれば何れも使用できる。特に、不溶性担体内に疎水性
の部分を持つもの、例えば樹脂中の−ＣＩ！一部分の多
いもの、官能基にアルキル基の入ったものが、脂質分解
酵素の吸着性や基質としての脂質との相性からも好まし
い、また担体の疎水性が特に高い場合は、固定化時にア
ンチカオトロピックイオンとなる塩（硫安など）を加え
ると固定化収率が良好に保てる。また担体の形状として
は、粉末状、顆粒状、繊維状、スポンジ状等種々あるが
、そのいずれでも使用できる。特に工程操作上の面から
は４００−１０００−の粒径を有し、細孔径１００〜１
５００人の多孔性の担体を用いるものが好適である。特
に好ましい固定化担体としては特開昭６０−９８９８４
号公報記載のマクロ多孔性弱アニオン交換樹脂があり、
市販入手可能なものとしてダイヤモンドシャムロ・ンク
社のデュオライト八−５６８、デュオライトＳ−７６２
等のマクロ多孔性の弱アニオン交換樹脂及び吸着樹脂が
挙げられる。

本発明で用いられる脂肪酸としては、炭素数２〜３６の
ものが好ましく、更に好ましくは８〜１８のものであり
、例えばカプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸等の直
鎖飽和脂肪酸、オレイン酸、リノール酸等の不飽和脂肪
酸、リシノール酸等のヒドロキシ脂肪酸、もしくはイソ
ステアリン酸等の分岐状の脂肪酸が挙げられる。

本発明に用いられる脂肪酸誘導体としては、炭素数２〜
３６好ましくは８〜１８の脂肪酸と水酸基を有する化合
物とのエステルが挙げられ、１価アルコールエステル、
多価アルコールエステル、リン脂質、あるいはこれらの
エステルにさらにエチレンオキシドを付加した誘導体等
が例示される。１価アルコールエステルとしては、メチ
ルエステル、エチルエステル等が、多価アルコールエス
テルとしては、モノグリセリド、ジグリセリド、および
それらの誘導体、あるいはプロピレングリコール、ポリ
グリセリン等の多価アルコールの脂肪酸エステル、ソル
ビタン脂肪酸エステル、蔗糖脂肪酸エステル等が挙げら
れる。

本発明に用いるリン脂質の例としては、市販大豆レシチ
ン、卵黄レシチン等の粗製およびまたは精製混合レシチ
ン等を用いてもよく、またこれらを分画して得たホスフ
ァチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジ
ルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホ
スファチジン酸、カルシオリピン等を単独または混合し
て用いてもよい。また各種合成法により得た合成リン脂
質およびこれらの誘導体を用いることができる。

上記の脂肪酸及びその誘導体はいずれも常温で液状であ
ることが工程操作上好ましいが、これに限定されるもの
ではない。またこれらは単体で用いてもよいが、適当な
組み合わせにより一層の効果が発揮される。また広範な
脂肪酸誘導体が使用可能なのは、これら誘導体が水性媒
体中では化学的に、もしくはリパーゼにより酵素的に加
水分解され、脂肪酸を生成するためと想像される。

脂肪酸又はその誘導体と水不溶性担体との接触方法とし
ては、水もしくは有機溶剤中にこれらの物質をそのまま
加えても良いが、分散性を良くするため溶剤に脂肪酸又
はその誘導体を一旦分散・溶解させた後、水に分散させ
た担体に加えることもよい。適当な有機溶剤としてはク
ロロホルム、ｎ−ヘキサン等が挙げられる。脂肪酸又は
その誘導体と不溶性担体の比率は、不溶性担体１重量部
（乾燥重量）に対し脂肪酸又はその誘導体０．０１〜１
重量部、より好ましくは０．０５〜０．５重量部が適当
であるが、これに限定されるものではない。適当な接触
温度としては０〜１００℃、好ましくは２０〜６０℃が
よい。適当な処理時間としては５分〜５時間程度で良く
、これらの接触処理した後の担体は必要に応じて該溶液
より濾別した後−旦乾燥する。適当な乾燥温度としては
室温〜１００″Ｃが良く、減圧下での乾燥が乾燥速度の
点から好ましいが、これに限定されるものではない。

本発明において固定化を行う温度としては、酵素の失活
の起きない温度であればよく、０〜６０℃、好ましくは
２０〜４０℃がよい。また酵素溶液のｐｎは酵素の変性
が起きないような範囲であればよく、ｐＨ３〜９であれ
ばよい。特に至適ｐＨが酸性とされている酵素を用いる
場合に最大の活性を得るには、ｐＨ４〜６とすることが
よい。

またアルカリ性に至適ｐＨをもつものはｐＨ７〜９が好
ましい。また酵素溶液に用いる緩衝液の種類は特に規定
しないが、−船釣な酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス
塩酸緩衝液等を用いることができる。

本発明における固定化方法において、水溶液中の酵素濃
度は特に限定されないが、固定化効率の点から前記酵素
の溶解度以下でかつ充分な濃度であることが望ましい。

また必要に応じて不溶部を遠心分離により除去し、上澄
を使用しても良い。また酵素と固定化担体の使用割合は
固定化担体１重量部に対して、酵素０．０１〜１０重量
部、特に０．０５〜５重量部が好ましいが、特にこれに
限定されるものではない。

本発明における固定化酵素を用いたエステル合成反応の
例として、通常のメタノール、エタノール、プロパツー
ル、オレイルアルコール等の１価アルコール、ないしは
プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトールおよ
びポリグリセリン等の多価アルコール、またはゲラニオ
ール、シトロネロール、メントール等のテルペンアルコ
ール、あるいはコレステロール等のステロールと、炭素
数２〜３６、好ましくは６〜２４の飽和もしくは不飽和
の脂肪酸又はその低級アルコールエステルとのエステル
化反応が挙げられる。またエステル交換反応の例として
は、エステルと脂肪酸によるアシドリシス反応、エステ
ルとアルコールによるアルコリシス反応、エステル同士
によるインターエステル化反応、リン脂質と各種アルコ
ールとのトランスホスファチシレージョン等の反応が挙
げられる。

エステル合成反応は２０〜９０″Ｃ１より好ましくは３
０〜８０°Ｃで無溶剤、もしくは炭化水素、エーテル等
の不活性溶剤中で行う。またアルコールと脂肪酸の量は
これらの価数、目的物に応じ適宜調整する。例えばジグ
リセリドの合成を目的とする場合はグリセリン１モルに
対し脂肪酸約２モル、モノグリセリドの合成を目的とす
るときはグリセリン１モルに対し、脂肪酸約１モルを反
応させる。

本発明において、固定化前の担体に、多官能性試薬を用
いて架橋することにより、固定化酵素の繰り返し使用に
おける耐久性向上をはかることができる。多官能性の架
橋試薬としては、グリオキザール、グルタルアルデヒド
、マロンアルデヒド、スクシニルアルデヒドなどのポリ
アルデヒド類が好ましく、ヘキサメチレンジチオイソシ
アネート、Ｎ、　Ｎ’−エチレンビスマレイミドなども
使用可能である。また、カルボジイミド類も使用できる
。

〔発明の効果〕

本発明の方法は、リパーゼ等の脂質分解酵素の持つ合成
活性を十分に発揮させる為のものであり、脂肪酸又はそ
の誘導体を不溶性担体上に予め吸着させておくことによ
り、酵素の選択的吸着固定化が可能となり、同時にエス
テル交換活性、合成活性の増大が起こる事を発見した結
果から得たものである。

また、特開昭６２−１３４０９０号公報に開示された方
法と異なり、脂肪酸もしくはその誘導体と、担体、酵素
とを共存させて固定化させるのでなく、担体を脂肪酸又
はその誘導体で前処理するため、この前処理段階で巾広
い溶媒の選択が可能となる。すなわちステアリン酸等の
固体脂肪酸をブタノール、ヘキサン等の溶剤に溶解し、
担体への吸着終了後、溶剤を除去し、固定化操作に供す
ることも可能である。

またエステル類の合成においては、従来の酵素法では反
応の進行に伴って生成する水分により反応が平衡に到達
するため、エステル化が進行しなくなる。そこで反応系
を減圧にする等の脱水操作によってエステル化をさらに
進めようとするが、こうした操作により酵素のエステル
合成活性の低下は避けられない。こうした場合に本発明
の方法による固定化酵素を用いると、低水分条件下にお
いても十分なエステル合成活性を保持しているため、短
時間の間に高いエステル化率が達成され、反応の長時間
化による着色および異臭の生成等、品質の低下が見られ
ないという利点を有する。

以上のように本発明により、脂質分解酵素を界面での活
性型にした状態で固定化することによりエステル合成お
よびエステル交換活性が増大することを発見し、工業的
実施にあたって簡便かつ廉価に固定化酵素を製造するこ
とができる。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例、比較例をもって詳細に説明する
。

実施例１ 市販の弱アニオン交換樹脂〔フェノールホルムアルデヒ
ド系樹脂、商品名：デュオライト（Ｄｕｏｌｉｔｅ）　
Ａ−５６８、ダイヤモンドシャムロツタ社製〕１０ｇを
１００　ｍＺのイオン交換水に加え、次いでオレイン酸
（商品名ニルナック０−ＬＬ、花王株式会社製）２ｇを
加え３０°Ｃで３０分撹拌した。次に該樹脂を溶液から
濾別した後イオン交換水にて洗浄した。

市販のリパーゼ〔リゾプス・ジャボニカス（Ｒｈｉｚｏ
ｐｕｓ−ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）起源のリパーゼ製剤、商
品名：リリパーゼ・ＡＩＯ、大阪細菌研究所株式会社製
、１９，０００［１ｎｉｔ／　ｇ　）　１０ｇをｐＨ４
，５の１０１の酢酸緩衝液１００　＠７に溶解した。こ
の溶液に先に調整した樹脂を全量加え２時間撹拌した。

次に該懸濁液より樹脂を濾別し、水で洗浄した。

このとき濾液中のリパーゼ活性より求めた活性収率は９
６％となり、加えたリパーゼのほとんどが吸着固定化さ
れている事が分かった。次いで水分５％となるように常
温にて減圧乾燥を行い固定化リパーゼを得た。

こうして得られた固定化リパーゼ１ｇを、グリセリン２
３ｇ（水分含量０．８％、花王株式会社製）及びオレイ
ン酸７０．５　ｇと混合し、４０°Ｃにて撹拌しながら
エステル化反応を行った。経時的に反応液の一部を試料
として取り出し、基準油脂分析試験法に従って試料の酸
価を測定した。

試料の酸価より次式によりエステル化率を求めた。結果
を第１表に示す。

ここでＡＶｔ：を時間後の試料の酸価 ＡＶｏ　：反応前の混合試料の酸価を表す。

比較例１ 実施例１で用いた市販の樹脂をオレイン酸で処理するこ
となく、そのままりパーゼを固定化した以外は実施例１
と同様の方法で固定化リパーゼを得、同様の方法で酵素
の吸着率及びエステル化率を求めた。結果は第１表に示
す。

第　　　１　　　表 実施例２ この例では実施例１の樹脂の前処理工程において、オレ
イン酸にかえて、脂肪酸エステルとしてオレイン酸トリ
グリセリド（試薬、東京化成製）、オレイン酸ジグリセ
リド（試薬、東京化成製）、オレイン酸モノグリセリド
（商品名：エキセル０−９５、花王株式会社製）、オレ
イン酸エチル（試薬、東京化成製）をそれぞれ用いた以
外は全く同様の操作を行った。

本実施例及び実施例１及び比較例１で得られた固定化リ
パーゼをそれぞれ１ｇ用いて、パーム油中融点部（沃素
価３２．５、ジグリセリド含量４．６％）１０ｇと市販
のステアリン酸〔商品名ニルナック５−９０、ステアリ
ン酸純度９３％、花王株式会社製ＮＯｇを加えて７０°
Ｃで２時間反応を行った。反応後カラムクロマトグラフ
ィー（固定相フロリジル、フロリジン社製、展開溶剤：
ヘキサン／エチルエーテル＝２／３）によりグリセリド
画分を分離し、グリセリド中に含まれるステアリン酸含
量をガスクロマトグラフィーにより分析し、次式で示さ
れる平衡値を１００％とした反応率を算出した。

上の式において、 Ｓｔ：を時間後の油脂中のステアリン酸含量Ｓｏ：原料
油脂中のステアリン酸含量 Ｓω：１．３ランダム平衡時のステアリン酸含量を意味
する。

結果は第２表にまとめて示した。いずれの実施例の場合
も５時間以内に反応が平衡に到達し、副生物の生成も比
較例に比べ少なかった。

第　　　　２　　　　表 実施例３ 実施例１の樹脂の前処理工程において、オレイン酸にか
えて、リノール酸、ラウリン酸、ステアリン酸、リシノ
ール酸（以上いずれも試薬、東京化成製）、イソステア
リン酸（商品名：ダイヤドール１Ｏ−ＧＡ、三菱化成工
業型）を用いた以外は全く同様の操作を行った。ここで
得られた固定化酵素を用いて実施例２と同様にエステル
交換反応を行った。

これらの結果は第３表にまとめて示した。

第　　　　３　　　　表 実施例４ 実施例１の樹脂の前処理工程において、オレイン酸に変
えて脂肪酸誘導体（脂肪酸の多価アルコールエステル）
としてのプロピレングリコールモノオレエート（商品名
：サンソフト２５−０、太陽化学株式会社製）、ソルビ
タンモノオレエート（商品名：エマゾール０−１０、花
王株式会社製）、トリグリセロールペンタオレエート（
商品名：　ＰＯ−３１０、阪本薬品株式会社製）、ショ
糖モノオレエート（商品名：リョートーエステル０−１
５７０、三菱化成食品株式会社製）を各々用いた以外は
全（同様の操作を行った。得られた固定化酵素を用いて
実施例２と同様のエステル交換反応を行った。

これらの結果は第４表に示した。

第　　　　４　　　　表 実施例５ この例は有機担体についての検索を行った例である。

実施例１で用いた弱アニオン交換樹脂にかえて、マクロ
多孔性弱アニオン交換樹脂としてデュオライトＡ−７、
デュオライトＵＳ−５６２、デュオライトＵＳ−７７１
、デュオライトＡ−３６８、フェノール系吸着樹脂とし
てデュオライトＳ−７６２（以上ダイヤモンドジャムロ
ック社製）、スチレン系マクロ多孔性弱アニオン交換樹
脂としてダイヤイオンｗＡ３０　（三菱化成工業型）、
有機高分子としてキトサン（商品名：キトパールＢＣ−
３０００、富士紡績製）をそれぞれ用いた以外は実施例
１と同様の操作を行った。

ここで得られた固定化リパーゼを用いて、実施例２と同
様にエステル交換反応を行った。結果は第５表に示した
。

第　　　　５　　　　表 実施例に の例では無機担体についての検索を行った。

実施例１で用いた弱アニオン交換樹脂にかえて、ケイ酸
カルシウム（商品名：フローライトＲ１徳山曹達株式会
社製）、合成ゼオライト（商品名：ミズカシーブス５＾
、水沢化学製）、シリカビーズ（商品名：　５ｉｌｂｅ
ａｄ　Ｎ、水沢化学製）、球状アルミナ（商品名：　Ｎ
ｅｏｂｅａｄ　Ｄ　、水沢化学製）を用いた以外は実施
例Ｉと同様の固定化操作を行った。

ここで得られた固定化リパーゼを用いて、実施例２と同
様にエステル交換反応を行った。結果は第６表に示した
。

第　　　　６　　　　表 以上の結果に示すようにイオン交換樹脂以外にも多孔性
の吸着樹脂、天然の有機高分子、多孔性の無機担体にお
いても効果が認められた。

実施例７ 実施例１において、市販リパーゼとしてリゾプス　デレ
マー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅａ＋ａｒ）起源のリ
パーゼ（商品名：タリパーゼ、田辺製薬株式会社製）を
用いた以外は全く同様の固定化操作を行った。

実施例８ 実施例１において、市販リパーゼとしてムコールｓｐ、
起源のリパーゼ（商品名：リパーゼ１−１０、天野製薬
株式会社製）を用いた以外は同様の固定化操作を行った
。

実施例９ 実施例１において、市販リパーゼとしてペニシリウム　
シクロビウム起源のリパーゼ（商品名：リパーゼＧ、天
野製薬株式会社製）を用いた以外は同様の固定化操作を
行った。

比較例２ 実施例７において、担体をオレイン酸で処理することな
く、そのままリパーゼを固定化した以外は同様な操作を
行った。

比較例３ 実施例８において、担体をオレイン酸で処理することな
く、そのままりパーゼを固定化した以外は同様な操作を
行った。

比較例４ 実施例９において、担体をオレイン酸で処理することな
く、そのままりパーゼを固定化した以外は同様な操作を
行った。

以上の実施例７〜実施例９、及び比較例２〜比較例４で
得られた固定化リパーゼを用いて実施例１と同様のエス
テル化反応を行った。結果は第７表にまとめて示した。

これらの結果からいくつかの他のリパーゼでも同様に活
性が発現した。

第　　　　７　　　　表 実施例ＩＯ 実施例２で用いた脂肪酸誘導体にかえて市販の大豆レシ
チン（試薬、和光純薬製）、及びホスファチジルコリン
、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール
、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸
をそれぞれ単独で用いた以外は実施例２と同様の固定化
操作を行った。このときリン脂質の分散剤としてブタノ
ールを各々１０ｆｌ１７用いた。

次いで実施例２と同様のエステル交換反応を行い、結果
を第８表にまとめて示した。

第８表から明らかな様にリン脂質についても顕著な効果
が認められた。

−第　　　　８　　　　表 試験例１ 実施例１で得られた固定化酵素５０ｇを１２５−のジャ
ケット付カラムに充填し、そこに実施例２で用いたパー
ム中融点部とステアリン酸を等量溶解したものをカラム
内温度７０’Ｃ，１８０ｇ／Ｈｒの流量で連続通液しカ
ラム出口での反応率を調べた。　１４００時間後も出口
の反応率は８５％を維持しており、この間に固定化酵素
１ｋｇあたり約５０００ｋｇの油脂を処理した。

この結果から本発明の方法による処理固定化酵素の耐久
性は極めて高いものであることが確かめられた。

出願人代理人　　古　谷　　　馨

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、脂肪酸またはその誘導体を予め吸着処理して得た不
   溶性担体と、脂質分解酵素とを水性媒体中で吸着固定化
   して得られる固定化酵素。 ２、脂質分解酵素がリパーゼ、ホスホリパーゼ、コレス
   テロールエステラーゼ、スフィンゴミエリエーゼより選
   ばれたものである特許請求の範囲第１項記載の固定化酵
   素。 ３、不溶性担体がマクロ多孔性担体である特許請求の範
   囲第１項又は第２項記載の固定化酵素。 ４、脂肪酸またはその誘導体を予め吸着処理して得た不
   溶性担体を、脂質分解酵素と水性媒体中で接触させて得
   られる固定化酵素の存在下、低級１価もしくは多価アル
   コールと高級脂肪酸とを反応させることを特徴とするエ
   ステル合成方法。