CZ308596B6

CZ308596B6 - Deriváty fosfolipidů a jejich použití jako léčiva

Info

Publication number: CZ308596B6
Application number: CZ2017-190A
Authority: CZ
Inventors: Michal Dvořák; Marta Dvořáková; Vít Karafiát; Jan Ĺ tursa; Lukáš WERNER
Original assignee: Ústav molekulární genetiky AV ČR, v. v. i.; Smart Brain s.r.o.
Priority date: 2017-04-03
Filing date: 2017-04-03
Publication date: 2020-12-23
Also published as: EP3606534B1; WO2018184604A1; PT3606534T; US11414443B2; EP3606534A1; CA3058792A1; US20200102333A1; PL3606534T3; CZ2017190A3; CA3058792C; CN110494143B; DK3606534T3; ES2877647T3; CN110494143A; HUE055171T2

Abstract

Předkládané řešení poskytuje 1-acyl-lysofosfatidyl deriváty obecného vzorce I, kde R je C4 až C30 alifatický uhlovodíkový řetězec nebo C5 až C10 cyklický či cyklus obsahující alkyl nebo alkenyl, R1 je vybrán z H nebo C1 až C10 alkylu, R2 je vybrán z H, C10 až C30 acylu nebo C1 až C10 alkylu, R3 je vybrán z H nebo C1 až C10 alkylu, nebo R3 není přítomen, pro použití pro léčení melanomu nebo hepatokarcinomu.

Description

Deriváty fosfolipidů a jejich použití jako léčiva

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových látek na bázi lysofosfolipidů a jejich použití jako léčiv.

Dosavadní stav techniky

Fosfolipidy jsou klíčovou složkou všech biologických membrán - tvoří základ membránové dvouvrstvy spolu s bílkovinami, glykolipidy a deriváty cholesterolu. Dávají membránám jejich specifické polopropustné vlastnosti. Lipidy ze žloutků vajec kúra domácího obsahují značné množství (20 %) fosfolipidů. Dominantními fosfolipidy žloutku jsou fosfatidylcholin (75 %) a fosfatidylethanolamin (20 % žloutkových fosfolipidů). Dále žloutky obsahují malá množství fosfatidylserinu, fosfatidylinositolu, kyseliny fosfatidylové, sfingomyelinu a dalších ve stopových množstvích.

Po přijetí potravy jsou lipidy ve střevě emulgovány s přispěním solí žlučových kyselin, absorbovány a zpracovány buňkami střevní výstelky, enterocyty. Prvním krokem při trávení fosfolipidů je jejich naštěpení fosfolipázou A2 sekretovanou enterocyty tenkého střeva, za vzniku lysofosfolipidů a uvolněných mastných kyselin. Tyto látky jsou pak absorbovány enterocyty, metabolizovány a začleněny do lipoproteinových částic (např. chylomikronů), jejichž prostřednictvím se pak dostávají přes lymfatický a krevní systém k buňkám ostatních tkání.

Lysofosfolipidy založené na glycerolu se v organismech vyskytují nejen jako intermediáty při syntézách různých fosfolipidů, ale jak se v poslední době ukazuje, mají i vlastní významné regulační funkce. O biologické aktivitě 1-acyl lysofosfatidylcholinu, nebo směsi 1-acyl lysofosfolipidů připravených fosfolipázou A2 z přírodní směsi fosfolipidů a o jejich možném terapeutickém využití jsou jen nedostatečné informace. Ukazuje se, že 1-acyl lysoPC se nepřímo podílí na regeneraci orgánů a hojení ran (lit. 1,2) a může být zřejmě využit při léčení autoimunních a degenerativních onemocnění (lit. 3-7) a snad by se mohl uplatnit i při léčbě diabetů (lit. 8,9). V krevním séru je lysofosfatidylcholin nejvíce zastoupeným lysofosfolipidem. Je substrátem pro enzym autotaxin. V tělních tekutinách odštěpuje autotaxin, který je fosfolipázou D, cholinovou skupinu lysofosfatidylcholinu za vzniku kyseliny lysofosfatidylové (LPA). LPA je poměrně dobře studovanou látkou díky jejím významným biologickým účinkům. LPA aktivuje buněčnou proliferaci a angiogenesu a má prozánětlivé a pronádorové účinky. Signální dráhy ovládané touto kyselinou, prostřednictvím LPA receptorů hrají zásadní úlohu v karcinogenesi, invasivitě nádorových buněk a jejich metastatickém potenciálu. LPA signál se zřejmě podílí i na resistenci některých typů karcinomů vůči terapii (10-12).

Přestože se dá očekávat, že 1 -acyl lysofosfatidylcholin, díky své konverzi na pronádorové působící LPA, bude vykazovat pronádorové účinky in vivo, zjistili jsme, že naopak brzdí rozvoj experimentálních jatemích nádorů u kuřat i podkožních a intraperitoneálních nádorů vyvolaných syngenními nádorovými buňkami u myší. Toto překvapivé pozorování je základem předkládané přihlášky.

Seznam literatury:

1. Gendaszewska-Darmach E.: Acta Biochim. Pol.55, 227 (2008).

2. Benesch M.G., Ko Y.M., McMullen T.P., Brindley D.N.: FEBS Lett. (2014)

3. Abramowski P., Otto B., Martin R.: PLoS One 9, e91970 (2014).

4. MamathaB.S., Baskaran. V.: Nutrition 27, 960 (2011)

5. Riederer M., Ojala P.J., Hrzenjak A., Graier W.F., Malli R., Tritscher M., Hermansson M. et al.: J. Lipid Res. 51,2957 (2010).

-1 CZ 308596 B6

6. Grimm M.O., Grosgen S., Reimenschneider M., Tanila H., Grimm H.S., Hartmann T.: J. Chromatogr A 1218, 7713 (2011).

7. Jin M.C., Hung N.D., Yoo J.M., Kim M.R., Sok D.: J. Lipid. Sci. Technol. 114, 114 (2012).

8. Yea K., Kim J., Yoon J.H., Kwon T., Kim J.H., Lee H.J, Kim J.I. et al.: J. Biol. Chern. 284, 33833 (2009).

9. Overton H.A., Fyfe M.C.T., Reynet C.: Br. J. Pharmacol. 153, 76 (2008).).

10. Mills GB, Moolenaar WH. The emerging role of lysophosphatidic acid in cancer. Nat Rev Cancer. 2003;3(8):582-91.

11. Mari Gotoh a ost. Controlling cancer through the autotaxin-lysophosphatidic acid receptor axis. Biochem Soc Trans. 2012 February ; 40(1): 31-36. doi: 10.1042/BST20110608.

12. Houben AJ, Moolenaar WH. Autotaxin and LPA receptor signaling in cancer. Cancer Metastasis Rev. 2011;30(3-4):557-65.).

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje 1-acyl-lysofosfatidyl deriváty obecného vzorce I, kde

Rje C4 až C30 alifatický uhlovodíkový řetězec nebo C5 až CIO cyklický či cyklus obsahující alkyl nebo alkenyl,

R1 je vybrán z H nebo Cl až CIO alkylu, s výhodou Cl až C6 alkylu,

R2 je vybrán z H, CIO až C30 acylu nebo Cl až CIO alkylu (s výhodou Cl až C6 alkylu),

R3 je vybrán z H nebo Cl až CIO alkylu, s výhodou Cl až C6 alkylu, nebo R3 není přítomen, pro použití pro léčení melanomu nebo hepatokarcinomu.

S výhodou je R vybrán ze skupiny zahrnující C5 až CIO lineární, rozvětvený nebo cyklický či cyklus obsahující alkyl nebo alkenyl, jako je pentyl nebo 3,5,5-trimethylpentyl, cyklopentylethyl; nebo C13 až C30, s výhodou C13 až C20 lineární nebo rozvětvený alkyl nebo alkenyl, zejména C15, C16, C17, C18 nebo C19 lineární alkyl nebo alkenyl. Alkenyly obsahují jednu nebo více dvojných vazeb.

S výhodou je R2 vybrán ze skupiny zahrnující CIO až C30, s výhodou CIO až C20 acyly obsahující lineární nasycené nebo nenasycené řetězce, jako jsou například dekanoyl, palmitoyl, stearoyl, oleoyl, linoleoví, elaidoyl.

Pokud molekula nebo její část nese náboj, je kompenzován protiiontem. Vhodnými protionty jsou například kationty alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, nebo anionty halogenů, anionty

- 2 CZ 308596 B6 odvozené od anorganických nebo organických kyselin. Náboj může být kompenzován také formou vnitřní soli - betainu.

Atom dusíku nese kladný náboj tehdy, pokud R3 je přítomen.

V jednom výhodném provedení je alespoň jeden z Rl, R2, R3 methyl. V jednom specifickém provedení jsou Rl, R2 i R3 methyly.

V jednom specifickém provedení jsou Rl a R2 H, a R3 není přítomen.

V dalším specifickém provedení je Rl HaR2je CIO až C20 acyl obsahující lineární nasycené nebo nenasycené řetězce, a R3 není přítomen.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu jeví cytotoxické účinky na nádorové buňky, tedy potlačují růst nádorových buněk. Předmětem předkládaného vynálezu je tedy použití látek obecného vzorce (I) jako léčiv pro léčbu solidních tumorů vybraných z melanomu a hepatokarcinomu. V rámci tohoto vynálezu bylo potvrzeno, že látky obecného vzorce jsou silnými inhibitory růstu nádorových buněk v tkáňové kultuře, i inhibitory růstu experimentálních nádorů u zvířecích modelů.

Látky obecného vzorce I lze připravit selektivní deacylací příslušných fosfolipidů, případně modifikovaných fosfolipidů. Vstupní fosfolipidy mohou zahrnovat fosfatidylcholiny, fosfatidylethanolaminy, jejich deriváty odlišující se substitucí na atomu dusíku, nebo přírodní směsi fosfolipidů, případně modifikované substitucí na atomu dusíku. Přírodní směsi fosfolipidů mohou zahrnovat například fosfolipidy vaječného žloutku. Selektivní deacylací lze provádět syntetickými postupy známými odborníkovi v oboru nebo enzymaticky.

Po selektivní deacylací lze provést také následnou acylaci pro získání látky nesoucí požadovaný acylový zbytek R. Acylace prováděná po deacylací musí být selektivní, toho lze například dosáhnout chráněním -OH skupiny chránícími skupinami, které jsou odborníkovi v oboru dobře známé.

Z reakční směsi po deacylací lze látku obecného vzorce I izolovat samostatně, nebo ve směsi s uvolněnou mastnou kyselinou. Přítomnost mastné kyseliny nemá vliv na cytotoxické účinky látek obecného vzorce I.

Látky vzorce I lze pro použití formulovat jako léčivo, obsahující alespoň jednu látku obecného vzorce I a alespoň jeden nosič, rozpouštědlo nebo plnivo. Dále mohou léčiva obsahovat další vhodné pomocné látky, jako kluzné látky, látky usnadňující tabletování, emulgátory, potahové látky atd. Léčivo může být například ve formě kapslí, tablet, tobolek, mastí, krémů.

Příklady uskutečnění vynálezu

Seznam zkratek:

PC - fosfatidylcholin

PE - fosfatidylethanolamin

E-DAPL - směs 1-acyl-lysofosfolipidů ze žloutku připravená fosfolipázou A2

TLC - tenkovrstvá chromatografie

FA - mastné kyseliny

DMAP - dimethylaminopyridin

DCC - N, N'-dicyklohexylkarbodiimide

Příklad 1: Izolace přírodních směsných fosfolipidů z vaječných žloutků

-3CZ 308596 B6 žloutků bylo mícháno 10 minut s 1200 ml 96% ethanolu, obsahujícího 0,01 mM 2,6-bis( 1,1 dimethylethyl)-4-methylfenol, při 30 °C. Směs byla zfiltrována přes filtrační papír Whatman 1 a filtrát odpařen na rotační vakuové odparce. Odparek byl rozpuštěn v 200 ml «-hexanu (25 °C) a nerozpustný podíl odstraněn centrifůgací 10 min 3000 xg, 25 °C. Čirý supernatant byl vychlazen na 4 °C, smíchán s 2 objemy acetonu (4 °C) a ponechán přes noc při 4 °C. Sraženina byla 3x promyta směsí «-hexan:aceton (1:2) a usušena v exikátoru za sníženého tlaku. Takto purifikované fosfolipidy byly použity buď na isolaci fosfatidylcholinu a fosfatidylethanolaminu nebo na přípravu směsi lysofosfolipidů. Obsah fosfolipidů byl stanoven měřením fosforu.

Příklad 2: Izolace fosfatidylcholinu (PC) a fosfatidylethanolaminu (PE)

Purifikované celkové fosfolipidy (1,2 g) byly rozpuštěny v malém objemu směsi chloroform methanol: voda (66:33:2) a naneseny na 100 ml kolonu silikagelu ekvilibrovanou ve stejné směsi rozpouštědel. Kolona byla vyvíjena stejnou směsí rozpouštědel. Vzorek z každé frakce byl analyzován pomocí TLC.

Spojené frakce obsahující buď PE, nebo PC byly odpařeny a použity pro přípravu 1-acyllysofosfatidylethanolaminu (1-acyl-lysoPE), 1-acyl-lysofosfatidylcholinu (1-acyl-lysoPC), 2-acyllysofosfatidylcholinu (2-acyl-lysoPC) a N-acyl-lysofosofatidylethanolaminů. Malé alikvoty ze spojených frakcí PE a PC byly analyzovány pomocí MALDI-TOF, NMR a pomocí TLC spolu se standardy. Tyto metody ověřily, že frakce obsahují prakticky jen PE nebo PC.

Strukturní analýza fosfatidylcholinu (PC) indikovala jako majoritní složku diester s kyselinou palmitovou a olejovou a minoritní estery se souborem přirozeně se vyskytujících mastných kyselin.

MS vypočteno: 760,5851 nalezeno: 760,5853 (M+)

IR: 3384 (m), 3007(m), 2853(m), 1738 (s), 1602(s), 1467(m), 1419(m), 1378(m), 1346(m), 1249(s), 1174(m), 1092(s), 1064(s), 969(s), 925(s), 874(s), 821(m), 761(m), 721(s), 579(m), 506(m), 461(m)cm^-1

Ή NMR (500 MHz, Methanol-d4) δ 5,35 (t, J = 5,2 Hz, 4H), 5,25 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 4.44 (dd, J = 12,0, 3,1 Hz, 1H), 4,32 - 4,23 (m, 2H), 4,17 (dd, J = 12,0, 6,9 Hz, 1H), 4,00 (t, J = 6,1 Hz, 2H), 3,68 - 3,60 (m, 2H), 3,23 (s, 9H), 2,33 (dt, J = 14,3, 7,4 Hz, 4H), 2,11 - 1,94 (m, 4H), 1,67 - 1,50 (m, 4H), 1,46 - 1,23 (m, 44H), 0,99 - 0,82 (m, 6H).

¹³C NMR (126 MHz, Methanol-d4) δ 173,49, 173,15, 129,44 (d, J = 20.1 Hz), 127,69 (d, J = 14,5 Hz), 70,40 (d, I = 7,9 Hz), 66,08 (dd, J = 7,2, 3,4 Hz), 63,47 (d, J = 5,1 Hz), 62,30, 59,07 (d, J = 4,9 Hz), 53,33, 53,30, 53,27, 33,70, 33,55, 31,69, 29,47, 29,42, 29,28, 29,24, 29,08, 28,99, 28,88, 28,85, 28,80, 26,79, 24,63, 22,36, 13,09.

Minoritní signály:

Ή NMR (500 MHz, Methanol-d4) δ 3,61 (d, J = 6,9 Hz), 3,35 (s), 2,89 - 2,72 (m), 2,40 (d, J = 3,2 Hz), 2,14 (d, J = 6,7 Hz), 1,74 - 1,65 (m), 1,18 (t, J = 7,0 Hz), 0,98 (t, J = 7,5 Hz).

¹³C NMR (126 MHz, Methanol-d4) δ 172,97, 172,49, 129,82, 129,56, 129,43, 128,93, 128,58, 128,09, 127,82, 127,43 (d, J = 16,2 Hz), 70,51, 48,45, 33,09, 31,29, 26,15, 25,20 (d, J = 3.0 Hz), 24,54, 22,26.

Strukturní analýza fosfatidylethanolaminu (PE) indikovala jako majoritní složku diester s kyselinou palmitovou a olejovou a dále další minoritní estery se souborem přirozeně se vyskytujících mastných kyselin.

IR: 3374(m), 2956(m), 2925(s), 2854(m), 1741(s), 1653(m), 1490(m), 1467(m),1457(m), 1378(m), 1227(s), 105 l(m), 722(m) cm¹

Ή NMR (500 MHz, Methanol-ď₄) δ 5,43 - 5,31 (m, 5H), 5,23 (d, J= 3,4 Hz, 1H), 4,58 (s, 1H, NH2), 4,44 (dd, J= 12,0, 3,2 Hz, 1H), 4,24 - 4,14 (m, 1H), 4,04 (dd, J= 5,2, 2,7 Hz, 2H), 4,02

-4CZ 308596 B6

3,97 (m, 2H), 3,16 (t, J= 4,9 Hz, 2H), 2,92 - 2,78 (m, 4H), 2,33 (dt, J= 12,9, 8,5 Hz, 4H), 2,11 2,00 (m, 4H), 1,65 - 1,57 (m, 4H), 1,38 - 1,24 (m, 38H), 0,95 - 0,86 (m, 6H).

Minoritní signály:

Ή NMR (500 MHz, Mcthanol-J) δ 5,18 - 5,14 (m), 3,67 - 3,58 (m), 3,50 - 3,43 (m), 3,35 (s), 3,23 (s), 2,78 (t, J= 6,7 Hz), 2,40 (d, J= 3,9 Hz), 2,17 - 2,11 (m), 1,69 (td, J= 7,3, 4,4 Hz), 0,98 (t, 7= 7,6 Hz).

Rozlišení mezi signály pro hlavní látku (PE) a látky směsi nebylo možné. Všechny signály jsou vypsány.

¹³C NMR (126 MHz, Mcthanol-J) δ 174,94, 174,59, 174,39, 131,22, 130,96, 130,84 (d. J= 19,8 Hz), 130,84, 130,34, 130,03- 129,94 (m), 129,48, 129,27, 129,22, 129,17, 129,15, 129,10, 129,06 - 129,03 (m), 128,93, 128,84 (d, J= 16,2 Hz), 72,03 - 72,00 (m), 71,95 - 71,91 (m), 71,89 - 71,84 (m), 71,79, 65,03 - 64,76 (m), 63,82 - 63,52 (m), 63,21 - 62,76 (m), 41,69 (d, J= 6,3 Hz), 35,10, 34,93, 34,49, 33,09, 32,69, 30,86, 30,80, 30,64, 30,49, 30,47, 30,38, 30,26, 30,23, 30,20, 28,23, 28,17, 27,55, 26,61, 26,03, 25,93, 23,75, 14,46.

Příklad 3: Příprava 1-acyl-lysofosfatidylethanolaminu (1-acyl-lysoPE)

O— ÍF

R' = směs acylů, majoritně palmitoyl

PE purifikovaný flash chromatografií nebo PE zakoupené od firmy Sigma Aldrich byly v 10% (w/v) koncentraci opakovaně vortexovány a sonikovány při 43 °C v 50mM TrisHCl (pH 8,0, 50mM KC1, 8mM CaCL), dokud nebyly fosfolipidy dokonale dispergovány. Pak byly fosfolipidy štěpeny fosfolipázou A2 (EC 3.1.1.4) v poměru 2 jednotky enzymu/mg fosfolipidů při 43 °C a průběh reakce sledován pomocí tenkovrstevné chromatografie na silikagelu (TLC), vyvíjené směsí chloroform:methanol:voda 20:10:1. Po úplném naštěpení byla reakce zastavena přidáním EDTA do koncentrace 10 mM a uložena při 0 až 4 °C. Preparát byl označen PE/E-DAPL+FA (1-acyllysofosfatidylethanolamin štěpený enzymem, ve směsi s mastnými kyselinami). Přírodní fosfatidylethanolamin nese jako acyl obvykle zbytek palmitové kyseliny, olejové kyseliny, nebo stearové kyseliny.

Příklad 4: Příprava 1-acyl-lysofosfatidylcholinu (1-acyl-lysoPC)

X b-R'

R' = směs acylů, majoritně palmitoyl

PC purifikovaný flash chromatografií byl v 10% (w/v) koncentraci opakovaně vortexován a sonikován při 43 °C v 50mM Tris.HCl (pH 8,0, 50mM KC1, 8mM CaCL), dokud nebyly fosfolipidy dokonale dispergovány. Pak byl PC štěpen fosfolipázou A2 v poměru 2 jednotky enzymu/mg fosfolipidů při 43 °C a průběh reakce sledován pomocí tenkovrstevné chromatografie na silikagelu (TLC), vyvíjené směsí chloroform methanol: voda 20:10:1. Po úplném naštěpení byla

-5CZ 308596 B6 reakce zastavena přidáním EDTA do koncentrace lOmM a uložena při 0 až 4 °C. Preparát byl označen PC/ E-DAPL+FA (1-acyl-lysofosfatidylcholin štěpený enzymem, ve směsi s mastnými kyselinami). Přírodní fosfatidylcholin nese jako acyl obvykle zbytek palmitové kyseliny, olejové kyseliny, nebo stearové kyseliny.

Příklad 5: Příprava směsných 1 -acyl-lysofosfolipidů

Metoda A: Celkové purifikované fosfolipidy z příkladu 1 byly v 10% (w/v) koncentraci opakovaně vortexovány a sonikovány při 43 °C v 50mM Tris.HCl, pH 8,0, 50mM KC1, 8mM CaCF. dokud nebyly fosfolipidy dokonale dispergovány. Pak byly fosfolipidy štěpeny fosfolipázou A2 v poměru 2 jednotky enzymu/mg fosfolipidů při 43 °C a průběh reakce sledován pomocí tenkovrstevné chromatografie na silikagelu (TLC), vyvíjené směsí chloroform:methanol:voda 20:10:1. Po úplném naštěpení byla reakce zastavena přidáním EDTA do koncentrace lOmM a krátkodobě uložena při 0 až 4 °C.

Metoda B: Usušené celkové purifikované fosfolipidy z příkladu 1 byly opakovaně vortexovány a sonikovány při 43 °C v 83mM deoxycholátu sodném v 50mM Tris.Cl, pH 8,0, 50mM KC1, 8mM CaCE. Konečná koncentrace fosfolipidů byla rovněž 83mM (vzhledem k PC). Pak byly fosfolipidy štěpeny fosfolipázou A2 v poměru 0,2 jednotky enzymu/mg fosfolipidů při 43 °C a průběh reakce sledován pomocí tenkovrstevné chromatografie na silikagelu (TLC), vyvíjené směsí chloroform:methanol:voda 20:10:1. Po 120 minutách byla reakce zastavena přidáním EDTA do koncentrace lOmM, pH směsi upraveno IM HC1 na pH=3, vy srážená kyselina deoxy cholová odtečena a supernatant neutralizován 5M NaOH na pH=7. Reakční směs byla krátkodobě uložena při 0 až 4 °C. Preparáty z metod A i B byly označeny E-DAPL+FA.

Směs E-DAPL+FA obsahuje zejména 1-acyl-lysoPC a 1-acyl-lysoPE, které lze charakterizovat vzorci níže, kde R je převážně kyselina palmitová. Směs rovněž obsahuje mastnou kyselinu uvolněnou enzymatickým štěpením, převážně kyselinu olejovou.

||

HjC — O~~C~R

OH-CH i i! +/

CH O”P~O - CH₂- CH ₂- N - CH 3

I |j

H₂C — O ~ C” R

OH~CH

I

III

CH₂- O~PO- ch₂- ch₂-n h₂

0'

-acyl-lysofosfatidylcholin l-acyl-lysofosfatidyletanolamín

Spektrum přečištěného 1 -acyl-lysofosfatidylcholinu:

Ή NMR (600 MHz, Methanol-ri/u) δ 5,44 - 5,32 (m, 2H), 4,40 - 4,26 (m, 2H), 4,23 - 4,11 (m, 2H), 4,03 - 3,96 (m, 1H), 3,98 - 3,87 (m, 2H), 3,69 - 3,65 (m, 2H), 3,25 (s, 9H), 2,44 - 2,33 (m, 2H), 2,15 - 2,00 (m, 2H), 1,70 - 1,59 (m, 2H), 1,45 - 1,27 (m, 20H), 0,98 - 0,89 (m, 3H).

¹³C NMR (151 MHz, Mcthanol-í/₄) δ 175,71 - 175,03 (m), 130,83 (d, J= 15,5 Hz), 129,07 (d, J= 9,9 Hz), 69,84 (d, J= 7,6 Hz), 67,85, 67,81, 67,49 (dd, J= 6,9, 3,4 Hz), 66,24,60,43 (d, J= 5,1 Hz), 54,69 (d, J= 7,6 Hz), 34,90, 33,05, 30,83, 30,81, 30,60, 30,43, 30,33, 30,31, 30,21, 30,20, 28,14 (d, J= 5,2 Hz), 26,00 (d, J= 5,3 Hz), 23,73, 14,45 .

Minoritní signály:

Ή NMR (600 MHz, Mcthanol-í/₄) δ 5,05 - 4,98 (m), 4,07 - 4,02 (m), 3,80 (dd, J= 5,7, 4,5 Hz), 3,75 - 3,70 (m), 3,65 - 3,56 (m), 3,37 (d, J= 1,5 Hz), 3,13 (s), 2,91 - 2,83 (m), 2,82-2,78 (m),

-6CZ 308596 B6

2,44 (dd, J= 5,6, 3,9 Hz), 2,34 (t, J= 7,4 Hz), 2,20 - 2,14 (m), 2,13 - 2,08 (m), 1,75 - 1,68 (m), 1,00 (t, 7=7,6 Hz).

¹³C NMR (151 MHz, Methanol-X) δ 175,14, 175,09, 174,94, 131,19, 130,93, 130,85, 130,27, 130,01, 129,90, 129,45, 129,16 (d, J= 1,5 Hz), 128,89, 128,76, 79,20 (d, J= 6,1 Hz), 75,77 (d, J = 5,8 Hz), 74,69 (d, J= 8,1 Hz), 72,48 (d, J= 7,5 Hz), 66,34, 64,73 (d, J= 5,4 Hz), 64,55 (d, J = 5,0 Hz), 63,78, 63,46 (d, J= 4,5 Hz), 63,02 (d, J= 4,2 Hz), 35,10, 34,81, 34,31, 32,66, 30,75, 30,71, 30,47, 30,17, 30,13, 27,55, 26,59 - 26,50 (m), 26,02, 25,89, 23,62.

Příklad 6: Příprava 2-acyl-lysofosfatidylcholinu ’AC ..-/Μ'³

-- χ-' Ο ( R

ÓH

R” = směs acylů, majoritně oleoyl

Z fosfatidylcholinu izolovaného postupem podle příkladu 2 byl enzymaticky odstraněn zbytek mastné kyseliny v pozici sn-1. PC byl v 10% (w/v) koncentraci opakovaně vortexován a sonikován při 43 °C v 50mM Tris.HCl, pH 8,0, 50mM KC1, 8mM CaCL, dokud nebyl dokonale dispergován. Pak byl PC štěpen fosfolipázou AI v poměru 2 jednotky enzymu/mg fosfolipidů při 37 °C a průběh reakce sledován pomocí tenkovrstevné chromatografie na silikagelu (TLC), vyvíjené směsí chloroform:methanol:voda 20:10:1. Po úplném naštěpení byla přidána EDTA do koncentrace lOmM a směs krátkodobě uložena při 0 až 4 °C. Ή NMR analýza produktu indikovala 15 až 20% migraci acylu z polohy sn-1 za vzniku 1-acyl-lysofosfatidylcholinu jako minoritního vedlejšího produktu (viz příklad 5).

Spektrum 2-acyl-lysofosfatidylcholinu:

Ή NMR (500 MHz, Methanol-d4) δ 5,42 - 5,27 (m, 2H), 5,05 - 4,97 (m, 1H), 4,35 - 4,22 (m, 2H), 4,01 (p, 2H), 3,75 - 3,68 (m, 2H), 3,66 (dd, J = 5,5, 3,4 Hz, 2H), 3,24 (s, 9H), 2,83 (m, 1H), 2,37 (t, J = 8,6, 6,5 Hz, 2H), 2,10 - 1,99 (m, 2H), 1,63 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 1,41 - 1,24 (m, 18H), 0,92 (t, J = 6,9, 3,5 Hz, 2H).

¹³C NMR (126 MHz, Methanol-d4) δ 174,95, 130,83 (d, J = 12,1 Hz), 74,68 (d, J = 8,5 Hz), 64,73 (d, J = 5,5 Hz), 61,24, 60,42 (d, J = 5,3 Hz), 54,72, 54,69, 54,66, 35,09, 30,83, 30,60, 30,44, 30,33, 30,21, 28,13, 25,97, 23,73, 14,46.

Minoritní signály:

Ή NMR (500 MHz, Methanol-d4) δ 7,91 (s), 4,58 (s), 4,22 - 4,08 (m), 3,91 (q, J = 6,3, 5,6 Hz), 3,77 (d, J = 14,4 Hz), 3,36 (s), 3,09 (s), 2,94 - 2,73 (m), 2,24 - 2,09 (m), 1,71 (s), 1,19 (t, J = 7,0 Hz), 0,99 (t, J = 7,6 Hz), ¹³C NMR (126 MHz, Methanol-d4) δ 175,33, 131,20, 130,93, 130,25 (d, J = 4,6 Hz), 129,96 (d, J = 18,2 Hz), 129,46, 129,17, 128,83 (d, J = 16,1 Hz), 73,34 (d, J = 84,0 Hz), 70,87,69,82 (d, J = 7,7 Hz), 67,82 (d, J = 5,7 Hz), 67,48 (dt, J = 6,8, 3,2 Hz), 66,23, 64,73 (d, J = 5,5 Hz), 64,14, 61,53, 34,90, 33,06, 30,83, 30,78, 30,47, 30,44, 26.55.

Příklad 7: Příprava 1-acyl-specifických 1,2-diacylfosfolipidů

Z fosfatidylcholinu izolovaného postupem podle příkladu 2 byl enzymaticky odstraněn zbytek mastné kyseliny v pozici sn-1 podle příkladu 6, který byl následnou organickou esterifikační reakcí nahrazen acylovým zbytkem R' (viz tabulka níže).

-7 CZ 308596 B6

Výchozí 2-acyl-lysofosfatidylcholin z příkladu 6 (1 eq) byl rozpuštěn v suchém dichlormethanu (0,06 M), roztok byl ochlazen na 4 °C a byl pomalu přidán chlorid příslušné mastné kyseliny (hexanové, stearové, trimethylhexanové, cyklopentanpropionové) (3 eq). Reakční směs byla dále zahřívána na 10 °C a poté byl pomalu přikapán pyridin (5 eq) a katalytické množství DMAP (0,05 eq). Směs byla míchána přes noc při laboratorní teplotě. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (CHC13/MeOH/H2O v poměru 75/22,5/2,5). Reakce byla ukončena extrakcí reakční směsi mezi 50% vodný roztok NaCl a dichlormethan. Finální produkt byl získán sloupcovou chromatografií na silikagelu (20% (MeOH + 10% H2O) v chloroformu, + 1% za minutu). Výsledný produkt je kontaminován produktem acylace 1-acyl-lysofosfatidylcholinu (15 až 20%), který vzniká mechanismem transacylace jako vedlejší produkt dle příkladu 6.

Příklad 8: Příprava 1-hexanoyl-fosfatidylcholinu

R” = směs acylů, majoritně oleoyl

Postupem uvedeným v příkladu 7 byl připraven 1-hexanoyl-fosfatidylcholin ve výtěžku 43 %. MS: vypočteno: 619,4213 nalezeno: 619,4215

IR: 3373(m), 3004(w), 2925(s), 2855(m), 1737(s), 1490(sh), 1467(m), 1380(m), 1246(s), 105 l(m), 928(m), 726(w) cm¹

Ή NMR (600 MHz, Methanol-d₄) δ 5,44 - 5,32 (m, 2H), 5,32 - 5,24 (m, 1H), 4,46 (dd, J = 12,1, 3,1 Hz, 1H), 4,36 (dd, J = 6,5, 3,4 Hz, 2H), 4,21 (dd, J = 12,1, 7,0 Hz, 1H), 4,06 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 3,82 - 3,68 (m, 2H), 3,30 (s, 9H), 2,36 (dt, J = 15,1, 7,4 Hz, 4H), 2,16 - 1,97 (m, 4H), 1,64 (t, J = 7,4 Hz, 4H), 1,42 - 1,26 (m, 22H), 0,98 - 0,88 (m, 6H).

¹³C NMR (151 MHz, Methanol-d₄) δ 174,93, 174,62, 130,81 (d, J = 27,4 Hz), 129,07 (d, J = 18,3 Hz), 71,81 (d), 67,55 - 67,22 (m), 65,03 (d, J = 4,5 Hz), 63,70, 60,70 (d, J = 4,9 Hz), 54,79, 54,76, 54,74, 34,96 (d, J = 33,0 Hz), 33,03, 32,39, 30,81, 30,72, 30,57, 30,45, 30,42, 30,33, 30,31, 30,29, 30,22, 30,21, 30,18, 30,16, 30,14, 28,12, 26,57, 26,54, 25,83 (d, J = 52,5 Hz), 23,55 (d, J = 47,9 Hz), 14,37 (d,J = 23,1 Hz).

Minoritní signály:

Ή NMR (600 MHz, Methanol-d₄) δ 5,16 (d, J = 3,7 Hz), 4,63 - 4,57 (m), 4,52 (d, J = 7,8 Hz), 4,32 - 4,28 (m), 3,88 (dd, J = 11,9, 1,6 Hz), 3,83 - 3,79 (m), 3,71 (s), 2,92 - 2,83 (m), 2,80 (t, J = 6,7 Hz), 2,16 (t, J = 6,4 Hz), 1,76 - 1,70 (m), 1,48 - 1,44 (m), 1,11 - 0,98 (m).

¹³C NMR (151 MHz, Methanol-d4) δ 131,20, 130,93, 130,80, 130,37, 129,95 (d, J = 14,7 Hz), 129,47, 129,21, 128,80 (d, J = 18,3 Hz), 98,15, 93,89, 77,99, 76,25, 74,83, 73,75, 72,97, 64,07, 62,73 (d, J = 17,4 Hz), 60,99, 35,04, 34,88, 34,48, 32,65, 32,36, 30,81, 30,72, 30,57, 30,45, 30,42, 30,33, 30,31, 30,29, 30,22, 30,21, 30,18, 30,16, 30,14, 28,15, 27,50, 25,96, 25,69, 23,61, 14,37 (d, J = 23,1 Hz).

-8CZ 308596 B6

Příklad 9: Příprava 1-stearoyl-fosfatidylcholinu

R” = směs acylů, majoritně oleoyl

Postupem uvedeným v příkladu 7 byl připraven 1-stearoyl-fosfatidylcholin ve výtěžku 54 %.

MS: vypočteno: 810,5983 nalezeno: 810,5989 (M+Na⁺)

IR: 3408(m), 30012(w),2957(m), 2925(s), 2852(m), 1737(s), 1490(m), 1488(sh), 1467(m), 1378(m), 125l(s), 1063(m), 926(m), 721(m) cm¹

Ή NMR (600 MHz, Mcthanol-í/₄) δ 5,43 - 5,31 (m, 2H), 5,27 - 5,23 (m, 1H), 4,44 (dd, J= 12,1, 3,0 Hz, 1H), 4,29 (t, J= 4,6 Hz, 2H), 4,18 (dd, J= 12,0, 7,0 Hz, 1H), 4,01 (t, J= 6,0 Hz, 2H), 3,72 - 3,63 (m, 2H), 3,24 (s, 9H), 2,33 (dt, J= 16,4, 7,4 Hz, 4H), 2,11 - 1,96 (m, 4H), 1,65 - 1,55 (m, 4H), 1,42 - 1,17 (m, 24H), 0,97 - 0,81 (m, 6H).

¹³CNMR(151 MHz, Methanol-ri₄) δ 175,01, 174,66, 130,84 (d, J= 25,4 Hz), 129,08 (d, J= 18,5 Hz), 71,83 (d, J= 8,1 Hz), 67,46 (dt, J= 7,1, 3,1 Hz), 64,90 (d, J= 5,2 Hz), 63,73, 60,53 (d, J = 5,0 Hz), 54,79,54,76, 54,74, 35,04 (d, J= 23,6 Hz), 33,06, 30,85, 30,83, 30,74, 30,64, 30,61, 30,46, 30,37, 30,35, 30,25, 30,21, 30,18, 28,50 - 27,96 (m), 26,03 (d, J= 3,3 Hz), 23,73, 14,46.

Minoritní signály:

Ή NMR (600 MHz, Methanol-ri₄) δ 4,56 (s), 3,79 (s), 3,35 (s), 2,95 - 2,72 (m), 2,45 - 2,39 (m), 2,16 (s), 2,13 (t, 7=6,9 Hz), 1,76 - 1,67 (m), 1,06-0,95 (m), ¹³C NMR (151 MHz, Methanol-ri₄) δ 174,97, 174,70, 136,28 (d, J= 3,0 Hz), 134,77 (d, J= 10,0 Hz), 131,53 (d, J= 12,6 Hz), 131,22, 129,97 (d, J = 5,1 Hz), 129,48, 129,31, 129,22, 128,88, 128,75, 108,23, 72,47, 64,12 (d, J= 5,0 Hz), 34,51, 32,67, 30,45, 27,53, 26,59 (d, J= 4,4 Hz), 25,93, 23,63, 14,48.

Příklad 10: Příprava 1-trimethylhexanoyl-fosfatidylcholinu

R” = směs acylů, majoritně oleoyl

Postupem uvedeným v příkladu 7 byl připraven 1 -trimethtylhexanoyl-fosfatidylcholin ve výtěžku

MS: vypočteno: 662,4755 nalezeno: 662,4758 (M+)

IR: 3404(m), 3009(w), 2957(m), 2927(s), 2855(m), 1739(s), 1478(s), 1467(m), 1394(m), 1365(m), 1247(s), 1054(m), 925(m), 723(m) cm¹

Ή NMR (600 MHz, Methanol-d₄) δ 5,46 - 5,32 (m, 2H), 5,31 - 5,20 (m, 2H), 4,58 (s, 1H), 4,46 (ddd, J = 22,6, 12,1, 3,2 Hz, 1H), 4,29 (tp, J = 5,5, 2,7 Hz, 2H), 4,19 (ddd, J = 21,8, 12,1, 6.9 Hz,

-9CZ 308596 B6

1H), 4.08 - 3.95 (m, 2H), 3.73 - 3.61 (m, 2H), 3.25 (s, 9H), 2.41 - 2.31 (m, 4H), 2.13 - 1.98 (m, 4H), 1.64 (dq, J = 12.3, 7.4 Hz, 2H), 1.49- 1.29 (m, 20H), 1.27 (d, J = 4.2 Hz, 2H), 1.15 (ddd, J = 14.0, 6.2, 1.9 Hz, 1H), 1.00 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.97 - 0.85 (m, 12H).

¹³CNMR(151 MHz, Methanol-d₄) δ 174.58, 174.21, 130.84 (d, J = 23.7 Hz), 129.18 (d, J = 11.0 Hz), 71.84 (d, J = 8,0 Hz), 67,48 (dt, J = 6,8, 3,1 Hz), 65,14 - 64,30 (m), 63,70 (d, J = 2,3 Hz), 60,47 (d, J = 5,0 Hz), 55,06 - 54,34 (m), 51,64 (d, J = 3,0 Hz), 49,85, 44,63 (d, J = 1,5 Hz), 35,10, 33,06, 31,88, 30,83, 30,60, 30,45, 30,43, 30,34, 30,33, 30,22, 30,17, 28,16, 28,15, 26,56, 26,00 (d, J = 1,3 Hz), 23,74, 23,15, 23,12, 14,47.

Minoritní signály:

Ή NMR (600 MHz, Methanol-d₄) δ 5,47 - 5,36 (m), 2,93 - 2,82 (m), 2,80 (t, J = 6,7 Hz), 2,22 2,11 (m), 1,72 (td, J = 7,3, 3,8 Hz), 1,16 (dd, J = 6,2, 1,9 Hz).

¹³C NMR (151 MHz, Methanol-d₄) δ 131,22, 130,96, 130,84, 130,36, 129,99, 129,95, 129,93, 129,48, 129,14, 128,89, 128,77, 126,31, 34,51, 32,67, 30,73, 30,47, 30,24, 28,14, 26,60 (t, J = 0,9 Hz), 25,92, 23,72, 23,63, 21,49.

Příklad 11: Příprava 1 -cyklopentanpropionyl-fosfatidylcholinu

N

R” = směs acylů, majoritně oleoyl

Postupem uvedeným v příkladu 7 byl připraven 1 - cyklopentanpropionyl-fosfatidylcholin ve výtěžku 71%.

MS: vypočteno: 668,4262 nalezeno: 668,4267 (M+Na+)

IR: 3363(m), 3008(w), 2950(sh), 2927(s), 2856(m), 1734(s), 1487(m), 1465(m), 1553(m), 1377(m), 1245(s), 1068 (m), 926(m) cm¹.

‘HNMR (500 MHz, Methanol-d₄) δ 5,47 - 5,32 (m, 2H), 5,32 - 5,23 (m, 1H), 4,70 - 4,62 (m, 1H), 4,46 (dd, J = 12,0, 3,2 Hz, 1H), 4,31 (tq, J = 7,3, 2,6 Hz, 2H), 4,03 (t, J = 5,9 Hz, 2H), 3,72 - 3,64 (m, 2H), 3,26 (s, 9H), 2,36 (td, J = 7,6, 4,4 Hz, 4H), 2,18 - 2,04 (m, 4H), 1,81 (pd, J = 6,7, 4,5, 3,8 Hz, 1H), 1,64 (q, J = 5,8, 4,1 Hz, 4H), 1,56 (dp, J = 7,1, 3,2 Hz, 4H), 1,45 - 1,28 (m, 20H), 1,22 1,07 (m, 4H), 0,93 (td, J = 6,9, 3,4 Hz, 3H).

¹³C NMR (126 MHz, Methanol-d₄) δ 130,82 (d, J = 20,1 Hz), 129,35 (d, J = 7,6 Hz), 77,92, 76,62, 75,61, 74,56, 74,38, 71,76, 69,56, 64,89 (d, J = 5,2 Hz), 63,71, 61,86 - 60,10 (m), 57,72 - 53,49 (m), 35,08, 34,26, 33,43, 33,05, 32,24, 30,83, 30,59, 30,44, 30,34, 30,22, 30,16, 28,17, 26,10, 26,02, 23,73, 14.48.

Minoritní signály:

Ή NMR (500 MHz, Methanol-d₄) δ 4,94 (dd, J = 6,2, 2,8 Hz, 1H), 4,79 (d, J = 11,4 Hz, 1H), 4,60 - 4,52 (m, 4H), 4,26 - 4,15 (m, 3H), 3,87 - 3,80 (m, 2H), 3,75 (dd, J = 10,8, 2,9 Hz, 1H), 2,93 2,74 (m, 3H).

¹³C NMR (126 MHz, Methanol-d₄) δ 139,75, 139,66, 139,39, 128,97 (d, J = 3,6 Hz), 128,86 128,58 (m), 101,07, 40,87, 34,48, 32,66, 30,73, 30,46, 26,58, 23,62.

-10CZ 308596 B6

Příklad 12: Příprava 1-palmitoyl-fosfatidylcholinu , i + +

R” = směs acylů, majoritně oleoyl

Postupem uvedeným v příkladu 7 byl připraven 1-palmitoyl-fosfatidylcholin ve výtěžku 15 %.

MS: calculated: 760,5851 found: 760,5855 (M+).

IR: 3403(m), 3007(w), 2956(m), 2923(s), 2853(m), 1738(s), 1478(sh), 1467(m), 1379(m), 125 l(s), 1068(m), 926(m), 721(m) cm¹

Ή NMR (600 MHz, Methanol-d₄) δ 5,38 (td, J = 4,9, 4,1, 1,2 Hz, 2H), 5,28 (dtd, J = 6,9, 5,4, 3,1 Hz, 1H), 4,47 (dd, J = 12,0, 3,2 Hz, 1H), 4,35 - 4,27 (m, 2H), 4,21 (dd, J = 12,0, 6,9 Hz, 1H), 4,03 (ddd, J = 6,7, 5,3, 1,3 Hz, 2H), 3,75 - 3,58 (m, 2H), 3,26 (s, 9H), 2,36 (dt, J = 16,0, 7,4 Hz, 4H), 2,15 - 2,00 (m. 4H), 1,64 (pd, J = 9,1, 8,0, 4,1 Hz, 4H), 1,46 - 1,24 (m, 44H), 0,93 (td, J = 7,1, 1,4 Hz, 6H).

¹³C NMR (151 MHz, Methanol-d₄) δ 174,90, 174,56, 130,84 (d, J = 24,7 Hz), 71,81 (d, J = 8,1 Hz), 67,49 (t, J = 6,7 Hz), 64,90, 64,87, 63,69, 60,47 (d, J = 5,0 Hz), 55,70 - 53,83 (m), 30,87, 30,82, 30,79, 30,67, 30,47, 30,38 (d, J = 1,4 Hz), 30,27, 30,24, 30,20, 28,18, 26,05, 26,03, 23,75, 14,46.

1-acyl-specifické 1,2-diacylfosfolipidy uvedené v příkladech 8 až 12 byly opracovány fosfolipázou A2 a purifikovány, jak uvedeno v příkladu 4. Tak byly připraveny následující látky:

Preparáty byly označeny tak, jak je uvedeno v tabulce:

R	Označení preparátu
hexanoyl	sn-1 hexanoyl PC/E-DAPL+FA
stearoyl	sn-1 stearoyl PC/E-DAPL+FA
trimethylhexanoyl	sn-1 trimethylhexanoyl PC/E-DAPL+FA
cyklopentanpropionyl	sn-1 cyklopentanpropionyl PC/E-DAPL+FA
palmitoyl	sn-1 palmitoyl PC/E-DAPL+FA

Preparáty obsahovaly uvolněné mastné kyseliny (+FA) a majoritně lysofosfolipidy následujících struktur:

sn-1 hexanoyl PC/E-DAPL sn-1 cyklopentanpropionyl

PC/E-DAPL sn-1 trimethylhexanoyl

PC/E-DAPL

-11 CZ 308596 B6

Příklad 13: Příprava N-acyl derivátů 1,2-diacyl-fosfatidylethanolaminu

Ve fosfatidylethanolaminu izolovaném postupem podle příkladu 2 byl esterifikační reakcí nahrazen vodík aminové skupiny acylovým zbytkem R2 (viz tabulka níže).

Fosfatidylethanolamin izolovaný z přírodního zdroje postupem podle příkladu 2 nese v poloze sn1 směs zbytků mastných kyselin, cca z 80 % zbytky kyseliny palmitové, zbytek tvoří zbytky kyseliny stearové, olejové, v malém množství zbytky dalších mastných kyselin.

Purifikovaný fosfatidylethanolamin byl rozpuštěn v bezvodém benzenu a smíchán v přítomnosti DMAP s dvěma ekvivalenty anhydridu kyseliny (palmitové, děkanové, olejové, linolejové nebo elaidové). Anhydridy byly připraveny kondenzací uvedených kyselin v přítomnosti DCC. Nacylace probíhala 30 min při laboratorní teplotě. Reakční směs byla usušena, rozpuštěna v hexanu, nerozpustný podíl odstraněn centrifůgací a N-acyl fosfatidylethanolaminy byly izolovány srážením 2 objemy acetonu při 4 °C přes noc. Sraženina byla 3x promyta ledovou směsí hexan:aceton 1:2 při 0 °C.

R2	Označení preparátu
palmitoyl	N-palmitoyl PE
dekanoyl	N-dekanoyl PE
oleoyl	N-oleoyl PE
linoleoyl	N-linoleoyl PE
elaidoyl	N-elaidoyl PE

-12 CZ 308596 B6

Příklad 14: Příprava N-palmitoyl-fosfatidylethanolaminu

UN

R

R' = směs acylů, majoritně palmitoyl R” = směs acylů, majoritně oleoyl

Postupem uvedeným v příkladu 13 byl připraven N-palmitoyl-fosfatidylethanolamin.

Ή NMR (600 MHz, Methanol-d4) δ 5,50 - 5,32 (m, 2H), 5,27 (quintet, J = 5,5 Hz, 1H), 4,46 (dd, J = 12,0, 3,1 Hz, 1H), 4,20 (dd, J = 12,1, 6,9 Hz, 1H), 4,12 (ddd, J = 9,5, 6,2, 3,5 Hz, 2H), 4,08 4,01 (m, 2H), 3,26 - 3,21 (m, 2H), 2,40 - 2,37 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 2,34 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 2,28 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,13 - 2,00 (m, 4H), 1,62 (m, 6H), 1,31 (m, 82H), 0,92 (t, J = 6,9 Hz, 9H).

Signály ostatních derivátů mastných kyselin: 5,50 - 5,32 (m, 2H), 2,90 - 2,77 (m, 3H).

¹³C NMR (151 MHz, Methanol-d4) δ 173,48, 173,14, 172,95, 129,51, 129,31,70,36, 63,51,61,51, 60,86, 40,24, 33,53, 31,67, 29,5-28,8 (mnohočetné signály), 24,85, 24,63, 22,33, 13,03.

Příklad 15: Příprava N-dekanoyl-fosfatidylethanolaminu

R' = směs acylů, majoritně palmitoyl R” = směs acylů, majoritně oleoyl

Postupem uvedeným v příkladu 13 byl připraven N-dekanoyl-fosfatidylethanolamin.

Příklad 16: Příprava N-oleoyl-fosfatidylethanolaminu

R' = směs acylů, majoritně palmitoyl R” = směs acylů, majoritně oleoyl

Postupem uvedeným v příkladu 13 byl připraven N-oleoyl-fosfatidylethanolamin.

-13 CZ 308596 B6

Příklad 17: Příprava N-linoleoyl-fosfatidylethanolaminu

O /

R' = směs acylů, majoritně palmitoyl R” = směs acylů, majoritně oleoyl

Postupem uvedeným v příkladu 13 byl připraven N-linoleoyl-fosfatidylethanolamin.

Příklad 18: PřípravaN-elaidoyl-fosfatidylethanolaminu

S. \......

tí X '—\

Ós

R·'

R' = směs acylů, majoritně palmitoyl R” = směs acylů, majoritně oleoyl

Postupem uvedeným v příkladu 13 byl připraven N-elaidoyl-fosfatidylethanolamin.

Příklad 19: Příprava 1-acyl-lysofosfolipidů odvozených od N-palmitoyl PE, N-dekanoyl PE, Noleoyl PE, N-linoleoyl PE a N-elaidoyl PE ve směsi s odštěpenými mastnými kyselinami

N-acyl fosfolipid byl v 10% (w/v) koncentraci opakovaně vortexován a sonikován při 43 °C v 50mM Tris.HCl (pH 8,0, 50mM KC1, 8mM CaCL), dokud nebyl fosfolipid dokonale dispergován a pak byl zpracován, jak uvedeno v příkladu 4 - byl štěpen fosfolipázou A2 v poměru 2 jednotky enzymu/mg fosfolipidu při 43 °C a průběh reakce sledován pomocí tenkovrstevné chromatografie na silikagelu (TLC), vyvíjené směsí chloroform methanol: voda 20:10:1. Po úplném naštěpení byla reakce zastavena přidáním EDTA do koncentrace lOmM a krátkodobě uložena při 0 až 4 °C.

Preparáty byly označeny tak, jak je uvedeno v tabulce:

R2	Označení preparátu
palmitoyl	N-palmitoyl PE/E-DAPL+FA
dekanoyl	N-dekanoyl PE/E-DAPL+FA
oleoyl	N-oleoyl PE/E-DAPL+FA
linoleoyl	N-linoleoyl PE/E-DAPL+FA
elaidoyl	N-elaidoyl PE/E-DAPL+FA

Příklad 20: Odstranění odštěpených volných mastných kyselin (FA) z preparátů (směsí)

Preparáty 1-acyl-lysofosfolipidů, připravených podle předkládaných příkladů enzymatickou deacylací v poloze sn-2 za vzniku směsi s mastnými kyselinami (tj. PE/E-DAPL+FA, PC/EDAPL+FA a E-DAPL+FA, sn-1 hexanoyl PC/E-DAPL+FA, sn-1 stearoyl PC/E-DAPL+FA, sn-1 trimethylhexanoyl PC/E-DAPL+FA, sn-1 cyklopentanpropionyl PC/E-DAPL+FA, N-palmitoyl PE/E-DAPL+FA, N-dekanoyl PE/E-DAPL+FA, N-oleoyl PE/E-DAPL+FA, N-linoleoyl PE/EDAPL+FA, N-elaidoyl PE/E-DAPL+FA), byly rozpuštěny v ethanolu a pak byly postupně přidány

-14CZ 308596 B6 voda a chloroform tak, aby bylo dosaženo poměru ethanol:voda:chloroform 3:2:4. Směs byla intensivně třepána 10 min, centrifugována 5 min 3000xg při laboratorní teplotě a chloroformová fáze byla isolována a odpařena. Odparek byl promýván n-hexanem při 0 až 4 °C. Nerozpustné lysofosfolipidy byly získány centrifůgací a sediment ještě 3x promyt směsí «-hexan:aceton 1:2 (4 °C) a usušen. Usušené preparáty již prakticky neobsahovaly volné mastné kyseliny a byly označeny PE/E-DAPU, PC/E-DAPL, E-DAPL, sn-1 hexanoyl PC/E-DAPL, sn-1 stearoyl PC/EDAPL, sn-1 trimethylhexanoyl PC/E-DAPL, sn-1 cyklopentanpropionyl PC/E-DAPL, Npalmitoyl PE/E-DAPL, N-dekanoyl PE/E-DAPL, N-oleoyl PE/E-DAPL, N-linoleoyl PE/E-DAPL aN-elaidoyl PE/E-DAPL.

\ / + N—

sn-1 hexanoyl PC/EDAPL

sn-ltrimethylhexanoyl PC/EDAPL

sn-1 cyklopentanpropionyl

PC/E-DAPL

N-palmitoyl PE/E-DAPL R' = směs acylů, majoritně palmitoyl hn“4

N-dekanoyl PE/E-DAPL R'= směs acylů, majoritně palmitoyl

N-oleoyl PE/E-DAPL R' = směs acylů, majoritně palmitoyl

N-linoleoyl PE/E-DAPL R' = směs acylů, majoritně palmitoyl

N-elaidoyl PE/E-DAPL R' = směs acylů, majoritně palmitoyl

N-palmitoyl PE/E-DAPL & A

R' = směs acylů, majoritně palmitoyl

Ή NMR (600 MHz, Methanol-4) δ 4,19 (dd, J = 11,4, 4,3 Hz, 1H), 4,13 (dd, J = 11,3, 6,2 Hz, 1H), 4,08 (ddd, J = 9,5, 6,2, 3,5 Hz, 2H), 4,02 - 3,97 (m, 1H), 3,95 - 3,88 (m, 2H), 3,19 - 3,15 (m, 2H), 2,37 (t, J = 7,5 Hz, 4H), 2,37- 2,15 (m, 2H), 1,63 (q, J = 7,3 Hz, 4H), 1,31 (s, 52H), 0,92 (t, J = 7,0 Hz, 2H).

-15 CZ 308596 B6 ¹³C NMR (151 MHz, Methanol-d4) δ 174,13, 173,95, 2 x 130,05, 68,39, 66,41, 64,87, 61,62, 40,28, 33,50, 31,66, 29,62-28,69 (mnohočetné signály), 24,60, 22,32, 12,96.

Příklad 21: Stanovení vlivu jednotlivých připravených látek a směsí na růst nádorových buněk v tkáňové kultuře.

Tento příklad ukazuje stanovení vlivu připravených látek a směsí, tj. PE/ E-DAPL+FA, PC/ EDAPL+FA a E-DAPL+FA, sn-1 hexanoyl PC/E-DAPL+FA, sn-1 stearoyl PC/E-DAPL+FA, sn-1 trimethylhexanoyl PC/E-DAPL+FA, sn-1 cyklopentanpropionyl PC/E-DAPL+FA, N-palmitoyl PE/E-DAPL+FA, N-dekanoyl PE/E-DAPL+FA, N-oleoyl PE/E-DAPL+FA, N-linoleoyl PE/EDAPL+FA, N-elaidoyl PE/E-DAPL+FA a PE/ E-DAPL, PC/ E-DAPL, E-DAPL, sn-1 hexanoyl PC/E-DAPL, sn-1 stearoyl PC/E-DAPL, sn-1 trimethylhexanoyl PC/E-DAPL, sn-1 cyklopentanpropionyl PC/E-DAPL, N-palmitoyl PE/E-DAPL, N-dekanoyl PE/E-DAPL, N-oleoyl PE/E-DAPL, N-linoleoyl PE/E-DAPL a N-elaidoyl PE/E-DAPL, na růst nádorových buněk v tkáňové kultuře. Jako kontrola byly použity výchozí fosfolipidy, buď PE, PC, sn-1 stearoyl PC, N-palmitoyl PE nebo výchozí směs fosfolipidů, za zcela stejných koncentrací a podmínek.

Cytotoxická aktivita preparátů byla testována v kulturách nádorových buněk C32 (lidský melanom), TIB-75 (indukují myší hepatokarcinom), LMH (kuřecí hepatokarcinom).

A) Buňky C32 byly kultivovány v médiu D-MEM, obsahujícím 10% fetálního séra a penicilin+streptomycin, při 37 °C v atmosféře vzduch/5% CO2, nasycené vodní parou. Každá jamka obsahovala 5x 10⁴ buněk a 0,5 ml média. Testované preparáty byly přidávány k buňkám v koncentracích 0, 2,5, 5, 10, 20 40, 80, 160 a 240 μΜ. Po 16 hodinách kultivace byl stav buněk zaznamenán.

B) Buňky LMH byly kultivovány v médiu D-MEM, obsahujícím 10% fetálního séra a penicilin+streptomycin, při 37 °C v atmosféře vzduch/5% CO2, nasycené vodní parou. Každá jamka obsahovala 5xl0⁴ buněk a 0,5 ml média. Testované fosfolipidy byly přidávány k buňkám v koncentracích 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 a 240 μΜ. Po 16 hodinách kultivace byl stav buněk zaznamenán.

C) Buňky TIB-75 byly kultivovány v médiu D-MEM, obsahujícím 10% fetálního séra a penicilin+streptomycin, při 37 °C v atmosféře vzduch/5% CO2, nasycené vodní parou. Každá jamka obsahovala 5x 10⁴ buněk a 0,5 ml média. Testované fosfolipidy byly přidávány k buňkám v koncentracích 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 a 240 μΜ. Po 16 hodinách kultivace byl stav buněk zaznamenán.

Přítomnost volných mastných kyselin neměla významný vliv na toxicitu preparátů vůči testovaným buňkám.

Kontrolní PE, PC, sn-1 stearoyl PC, N-palmitoyl PE nebo výchozí směs fosfolipidů za zcela stejných koncentrací neovlivnily fenotyp ani nesnížily rychlost růstu buněk. Pro srovnání byly otestovány 2-acyl-lysofosfolipidy připravené z PC, PE a celkových fosfolipidů, tyto látky jsou mírně cytotoxické, jsou zapotřebí asi 4 až 5x vyšší jejich koncentrace, aby se toxicitou vyrovnaly PE/E-DAPL, PC/E-DAPL, E-DAPL a sn-1 stearoyl PC/E-DAPL.

Cytotoxicita preparátů byla kvantifikována pomocí stanovení obsahu ATP v buňkách a pomocí příjmu neutrální červeně a bylo stanoveno IC50atp a IC50nr [μΜ]. Obě metody poskytly prakticky stejné hodnoty. Tabulka ukazuje IC50atp.

	C32 IC50atp[pM]	LMH IC50atp[pM]	TIB-75 IC50atp[pM]
sn-1 stearoyl PC/E-DAPL	45	40	45
sn-1 hexanoyl PC/E-DAPL	130	135	135

-16 CZ 308596 B6

sn-1 cyklopentanpropionyl PC/E-DAPL	150	130
sn-1 trimethylhexanoyl PC/E-DAPL	130	140
PC/E-DAPL	50	35	45
PE/E-DAPL	35	30	35
N-palmitoyl PE/E-DAPL	150	140	140
N-dekanoyl PE/E-DAPL	180
N-oleoyl PE/E-DAPL	180
N-linoleoyl PE/E-DAPL	180
2-acyl PC (15-20% 1-acyl PC)	200		210
2-acyl PE(15-20% 1-acyl PE)	200		200

Příklad 22: Působení (E-DAPL+FA) na rozvoj experimentálních jatemích nádorů kuřat

1-acyl-lysofosfatidyl deriváty E-DAPL+FA byly 5x týdně v potravě podávány kuřatům v množství 40 mg/20 g váhy kuřete, u nichž byly předem, ještě v embryonálním stadiu, indukovány hepatokarcinomy pomocí injekce LMH hepatokarcinomových buněk. Pokus byl vyhodnocen 25. den od vylíhnutí kuřat.

Kuřata	Počet kuřat na začátku pokusu	Počet kuřat přežívajících 25. den
infikovaná, neléčená	8	1 (mnohačetné velké jatemí nádory)
infikovaná, léčená E-DAPL+FA	8	4 (3 bez nádorů, 1 kuře 2 malé jatemí nádory)

Příklad 23: Působení E-DAPL na rozvoj experimentálních podkožních nádorů myší

Podkožní nádory byly vyvolány u 16 myší BALB/c (ve věku 8 až 10 týdnů) injekcí syngenních buněk TIB-75. Skupině 8 myší bylo potom Ix týdně aplikováno 8 mg E-DAPL v 0,1 ml fyziologického roztoku a skupině 8 myší Ix týdně 8 mg kontrolních fosfolipidů (PLs) vždy do oblasti rozvíjejícího se nádoru. Po 7 týdnech byly nádory vypitvány, změřen jejich průměr ve třech na sebe zhruba kolmých směrech a z průměrných hodnot vypočteny objemy koulí. Průměrný objem takto aproximovaných nádorů byl u myší léčených E-DAPL 30 % objemu nádorů u myší léčených kontrolními PLs.

Příklad 24: Působení E-DAPL na rozvoj experimentálních intraperitoneálních nádorů myší

Intraperitoneální nádory byly vyvolány u 20 myší BALB/c (ve věku 8 až 10 týdnů) injekcí syngenních buněk TIB-75. Kontrolní skupina 10 myší byla potom krmena po dobu osmi týdnů nízkotučnou experimentální potravou (Altromin) a druhá skupina toutéž dietou obsahující 8 mg EDAPL v každých 5 g krmivá. Myši dostávaly experimentální potravu vždy 4 dny v týdnu; zbylé 3 dny dostávaly standardní potravu. Do 6 týdnů od zahájení pokusu 2 kontrolní myši zahynuly na TIB-75 nádory. Poté byly 2 stejné skupinky kontrolních a léčených myší vypitvány. Průměrná hmotnost nádorů u léčených myší byla 75 % hmotnosti kontrolních nádorů. Po dalších 2 týdnech byly analyzovány zbývající myši. Průměrná hmotnost nádorů u léčených myší byla nyní 40 % hmotnosti kontrolních nádorů. Pokus ukazuje, že E-DAPL podávaný v potravě zpomaluje i růst experimentálních intraperitoneálních nádorů.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. 1-acyl-lysofosfatidyl deriváty obecného vzorce I

O h₂c-o-c-r

OH“CH

I O , . pí

CH-,-Ο-Ρ-Ο“CH,-~CH₂~N™ R2

L ^XR3

O (I) kde

Rje C4 až C30 alifatický uhlovodíkový řetězec nebo C5 až CIO cyklický či cyklus obsahující alkyl nebo alkenyl,

R1 je vybrán z H nebo Cl až CIO alkylu,

R2 je vybrán z H, CIO až C30 acylu nebo Cl až CIO alkylu,

R3 je vybrán z H nebo Cl až CIO alkylu, nebo R3 není přítomen, pro použití pro léčení melanomu nebo hepatokarcinomu.
2. 1-acyl-lysofosfatidyl deriváty pro použití podle nároku 1, kde

R1 je vybrán z Cl až C6 alkylu, a/nebo

R2 je vybrán z Cl až C6 alkylu, a/nebo

R3 je vybrán z Cl až C6 alkylu.
3. 1-acyl-lysofosfatidyl deriváty pro použití podle nároku 1 nebo 2, kde Rje vybrán ze skupiny zahrnující C5 až CIO lineární, rozvětvený nebo cyklický či cyklus obsahující alkyl nebo alkenyl;

s výhodou je R vybrán ze skupiny zahrnující pentyl, 3,5,5-trimethylpentyl, cyklopentylethyl.
4. 1-acyl-lysofosfatidyl deriváty pro použití podle nároku 1 nebo 2, kde Rje vybrán ze skupiny zahrnující C13 až C20 lineární nebo rozvětvený alkyl nebo alkenyl, s výhodou ze skupiny zahrnující C15,C16, Cl7, C18 nebo C19 lineární alkyl nebo alkenyl.
5. 1-acyl-lysofosfatidyl deriváty pro použití podle nároku 1, kde R2 je vybrán ze skupiny zahrnující C10-C20 acyly obsahující lineární nasycené nebo nenasycené řetězce, s výhodou ze skupiny zahrnující dekanoyl, palmitoyl, stearoyl, oleoyl, linoleoyl, elaidoyl.
6. 1-acyl-lysofosfatidyl deriváty pro použití podle nároku 1 nebo 2, kde je alespoň jeden z Rl, R2, R3 methyl, s výhodou jsou Rl, R2 i R3 methyly.
7. 1-acyl-lysofosfatidyl deriváty pro použití podle nároku 1, kde jsou Rl a R2 vodík, a R3 není přítomen.

-18 CZ 308596 B6
8. 1-acyl-lysofosfatidyl deriváty pro použití podle nároku 1, kde R1 je H a R2 je C10-C20 acyl obsahující lineární nasycené nebo nenasycené řetězce.