JP4216082B2 - リン脂質の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、1−アシル−2−リゾおよび1,2−ジ−アシル化グリセロリン脂質およびそれらの合成または天然類似体を製造するための新規な酵素によって触媒される合成法であって、モノ−およびジ−アシル化合物のアシル基が同一でもまたは異なっていてもよく、それぞれ飽和または不飽和の、短、中、および長鎖の線状または分岐状の遊離カルボン酸またはその誘導体、好ましくは遊離脂肪酸、または脂肪酸塩化物、脂肪酸アルキルエステル、脂肪酸ビニルエステル、無水脂肪酸、および脂肪族アシル供与体として働く脂肪酸の任意の他の活性化形態からなる群から選択されるその誘導体から誘導される、上記方法を記載する。本発明によれば、グリセロホスホリルコリン(GPC)またはその類似誘導体であって、コリン残基をエタノールアミン、セリン、イノシトール、グリセロールまたは任意の他のアルコールで置換することができるものを基質として用いて、1,2−ジアシル化および1−アシル化−2−リゾリン脂質を上記の脂肪酸誘導体と共に製造するための酵素的エステル化/エステル交換(アシル化)法が提供される。反応は、溶媒中でまたは無溶媒微小水性系で、不溶性マトリックス上に固定されていてもよく且つ場合によっては界面活性剤でコーティングした(改質した)ホスホリパーゼの存在下にて行うことができる。本発明の方法により、1−アシル−2−リゾ−グリセロリン脂質および1,2−ジ−アシル化グリセロリン脂質が高転換率で形成される。
本発明は、1−アシル化−または1,2−ジ−アシル化リン脂質、およびそれらの合成または天然類似体を製造するための酵素的方法の開発に関する。更に具体的には、本発明は、それぞれ式STRおよびSTR1
(上記式中、RおよびR’は同一であるかまたは異なるものであり、且つそれぞれ飽和または不飽和の、短、中、および長鎖の線状または分岐状の遊離カルボン酸またはその誘導体、好ましくは遊離脂肪酸、または脂肪酸塩化物、脂肪酸アルキルエステル、脂肪酸ビニルエステル、無水脂肪酸および脂肪族アシル供与体として働く脂肪酸の任意の他の活性化形態からなる群から選択されるその誘導体から誘導され、両式におけるXは、コリン、セリン、エタノールアミン、グリセロール、イノシトール、または任意の他の適当なアルコール残基を表す)
の1,2−ジアシル−3−グリセロリン脂質および2−リゾ−3−グリセロリン脂質の製造方法に関する。
本発明は、1,2−ジアシル化リン脂質を製造するための新規な酵素法であって、微小水性反応系でsn−1およびsn−2部位でのアシル化に対してホスホリパーゼ活性を有する酵素製剤を用いることを含んでなる方法を提供する。更に具体的には、本発明のエステル化/エステル交換工程に従って製造される1,2−ジアシル−リン脂質は高収率および高純度で得ることができ、同一の所望な脂肪酸基をsn−1およびsn−2位にアシル基を有する。この工程は、上記の適当な酵素製剤の存在下でのグリセロリン脂質、好ましくはグリセロホスホリルコリン(GPC)の、所望なカルボン酸アシル供与体、好ましくは脂肪酸誘導体を用いるアシル化を伴う。本発明の方法は、グリセロリン脂質、好ましくはグリセロホスホリルコリン(GPC)を所望なカルボン酸誘導体とsn−1特異的ホスホリパーゼ(PLA1またはPLA1,2)の存在下にて反応させることによる1−アシル−2−リゾ−グリセロリン脂質、好ましくは2−リゾ−PCの製造方法にも関する。
本発明の主要な態様は、Sankyo(日本)によって提供され、モノ−またはジ−アシル化リン脂質のsn−1位におけるアシル基の加水分解を触媒することが知られている市販のホスホリパーゼA1製品(Lecitase)が、ある条件下でグリセロリン脂質のsn−1およびsn−2部位のいずれにおいてもアシル化活性を示すという驚くべき且つ予想外の知見に基づいている。この予想外の酵素活性は、酵素を不溶性マトリックス上に固定しおよび/またはこれに界面活性剤材料によるコーティングを施すことによって実質的に促進される。このsn−1およびsn−2位(部位)におけるアシル化活性は、Novozymes(435および525)またはLecitase(Novo)のようなリパーゼまたはホスホリパーゼA1酵素によっては立証することができなかった。
(a) 1モルのGPC(またはその類似体)+2モルの所定の脂肪酸(またはその誘導体)をPLA1,2の存在下で反応させて、高収率の1,2−ジ−同一アシル−PC(またはその相当する類似体)を提供する。この反応は過剰の脂肪酸(またはその誘導体)が必要である点を特記すべきである。
(b) 1モルのGPC(またはその類似体)+1モルの所定の脂肪酸(またはその誘導体)をPLA1,2および溶媒(例えば、第三ブタノール)の存在下で反応させて、1−所望なアシル−2−リゾ−PC(またはその相当する類似体)を提供する。過剰の酸(またはその誘導体)が好ましいことを特記すべきである。
本発明の好ましい態様は、グリセロリン脂質のモノ−およびジ−アシル化の触媒に用いることができる、有機または無機不溶性マトリックス上に固定した界面活性剤をコーティングした酵素複合体に関する。
実験手続き
A. 材料
この研究では、様々な粗製リパーゼおよびホスホリパーゼ製剤を試験した。表1は、この研究に用いた市販のホスホリパーゼおよびリパーゼ製剤、並びにそれらの種の供給源、および供給業者を示している。この研究に用いた総ての脂肪酸誘導体は、Fluka(スイス)およびSigma−Aldrich(純度80%−99%)から得た。界面活性剤をコーティングしたリパーゼ複合体の支持体として用いたCelite、アルミナおよびシリカなどの緩衝塩および無機マトリックスはSigma(USA)から入手し、イオン交換樹脂および他の酵素吸着剤はRohm and Haas(ベルギー)の製品であった。
1. (主として不溶性支持体への)吸着による酵素修飾および固定
粗製酵素を、最初に脂質−界面活性剤材料でコーティングした。典型的な酵素修飾および固定の手続きは下記の通りであった。すなわち、酵素(2g)(タンパク質含量約70mg/100ml)を100mlの適当なpHを有するリン酸またはトリス緩衝溶液に溶解し、10℃で30分間マグネティックスターラー攪拌を行った。0.5mlエタノール(または他の溶媒)に溶解した100mgの脂質−界面活性剤(または他の酵素改質剤)を、攪拌溶液に滴加した。生成する酵素溶液を15分間超音波処理した後、10℃で3時間激しく攪拌した。2gの不溶性有機マトリックス(ポリプロピレン、ステアリン酸アルミニウムなど)または2gの無機マトリックス(Celite、アルミナ、シリカゲル、または他のセラミック支持体など)を、攪拌酵素溶液に加えた。溶液を、更に5時間10℃でマグネティックスターラー攪拌した。沈澱生成物を12000 x rpm(Sorval Centrifuge,RC−5B型)で遠心分離によってまたは濾過によって集めた後、凍結乾燥した。
上記の修飾および固定手続きを、イオン交換樹脂への固定に関しても応用可能であった。用いた樹脂の種類としては、弱−強塩基性アニオン交換樹脂、弱−強酸性カチオン交換樹脂、無極性−弱極性イオン交換樹脂が挙げられる。用いることができる市販の樹脂の例は、下記の通りである。Dowex(登録商標)22、Dowex(登録商標)lx2−400、Dowex(登録商標)2x8−100、セルロースホスフェート、Amberlite(登録商標)IRA−95、Amberlite(登録商標)IRA−200、Amberlite(登録商標)IRA−900、Amberlite(登録商標)XAD−7、Amberlite(登録商標)XAD−16、Diannon(登録商標)SA−10A、Ectoela(登録商標)セルロース、Sephadex(登録商標)、およびスルホキシエチルセルロース(いずれもSigma、米国から得た)、Duolite(登録商標)A 568およびAmberlyst(登録商標)A21(Rohm and Haas、ベルギー)。
原則的に、2種類の異なる固定手続きを応用することができる。第一の手続きによれば、酵素を最初に界面活性剤でコーティングした後、界面活性剤がコーティングされている酵素複合体を、例えば、活性オキシラン基を含むEupergitのような活性化マトリックスに共有結合する。表面アミノ基に共有結合することができる活性基、または酵素の任意の他の官能基を含む任意の他の活性化マトリックスが応用可能であることを指摘すべきである。このために、1gの粗製酵素(1−20重量%のタンパク質を含む)を、100mlのリン酸緩衝液,pH 5.8に溶解する。酵素溶液を、マグネティックスターラーで10℃で30分間激しく攪拌する。100mgのソルビタンモノステアレートを0.5mlエタノールに溶解したものを、攪拌した酵素溶液に滴加する。生成するコロイド状の酵素溶液を10分間超音波処理を行った後、10℃で3時間攪拌した。20−5gのEupergit(登録商標)CまたはEupergit(登録商標)C 250L、および場合によっては、5%過酸化水素溶液0.5ml酵素溶液に加え、生成する懸濁液を緩やかに手で1分間振盪した後、23℃で48時間インキュベーションする。沈澱生成物を濾過して、リン酸緩衝液,pH 5.8で洗浄し、一晩凍結乾燥する。
グリセロリン脂質の脂肪酸誘導体によるアシル化反応は、グリセロリン脂質と脂肪酸誘導体の混合物を有機溶媒に溶解または懸濁したものに酵素製剤(100mg)を加えることによって開始した。アシル化反応は、脂肪酸誘導体が反応媒質としても作用する無溶媒系でも行った。反応媒質を、20−80℃の温度範囲で振盪した。試料を定期的に取り出して、50%:50%のエタノール:水溶液(またはエタノールのみ)で希釈し、Milliporeフィルター(0.45μm)で濾過した後、HPLC系に注入した。生成物の収率は1,2−ジアシル−と2−リゾ−生成物の間の%ピーク面積比として計算し、またはグリセロリン脂質基質の転換率は形成したもの−および/またはジアシル化グリセロリン脂質の濃度を経時的に測定することによって計算した。
この例は、無溶媒系でPLA1,2(または「酵素」)と本明細書で呼ばれるホスホリパーゼA1(Lecitase,Sankyo,日本)の様々な製剤を用いる1,2−ジアシル−グリセロリン脂質の製造に関する。
(A). Aspergillus属のSANK 11870株(または米国特許第5,538,874号明細書,Sankyo−日本に記載の通り、同一微生物の他の株)から得た50mgの酵素製剤を、10mgのGPC、5−10μlの水および0.5mlのビニルラウレートの混合物に加えた。反応系を60℃で振盪した。試料を定期的に抜き取り、適当に希釈して、濾過し、HPLCによって分析した。
溶媒の非存在下で1,2−ジアシル−グリセロリン脂質の生成を触媒する同じ of Sankyo製Lecitase(PLA1,2)が、第三ブタノールのような有機溶媒の存在下ではl−アシル−2−リゾ−グリセロリン脂質の生成を触媒することができることを見出した。溶媒が存在しない同じ反応と比較して、第三ブタノールの存在下ではずっと少量の1,2−ジアシルグリセロリン脂質が形成される。
酵素をリン酸緩衝液(例えば、K2HPO4およびKH2PO4,pH=5など)に溶解した。Duolite A568(またはAmberlite XAD 7)を、脱イオン水で数回洗浄した(3−7回)。溶解した酵素を洗浄したDuolite A568(またはAmberlite XAD 7)に加え、形成した懸濁液を4時間激しく攪拌した。4時間後、未処理であるかまたは、EtOHに溶解したSMOを酵素+Duolite(またはAmberlite)懸濁液に攪拌しながら加えた。形成した酵素+Duolite(またはAmberlite)+SMO懸濁液を一晩攪拌した後、懸濁液を20μm濾紙で濾過し、沈澱生成物(ケーキ)をリン酸緩衝液で洗浄した。
ビニルステアレート(またはビニルパルミテート)を、第三ブタノールと混合した。
(A)で調製した界面活性剤がコーティングされている(修飾した)−固定酵素複合体を、ビニルステアレート(またはビニルパルミテート)を第三ブタノールに溶解したものに50−70℃で加えた後、GPCを加えて、混合を行った。混合中に、気泡が形成される可能性がある。エステル化/エステル交換反応中に、アセトアルデヒドが放出された。
反応は、攪拌機を備えた1リットルのジャケット付き反応装置で60℃で200時間行った。反応混合物は、下記のものを含んでいた:
0.0288Kg GPC
0.45Kg ビニルステアレート(VS)
0.0225Kg 固定した修飾酵素複合体
0.15リットル t−BuOH
l−ステアロイル−2−リゾ−PCの生成の速度曲線を、図2に示す。
反応は、攪拌機を備えた100リットルのジャケット付き反応装置で60℃で120時間行った。反応混合物は、下記のものを含んでいた:
4Kg GPC
60Kg VS
3Kg 固定した修飾酵素複合体
20リットル t−BuOH
VSをt−BuOHと混合し、溶液が60℃のときに固定酵素複合体とGPCを加えた。
90時間後の転換率は75%であった。
1−ステアロイル−2−リゾ−PCの生成の速度曲線を、図3に示す。
反応は、60℃の振盪インキュベーター中1リットル三角フラスコで4日間行った。反応混合物は、下記のものを含んでいた:
0.025Kg GPC
0.375Kg VS
0.015Kg 固定した修飾酵素複合体
0.1リットル t−BuOH
反応は、攪拌機を備えた0.25リットルの三角フラスコで70℃で1日間行った。反応混合物は、下記のものを含んでいた:
0.0025Kg GPC
0.0375Kg VS
0.0019Kg 固定した修飾酵素複合体
0.0125リットル t−BuOH
反応転換率は、上記で詳細に説明したのと同じレベルである。
反応は、60℃の振盪インキュベーターで3日間行った。この反応では、ビニルパルミテート(VP)をビニルステアレートの代わりに反応させた。
得られた生成物は、l−パルミチオイル−2−リゾ−PCである。
反応混合物は、下記のものを含んでいた:
0.005Kg GPC
0.075Kg VP
0.005Kg 固定した修飾酵素複合体
0.025リットル t−BuOH
反応転換率は、上記で詳細に説明したのと同じレベルである。
反応は、60℃の振盪インキュベーター中三角フラスコで行った。この反応では、Amberlite XAD 7がDuolite A568の代わりに不溶性マトリックスとして働く。反応混合物は、下記のものを含んでいた:
0.0025Kg GPC
0.0375Kg VS
0.0019Kg 固定した修飾酵素複合体
0.0125リットル t−BuOH
反応転換率は、Duolite A568上の固定酵素について上記で詳細に説明したのと同じレベルである。
反応は、60℃の振盪インキュベーター中三角フラスコで行った。この反応では、再生VSを未処理の新鮮な新規VSの代わりに反応で用いた。反応混合物は、下記のものを含んでいた:
0.005Kg GPC
0.075Kg VS
0.005Kg 固定した(Duolite A568)−修飾酵素複合体
0.025リットル t−BuOH
本発明のもう一つの態様は、ホスホリパーゼA1をヒドロキシル化することによって、ある条件下でsn−1位のグリセロリン脂質のエステル化/エステル交換(アシル化)を触媒することができるという、驚くべき知見である。
Claims (30)
- 1,2−ジアシル化グリセロリン脂質の製造方法であって、1−アシルおよび2−アシル基が所定のものであり且つ同一であり、微小水性環境においてグリセロリン脂質をカルボン酸アシル供与体と、上記グリセロリン脂質のsn−1位置およびsn−2位置のいずれにおいてもエステル化/エステル交換/アシル化を触媒することができるホスホリパーゼ酵素の存在下で接触させることを含んでなる、上記方法であって、ここで上記反応混合物の水含量が反応混合物の体積の0.5−5体積%である、上記方法。
- 上記反応混合物の水含量が0.5−3%である、請求項1に記載の方法。
- 上記グリセロリン脂質が、グリセロホスホリルコリン(GPC)、およびその誘導体であって、コリン残基がエタノールアミン、セリン、またはアルコールによって置換されている上記誘導体からなる群から選択される、請求項1及び2に記載の方法。
- 上記アルコールが、イノシトールまたはグリセロールである、請求項3に記載の方法。
- 上記カルボン酸アシル供与体が脂肪酸アシル供与体である請求項1−4のいずれか一項に記載の方法。
- 上記脂肪酸アシル供与体が、飽和または不飽和の短、中または長鎖の線状または分岐状脂肪酸誘導体である請求項1−5のいずれか一項に記載の方法。
- 上記脂肪酸誘導体が、遊離脂肪酸、脂肪酸塩化物、脂肪酸アルキルエステル、脂肪酸ビニルエステル、および無水脂肪酸からなる群から選択される、請求項5及び6に記載の方法。
- 上記ホスホリパーゼ酵素が不溶性マトリックス上で固定されている、請求項1−7のいずれか一項に記載の方法。
- 上記ホスホリパーゼ酵素が界面活性剤がコーティングされている請求項1−8いずれか一項に記載の方法。
- 上記グリセロリン脂質のsn−1位置およびsn−2位置のいずれでもアシル化を触媒するホスホリパーゼ酵素がアスペルギルス(Aspergillus)属に由来する請求項1−9のいずれか一項に記載の方法。
- 上記ホスホリパーゼがアスペルギルス(Aspergillus)株SANK 11870、IFO No.30102およびATCCNo.9642のいずれか一つに由来する、請求項1−10のいずれか一項に記載の方法。
- 上記グリセロリン脂質の1,2−ジアシル−グリセロリン脂質への転換収率が少なくとも20%である、請求項1−11のいずれか一項に記載の方法。
- 上記グリセロリン脂質がグリセロホスファチジルコリン(GPC)である、請求項1−12のいずれか一項に記載の方法。
- 1,2−ジアシル化−グリセロリン脂質の製造方法であって、1−および2−アシル基が同一であり且つ所定のものであり、微小水性環境においてグリセロリン脂質を、同一の所望なアシル基を提供することができるカルボン酸アシル供与体と、上記グリセロリン脂質のsn−1位置およびsn−2位置のいずれにおいてもアシル化を触媒することができるホスホリパーゼ酵素の存在下で接触させることを含んでなる、上記方法。
- 溶媒を用いるとき、1−モノアシル−2−リゾ−グリセロリン脂質が形成される、請求項1に記載の方法。
- 上記溶媒が第三ブタノールである、請求項15に記載の方法。
- 生成物が1,2−ジ−アシル−グリセロホスファチジルコリンである、請求項1−16のいずれか一項に記載の方法。
- 上記1,2−ジ−アシル−グリセロホスファチジルコリンが、1,2−ジラウロイル−グリセロホスファチジルコリン、1,2−ジミリストイル−グリセロホスファチジルコリン、または1,2−ジパルミトイル−グリセロホスファチジルコリンである、請求項17に記載の方法。
- sn−1位置およびsn−2位置でのアシル化を触媒することができる上記のホスホリパーゼが、物理的に、イオン的にまたは共有結合的に上記不溶性マトリックスに結合している、請求項7−18のいずれか一項に記載の方法。
- 上記不溶性マトリックスが、吸着剤、イオン交換樹脂および活性化した不溶性マトリックスからなる群から選択され、上記界面活性剤が、糖脂肪酸エステル、糖アルキルエステル、ポリオール脂肪酸エステルおよびポリオールアルキルエーテルからなる群から選択される、請求項19に記載の方法。
- 上記の不溶性マトリックスが、Dowex(登録商標)22、Dowex(登録商標)1x2−40、Dowex(登録商標)2x8−100、セルロースホスフェート、Amberlite(登録商標)IRA−95、Amberlite(登録商標)IRA−200、Amberlite(登録商標)IRA−900、Amberlite(登録商標)XAD−7、Amberlite(登録商標)XAD−16、Diannon(登録商標)SA−10A、Ectoela(登録商標)セルロース、Sephadex(登録商標)およびスルホキシエチルセルロース、セライト(Celite)、アルミナ、シリカゲル、炭酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、木炭および硫酸カルシウムからなる群から選択され、上記界面活性剤が、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノミリステート、ソルビタンモノパルミテート、またはソルビタンモノステアレートである、請求項20に記載の方法。
- 1−アシル化−2−リゾ−グリセロリン脂質の製造方法であって、1−アシル基は所定のものであり、微小水性環境においてグリセロリン脂質をカルボン酸アシル供与体と、上記グリセロリン脂質のsn−1位置でアシル化を触媒することができるホスホリパーゼの存在下、有機溶媒の存在下にて接触させることを含んでなる、上記方法。
- 反応混合物の水含量が、反応混合物の体積の0.5−30体積%である、請求項22に記載の方法。
- 上記反応混合物の水含量が、反応混合物の体積の0.5−5体積%である、請求項23に記載の方法。
- 上記反応混合物の水含量が、反応混合物の体積の0.5−3体積%である、請求項23または請求項24に記載の方法。
- 上記カルボン酸アシル供与体が飽和または不飽和の短、中または長鎖の線状または分岐状脂肪酸誘導体である、請求項22または23に記載の方法。
- 上記脂肪酸誘導体が遊離脂肪酸、脂肪酸塩化物、脂肪酸アルキルエステル、脂肪酸ビニルエステル、および無水脂肪酸からなる群から選択される、請求項26に記載の方法。
- 上記ホスホリパーゼが、不溶性マトリックス上で固定されているホスホリパーゼA1である、請求項22−27のいずれか一項に記載の方法。
- 上記ホスホリパーゼが、界面活性剤がコーティングされているホスホリパーゼA1である、請求項22−28のいずれか一項に記載の方法。
- 上記ホスホリパーゼが、固定され且つ界面活性剤がコーティングされている請求項22−28のいずれか一項に記載の方法。
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