CZ308596B6 - Deriváty fosfolipidů a jejich použití jako léčiva - Google Patents
Deriváty fosfolipidů a jejich použití jako léčiva Download PDFInfo
- Publication number
- CZ308596B6 CZ308596B6 CZ2017-190A CZ2017190A CZ308596B6 CZ 308596 B6 CZ308596 B6 CZ 308596B6 CZ 2017190 A CZ2017190 A CZ 2017190A CZ 308596 B6 CZ308596 B6 CZ 308596B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- acyl
- dapl
- alkyl
- mixture
- methanol
- Prior art date
Links
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 title description 43
- 239000003814 drug Substances 0.000 title description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 37
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 125000000008 (C1-C10) alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- -1 3,5,5-trimethylpentyl Chemical group 0.000 claims description 46
- 125000001312 palmitoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 18
- 125000002811 oleoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C([H])\C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 15
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 125000003074 decanoyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 4
- 125000004016 elaidoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C([H])/C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 4
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 4
- 125000002669 linoleoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C([H])\C([H])([H])/C([H])=C([H])\C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 125000003696 stearoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 125000005466 alkylenyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 claims description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 78
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 57
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 57
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 57
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 56
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 48
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 36
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 32
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 31
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 29
- OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N Deuterated methanol Chemical compound [2H]OC([2H])([2H])[2H] OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N 0.000 description 26
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 23
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 description 19
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 17
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 16
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N n-hexadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 10
- 102100026918 Phospholipase A2 Human genes 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 10
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 8
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 8
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 7
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 description 6
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 5
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 5
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 125000005313 fatty acid group Chemical group 0.000 description 4
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100021977 Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 2 Human genes 0.000 description 3
- 108050004000 Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 2 Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010019695 Hepatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 3
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 3
- 210000001842 enterocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 3
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical group CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- YVYMBNSKXOXSKW-UHFFFAOYSA-N 1-Palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-PE Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP(O)(=O)OCCN YVYMBNSKXOXSKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYCNUMLMNKHWPZ-SNVBAGLBSA-N 1-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C RYCNUMLMNKHWPZ-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 2
- ASWBNKHCZGQVJV-HSZRJFAPSA-N 1-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-HSZRJFAPSA-N 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 2
- 102000004137 Lysophosphatidic Acid Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108090000642 Lysophosphatidic Acid Receptors Proteins 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 2
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 2
- 150000005690 diesters Chemical class 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- OKKJLVBELUTLKV-VMNATFBRSA-N methanol-d1 Chemical compound [2H]OC OKKJLVBELUTLKV-VMNATFBRSA-N 0.000 description 2
- 235000021313 oleic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940067605 phosphatidylethanolamines Drugs 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000000722 protumoral effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical class C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 1
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAVZTHXOOBZCOB-UHFFFAOYSA-N 2,6-Bis(1,1-dimethylethyl)-4-methyl phenol Natural products CC(C)CC1=CC(C)=CC(CC(C)C)=C1O FAVZTHXOOBZCOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N Butylhydroxytoluene Chemical compound CC1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010004103 Chylomicrons Proteins 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108090000553 Phospholipase D Proteins 0.000 description 1
- 102000011420 Phospholipase D Human genes 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 150000008065 acid anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001338 aliphatic hydrocarbons Chemical group 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 229940053200 antiepileptics fatty acid derivative Drugs 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 150000001841 cholesterols Chemical class 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical group C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000008344 egg yolk phospholipid Substances 0.000 description 1
- 229940068998 egg yolk phospholipid Drugs 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid group Chemical group C(CCCCC)(=O)O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003104 hexanoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 235000004213 low-fat Nutrition 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- LLYKPZOWCPVRPD-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine;n,n-dimethylpyridin-4-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1.CN(C)C1=CC=CC=N1 LLYKPZOWCPVRPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 230000033667 organ regeneration Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 125000001095 phosphatidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000008105 phosphatidylcholines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000005924 transacylation reaction Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/66—Phosphorus compounds
- A61K31/683—Diesters of a phosphorus acid with two hydroxy compounds, e.g. phosphatidylinositols
- A61K31/685—Diesters of a phosphorus acid with two hydroxy compounds, e.g. phosphatidylinositols one of the hydroxy compounds having nitrogen atoms, e.g. phosphatidylserine, lecithin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
- C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
- C07F9/09—Esters of phosphoric acids
- C07F9/10—Phosphatides, e.g. lecithin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
- C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
- C07F9/09—Esters of phosphoric acids
- C07F9/113—Esters of phosphoric acids with unsaturated acyclic alcohols
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
- C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
- C07F9/09—Esters of phosphoric acids
- C07F9/117—Esters of phosphoric acids with cycloaliphatic alcohols
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2121/00—Preparations for use in therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
- A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
- A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Physiology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Předkládané řešení poskytuje 1-acyl-lysofosfatidyl deriváty obecného vzorce I, kde R je C4 až C30 alifatický uhlovodíkový řetězec nebo C5 až C10 cyklický či cyklus obsahující alkyl nebo alkenyl, R1 je vybrán z H nebo C1 až C10 alkylu, R2 je vybrán z H, C10 až C30 acylu nebo C1 až C10 alkylu, R3 je vybrán z H nebo C1 až C10 alkylu, nebo R3 není přítomen, pro použití pro léčení melanomu nebo hepatokarcinomu.
Description
Deriváty fosfolipidů a jejich použití jako léčiva
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká nových látek na bázi lysofosfolipidů a jejich použití jako léčiv.
Dosavadní stav techniky
Fosfolipidy jsou klíčovou složkou všech biologických membrán - tvoří základ membránové dvouvrstvy spolu s bílkovinami, glykolipidy a deriváty cholesterolu. Dávají membránám jejich specifické polopropustné vlastnosti. Lipidy ze žloutků vajec kúra domácího obsahují značné množství (20 %) fosfolipidů. Dominantními fosfolipidy žloutku jsou fosfatidylcholin (75 %) a fosfatidylethanolamin (20 % žloutkových fosfolipidů). Dále žloutky obsahují malá množství fosfatidylserinu, fosfatidylinositolu, kyseliny fosfatidylové, sfingomyelinu a dalších ve stopových množstvích.
Po přijetí potravy jsou lipidy ve střevě emulgovány s přispěním solí žlučových kyselin, absorbovány a zpracovány buňkami střevní výstelky, enterocyty. Prvním krokem při trávení fosfolipidů je jejich naštěpení fosfolipázou A2 sekretovanou enterocyty tenkého střeva, za vzniku lysofosfolipidů a uvolněných mastných kyselin. Tyto látky jsou pak absorbovány enterocyty, metabolizovány a začleněny do lipoproteinových částic (např. chylomikronů), jejichž prostřednictvím se pak dostávají přes lymfatický a krevní systém k buňkám ostatních tkání.
Lysofosfolipidy založené na glycerolu se v organismech vyskytují nejen jako intermediáty při syntézách různých fosfolipidů, ale jak se v poslední době ukazuje, mají i vlastní významné regulační funkce. O biologické aktivitě 1-acyl lysofosfatidylcholinu, nebo směsi 1-acyl lysofosfolipidů připravených fosfolipázou A2 z přírodní směsi fosfolipidů a o jejich možném terapeutickém využití jsou jen nedostatečné informace. Ukazuje se, že 1-acyl lysoPC se nepřímo podílí na regeneraci orgánů a hojení ran (lit. 1,2) a může být zřejmě využit při léčení autoimunních a degenerativních onemocnění (lit. 3-7) a snad by se mohl uplatnit i při léčbě diabetů (lit. 8,9). V krevním séru je lysofosfatidylcholin nejvíce zastoupeným lysofosfolipidem. Je substrátem pro enzym autotaxin. V tělních tekutinách odštěpuje autotaxin, který je fosfolipázou D, cholinovou skupinu lysofosfatidylcholinu za vzniku kyseliny lysofosfatidylové (LPA). LPA je poměrně dobře studovanou látkou díky jejím významným biologickým účinkům. LPA aktivuje buněčnou proliferaci a angiogenesu a má prozánětlivé a pronádorové účinky. Signální dráhy ovládané touto kyselinou, prostřednictvím LPA receptorů hrají zásadní úlohu v karcinogenesi, invasivitě nádorových buněk a jejich metastatickém potenciálu. LPA signál se zřejmě podílí i na resistenci některých typů karcinomů vůči terapii (10-12).
Přestože se dá očekávat, že 1 -acyl lysofosfatidylcholin, díky své konverzi na pronádorové působící LPA, bude vykazovat pronádorové účinky in vivo, zjistili jsme, že naopak brzdí rozvoj experimentálních jatemích nádorů u kuřat i podkožních a intraperitoneálních nádorů vyvolaných syngenními nádorovými buňkami u myší. Toto překvapivé pozorování je základem předkládané přihlášky.
Seznam literatury:
1. Gendaszewska-Darmach E.: Acta Biochim. Pol.55, 227 (2008).
2. Benesch M.G., Ko Y.M., McMullen T.P., Brindley D.N.: FEBS Lett. (2014)
3. Abramowski P., Otto B., Martin R.: PLoS One 9, e91970 (2014).
4. MamathaB.S., Baskaran. V.: Nutrition 27, 960 (2011)
5. Riederer M., Ojala P.J., Hrzenjak A., Graier W.F., Malli R., Tritscher M., Hermansson M. et al.: J. Lipid Res. 51,2957 (2010).
-1 CZ 308596 B6
6. Grimm M.O., Grosgen S., Reimenschneider M., Tanila H., Grimm H.S., Hartmann T.: J. Chromatogr A 1218, 7713 (2011).
7. Jin M.C., Hung N.D., Yoo J.M., Kim M.R., Sok D.: J. Lipid. Sci. Technol. 114, 114 (2012).
8. Yea K., Kim J., Yoon J.H., Kwon T., Kim J.H., Lee H.J, Kim J.I. et al.: J. Biol. Chern. 284, 33833 (2009).
9. Overton H.A., Fyfe M.C.T., Reynet C.: Br. J. Pharmacol. 153, 76 (2008).).
10. Mills GB, Moolenaar WH. The emerging role of lysophosphatidic acid in cancer. Nat Rev Cancer. 2003;3(8):582-91.
11. Mari Gotoh a ost. Controlling cancer through the autotaxin-lysophosphatidic acid receptor axis. Biochem Soc Trans. 2012 February ; 40(1): 31-36. doi: 10.1042/BST20110608.
12. Houben AJ, Moolenaar WH. Autotaxin and LPA receptor signaling in cancer. Cancer Metastasis Rev. 2011;30(3-4):557-65.).
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje 1-acyl-lysofosfatidyl deriváty obecného vzorce I, kde
Rje C4 až C30 alifatický uhlovodíkový řetězec nebo C5 až CIO cyklický či cyklus obsahující alkyl nebo alkenyl,
R1 je vybrán z H nebo Cl až CIO alkylu, s výhodou Cl až C6 alkylu,
R2 je vybrán z H, CIO až C30 acylu nebo Cl až CIO alkylu (s výhodou Cl až C6 alkylu),
R3 je vybrán z H nebo Cl až CIO alkylu, s výhodou Cl až C6 alkylu, nebo R3 není přítomen, pro použití pro léčení melanomu nebo hepatokarcinomu.
S výhodou je R vybrán ze skupiny zahrnující C5 až CIO lineární, rozvětvený nebo cyklický či cyklus obsahující alkyl nebo alkenyl, jako je pentyl nebo 3,5,5-trimethylpentyl, cyklopentylethyl; nebo C13 až C30, s výhodou C13 až C20 lineární nebo rozvětvený alkyl nebo alkenyl, zejména C15, C16, C17, C18 nebo C19 lineární alkyl nebo alkenyl. Alkenyly obsahují jednu nebo více dvojných vazeb.
S výhodou je R2 vybrán ze skupiny zahrnující CIO až C30, s výhodou CIO až C20 acyly obsahující lineární nasycené nebo nenasycené řetězce, jako jsou například dekanoyl, palmitoyl, stearoyl, oleoyl, linoleoví, elaidoyl.
Pokud molekula nebo její část nese náboj, je kompenzován protiiontem. Vhodnými protionty jsou například kationty alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, nebo anionty halogenů, anionty
- 2 CZ 308596 B6 odvozené od anorganických nebo organických kyselin. Náboj může být kompenzován také formou vnitřní soli - betainu.
Atom dusíku nese kladný náboj tehdy, pokud R3 je přítomen.
V jednom výhodném provedení je alespoň jeden z Rl, R2, R3 methyl. V jednom specifickém provedení jsou Rl, R2 i R3 methyly.
V jednom specifickém provedení jsou Rl a R2 H, a R3 není přítomen.
V dalším specifickém provedení je Rl HaR2je CIO až C20 acyl obsahující lineární nasycené nebo nenasycené řetězce, a R3 není přítomen.
Sloučeniny podle předkládaného vynálezu jeví cytotoxické účinky na nádorové buňky, tedy potlačují růst nádorových buněk. Předmětem předkládaného vynálezu je tedy použití látek obecného vzorce (I) jako léčiv pro léčbu solidních tumorů vybraných z melanomu a hepatokarcinomu. V rámci tohoto vynálezu bylo potvrzeno, že látky obecného vzorce jsou silnými inhibitory růstu nádorových buněk v tkáňové kultuře, i inhibitory růstu experimentálních nádorů u zvířecích modelů.
Látky obecného vzorce I lze připravit selektivní deacylací příslušných fosfolipidů, případně modifikovaných fosfolipidů. Vstupní fosfolipidy mohou zahrnovat fosfatidylcholiny, fosfatidylethanolaminy, jejich deriváty odlišující se substitucí na atomu dusíku, nebo přírodní směsi fosfolipidů, případně modifikované substitucí na atomu dusíku. Přírodní směsi fosfolipidů mohou zahrnovat například fosfolipidy vaječného žloutku. Selektivní deacylací lze provádět syntetickými postupy známými odborníkovi v oboru nebo enzymaticky.
Po selektivní deacylací lze provést také následnou acylaci pro získání látky nesoucí požadovaný acylový zbytek R. Acylace prováděná po deacylací musí být selektivní, toho lze například dosáhnout chráněním -OH skupiny chránícími skupinami, které jsou odborníkovi v oboru dobře známé.
Z reakční směsi po deacylací lze látku obecného vzorce I izolovat samostatně, nebo ve směsi s uvolněnou mastnou kyselinou. Přítomnost mastné kyseliny nemá vliv na cytotoxické účinky látek obecného vzorce I.
Látky vzorce I lze pro použití formulovat jako léčivo, obsahující alespoň jednu látku obecného vzorce I a alespoň jeden nosič, rozpouštědlo nebo plnivo. Dále mohou léčiva obsahovat další vhodné pomocné látky, jako kluzné látky, látky usnadňující tabletování, emulgátory, potahové látky atd. Léčivo může být například ve formě kapslí, tablet, tobolek, mastí, krémů.
Příklady uskutečnění vynálezu
Seznam zkratek:
PC - fosfatidylcholin
PE - fosfatidylethanolamin
E-DAPL - směs 1-acyl-lysofosfolipidů ze žloutku připravená fosfolipázou A2
TLC - tenkovrstvá chromatografie
FA - mastné kyseliny
DMAP - dimethylaminopyridin
DCC - N, N'-dicyklohexylkarbodiimide
Příklad 1: Izolace přírodních směsných fosfolipidů z vaječných žloutků
-3CZ 308596 B6 žloutků bylo mícháno 10 minut s 1200 ml 96% ethanolu, obsahujícího 0,01 mM 2,6-bis( 1,1 dimethylethyl)-4-methylfenol, při 30 °C. Směs byla zfiltrována přes filtrační papír Whatman 1 a filtrát odpařen na rotační vakuové odparce. Odparek byl rozpuštěn v 200 ml «-hexanu (25 °C) a nerozpustný podíl odstraněn centrifůgací 10 min 3000 xg, 25 °C. Čirý supernatant byl vychlazen na 4 °C, smíchán s 2 objemy acetonu (4 °C) a ponechán přes noc při 4 °C. Sraženina byla 3x promyta směsí «-hexan:aceton (1:2) a usušena v exikátoru za sníženého tlaku. Takto purifikované fosfolipidy byly použity buď na isolaci fosfatidylcholinu a fosfatidylethanolaminu nebo na přípravu směsi lysofosfolipidů. Obsah fosfolipidů byl stanoven měřením fosforu.
Příklad 2: Izolace fosfatidylcholinu (PC) a fosfatidylethanolaminu (PE)
Purifikované celkové fosfolipidy (1,2 g) byly rozpuštěny v malém objemu směsi chloroform methanol: voda (66:33:2) a naneseny na 100 ml kolonu silikagelu ekvilibrovanou ve stejné směsi rozpouštědel. Kolona byla vyvíjena stejnou směsí rozpouštědel. Vzorek z každé frakce byl analyzován pomocí TLC.
Spojené frakce obsahující buď PE, nebo PC byly odpařeny a použity pro přípravu 1-acyllysofosfatidylethanolaminu (1-acyl-lysoPE), 1-acyl-lysofosfatidylcholinu (1-acyl-lysoPC), 2-acyllysofosfatidylcholinu (2-acyl-lysoPC) a N-acyl-lysofosofatidylethanolaminů. Malé alikvoty ze spojených frakcí PE a PC byly analyzovány pomocí MALDI-TOF, NMR a pomocí TLC spolu se standardy. Tyto metody ověřily, že frakce obsahují prakticky jen PE nebo PC.
Strukturní analýza fosfatidylcholinu (PC) indikovala jako majoritní složku diester s kyselinou palmitovou a olejovou a minoritní estery se souborem přirozeně se vyskytujících mastných kyselin.
MS vypočteno: 760,5851 nalezeno: 760,5853 (M+)
IR: 3384 (m), 3007(m), 2853(m), 1738 (s), 1602(s), 1467(m), 1419(m), 1378(m), 1346(m), 1249(s), 1174(m), 1092(s), 1064(s), 969(s), 925(s), 874(s), 821(m), 761(m), 721(s), 579(m), 506(m), 461(m)cm-1
Ή NMR (500 MHz, Methanol-d4) δ 5,35 (t, J = 5,2 Hz, 4H), 5,25 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 4.44 (dd, J = 12,0, 3,1 Hz, 1H), 4,32 - 4,23 (m, 2H), 4,17 (dd, J = 12,0, 6,9 Hz, 1H), 4,00 (t, J = 6,1 Hz, 2H), 3,68 - 3,60 (m, 2H), 3,23 (s, 9H), 2,33 (dt, J = 14,3, 7,4 Hz, 4H), 2,11 - 1,94 (m, 4H), 1,67 - 1,50 (m, 4H), 1,46 - 1,23 (m, 44H), 0,99 - 0,82 (m, 6H).
13C NMR (126 MHz, Methanol-d4) δ 173,49, 173,15, 129,44 (d, J = 20.1 Hz), 127,69 (d, J = 14,5 Hz), 70,40 (d, I = 7,9 Hz), 66,08 (dd, J = 7,2, 3,4 Hz), 63,47 (d, J = 5,1 Hz), 62,30, 59,07 (d, J = 4,9 Hz), 53,33, 53,30, 53,27, 33,70, 33,55, 31,69, 29,47, 29,42, 29,28, 29,24, 29,08, 28,99, 28,88, 28,85, 28,80, 26,79, 24,63, 22,36, 13,09.
Minoritní signály:
Ή NMR (500 MHz, Methanol-d4) δ 3,61 (d, J = 6,9 Hz), 3,35 (s), 2,89 - 2,72 (m), 2,40 (d, J = 3,2 Hz), 2,14 (d, J = 6,7 Hz), 1,74 - 1,65 (m), 1,18 (t, J = 7,0 Hz), 0,98 (t, J = 7,5 Hz).
13C NMR (126 MHz, Methanol-d4) δ 172,97, 172,49, 129,82, 129,56, 129,43, 128,93, 128,58, 128,09, 127,82, 127,43 (d, J = 16,2 Hz), 70,51, 48,45, 33,09, 31,29, 26,15, 25,20 (d, J = 3.0 Hz), 24,54, 22,26.
Strukturní analýza fosfatidylethanolaminu (PE) indikovala jako majoritní složku diester s kyselinou palmitovou a olejovou a dále další minoritní estery se souborem přirozeně se vyskytujících mastných kyselin.
IR: 3374(m), 2956(m), 2925(s), 2854(m), 1741(s), 1653(m), 1490(m), 1467(m),1457(m), 1378(m), 1227(s), 105 l(m), 722(m) cm1
Ή NMR (500 MHz, Methanol-ď4) δ 5,43 - 5,31 (m, 5H), 5,23 (d, J= 3,4 Hz, 1H), 4,58 (s, 1H, NH2), 4,44 (dd, J= 12,0, 3,2 Hz, 1H), 4,24 - 4,14 (m, 1H), 4,04 (dd, J= 5,2, 2,7 Hz, 2H), 4,02
-4CZ 308596 B6
3,97 (m, 2H), 3,16 (t, J= 4,9 Hz, 2H), 2,92 - 2,78 (m, 4H), 2,33 (dt, J= 12,9, 8,5 Hz, 4H), 2,11 2,00 (m, 4H), 1,65 - 1,57 (m, 4H), 1,38 - 1,24 (m, 38H), 0,95 - 0,86 (m, 6H).
Minoritní signály:
Ή NMR (500 MHz, Mcthanol-J) δ 5,18 - 5,14 (m), 3,67 - 3,58 (m), 3,50 - 3,43 (m), 3,35 (s), 3,23 (s), 2,78 (t, J= 6,7 Hz), 2,40 (d, J= 3,9 Hz), 2,17 - 2,11 (m), 1,69 (td, J= 7,3, 4,4 Hz), 0,98 (t, 7= 7,6 Hz).
Rozlišení mezi signály pro hlavní látku (PE) a látky směsi nebylo možné. Všechny signály jsou vypsány.
13C NMR (126 MHz, Mcthanol-J) δ 174,94, 174,59, 174,39, 131,22, 130,96, 130,84 (d. J= 19,8 Hz), 130,84, 130,34, 130,03- 129,94 (m), 129,48, 129,27, 129,22, 129,17, 129,15, 129,10, 129,06 - 129,03 (m), 128,93, 128,84 (d, J= 16,2 Hz), 72,03 - 72,00 (m), 71,95 - 71,91 (m), 71,89 - 71,84 (m), 71,79, 65,03 - 64,76 (m), 63,82 - 63,52 (m), 63,21 - 62,76 (m), 41,69 (d, J= 6,3 Hz), 35,10, 34,93, 34,49, 33,09, 32,69, 30,86, 30,80, 30,64, 30,49, 30,47, 30,38, 30,26, 30,23, 30,20, 28,23, 28,17, 27,55, 26,61, 26,03, 25,93, 23,75, 14,46.
Příklad 3: Příprava 1-acyl-lysofosfatidylethanolaminu (1-acyl-lysoPE)
O— ÍF
R' = směs acylů, majoritně palmitoyl
PE purifikovaný flash chromatografií nebo PE zakoupené od firmy Sigma Aldrich byly v 10% (w/v) koncentraci opakovaně vortexovány a sonikovány při 43 °C v 50mM TrisHCl (pH 8,0, 50mM KC1, 8mM CaCL), dokud nebyly fosfolipidy dokonale dispergovány. Pak byly fosfolipidy štěpeny fosfolipázou A2 (EC 3.1.1.4) v poměru 2 jednotky enzymu/mg fosfolipidů při 43 °C a průběh reakce sledován pomocí tenkovrstevné chromatografie na silikagelu (TLC), vyvíjené směsí chloroform:methanol:voda 20:10:1. Po úplném naštěpení byla reakce zastavena přidáním EDTA do koncentrace 10 mM a uložena při 0 až 4 °C. Preparát byl označen PE/E-DAPL+FA (1-acyllysofosfatidylethanolamin štěpený enzymem, ve směsi s mastnými kyselinami). Přírodní fosfatidylethanolamin nese jako acyl obvykle zbytek palmitové kyseliny, olejové kyseliny, nebo stearové kyseliny.
Příklad 4: Příprava 1-acyl-lysofosfatidylcholinu (1-acyl-lysoPC)
X b-R'
R' = směs acylů, majoritně palmitoyl
PC purifikovaný flash chromatografií byl v 10% (w/v) koncentraci opakovaně vortexován a sonikován při 43 °C v 50mM Tris.HCl (pH 8,0, 50mM KC1, 8mM CaCL), dokud nebyly fosfolipidy dokonale dispergovány. Pak byl PC štěpen fosfolipázou A2 v poměru 2 jednotky enzymu/mg fosfolipidů při 43 °C a průběh reakce sledován pomocí tenkovrstevné chromatografie na silikagelu (TLC), vyvíjené směsí chloroform methanol: voda 20:10:1. Po úplném naštěpení byla
-5CZ 308596 B6 reakce zastavena přidáním EDTA do koncentrace lOmM a uložena při 0 až 4 °C. Preparát byl označen PC/ E-DAPL+FA (1-acyl-lysofosfatidylcholin štěpený enzymem, ve směsi s mastnými kyselinami). Přírodní fosfatidylcholin nese jako acyl obvykle zbytek palmitové kyseliny, olejové kyseliny, nebo stearové kyseliny.
Příklad 5: Příprava směsných 1 -acyl-lysofosfolipidů
Metoda A: Celkové purifikované fosfolipidy z příkladu 1 byly v 10% (w/v) koncentraci opakovaně vortexovány a sonikovány při 43 °C v 50mM Tris.HCl, pH 8,0, 50mM KC1, 8mM CaCF. dokud nebyly fosfolipidy dokonale dispergovány. Pak byly fosfolipidy štěpeny fosfolipázou A2 v poměru 2 jednotky enzymu/mg fosfolipidů při 43 °C a průběh reakce sledován pomocí tenkovrstevné chromatografie na silikagelu (TLC), vyvíjené směsí chloroform:methanol:voda 20:10:1. Po úplném naštěpení byla reakce zastavena přidáním EDTA do koncentrace lOmM a krátkodobě uložena při 0 až 4 °C.
Metoda B: Usušené celkové purifikované fosfolipidy z příkladu 1 byly opakovaně vortexovány a sonikovány při 43 °C v 83mM deoxycholátu sodném v 50mM Tris.Cl, pH 8,0, 50mM KC1, 8mM CaCE. Konečná koncentrace fosfolipidů byla rovněž 83mM (vzhledem k PC). Pak byly fosfolipidy štěpeny fosfolipázou A2 v poměru 0,2 jednotky enzymu/mg fosfolipidů při 43 °C a průběh reakce sledován pomocí tenkovrstevné chromatografie na silikagelu (TLC), vyvíjené směsí chloroform:methanol:voda 20:10:1. Po 120 minutách byla reakce zastavena přidáním EDTA do koncentrace lOmM, pH směsi upraveno IM HC1 na pH=3, vy srážená kyselina deoxy cholová odtečena a supernatant neutralizován 5M NaOH na pH=7. Reakční směs byla krátkodobě uložena při 0 až 4 °C. Preparáty z metod A i B byly označeny E-DAPL+FA.
Směs E-DAPL+FA obsahuje zejména 1-acyl-lysoPC a 1-acyl-lysoPE, které lze charakterizovat vzorci níže, kde R je převážně kyselina palmitová. Směs rovněž obsahuje mastnou kyselinu uvolněnou enzymatickým štěpením, převážně kyselinu olejovou.
||
HjC — O~~C~R
OH-CH i i! +/
CH O”P~O - CH2- CH 2- N - CH 3
I |j
H2C — O ~ C” R
OH~CH
I
III
CH2- O~PO- ch2- ch2-n h2
0'
-acyl-lysofosfatidylcholin l-acyl-lysofosfatidyletanolamín
Spektrum přečištěného 1 -acyl-lysofosfatidylcholinu:
Ή NMR (600 MHz, Methanol-ri/u) δ 5,44 - 5,32 (m, 2H), 4,40 - 4,26 (m, 2H), 4,23 - 4,11 (m, 2H), 4,03 - 3,96 (m, 1H), 3,98 - 3,87 (m, 2H), 3,69 - 3,65 (m, 2H), 3,25 (s, 9H), 2,44 - 2,33 (m, 2H), 2,15 - 2,00 (m, 2H), 1,70 - 1,59 (m, 2H), 1,45 - 1,27 (m, 20H), 0,98 - 0,89 (m, 3H).
13C NMR (151 MHz, Mcthanol-í/4) δ 175,71 - 175,03 (m), 130,83 (d, J= 15,5 Hz), 129,07 (d, J= 9,9 Hz), 69,84 (d, J= 7,6 Hz), 67,85, 67,81, 67,49 (dd, J= 6,9, 3,4 Hz), 66,24,60,43 (d, J= 5,1 Hz), 54,69 (d, J= 7,6 Hz), 34,90, 33,05, 30,83, 30,81, 30,60, 30,43, 30,33, 30,31, 30,21, 30,20, 28,14 (d, J= 5,2 Hz), 26,00 (d, J= 5,3 Hz), 23,73, 14,45 .
Minoritní signály:
Ή NMR (600 MHz, Mcthanol-í/4) δ 5,05 - 4,98 (m), 4,07 - 4,02 (m), 3,80 (dd, J= 5,7, 4,5 Hz), 3,75 - 3,70 (m), 3,65 - 3,56 (m), 3,37 (d, J= 1,5 Hz), 3,13 (s), 2,91 - 2,83 (m), 2,82-2,78 (m),
-6CZ 308596 B6
2,44 (dd, J= 5,6, 3,9 Hz), 2,34 (t, J= 7,4 Hz), 2,20 - 2,14 (m), 2,13 - 2,08 (m), 1,75 - 1,68 (m), 1,00 (t, 7=7,6 Hz).
13C NMR (151 MHz, Methanol-X) δ 175,14, 175,09, 174,94, 131,19, 130,93, 130,85, 130,27, 130,01, 129,90, 129,45, 129,16 (d, J= 1,5 Hz), 128,89, 128,76, 79,20 (d, J= 6,1 Hz), 75,77 (d, J = 5,8 Hz), 74,69 (d, J= 8,1 Hz), 72,48 (d, J= 7,5 Hz), 66,34, 64,73 (d, J= 5,4 Hz), 64,55 (d, J = 5,0 Hz), 63,78, 63,46 (d, J= 4,5 Hz), 63,02 (d, J= 4,2 Hz), 35,10, 34,81, 34,31, 32,66, 30,75, 30,71, 30,47, 30,17, 30,13, 27,55, 26,59 - 26,50 (m), 26,02, 25,89, 23,62.
Příklad 6: Příprava 2-acyl-lysofosfatidylcholinu ’AC ..-/Μ'3
-- χ-' Ο ( R
ÓH
R” = směs acylů, majoritně oleoyl
Z fosfatidylcholinu izolovaného postupem podle příkladu 2 byl enzymaticky odstraněn zbytek mastné kyseliny v pozici sn-1. PC byl v 10% (w/v) koncentraci opakovaně vortexován a sonikován při 43 °C v 50mM Tris.HCl, pH 8,0, 50mM KC1, 8mM CaCL, dokud nebyl dokonale dispergován. Pak byl PC štěpen fosfolipázou AI v poměru 2 jednotky enzymu/mg fosfolipidů při 37 °C a průběh reakce sledován pomocí tenkovrstevné chromatografie na silikagelu (TLC), vyvíjené směsí chloroform:methanol:voda 20:10:1. Po úplném naštěpení byla přidána EDTA do koncentrace lOmM a směs krátkodobě uložena při 0 až 4 °C. Ή NMR analýza produktu indikovala 15 až 20% migraci acylu z polohy sn-1 za vzniku 1-acyl-lysofosfatidylcholinu jako minoritního vedlejšího produktu (viz příklad 5).
Spektrum 2-acyl-lysofosfatidylcholinu:
Ή NMR (500 MHz, Methanol-d4) δ 5,42 - 5,27 (m, 2H), 5,05 - 4,97 (m, 1H), 4,35 - 4,22 (m, 2H), 4,01 (p, 2H), 3,75 - 3,68 (m, 2H), 3,66 (dd, J = 5,5, 3,4 Hz, 2H), 3,24 (s, 9H), 2,83 (m, 1H), 2,37 (t, J = 8,6, 6,5 Hz, 2H), 2,10 - 1,99 (m, 2H), 1,63 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 1,41 - 1,24 (m, 18H), 0,92 (t, J = 6,9, 3,5 Hz, 2H).
13C NMR (126 MHz, Methanol-d4) δ 174,95, 130,83 (d, J = 12,1 Hz), 74,68 (d, J = 8,5 Hz), 64,73 (d, J = 5,5 Hz), 61,24, 60,42 (d, J = 5,3 Hz), 54,72, 54,69, 54,66, 35,09, 30,83, 30,60, 30,44, 30,33, 30,21, 28,13, 25,97, 23,73, 14,46.
Minoritní signály:
Ή NMR (500 MHz, Methanol-d4) δ 7,91 (s), 4,58 (s), 4,22 - 4,08 (m), 3,91 (q, J = 6,3, 5,6 Hz), 3,77 (d, J = 14,4 Hz), 3,36 (s), 3,09 (s), 2,94 - 2,73 (m), 2,24 - 2,09 (m), 1,71 (s), 1,19 (t, J = 7,0 Hz), 0,99 (t, J = 7,6 Hz), 13C NMR (126 MHz, Methanol-d4) δ 175,33, 131,20, 130,93, 130,25 (d, J = 4,6 Hz), 129,96 (d, J = 18,2 Hz), 129,46, 129,17, 128,83 (d, J = 16,1 Hz), 73,34 (d, J = 84,0 Hz), 70,87,69,82 (d, J = 7,7 Hz), 67,82 (d, J = 5,7 Hz), 67,48 (dt, J = 6,8, 3,2 Hz), 66,23, 64,73 (d, J = 5,5 Hz), 64,14, 61,53, 34,90, 33,06, 30,83, 30,78, 30,47, 30,44, 26.55.
Příklad 7: Příprava 1-acyl-specifických 1,2-diacylfosfolipidů
Z fosfatidylcholinu izolovaného postupem podle příkladu 2 byl enzymaticky odstraněn zbytek mastné kyseliny v pozici sn-1 podle příkladu 6, který byl následnou organickou esterifikační reakcí nahrazen acylovým zbytkem R' (viz tabulka níže).
-7 CZ 308596 B6
Výchozí 2-acyl-lysofosfatidylcholin z příkladu 6 (1 eq) byl rozpuštěn v suchém dichlormethanu (0,06 M), roztok byl ochlazen na 4 °C a byl pomalu přidán chlorid příslušné mastné kyseliny (hexanové, stearové, trimethylhexanové, cyklopentanpropionové) (3 eq). Reakční směs byla dále zahřívána na 10 °C a poté byl pomalu přikapán pyridin (5 eq) a katalytické množství DMAP (0,05 eq). Směs byla míchána přes noc při laboratorní teplotě. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (CHC13/MeOH/H2O v poměru 75/22,5/2,5). Reakce byla ukončena extrakcí reakční směsi mezi 50% vodný roztok NaCl a dichlormethan. Finální produkt byl získán sloupcovou chromatografií na silikagelu (20% (MeOH + 10% H2O) v chloroformu, + 1% za minutu). Výsledný produkt je kontaminován produktem acylace 1-acyl-lysofosfatidylcholinu (15 až 20%), který vzniká mechanismem transacylace jako vedlejší produkt dle příkladu 6.
Příklad 8: Příprava 1-hexanoyl-fosfatidylcholinu
R” = směs acylů, majoritně oleoyl
Postupem uvedeným v příkladu 7 byl připraven 1-hexanoyl-fosfatidylcholin ve výtěžku 43 %. MS: vypočteno: 619,4213 nalezeno: 619,4215
IR: 3373(m), 3004(w), 2925(s), 2855(m), 1737(s), 1490(sh), 1467(m), 1380(m), 1246(s), 105 l(m), 928(m), 726(w) cm1
Ή NMR (600 MHz, Methanol-d4) δ 5,44 - 5,32 (m, 2H), 5,32 - 5,24 (m, 1H), 4,46 (dd, J = 12,1, 3,1 Hz, 1H), 4,36 (dd, J = 6,5, 3,4 Hz, 2H), 4,21 (dd, J = 12,1, 7,0 Hz, 1H), 4,06 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 3,82 - 3,68 (m, 2H), 3,30 (s, 9H), 2,36 (dt, J = 15,1, 7,4 Hz, 4H), 2,16 - 1,97 (m, 4H), 1,64 (t, J = 7,4 Hz, 4H), 1,42 - 1,26 (m, 22H), 0,98 - 0,88 (m, 6H).
13C NMR (151 MHz, Methanol-d4) δ 174,93, 174,62, 130,81 (d, J = 27,4 Hz), 129,07 (d, J = 18,3 Hz), 71,81 (d), 67,55 - 67,22 (m), 65,03 (d, J = 4,5 Hz), 63,70, 60,70 (d, J = 4,9 Hz), 54,79, 54,76, 54,74, 34,96 (d, J = 33,0 Hz), 33,03, 32,39, 30,81, 30,72, 30,57, 30,45, 30,42, 30,33, 30,31, 30,29, 30,22, 30,21, 30,18, 30,16, 30,14, 28,12, 26,57, 26,54, 25,83 (d, J = 52,5 Hz), 23,55 (d, J = 47,9 Hz), 14,37 (d,J = 23,1 Hz).
Minoritní signály:
Ή NMR (600 MHz, Methanol-d4) δ 5,16 (d, J = 3,7 Hz), 4,63 - 4,57 (m), 4,52 (d, J = 7,8 Hz), 4,32 - 4,28 (m), 3,88 (dd, J = 11,9, 1,6 Hz), 3,83 - 3,79 (m), 3,71 (s), 2,92 - 2,83 (m), 2,80 (t, J = 6,7 Hz), 2,16 (t, J = 6,4 Hz), 1,76 - 1,70 (m), 1,48 - 1,44 (m), 1,11 - 0,98 (m).
13C NMR (151 MHz, Methanol-d4) δ 131,20, 130,93, 130,80, 130,37, 129,95 (d, J = 14,7 Hz), 129,47, 129,21, 128,80 (d, J = 18,3 Hz), 98,15, 93,89, 77,99, 76,25, 74,83, 73,75, 72,97, 64,07, 62,73 (d, J = 17,4 Hz), 60,99, 35,04, 34,88, 34,48, 32,65, 32,36, 30,81, 30,72, 30,57, 30,45, 30,42, 30,33, 30,31, 30,29, 30,22, 30,21, 30,18, 30,16, 30,14, 28,15, 27,50, 25,96, 25,69, 23,61, 14,37 (d, J = 23,1 Hz).
-8CZ 308596 B6
Příklad 9: Příprava 1-stearoyl-fosfatidylcholinu
R” = směs acylů, majoritně oleoyl
Postupem uvedeným v příkladu 7 byl připraven 1-stearoyl-fosfatidylcholin ve výtěžku 54 %.
MS: vypočteno: 810,5983 nalezeno: 810,5989 (M+Na+)
IR: 3408(m), 30012(w),2957(m), 2925(s), 2852(m), 1737(s), 1490(m), 1488(sh), 1467(m), 1378(m), 125l(s), 1063(m), 926(m), 721(m) cm1
Ή NMR (600 MHz, Mcthanol-í/4) δ 5,43 - 5,31 (m, 2H), 5,27 - 5,23 (m, 1H), 4,44 (dd, J= 12,1, 3,0 Hz, 1H), 4,29 (t, J= 4,6 Hz, 2H), 4,18 (dd, J= 12,0, 7,0 Hz, 1H), 4,01 (t, J= 6,0 Hz, 2H), 3,72 - 3,63 (m, 2H), 3,24 (s, 9H), 2,33 (dt, J= 16,4, 7,4 Hz, 4H), 2,11 - 1,96 (m, 4H), 1,65 - 1,55 (m, 4H), 1,42 - 1,17 (m, 24H), 0,97 - 0,81 (m, 6H).
13CNMR(151 MHz, Methanol-ri4) δ 175,01, 174,66, 130,84 (d, J= 25,4 Hz), 129,08 (d, J= 18,5 Hz), 71,83 (d, J= 8,1 Hz), 67,46 (dt, J= 7,1, 3,1 Hz), 64,90 (d, J= 5,2 Hz), 63,73, 60,53 (d, J = 5,0 Hz), 54,79,54,76, 54,74, 35,04 (d, J= 23,6 Hz), 33,06, 30,85, 30,83, 30,74, 30,64, 30,61, 30,46, 30,37, 30,35, 30,25, 30,21, 30,18, 28,50 - 27,96 (m), 26,03 (d, J= 3,3 Hz), 23,73, 14,46.
Minoritní signály:
Ή NMR (600 MHz, Methanol-ri4) δ 4,56 (s), 3,79 (s), 3,35 (s), 2,95 - 2,72 (m), 2,45 - 2,39 (m), 2,16 (s), 2,13 (t, 7=6,9 Hz), 1,76 - 1,67 (m), 1,06-0,95 (m), 13C NMR (151 MHz, Methanol-ri4) δ 174,97, 174,70, 136,28 (d, J= 3,0 Hz), 134,77 (d, J= 10,0 Hz), 131,53 (d, J= 12,6 Hz), 131,22, 129,97 (d, J = 5,1 Hz), 129,48, 129,31, 129,22, 128,88, 128,75, 108,23, 72,47, 64,12 (d, J= 5,0 Hz), 34,51, 32,67, 30,45, 27,53, 26,59 (d, J= 4,4 Hz), 25,93, 23,63, 14,48.
Příklad 10: Příprava 1-trimethylhexanoyl-fosfatidylcholinu
R” = směs acylů, majoritně oleoyl
Postupem uvedeným v příkladu 7 byl připraven 1 -trimethtylhexanoyl-fosfatidylcholin ve výtěžku
MS: vypočteno: 662,4755 nalezeno: 662,4758 (M+)
IR: 3404(m), 3009(w), 2957(m), 2927(s), 2855(m), 1739(s), 1478(s), 1467(m), 1394(m), 1365(m), 1247(s), 1054(m), 925(m), 723(m) cm1
Ή NMR (600 MHz, Methanol-d4) δ 5,46 - 5,32 (m, 2H), 5,31 - 5,20 (m, 2H), 4,58 (s, 1H), 4,46 (ddd, J = 22,6, 12,1, 3,2 Hz, 1H), 4,29 (tp, J = 5,5, 2,7 Hz, 2H), 4,19 (ddd, J = 21,8, 12,1, 6.9 Hz,
-9CZ 308596 B6
1H), 4.08 - 3.95 (m, 2H), 3.73 - 3.61 (m, 2H), 3.25 (s, 9H), 2.41 - 2.31 (m, 4H), 2.13 - 1.98 (m, 4H), 1.64 (dq, J = 12.3, 7.4 Hz, 2H), 1.49- 1.29 (m, 20H), 1.27 (d, J = 4.2 Hz, 2H), 1.15 (ddd, J = 14.0, 6.2, 1.9 Hz, 1H), 1.00 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.97 - 0.85 (m, 12H).
13CNMR(151 MHz, Methanol-d4) δ 174.58, 174.21, 130.84 (d, J = 23.7 Hz), 129.18 (d, J = 11.0 Hz), 71.84 (d, J = 8,0 Hz), 67,48 (dt, J = 6,8, 3,1 Hz), 65,14 - 64,30 (m), 63,70 (d, J = 2,3 Hz), 60,47 (d, J = 5,0 Hz), 55,06 - 54,34 (m), 51,64 (d, J = 3,0 Hz), 49,85, 44,63 (d, J = 1,5 Hz), 35,10, 33,06, 31,88, 30,83, 30,60, 30,45, 30,43, 30,34, 30,33, 30,22, 30,17, 28,16, 28,15, 26,56, 26,00 (d, J = 1,3 Hz), 23,74, 23,15, 23,12, 14,47.
Minoritní signály:
Ή NMR (600 MHz, Methanol-d4) δ 5,47 - 5,36 (m), 2,93 - 2,82 (m), 2,80 (t, J = 6,7 Hz), 2,22 2,11 (m), 1,72 (td, J = 7,3, 3,8 Hz), 1,16 (dd, J = 6,2, 1,9 Hz).
13C NMR (151 MHz, Methanol-d4) δ 131,22, 130,96, 130,84, 130,36, 129,99, 129,95, 129,93, 129,48, 129,14, 128,89, 128,77, 126,31, 34,51, 32,67, 30,73, 30,47, 30,24, 28,14, 26,60 (t, J = 0,9 Hz), 25,92, 23,72, 23,63, 21,49.
Příklad 11: Příprava 1 -cyklopentanpropionyl-fosfatidylcholinu
N
R” = směs acylů, majoritně oleoyl
Postupem uvedeným v příkladu 7 byl připraven 1 - cyklopentanpropionyl-fosfatidylcholin ve výtěžku 71%.
MS: vypočteno: 668,4262 nalezeno: 668,4267 (M+Na+)
IR: 3363(m), 3008(w), 2950(sh), 2927(s), 2856(m), 1734(s), 1487(m), 1465(m), 1553(m), 1377(m), 1245(s), 1068 (m), 926(m) cm1.
‘HNMR (500 MHz, Methanol-d4) δ 5,47 - 5,32 (m, 2H), 5,32 - 5,23 (m, 1H), 4,70 - 4,62 (m, 1H), 4,46 (dd, J = 12,0, 3,2 Hz, 1H), 4,31 (tq, J = 7,3, 2,6 Hz, 2H), 4,03 (t, J = 5,9 Hz, 2H), 3,72 - 3,64 (m, 2H), 3,26 (s, 9H), 2,36 (td, J = 7,6, 4,4 Hz, 4H), 2,18 - 2,04 (m, 4H), 1,81 (pd, J = 6,7, 4,5, 3,8 Hz, 1H), 1,64 (q, J = 5,8, 4,1 Hz, 4H), 1,56 (dp, J = 7,1, 3,2 Hz, 4H), 1,45 - 1,28 (m, 20H), 1,22 1,07 (m, 4H), 0,93 (td, J = 6,9, 3,4 Hz, 3H).
13C NMR (126 MHz, Methanol-d4) δ 130,82 (d, J = 20,1 Hz), 129,35 (d, J = 7,6 Hz), 77,92, 76,62, 75,61, 74,56, 74,38, 71,76, 69,56, 64,89 (d, J = 5,2 Hz), 63,71, 61,86 - 60,10 (m), 57,72 - 53,49 (m), 35,08, 34,26, 33,43, 33,05, 32,24, 30,83, 30,59, 30,44, 30,34, 30,22, 30,16, 28,17, 26,10, 26,02, 23,73, 14.48.
Minoritní signály:
Ή NMR (500 MHz, Methanol-d4) δ 4,94 (dd, J = 6,2, 2,8 Hz, 1H), 4,79 (d, J = 11,4 Hz, 1H), 4,60 - 4,52 (m, 4H), 4,26 - 4,15 (m, 3H), 3,87 - 3,80 (m, 2H), 3,75 (dd, J = 10,8, 2,9 Hz, 1H), 2,93 2,74 (m, 3H).
13C NMR (126 MHz, Methanol-d4) δ 139,75, 139,66, 139,39, 128,97 (d, J = 3,6 Hz), 128,86 128,58 (m), 101,07, 40,87, 34,48, 32,66, 30,73, 30,46, 26,58, 23,62.
-10CZ 308596 B6
Příklad 12: Příprava 1-palmitoyl-fosfatidylcholinu , i + +
R” = směs acylů, majoritně oleoyl
Postupem uvedeným v příkladu 7 byl připraven 1-palmitoyl-fosfatidylcholin ve výtěžku 15 %.
MS: calculated: 760,5851 found: 760,5855 (M+).
IR: 3403(m), 3007(w), 2956(m), 2923(s), 2853(m), 1738(s), 1478(sh), 1467(m), 1379(m), 125 l(s), 1068(m), 926(m), 721(m) cm1
Ή NMR (600 MHz, Methanol-d4) δ 5,38 (td, J = 4,9, 4,1, 1,2 Hz, 2H), 5,28 (dtd, J = 6,9, 5,4, 3,1 Hz, 1H), 4,47 (dd, J = 12,0, 3,2 Hz, 1H), 4,35 - 4,27 (m, 2H), 4,21 (dd, J = 12,0, 6,9 Hz, 1H), 4,03 (ddd, J = 6,7, 5,3, 1,3 Hz, 2H), 3,75 - 3,58 (m, 2H), 3,26 (s, 9H), 2,36 (dt, J = 16,0, 7,4 Hz, 4H), 2,15 - 2,00 (m. 4H), 1,64 (pd, J = 9,1, 8,0, 4,1 Hz, 4H), 1,46 - 1,24 (m, 44H), 0,93 (td, J = 7,1, 1,4 Hz, 6H).
13C NMR (151 MHz, Methanol-d4) δ 174,90, 174,56, 130,84 (d, J = 24,7 Hz), 71,81 (d, J = 8,1 Hz), 67,49 (t, J = 6,7 Hz), 64,90, 64,87, 63,69, 60,47 (d, J = 5,0 Hz), 55,70 - 53,83 (m), 30,87, 30,82, 30,79, 30,67, 30,47, 30,38 (d, J = 1,4 Hz), 30,27, 30,24, 30,20, 28,18, 26,05, 26,03, 23,75, 14,46.
1-acyl-specifické 1,2-diacylfosfolipidy uvedené v příkladech 8 až 12 byly opracovány fosfolipázou A2 a purifikovány, jak uvedeno v příkladu 4. Tak byly připraveny následující látky:
Preparáty byly označeny tak, jak je uvedeno v tabulce:
| R | Označení preparátu |
| hexanoyl | sn-1 hexanoyl PC/E-DAPL+FA |
| stearoyl | sn-1 stearoyl PC/E-DAPL+FA |
| trimethylhexanoyl | sn-1 trimethylhexanoyl PC/E-DAPL+FA |
| cyklopentanpropionyl | sn-1 cyklopentanpropionyl PC/E-DAPL+FA |
| palmitoyl | sn-1 palmitoyl PC/E-DAPL+FA |
Preparáty obsahovaly uvolněné mastné kyseliny (+FA) a majoritně lysofosfolipidy následujících struktur:
sn-1 hexanoyl PC/E-DAPL sn-1 cyklopentanpropionyl
PC/E-DAPL sn-1 trimethylhexanoyl
PC/E-DAPL
-11 CZ 308596 B6
Příklad 13: Příprava N-acyl derivátů 1,2-diacyl-fosfatidylethanolaminu
Ve fosfatidylethanolaminu izolovaném postupem podle příkladu 2 byl esterifikační reakcí nahrazen vodík aminové skupiny acylovým zbytkem R2 (viz tabulka níže).
Fosfatidylethanolamin izolovaný z přírodního zdroje postupem podle příkladu 2 nese v poloze sn1 směs zbytků mastných kyselin, cca z 80 % zbytky kyseliny palmitové, zbytek tvoří zbytky kyseliny stearové, olejové, v malém množství zbytky dalších mastných kyselin.
Purifikovaný fosfatidylethanolamin byl rozpuštěn v bezvodém benzenu a smíchán v přítomnosti DMAP s dvěma ekvivalenty anhydridu kyseliny (palmitové, děkanové, olejové, linolejové nebo elaidové). Anhydridy byly připraveny kondenzací uvedených kyselin v přítomnosti DCC. Nacylace probíhala 30 min při laboratorní teplotě. Reakční směs byla usušena, rozpuštěna v hexanu, nerozpustný podíl odstraněn centrifůgací a N-acyl fosfatidylethanolaminy byly izolovány srážením 2 objemy acetonu při 4 °C přes noc. Sraženina byla 3x promyta ledovou směsí hexan:aceton 1:2 při 0 °C.
| R2 | Označení preparátu |
| palmitoyl | N-palmitoyl PE |
| dekanoyl | N-dekanoyl PE |
| oleoyl | N-oleoyl PE |
| linoleoyl | N-linoleoyl PE |
| elaidoyl | N-elaidoyl PE |
-12 CZ 308596 B6
Příklad 14: Příprava N-palmitoyl-fosfatidylethanolaminu
UN
R
R' = směs acylů, majoritně palmitoyl R” = směs acylů, majoritně oleoyl
Postupem uvedeným v příkladu 13 byl připraven N-palmitoyl-fosfatidylethanolamin.
Ή NMR (600 MHz, Methanol-d4) δ 5,50 - 5,32 (m, 2H), 5,27 (quintet, J = 5,5 Hz, 1H), 4,46 (dd, J = 12,0, 3,1 Hz, 1H), 4,20 (dd, J = 12,1, 6,9 Hz, 1H), 4,12 (ddd, J = 9,5, 6,2, 3,5 Hz, 2H), 4,08 4,01 (m, 2H), 3,26 - 3,21 (m, 2H), 2,40 - 2,37 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 2,34 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 2,28 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,13 - 2,00 (m, 4H), 1,62 (m, 6H), 1,31 (m, 82H), 0,92 (t, J = 6,9 Hz, 9H).
Signály ostatních derivátů mastných kyselin: 5,50 - 5,32 (m, 2H), 2,90 - 2,77 (m, 3H).
13C NMR (151 MHz, Methanol-d4) δ 173,48, 173,14, 172,95, 129,51, 129,31,70,36, 63,51,61,51, 60,86, 40,24, 33,53, 31,67, 29,5-28,8 (mnohočetné signály), 24,85, 24,63, 22,33, 13,03.
Příklad 15: Příprava N-dekanoyl-fosfatidylethanolaminu
R' = směs acylů, majoritně palmitoyl R” = směs acylů, majoritně oleoyl
Postupem uvedeným v příkladu 13 byl připraven N-dekanoyl-fosfatidylethanolamin.
Příklad 16: Příprava N-oleoyl-fosfatidylethanolaminu
R' = směs acylů, majoritně palmitoyl R” = směs acylů, majoritně oleoyl
Postupem uvedeným v příkladu 13 byl připraven N-oleoyl-fosfatidylethanolamin.
-13 CZ 308596 B6
Příklad 17: Příprava N-linoleoyl-fosfatidylethanolaminu
O /
R' = směs acylů, majoritně palmitoyl R” = směs acylů, majoritně oleoyl
Postupem uvedeným v příkladu 13 byl připraven N-linoleoyl-fosfatidylethanolamin.
Příklad 18: PřípravaN-elaidoyl-fosfatidylethanolaminu
S. \......
tí X '—\
Ós
R·'
R' = směs acylů, majoritně palmitoyl R” = směs acylů, majoritně oleoyl
Postupem uvedeným v příkladu 13 byl připraven N-elaidoyl-fosfatidylethanolamin.
Příklad 19: Příprava 1-acyl-lysofosfolipidů odvozených od N-palmitoyl PE, N-dekanoyl PE, Noleoyl PE, N-linoleoyl PE a N-elaidoyl PE ve směsi s odštěpenými mastnými kyselinami
N-acyl fosfolipid byl v 10% (w/v) koncentraci opakovaně vortexován a sonikován při 43 °C v 50mM Tris.HCl (pH 8,0, 50mM KC1, 8mM CaCL), dokud nebyl fosfolipid dokonale dispergován a pak byl zpracován, jak uvedeno v příkladu 4 - byl štěpen fosfolipázou A2 v poměru 2 jednotky enzymu/mg fosfolipidu při 43 °C a průběh reakce sledován pomocí tenkovrstevné chromatografie na silikagelu (TLC), vyvíjené směsí chloroform methanol: voda 20:10:1. Po úplném naštěpení byla reakce zastavena přidáním EDTA do koncentrace lOmM a krátkodobě uložena při 0 až 4 °C.
Preparáty byly označeny tak, jak je uvedeno v tabulce:
| R2 | Označení preparátu |
| palmitoyl | N-palmitoyl PE/E-DAPL+FA |
| dekanoyl | N-dekanoyl PE/E-DAPL+FA |
| oleoyl | N-oleoyl PE/E-DAPL+FA |
| linoleoyl | N-linoleoyl PE/E-DAPL+FA |
| elaidoyl | N-elaidoyl PE/E-DAPL+FA |
Příklad 20: Odstranění odštěpených volných mastných kyselin (FA) z preparátů (směsí)
Preparáty 1-acyl-lysofosfolipidů, připravených podle předkládaných příkladů enzymatickou deacylací v poloze sn-2 za vzniku směsi s mastnými kyselinami (tj. PE/E-DAPL+FA, PC/EDAPL+FA a E-DAPL+FA, sn-1 hexanoyl PC/E-DAPL+FA, sn-1 stearoyl PC/E-DAPL+FA, sn-1 trimethylhexanoyl PC/E-DAPL+FA, sn-1 cyklopentanpropionyl PC/E-DAPL+FA, N-palmitoyl PE/E-DAPL+FA, N-dekanoyl PE/E-DAPL+FA, N-oleoyl PE/E-DAPL+FA, N-linoleoyl PE/EDAPL+FA, N-elaidoyl PE/E-DAPL+FA), byly rozpuštěny v ethanolu a pak byly postupně přidány
-14CZ 308596 B6 voda a chloroform tak, aby bylo dosaženo poměru ethanol:voda:chloroform 3:2:4. Směs byla intensivně třepána 10 min, centrifugována 5 min 3000xg při laboratorní teplotě a chloroformová fáze byla isolována a odpařena. Odparek byl promýván n-hexanem při 0 až 4 °C. Nerozpustné lysofosfolipidy byly získány centrifůgací a sediment ještě 3x promyt směsí «-hexan:aceton 1:2 (4 °C) a usušen. Usušené preparáty již prakticky neobsahovaly volné mastné kyseliny a byly označeny PE/E-DAPU, PC/E-DAPL, E-DAPL, sn-1 hexanoyl PC/E-DAPL, sn-1 stearoyl PC/EDAPL, sn-1 trimethylhexanoyl PC/E-DAPL, sn-1 cyklopentanpropionyl PC/E-DAPL, Npalmitoyl PE/E-DAPL, N-dekanoyl PE/E-DAPL, N-oleoyl PE/E-DAPL, N-linoleoyl PE/E-DAPL aN-elaidoyl PE/E-DAPL.
\ / + N—
sn-1 hexanoyl PC/EDAPL
sn-ltrimethylhexanoyl PC/EDAPL
sn-1 cyklopentanpropionyl
PC/E-DAPL
N-palmitoyl PE/E-DAPL R' = směs acylů, majoritně palmitoyl hn“4
N-dekanoyl PE/E-DAPL R'= směs acylů, majoritně palmitoyl
N-oleoyl PE/E-DAPL R' = směs acylů, majoritně palmitoyl
N-linoleoyl PE/E-DAPL R' = směs acylů, majoritně palmitoyl
N-elaidoyl PE/E-DAPL R' = směs acylů, majoritně palmitoyl
N-palmitoyl PE/E-DAPL & A
R' = směs acylů, majoritně palmitoyl
Ή NMR (600 MHz, Methanol-4) δ 4,19 (dd, J = 11,4, 4,3 Hz, 1H), 4,13 (dd, J = 11,3, 6,2 Hz, 1H), 4,08 (ddd, J = 9,5, 6,2, 3,5 Hz, 2H), 4,02 - 3,97 (m, 1H), 3,95 - 3,88 (m, 2H), 3,19 - 3,15 (m, 2H), 2,37 (t, J = 7,5 Hz, 4H), 2,37- 2,15 (m, 2H), 1,63 (q, J = 7,3 Hz, 4H), 1,31 (s, 52H), 0,92 (t, J = 7,0 Hz, 2H).
-15 CZ 308596 B6 13C NMR (151 MHz, Methanol-d4) δ 174,13, 173,95, 2 x 130,05, 68,39, 66,41, 64,87, 61,62, 40,28, 33,50, 31,66, 29,62-28,69 (mnohočetné signály), 24,60, 22,32, 12,96.
Příklad 21: Stanovení vlivu jednotlivých připravených látek a směsí na růst nádorových buněk v tkáňové kultuře.
Tento příklad ukazuje stanovení vlivu připravených látek a směsí, tj. PE/ E-DAPL+FA, PC/ EDAPL+FA a E-DAPL+FA, sn-1 hexanoyl PC/E-DAPL+FA, sn-1 stearoyl PC/E-DAPL+FA, sn-1 trimethylhexanoyl PC/E-DAPL+FA, sn-1 cyklopentanpropionyl PC/E-DAPL+FA, N-palmitoyl PE/E-DAPL+FA, N-dekanoyl PE/E-DAPL+FA, N-oleoyl PE/E-DAPL+FA, N-linoleoyl PE/EDAPL+FA, N-elaidoyl PE/E-DAPL+FA a PE/ E-DAPL, PC/ E-DAPL, E-DAPL, sn-1 hexanoyl PC/E-DAPL, sn-1 stearoyl PC/E-DAPL, sn-1 trimethylhexanoyl PC/E-DAPL, sn-1 cyklopentanpropionyl PC/E-DAPL, N-palmitoyl PE/E-DAPL, N-dekanoyl PE/E-DAPL, N-oleoyl PE/E-DAPL, N-linoleoyl PE/E-DAPL a N-elaidoyl PE/E-DAPL, na růst nádorových buněk v tkáňové kultuře. Jako kontrola byly použity výchozí fosfolipidy, buď PE, PC, sn-1 stearoyl PC, N-palmitoyl PE nebo výchozí směs fosfolipidů, za zcela stejných koncentrací a podmínek.
Cytotoxická aktivita preparátů byla testována v kulturách nádorových buněk C32 (lidský melanom), TIB-75 (indukují myší hepatokarcinom), LMH (kuřecí hepatokarcinom).
A) Buňky C32 byly kultivovány v médiu D-MEM, obsahujícím 10% fetálního séra a penicilin+streptomycin, při 37 °C v atmosféře vzduch/5% CO2, nasycené vodní parou. Každá jamka obsahovala 5x 104 buněk a 0,5 ml média. Testované preparáty byly přidávány k buňkám v koncentracích 0, 2,5, 5, 10, 20 40, 80, 160 a 240 μΜ. Po 16 hodinách kultivace byl stav buněk zaznamenán.
B) Buňky LMH byly kultivovány v médiu D-MEM, obsahujícím 10% fetálního séra a penicilin+streptomycin, při 37 °C v atmosféře vzduch/5% CO2, nasycené vodní parou. Každá jamka obsahovala 5xl04 buněk a 0,5 ml média. Testované fosfolipidy byly přidávány k buňkám v koncentracích 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 a 240 μΜ. Po 16 hodinách kultivace byl stav buněk zaznamenán.
C) Buňky TIB-75 byly kultivovány v médiu D-MEM, obsahujícím 10% fetálního séra a penicilin+streptomycin, při 37 °C v atmosféře vzduch/5% CO2, nasycené vodní parou. Každá jamka obsahovala 5x 104 buněk a 0,5 ml média. Testované fosfolipidy byly přidávány k buňkám v koncentracích 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 a 240 μΜ. Po 16 hodinách kultivace byl stav buněk zaznamenán.
Přítomnost volných mastných kyselin neměla významný vliv na toxicitu preparátů vůči testovaným buňkám.
Kontrolní PE, PC, sn-1 stearoyl PC, N-palmitoyl PE nebo výchozí směs fosfolipidů za zcela stejných koncentrací neovlivnily fenotyp ani nesnížily rychlost růstu buněk. Pro srovnání byly otestovány 2-acyl-lysofosfolipidy připravené z PC, PE a celkových fosfolipidů, tyto látky jsou mírně cytotoxické, jsou zapotřebí asi 4 až 5x vyšší jejich koncentrace, aby se toxicitou vyrovnaly PE/E-DAPL, PC/E-DAPL, E-DAPL a sn-1 stearoyl PC/E-DAPL.
Cytotoxicita preparátů byla kvantifikována pomocí stanovení obsahu ATP v buňkách a pomocí příjmu neutrální červeně a bylo stanoveno IC50atp a IC50nr [μΜ]. Obě metody poskytly prakticky stejné hodnoty. Tabulka ukazuje IC50atp.
| C32 IC50atp[pM] | LMH IC50atp[pM] | TIB-75 IC50atp[pM] | |
| sn-1 stearoyl PC/E-DAPL | 45 | 40 | 45 |
| sn-1 hexanoyl PC/E-DAPL | 130 | 135 | 135 |
-16 CZ 308596 B6
| sn-1 cyklopentanpropionyl PC/E-DAPL | 150 | 130 | |
| sn-1 trimethylhexanoyl PC/E-DAPL | 130 | 140 | |
| PC/E-DAPL | 50 | 35 | 45 |
| PE/E-DAPL | 35 | 30 | 35 |
| N-palmitoyl PE/E-DAPL | 150 | 140 | 140 |
| N-dekanoyl PE/E-DAPL | 180 | ||
| N-oleoyl PE/E-DAPL | 180 | ||
| N-linoleoyl PE/E-DAPL | 180 | ||
| 2-acyl PC (15-20% 1-acyl PC) | 200 | 210 | |
| 2-acyl PE(15-20% 1-acyl PE) | 200 | 200 |
Příklad 22: Působení (E-DAPL+FA) na rozvoj experimentálních jatemích nádorů kuřat
1-acyl-lysofosfatidyl deriváty E-DAPL+FA byly 5x týdně v potravě podávány kuřatům v množství 40 mg/20 g váhy kuřete, u nichž byly předem, ještě v embryonálním stadiu, indukovány hepatokarcinomy pomocí injekce LMH hepatokarcinomových buněk. Pokus byl vyhodnocen 25. den od vylíhnutí kuřat.
| Kuřata | Počet kuřat na začátku pokusu | Počet kuřat přežívajících 25. den |
| infikovaná, neléčená | 8 | 1 (mnohačetné velké jatemí nádory) |
| infikovaná, léčená E-DAPL+FA | 8 | 4 (3 bez nádorů, 1 kuře 2 malé jatemí nádory) |
Příklad 23: Působení E-DAPL na rozvoj experimentálních podkožních nádorů myší
Podkožní nádory byly vyvolány u 16 myší BALB/c (ve věku 8 až 10 týdnů) injekcí syngenních buněk TIB-75. Skupině 8 myší bylo potom Ix týdně aplikováno 8 mg E-DAPL v 0,1 ml fyziologického roztoku a skupině 8 myší Ix týdně 8 mg kontrolních fosfolipidů (PLs) vždy do oblasti rozvíjejícího se nádoru. Po 7 týdnech byly nádory vypitvány, změřen jejich průměr ve třech na sebe zhruba kolmých směrech a z průměrných hodnot vypočteny objemy koulí. Průměrný objem takto aproximovaných nádorů byl u myší léčených E-DAPL 30 % objemu nádorů u myší léčených kontrolními PLs.
Příklad 24: Působení E-DAPL na rozvoj experimentálních intraperitoneálních nádorů myší
Intraperitoneální nádory byly vyvolány u 20 myší BALB/c (ve věku 8 až 10 týdnů) injekcí syngenních buněk TIB-75. Kontrolní skupina 10 myší byla potom krmena po dobu osmi týdnů nízkotučnou experimentální potravou (Altromin) a druhá skupina toutéž dietou obsahující 8 mg EDAPL v každých 5 g krmivá. Myši dostávaly experimentální potravu vždy 4 dny v týdnu; zbylé 3 dny dostávaly standardní potravu. Do 6 týdnů od zahájení pokusu 2 kontrolní myši zahynuly na TIB-75 nádory. Poté byly 2 stejné skupinky kontrolních a léčených myší vypitvány. Průměrná hmotnost nádorů u léčených myší byla 75 % hmotnosti kontrolních nádorů. Po dalších 2 týdnech byly analyzovány zbývající myši. Průměrná hmotnost nádorů u léčených myší byla nyní 40 % hmotnosti kontrolních nádorů. Pokus ukazuje, že E-DAPL podávaný v potravě zpomaluje i růst experimentálních intraperitoneálních nádorů.
Claims (8)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. 1-acyl-lysofosfatidyl deriváty obecného vzorce IO h2c-o-c-rOH“CHI O , . píCH-,-Ο-Ρ-Ο“CH,-~CH2~N™ R2L XR3O (I) kdeRje C4 až C30 alifatický uhlovodíkový řetězec nebo C5 až CIO cyklický či cyklus obsahující alkyl nebo alkenyl,R1 je vybrán z H nebo Cl až CIO alkylu,R2 je vybrán z H, CIO až C30 acylu nebo Cl až CIO alkylu,R3 je vybrán z H nebo Cl až CIO alkylu, nebo R3 není přítomen, pro použití pro léčení melanomu nebo hepatokarcinomu.
- 2. 1-acyl-lysofosfatidyl deriváty pro použití podle nároku 1, kdeR1 je vybrán z Cl až C6 alkylu, a/neboR2 je vybrán z Cl až C6 alkylu, a/neboR3 je vybrán z Cl až C6 alkylu.
- 3. 1-acyl-lysofosfatidyl deriváty pro použití podle nároku 1 nebo 2, kde Rje vybrán ze skupiny zahrnující C5 až CIO lineární, rozvětvený nebo cyklický či cyklus obsahující alkyl nebo alkenyl;s výhodou je R vybrán ze skupiny zahrnující pentyl, 3,5,5-trimethylpentyl, cyklopentylethyl.
- 4. 1-acyl-lysofosfatidyl deriváty pro použití podle nároku 1 nebo 2, kde Rje vybrán ze skupiny zahrnující C13 až C20 lineární nebo rozvětvený alkyl nebo alkenyl, s výhodou ze skupiny zahrnující C15,C16, Cl7, C18 nebo C19 lineární alkyl nebo alkenyl.
- 5. 1-acyl-lysofosfatidyl deriváty pro použití podle nároku 1, kde R2 je vybrán ze skupiny zahrnující C10-C20 acyly obsahující lineární nasycené nebo nenasycené řetězce, s výhodou ze skupiny zahrnující dekanoyl, palmitoyl, stearoyl, oleoyl, linoleoyl, elaidoyl.
- 6. 1-acyl-lysofosfatidyl deriváty pro použití podle nároku 1 nebo 2, kde je alespoň jeden z Rl, R2, R3 methyl, s výhodou jsou Rl, R2 i R3 methyly.
- 7. 1-acyl-lysofosfatidyl deriváty pro použití podle nároku 1, kde jsou Rl a R2 vodík, a R3 není přítomen.-18 CZ 308596 B6
- 8. 1-acyl-lysofosfatidyl deriváty pro použití podle nároku 1, kde R1 je H a R2 je C10-C20 acyl obsahující lineární nasycené nebo nenasycené řetězce.
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2017-190A CZ308596B6 (cs) | 2017-04-03 | 2017-04-03 | Deriváty fosfolipidů a jejich použití jako léčiva |
| ES18719029T ES2877647T3 (es) | 2017-04-03 | 2018-03-29 | Derivados de fosfolípidos y su uso como medicamentos |
| PCT/CZ2018/050015 WO2018184604A1 (en) | 2017-04-03 | 2018-03-29 | Phospholipid derivatives and their use as medicaments |
| US16/500,552 US11414443B2 (en) | 2017-04-03 | 2018-03-29 | Phospholipid derivatives and their use as medicaments |
| CA3058792A CA3058792C (en) | 2017-04-03 | 2018-03-29 | Phospholipid derivatives and their use as medicaments |
| DK18719029.3T DK3606534T3 (da) | 2017-04-03 | 2018-03-29 | Phospholipidderivater og deres anvendelse som medikamenter |
| PT187190293T PT3606534T (pt) | 2017-04-03 | 2018-03-29 | Derivados de fosfolípidos e sua utilização como medicamentos |
| EP18719029.3A EP3606534B1 (en) | 2017-04-03 | 2018-03-29 | Phospholipid derivatives and their use as medicaments |
| CN201880021144.1A CN110494143B (zh) | 2017-04-03 | 2018-03-29 | 磷脂衍生物和它们作为药物的用途 |
| HUE18719029A HUE055171T2 (hu) | 2017-04-03 | 2018-03-29 | Foszfolipid származékok és azok gyógyszerként történõ alkalmazása |
| PL18719029T PL3606534T3 (pl) | 2017-04-03 | 2018-03-29 | Pochodne fosfolipidów i ich zastosowanie jako leki |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2017-190A CZ308596B6 (cs) | 2017-04-03 | 2017-04-03 | Deriváty fosfolipidů a jejich použití jako léčiva |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2017190A3 CZ2017190A3 (cs) | 2018-10-10 |
| CZ308596B6 true CZ308596B6 (cs) | 2020-12-23 |
Family
ID=73838693
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2017-190A CZ308596B6 (cs) | 2017-04-03 | 2017-04-03 | Deriváty fosfolipidů a jejich použití jako léčiva |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11414443B2 (cs) |
| EP (1) | EP3606534B1 (cs) |
| CN (1) | CN110494143B (cs) |
| CA (1) | CA3058792C (cs) |
| CZ (1) | CZ308596B6 (cs) |
| DK (1) | DK3606534T3 (cs) |
| ES (1) | ES2877647T3 (cs) |
| HU (1) | HUE055171T2 (cs) |
| PL (1) | PL3606534T3 (cs) |
| PT (1) | PT3606534T (cs) |
| WO (1) | WO2018184604A1 (cs) |
Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3577446A (en) * | 1968-09-09 | 1971-05-04 | American Home Prod | Phosphatidylalkanolamine derivatives |
| DE2642661A1 (de) * | 1976-09-22 | 1978-03-23 | Nattermann A & Cie | Verfahren zur herstellung von alkyl- und acylphospholipiden |
| US4372949A (en) * | 1979-03-05 | 1983-02-08 | Toyama Chemical Co., Ltd. | Treatment of cancer with carcinostatic and immunostimulating agent containing lysophospholipid and phospholipid |
| EP0161519A2 (de) * | 1984-05-15 | 1985-11-21 | Chemie Linz Aktiengesellschaft | Derivate des Glycerophosphocholins und Glycerophosphoethanolamins, ihre Herstellung und Verwendung |
| EP0316117A1 (en) * | 1987-11-06 | 1989-05-17 | Scienscope International N.V. | Antiviral compounds, compositions containing such compounds and methods of treatment |
| WO1990009385A1 (en) * | 1989-02-17 | 1990-08-23 | The Liposome Company, Inc. | Lipid excipient for nasal delivery and topical application |
| CZ282139B6 (cs) * | 1995-04-03 | 1997-05-14 | Jindřich Rndr. Drsc. Kára | Způsob výroby přípravku s dieteticko-preventivním a léčebným účinkem na bázi vaječných l-O-alkyl-2-acyl-fosfatidylethanolaminů |
| WO2001058910A2 (en) * | 2000-02-10 | 2001-08-16 | Liplasome Pharma A/S | Lipid-based drug delivery systems |
| WO2002090560A2 (en) * | 2001-05-03 | 2002-11-14 | Enzymotec Ltd. | Process for the production of phospholipids |
| WO2003020941A1 (de) * | 2001-08-28 | 2003-03-13 | Degussa Food Ingredients Gmbh | Verfahren zur herstellung von phospholipiden |
| WO2004000854A1 (en) * | 2002-06-20 | 2003-12-31 | Ic Vec Limited | Sulfur-containing phospholipid derivatives |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5149527A (en) * | 1990-09-18 | 1992-09-22 | Oncotech, Inc. | Immunopotentiating protocol for chemotherapy-responsive tumors |
| WO2007056264A2 (en) * | 2005-11-08 | 2007-05-18 | Transave, Inc. | Methods of treating cancer with high potency lipid-based platinum compound formulations administered intraperitoneally |
| GB201509934D0 (en) * | 2015-06-08 | 2015-07-22 | King S College London | Nanoparticles |
| CN105878260A (zh) * | 2016-04-29 | 2016-08-24 | 陈西敬 | 一种抗坏血酸棕榈酸酯和阿霉素的组合物脂质体 |
-
2017
- 2017-04-03 CZ CZ2017-190A patent/CZ308596B6/cs unknown
-
2018
- 2018-03-29 PL PL18719029T patent/PL3606534T3/pl unknown
- 2018-03-29 ES ES18719029T patent/ES2877647T3/es active Active
- 2018-03-29 WO PCT/CZ2018/050015 patent/WO2018184604A1/en unknown
- 2018-03-29 CA CA3058792A patent/CA3058792C/en active Active
- 2018-03-29 CN CN201880021144.1A patent/CN110494143B/zh active Active
- 2018-03-29 HU HUE18719029A patent/HUE055171T2/hu unknown
- 2018-03-29 PT PT187190293T patent/PT3606534T/pt unknown
- 2018-03-29 EP EP18719029.3A patent/EP3606534B1/en active Active
- 2018-03-29 US US16/500,552 patent/US11414443B2/en active Active
- 2018-03-29 DK DK18719029.3T patent/DK3606534T3/da active
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3577446A (en) * | 1968-09-09 | 1971-05-04 | American Home Prod | Phosphatidylalkanolamine derivatives |
| DE2642661A1 (de) * | 1976-09-22 | 1978-03-23 | Nattermann A & Cie | Verfahren zur herstellung von alkyl- und acylphospholipiden |
| US4372949A (en) * | 1979-03-05 | 1983-02-08 | Toyama Chemical Co., Ltd. | Treatment of cancer with carcinostatic and immunostimulating agent containing lysophospholipid and phospholipid |
| EP0161519A2 (de) * | 1984-05-15 | 1985-11-21 | Chemie Linz Aktiengesellschaft | Derivate des Glycerophosphocholins und Glycerophosphoethanolamins, ihre Herstellung und Verwendung |
| EP0316117A1 (en) * | 1987-11-06 | 1989-05-17 | Scienscope International N.V. | Antiviral compounds, compositions containing such compounds and methods of treatment |
| WO1990009385A1 (en) * | 1989-02-17 | 1990-08-23 | The Liposome Company, Inc. | Lipid excipient for nasal delivery and topical application |
| CZ282139B6 (cs) * | 1995-04-03 | 1997-05-14 | Jindřich Rndr. Drsc. Kára | Způsob výroby přípravku s dieteticko-preventivním a léčebným účinkem na bázi vaječných l-O-alkyl-2-acyl-fosfatidylethanolaminů |
| WO2001058910A2 (en) * | 2000-02-10 | 2001-08-16 | Liplasome Pharma A/S | Lipid-based drug delivery systems |
| WO2002090560A2 (en) * | 2001-05-03 | 2002-11-14 | Enzymotec Ltd. | Process for the production of phospholipids |
| WO2003020941A1 (de) * | 2001-08-28 | 2003-03-13 | Degussa Food Ingredients Gmbh | Verfahren zur herstellung von phospholipiden |
| WO2004000854A1 (en) * | 2002-06-20 | 2003-12-31 | Ic Vec Limited | Sulfur-containing phospholipid derivatives |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| NIEZGODA N. ET AL., "Phosphatidylcholine with cis-9,trans-11 and trans-10,cis-12 conjugated linoleic acid isomers: Synthesis and cytotoxic studies", AUST. J. CHEM., (2015), vol. 68, pp. 1065 - 1075, ISSN: 0004-9425 * |
| SOWIŃSKA, Agata, et al. "The chemical synthesis and preliminary biological studies of phosphodiester and phosphorothioate analogues of 2-methoxylysophosphatidyl-ethanolamine". Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2016, 26.15; pp. 3725-3729; ISSN: 0960-894X. E-ISSN: 1464-3405 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK3606534T3 (da) | 2021-07-12 |
| US11414443B2 (en) | 2022-08-16 |
| CZ2017190A3 (cs) | 2018-10-10 |
| WO2018184604A1 (en) | 2018-10-11 |
| ES2877647T3 (es) | 2021-11-17 |
| CA3058792C (en) | 2022-08-16 |
| EP3606534B1 (en) | 2021-05-12 |
| US20200102333A1 (en) | 2020-04-02 |
| CN110494143B (zh) | 2022-12-20 |
| PL3606534T3 (pl) | 2021-12-13 |
| EP3606534A1 (en) | 2020-02-12 |
| PT3606534T (pt) | 2021-07-16 |
| CA3058792A1 (en) | 2018-10-11 |
| HUE055171T2 (hu) | 2021-11-29 |
| CN110494143A (zh) | 2019-11-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Van Deenen et al. | The synthesis of phosphoglycerides and some biochemical applications | |
| Van Hoogevest et al. | The use of natural and synthetic phospholipids as pharmaceutical excipients | |
| JP5430566B2 (ja) | 高純度リン脂質の製造方法およびその方法で得られた高純度のスフィンゴミエリンとプラズマローゲン型グリセロリン脂質 | |
| JP4163007B2 (ja) | カルバ環状ホスファチジン酸誘導体を含む癌転移抑制剤 | |
| WO2016130417A1 (en) | Omega-3 fatty acid prodrug compounds and uses thereof | |
| JPWO2016181491A1 (ja) | エーテルリン脂質の製造方法 | |
| KR20190022796A (ko) | 인지질 조성물들 | |
| CZ308596B6 (cs) | Deriváty fosfolipidů a jejich použití jako léčiva | |
| JP5477521B1 (ja) | リン脂質含有組成物の製造方法及びリン脂質含有組成物 | |
| Sevrain et al. | Glyco-Phospho-Glycero Ether Lipids (GPGEL): synthesis and evaluation as small conductance Ca 2+-activated K+ channel (SK3) inhibitors | |
| Kłobucki et al. | Syntheses and antiproliferative activities of novel phosphatidylcholines containing dehydroepiandrosterone moieties | |
| EP0497234A2 (en) | Phosphatidylinositol analogues, inhibitors of phosphatidyl-inositol-specific phospholipase C | |
| JP2002308778A (ja) | 環状ホスファチジン酸誘導体を含む神経細胞の生存促進剤 | |
| CN109963568A (zh) | 由铂基化合物进行免疫记忆诱导 | |
| Sato | The metabolic fate of lysolecithin administered into rat duodenal lumen | |
| Billault et al. | Synthesis of gluco‐Configured Tetrahydroimidazopyridine‐2phosphonate‐Derived Lipids, Potential Glucosyl Transferase Inhibitors | |
| CN113677349B (zh) | 用于抗炎化合物的结构化分子载体及其用途 | |
| AU2005215886B2 (en) | Glimepiride- and insulin-induced glycosylphosphatidylinositol-specific phospholipase C regulation | |
| US7825270B2 (en) | Inositolphospholipids and analogues: phosphatidylinositol products and processes | |
| Feng | Probing phosphoinositide and isoprenoid binding proteins by photoaffinity labeling | |
| Hébert | Methods for the synthesis of macrocyclic and bolaform phosphatidylcholines | |
| CZ282139B6 (cs) | Způsob výroby přípravku s dieteticko-preventivním a léčebným účinkem na bázi vaječných l-O-alkyl-2-acyl-fosfatidylethanolaminů | |
| EP1421941A1 (en) | Phospholipid derivatives having a polyhydroxylated aliphatic carbocycle | |
| Ozaki | Chemical Approach to Signal Transduction by Inositol Triphosphate | |
| Kulikov et al. | Synthesis of an analogue of the phospholipid platelet activation factor from a natural ethanolamine plasmalogen |