CN103906519B - 关节病治疗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于，提供对于关节软骨的破坏具有抑制作用、治疗效果高的关节病治疗剂。根据本发明，提供以环状磷脂酸或卡巴环状磷脂酸作为有效成分的关节病治疗剂。

Description

关节病治疗剂
技术领域
本发明涉及以环状磷脂酸或卡巴环状磷脂酸（カルバ環状ホスファチジン酸）作为有效成分的关节病治疗剂。
背景技术
关节病存在变形性关节病、关节风湿病、风湿热等，其中，变形性关节病和关节风湿病，患者数多，认为为主要的关节病。变形性关节病存在先天性或继发性的变形性关节病、和由于老化而关节软骨变形所导致的原发性的变形性关节病，原发性的变形性关节病存在随着老年人人口增加而增加的倾向。对于变形性关节病和关节风湿病而言，在病因、病状方面存在很大不同，但是在最终都会由于关节软骨的破坏而抑制关节机能方面是共通的。对于变形性关节病等风湿性疾病的以往的治疗药，为阿斯匹林、吲哚美辛等镇痛抗炎剂，但是这些镇痛抗炎剂对于关节软骨的破坏没有抑制作用，金制剂、免疫抑制剂、甾体剂等治疗药在临床上也没有发现关节软骨的破坏抑制作用。
关节软骨由软骨细胞和软骨基质构成，软骨基质，为软骨细胞所产生的纤维性蛋白质、即胶原和蛋白聚糖(蛋白多糖复合体)与透明质酸结合，形成了高度的三维结构的基质，通过在其中保持大量的水分，维持正常的关节机能。
作为与上述治疗药不同的变形性关节病的治疗剂，临床适用发现有关节软骨的保护和修复作用、关节内的润滑作用的透明质酸的关节内注射，但是存在侵袭性，现状是患者的QOL不充分。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于，提供对于关节软骨的破坏具有抑制作用、治疗效果高的关节病治疗剂。
用于解决问题的方案
本发明人等认为，若通过在关节软骨细胞中也促进透明质酸产生，可以抑制关节软骨的破坏，则能够成为变形性关节病等的有力的治疗剂，并进行了研究，结果发现，在源自变形性关节病患者的软骨细胞中，环状磷脂酸及其衍生物显著地促进细胞内的透明质酸产生，在变形关节病模型动物中也发现效果，从而完成了本发明。
即，根据本发明，提供一种关节病治疗剂，其含有下述式(1)所示的化合物作为有效成分。
[化学式1]
(式中，R是碳原子数为1～30的直链状或支链状烷基、碳原子数为2～30的直链状或支链状烯基、或者碳原子数为2～30的直链状或支链状炔基，这些基团可以含有环烷烃环或芳香环。X和Y各自独立地表示氧原子、或亚甲基，但是X和Y不会同时为亚甲基。M是氢原子或碱金属原子。)
优选式(1)中，X和Y是氧原子。
优选式(1)中，X或Y中的一方是氧原子、另一方是亚甲基。
优选式(1)所示的化合物是1-油酰基环状磷脂酸或1-棕榈油酰基环状磷脂酸以及它们的衍生物的卡巴环状磷脂酸。
根据本发明，进而提供一种关节病的治疗方法，其包括将上述式(1)所示的化合物给予伴随有关节病的患者。
根据本发明，进而提供上述式(1)所示的化合物在关节病的治疗剂的制造中的应用。
发明的效果
根据本发明，可以提供抑制关节软骨的破坏、治疗效果高的关节病治疗剂。
附图说明
[图1]图1表示调查环状磷脂酸衍生物对于源自变形性关节病患者的软骨细胞中的透明质酸合成酶基因(HAS1)的表达的作用的结果。
[图2]图2表示调查环状磷脂酸衍生物对于源自变形性关节病患者的软骨细胞中的透明质酸合成酶基因(HAS2)的表达的作用的结果。
[图3]图3表示调查环状磷脂酸衍生物对于源自变形性关节病患者的软骨细胞中的透明质酸合成酶基因(HAS3)的表达的作用的结果。
[图4]图4表示调查环状磷脂酸衍生物对于源自变形性关节病患者的软骨细胞中的透明质酸分解酶基因(HYAL1)的表达的作用的结果。
[图5]图5表示调查环状磷脂酸衍生物对于源自变形性关节病患者的软骨细胞中的透明质酸分解酶基因(HYAL2)的表达的作用的结果。
[图6]图6表示调查环状磷脂酸衍生物对于源自变形性关节病患者的软骨细胞中的透明质酸产生的作用的结果。
[图7]图7表示调查环状磷脂酸衍生物(试验化合物：ScPA)对于源自变形性关节病患者的滑膜细胞中的透明质酸合成酶基因(HAS1、HAS2、HAS3)的表达的作用的结果。
[图8]图8表示调查环状磷脂酸衍生物对于源自变形性关节病患者的滑膜细胞中的透明质酸分解酶基因((HYAL1、HYAL2)的表达的作用的结果。
[图9]图9表示疼痛评价(两后肢重量分配比)的推移。平均值±标准误差n=6、与第1组(介质给药组)相比，为*、**；在p<0.05、p<0.01下显著(Student的t检验、Aspin-Welch的t检验)
[图10]图10表示肿胀评价(两后肢关节肿胀比)的结果。平均值±标准误差n=6、与第1组(介质给药组)相比，为*、**；在p<0.05、p<0.01下显著(Student的t检验、Aspin-Welch的t检验)
[图11]图11表示股骨髁和胫骨髁的病理组织学评分。
[图12]图12表示代表例的病理组织图像。A为介质给药组(动物编号101)、右股骨内侧 HE染色×200 关节软骨部 发现软骨细胞排列不整齐(箭头)、形成串状集簇(箭头)。B为被试验物质给药组(动物编号201)、右股骨内侧 HE染色×200 关节软骨部 表现出软骨糜烂(极轻度)。C为介质给药组(动物编号101)、右股骨内侧 SO染色×200 关节软骨部 表现出蛋白聚糖的染色性降低(极轻度)。D为被试验物质给药组(动物编号201)、右股骨内侧SO染色×200 关节软骨部 没有发现变化。
具体实施方式
以下对本发明进行更具体的说明。
本发明的关节病治疗剂，可以用于变形性关节病、关节风湿病、风湿热等(特别是变形性关节病)关节病的治疗，含有环状磷脂酸、或卡巴环状磷脂酸或它们的盐作为有效成分。作为环状磷脂酸、或卡巴环状磷脂酸或其盐，若表现出本发明效果则没有特别限定，但是可以优选使用下述式(I)所示的化合物。
[化学式2]
(式中，R是碳原子数为1～30的直链状或支链状烷基、碳原子数为2～30的直链状或支链状烯基、或者碳原子数为2～30的直链状或支链状炔基，这些基团可以含有环烷烃环或芳香环。X和Y各自独立地表示氧原子、或亚甲基，但是X和Y不会同时为亚甲基。M是氢原子或碱金属原子。)
式(I)中，作为取代基R表示的碳原子数为1～30的直链状或支链状烷基的具体例，可列举出例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基等。
作为取代基R表示的碳原子数为2～30的直链状或支链状烯基的具体例，可列举出例如烯丙基、丁烯基、辛烯基、癸烯基、十二碳二烯基、十六碳三烯基等，更具体而言，可列举出8-癸烯基、8-十一碳烯基、8-十二碳烯基、8-十三碳烯基、8-十四碳烯基、8-十五碳烯基、8-十六碳烯基、8-十七碳烯基、8-十八碳烯基、8-二十碳烯基、8-二十二碳烯基、十七碳-8,11-二烯基、十七碳-8,11,14-三烯基、十九碳-4,7,10,13-四烯基、十九碳-4,7,10,13,16-五烯基、二十一碳-3,6,9,12,15,18-六烯基等。
作为取代基R表示的碳原子数为2～30的直链状或支链状炔基的具体例，可列举出例如8-癸炔基、8-十一碳炔基、8-十二碳炔基、8-十三碳炔基、8-十四碳炔基、8-十五碳炔基、8-十六碳炔基、8-十七碳炔基、8-十八碳炔基、8-二十碳炔基、8-二十二碳炔基、十七碳-8,11-二炔基等。
作为上述烷基、烯基或炔基中可以含有的环烷烃环的具体例，可列举出例如环丙烷环、环丁烷环、环戊烷环、环己烷环、环辛烷环等。环烷烃环可以含有一个以上杂原子，作为这种例子，可列举出例如环氧乙烷环、氧杂环丁烷环、四氢呋喃环、N-甲基前赖氨酸(プロリジン)环等。
作为上述烷基、烯基或炔基中可以含有的芳香环的具体例，可列举出例如苯环、萘环、吡啶环、呋喃环、噻吩环等。
因此，作为取代基R被环烷烃环取代而成的烷基时的具体例，可列举出例如环丙基甲基、环己基乙基、8,9-桥亚甲基十五烷基等。
作为取代基R被芳香环取代而成的烷基时的具体例，可列举出苄基、苯乙基、对戊基苯基辛基等。
R优选为碳原子数为9～17的直链状或支链状烷基、碳原子数为9～17的直链状或支链状烯基、或者碳原子数为9～17的直链状或支链状炔基。R进一步优选为碳原子数为9、11、13、15或17的直链状或支链状烷基、或者碳原子数为9、11、13、15或17的直链状或支链状烯基。R特别优选为碳原子数为9、11、13、15或17的直链状或支链状烯基。
通式(1)所示的化合物中的X和Y各自独立地表示氧原子(-O-)或亚甲基(-CH2-)，但是X和Y不会同时为亚甲基。即，X和Y的组合为如下所述三种。
(1)X为氧原子、Y为氧原子。
(2)X为氧原子、Y为亚甲基。
(3)X为亚甲基、Y为氧原子。
式(I)所示的环状磷脂酸衍生物中的M为氢原子或碱金属原子。作为碱金属原子，可列举出例如锂、钠、钾等，特别优选为钠。
作为本发明中使用的式(1)所示的化合物的具体例，特别优选为作为1位酰基，具有R是碳原子数为17的烯基的油酰基(简称为C18：1)、 R是碳原子数为15的烯基的棕榈油酰基(简称为C16：1)的环状磷脂酸以及卡巴环状磷脂酸衍生物。
式(I)的化合物根据其取代基的种类，有可能存在立体异构体、几何同分异构体、互变异构体、或光学异构体等异构体，但是全部可能的异构体以及以任意比例含有两种以上该异构体的混合物也处于本发明的范围内。
另外，式(I)的化合物有时以与水或各种溶剂的加成物(水合物或溶剂合物)的形式存在，这些加成物也处于本发明的范围内。进而，式(I)的化合物及其盐的任意晶体形式也处于本发明的范围内。
通式(1)所示的化合物中X和Y为氧原子的化合物，例如可以根据日本特开平5-230088号公报、日本特开平7-149772号公报、日本特开平7-258278号公报、日本特开平9-25235号公报中记载的方法等化学性地合成。
另外，通式(I)所示的化合物中X和Y为氧原子的化合物可以根据日本特开2001-178489号公报中记载的方法，通过使磷脂酶D作用于溶血型磷脂来合成。在此使用的溶血型磷脂若为可以与磷脂酶D作用的溶血型磷脂，则没有特别限定。溶血型磷脂已知很多种类，已知有脂肪酸种类不同的，具有醚或乙烯基醚键的分子种类等，它们可以以市售品形式获得。作为磷脂酶D，源自圆白菜、花生等高等植物的磷脂酶D，源自色褐链霉菌(Streptomyceschromofuscus,)、马杜拉放线菌(Actinomadula sp.)等微生物的磷脂酶D可以以市售试剂形式获得，但是通过源自马杜拉放线菌No. 362的酶，极具选择性地合成环状磷脂酸(日本特开平11-367032号说明书)。溶血型磷脂与磷脂酶D的反应，若为酶可以表现出活性的条件则没有特别限定，例如通过在含有氯化钙的乙酸缓冲液(pH为5〜6左右)中、在室温～加温下(优选37°C左右)下反应1～5小时左右来进行。所生成的环状磷脂酸衍生物可以根据常规方法，通过萃取、柱色谱、薄层色谱(TLC)等来精制。
另外，通式(1)所示的化合物中X为氧原子、Y为亚甲基的化合物，可以根据文献记载的方法(Kobayashi,S.,等,Tetrahedron Letters 34,4047-4050(1993))合成，另外，也可以通过国际公开WO2002/094286号公报中记载的方法合成。具体的合成路径的一例如以下所示。
[化学式3]
上述合成路径中，首先用BF3･Et2O使市售的(R)-苄基缩水甘油基醚(1)活化，使n-BuLi作用于甲基膦酸二甲酯得到的锂衍生物反应，由此得到醇(2)。
使所得到的醇在甲苯中，使用过量的对甲苯磺酸的吡啶鎓盐在80℃下反应，由此得到环化物(3)。将该环化物在氢气氛下使用20% Pd(OH)2-C加氢分解，进行脱苄基化(4)。作为缩合剂，使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，与脂肪酸反应，得到偶合物(5)。接着，使用溴三甲基硅烷作为亲核试剂，位置选择性地仅去除甲基，得到环状膦酸(6)。将其使用醚转移到分液漏斗，滴加少量的0.02N的氢氧化钠水溶液，进行分液操作，以钠盐(7)形式萃取、精制目的化合物。
另外，通式(1)所示的化合物中X为亚甲基、Y为氧原子的化合物，可以通过日本特开2004-010582号公报或国际公开WO03/104246号公报中记载的方法合成。
本发明的关节病治疗剂优选以含有一种或两种以上的制剂学上容许的制剂用添加物和作为有效成分的式(1)所示的化合物的药物组合物的形式提供。
本发明的关节病治疗剂可以以各种方式给药，作为优选的给药方式，可以为经口给药或非经口给药(例如，向静脉内、肌肉内、皮下或皮内等的注射，直肠内给药、经粘膜给药等)。作为适于经口给药的药物组合物，可列举出片剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂等，作为适于非经口给药的药物组合物，可列举出例如注射剂、点滴剂、栓剂、经皮吸收剂等，但是本发明的药剂的剂型不限于它们。进而，还可以通过公知的技术制成长效制剂。
对制造本发明的关节病治疗剂中使用的制剂用添加物的种类没有特别限定，本领域技术人员可以适当选择。例如可以使用赋形剂、崩解剂或崩解助剂、粘合剂、润滑剂、包衣剂、基质、溶解剂或助溶剂、分散剂、悬浮剂、乳化剂、缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、等渗剂、pH调节剂、溶解剂、稳定剂等，以这些目的使用的各种具体成分是本领域技术人员所周知的。
作为可以用于经口给药用制剂的制造的制剂用添加剂，例如可以使用葡萄糖、乳糖、D-甘露醇、淀粉或结晶纤维素等赋形剂；羧甲基纤维素、淀粉或羧甲基纤维素钙等崩解剂或崩解助剂；羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或明胶等粘合剂；硬脂酸镁或滑石等润滑剂；羟丙基甲基纤维素、白糖、聚乙二醇或氧化钛等包衣剂；凡士林、液体石蜡、聚乙二醇、明胶、高岭土、甘油、纯化水或固体脂肪等基质。
作为可以用于注射或点滴用制剂的制造的制剂用添加物，可以使用注射用蒸馏水、生理盐水、丙二醇、表面活性剂等可以构成水性或用时溶解型注射剂的溶解剂或溶解助剂；葡萄糖、氯化钠、D-甘露醇、甘油等等渗剂；无机酸、有机酸、无机碱或有机碱等pH调节剂等制剂用添加物。
本发明的关节病治疗剂可以给予人等哺乳动物。
本发明的关节病治疗剂的给药量应该根据患者的年龄、性别、体重、症状和给药途径等条件适当增减，但是通常作为成人每一天的有效成分的量，处于1μg/kg～1000mg/kg左右的范围内，优选处于10μg/kg～100mg/kg左右的范围内。上述给药量的药剂可以一天一次给药，也可以分为数次(例如2～4次左右)给药。
通过以下的实施例对本发明进行具体说明，但是本发明不被实施例所限定。
实施例
实施例1：
(1)方法
(1-1)关节软骨细胞和滑膜细胞的培养
使用由变形性膝关节病的患者在人工膝关节置换术时去除采集的关节玻璃软骨。关节软骨片在洗涤后，通过链霉蛋白酶-胶原酶酶处理，将软骨基质分解，采集细胞，并进行培养、冷冻保存。另外，也采集滑膜细胞。本实施例中，使用这种变形性关节病患者的关节软骨细胞和滑膜细胞，以单层高密度进行培养以避免表型改变，用于实验。培养基使用DMEM+10%FBS+1%抗生素/抗真菌剂（antibiotics/antifungus），融合(confluent)后替代为无血清培养基，开始实验。
(1-2)环状磷脂酸或卡巴环状磷脂酸(cPA)的添加
环状磷脂酸或卡巴环状磷脂酸分别使用C16:1-cPA(cPA)和天然（native） cPA(NcPA)，以浓度(0～50nM)、时间(0～48小时)对透明质酸(HA)产生、透明质酸(HA)合成酶(HAS1、HAS2和HAS3)的表达、以及透明质酸(HA)分解酶(HYAL1和HYAL2)进行了研究。
C16:1-cPA(图中表示为“cPA”)的化学结构如以下所示。
[化学式4]
另外，天然cPA(图中表示为“NcPA”)如下所述制造(参照日本特愿2011-126901的实施例1和3)
将大豆磷脂(卵磷脂含量：70%)10g用含有0.3M氯化钙的100ml的1M乙酸缓冲液(pH6.5)溶解后，添加6000单位的源自链霉素属的磷脂酶A2，40℃下搅拌18小时进行反应。将反应液调整到pH 2.5使酶失活后，添加100ml的氯仿、50ml的甲醇，并进行充分搅拌混合，萃取脂质成分。收集氯仿层，用旋转蒸发器进行减压干燥。向固体成分加入100ml的丙酮，使磷脂沉淀，去除游离脂肪酸。将沉淀物5g溶解于40ml的氯仿，加入1M乙酸缓冲液(pH5.5)10ml，进而添加1500单位的源自马杜拉放线菌属的磷脂酶D，40℃下搅拌18小时的同时进行反应。向反应液添加20ml的3M氯化钠、20ml的0.1M EDTA溶液，40℃下搅拌1小时。进而添加20ml的甲醇，并充分搅拌后，以3000转进行5分钟离心分离，收集氯仿层。用旋转蒸发器将该溶液减压干燥，得到环状磷脂酸钠盐3.8g。由于由卵磷脂含量70%(10g中7g)得到环状磷脂酸Na 3.8g，收率为54.3%。环状磷脂酸钠盐的纯度分析如下进行：使用硅胶板，用氯仿:甲醇:乙酸:5%二亚硫酸钠(100:40:12:5、V/V)展开后，短时间浸渍于5%乙酸铜:8%磷酸:2%硫酸混合液，进行风干后，180℃下加热约10分钟后，对于所生成的点，通过扫描(アトー社制)法进行上述环状磷脂酸钠盐的纯度分析。即，以标准品(97%纯度品)作为对照，通过光密度计测定薄层色谱的点，以面积比进行定量。通过上述工序得到的产物中环状磷脂酸钠盐的纯度为54%。
将上述环状磷脂酸钠盐500mg溶解于5ml的含有10%甲醇的氯仿，施加于硅胶柱，用同一溶剂展开，进而用含有20%甲醇的氯仿展开，分配为10ml的馏分。通过上述TLC法，确认并收集含有环状磷脂酸钠盐的馏分，用旋转蒸发器减压干燥，得到环状磷脂酸钠盐的粉末320mg。本试样的环状磷脂酸钠盐的纯度为95%。
(1-3)HA合成酶以及HA分解酶的表达测定
在试验24小时前，将软骨细胞培养替代为无血清培养基，添加各种浓度(0、5、10、25、50μM)的cPA或N-cPA。同样地，在试验24小时前，将骨膜细胞培养替代为无血清培养基，添加各种浓度(0、10、25μM)的cPA。在0、0.5、1、2、4小时后回收细胞全RNA，合成cDNA，用实时PCR进行HAS1、HAS2、HAS3、HYL1、和HYL2的表达定量。表达量以相对于β肌动蛋白(=对照基因)的相对表达量求得，无添加对照或添加前值表示为1。
具体而言，如下所述，通过比较样品中的标的与对照的循环数的阈值(Ct：循环数的阈值（cycle number threshold）)之差、和对照样品中的Ct的ΔΔCt法，算出表达量比。
1)使用各样品中的Ct，算出ΔCt
ΔCt = Ct(标的基因)-Ct(对照基因)
2)算出ΔΔCt
ΔΔCt = ΔCt(对象样品)-ΔCt(对照样品)
3)校正对象样品中的标的基因表达
2(-ΔΔCt)
4)使对照样品中的校正后的水平为1，算出标的基因变化
(1-4)透明质酸(HA)产生的测定
在试验48小时前，将软骨细胞培养替代为无血清培养基，添加各种浓度(0、10、50nM)的cPA、N-cPA。0、6、12、24、48小时后采集培养上清。通过使用源自牛鼻软骨的HA结合蛋白质的夹心ELISA法(QnE Hyaluronic Acid(HA) ELISA Assay kit; Biotech TradingPartners, Inc)，定量HA产生。
(2)结果
(2-1)HA合成酶以及HA分解酶的表达的测定结果
对于软骨细胞的HA合成酶以及HA分解酶的表达的测定结果如图1～图5所示。如图1～图5所示，C16:1-cPA(cPA)浓度依赖性地持续地诱导HAS2表达。HAS1、3在添加2小时后短暂性地诱导表达，但是4小时后表达降低。NcPA也与此相同。对HA分解酶(HYL1、2、3)的表达没有影响。由上述结果可知，cPA和NcPA诱导HA合成酶。另外，对于滑膜细胞，HA合成酶的表达的测定结果如图7所示，HA分解酶的表达的测定结果如图8所示。
(2-2)透明质酸(HA)产生的测定结果
HA产生的测定结果如图6所示。如图6所示，C16:1-cPA(cPA)计时性地促进软骨细胞HA合成，并释放到细胞外。48小时后，50nM添加组与对照相比，发现约3倍的HA增加。NcPA也表现出同样的作用。由上述结果可知，C16:1-cPA(cPA)和NcPA对于OA关节软骨细胞促进HA产生。
(3)结论
确认式(1)所示的环状磷脂酸或卡巴环状磷脂酸与皮肤成纤维细胞的情况同样地在人OA关节软骨细胞中诱导HA合成酶表达，促进HA产生。
实施例2：ScPA对于兔子变形性膝关节病的药效评价
(1)方法
(1-1)使用动物以及饲养条件
使用11～12周龄的雄兔子(Kbs:NZW)12只。兔子在14.4～24.9℃、7点～19点的照明时间(12小时)、连续通风、1只/笼的条件下饲养。饲料使用CR-3(日本クレア株式会社)(150g/天)，饮水使用自来水。
(1-2)给予物质
使用(9Z)-9-十八烯酸-(2-羟基-2-氧化物-1,2-氧杂磷杂环戊烷-4-基)甲酯钠盐：C18:1-cPA(以下为ScPA)。
[化学式5]
介质使用生理盐水。
(1-3)变形性关节病模型的制作
将深麻醉下的兔子的右后肢膝关节周围用电剪刀剃毛，用聚烯吡酮碘(Isodine)消毒。用手术刀将右后肢内侧的外皮切开，进而将膝盖韧带的内侧与关节囊的分界线切口后，切断内侧副韧带。切断后，大幅展开关节囊，露出内侧半月板后全部摘除。摘除半月板后，将关节囊的周围组织和表皮缝合。缝合时用含有抗生素(Viccillin、明治制果(株))的生理盐水(500mg(效价)/20 mL )洗涤手术部位。
外科的处置当天(第0天)禁食，给水为自由摄水。觉醒的确认，以动物自发地活动头部的状态作为觉醒。直至确认觉醒为止期间，为了防止该动物的体温降低，用毛巾覆盖躯干，由此保温，为了防止淤血，适当交换体位。直至处置后第5天(第5天Day5)为止为了预防感染，1天1次肌肉内给予抗生素(Viccillin、3单位/kg)。
制作处理模型后，使体重均匀地分为2组，1组6只，即介质给药组(动物编号101～106)和被试验物质(ScPA)给药组(动物编号201～206)。
(1-4)被试验物质和介质的关节腔内给药
被试验物质和介质的给药如以下所述进行。
给药途径：关节腔内给药
给药部位：右后肢(处置肢)
给药次数：第7、11、14、18、21、25、28、32、35和39天
给药用量：被试验物质：10μg/兔子(容量0.2mL)
介质：0.2mL/兔子
给药方法：用1.0mL的注射器(テルモ株式会社)和27G的注射针(テルモ株式会社)进行。
(1-5)疼痛评价(两后肢重量分配比)
测定次数：以处置前、处置1、2、3、4、5和6周后总计7次的频率进行。
测定方法：对于每一肢分别使用体重计测定负荷于左右后肢的体重，由此处置肢(右后肢)的分配比通过下式求得。
处置肢(右后肢)重量分配比(%)=[右后肢(kg)/(右后肢(kg)+左后肢(kg))]×100。
(1-6)肿胀评价(两后肢关节肿胀比)
测定次数：处置6周后进行。
测定方法：在左右后肢的关节部位，使用数字游标卡尺测定最宽的部位，通过下式求得由于变形性关节病诱发的关节部的肿胀。
处置肢(右后肢)肿胀比(%)=[(右后肢(mm)-左后肢(mm))/(左后肢(mm)+左后肢(mm))]×100。
(1-7)生物体材料采集(第42天)和采集后的处理
对于深麻醉下的动物，通过切开四肢，放血致死。放血致死后，摘除处置后肢(右后肢)的膝关节部位的股骨髁部和胫骨髁部，并用10%中性缓冲福尔马林液固定。
(1-8)病理组织标本的制作以及病理组织学的评价
将浸渍固定于10%中性缓冲福尔马林溶液的股骨、胫骨进行EDTA脱钙。脱钙结束后，根据常规方法，将以下的有色的部位进行石蜡包埋后，薄切成4μm，进行苏木精･曙红(HE)染色以及番红O(蛋白聚糖)染色，用光学显微镜(OLYMPUS (株)、型号：BX51TF)进行病理组织学的检查。病理组织标本中的软骨变性的程度根据以下的表1记载的评价基准(Kikuchi T, Yoneda H et al: Osteoarthritis cartilage, 4; 99～(1996))评价。即，以5等级对表层消失、软骨糜烂、粗糙化/龟裂、蛋白聚糖染色性(番红O（safrani O）染色性)降低、软骨细胞排列不整齐、软骨细胞消失、软骨下骨露出、软骨细胞串状集簇的8个项目进行评价(0～+4)，各项目的评分的总和作为综合评分。需要说明的是，对于表1的评价基准中没有具体基准的观察结果，根据以下的表2中记载的评价基准(石黒直树等；Journal ofSurgery,29:112～(2010))进行评价。
[表1]
a)小：2-4细胞，中等：5-8细胞，大：9或更多细胞。
[表2]
(1-9)数据的处理和统计解析
对于两后肢重量分配比和两后肢关节肿胀比，算出组平均值(mean)和其标准误差(SE)后，在被试验物质给药组与介质给药组之间进行F检验，若分散没有不同则通过Student的t检验，若分散存在不同则通过Aspin-Welch的t检验，对于病理组织学的检查中的评价项目的综合评分，算出组平均值(mean)和其标准误差(SE)后，通过Mann-Whitney的U检验检验2组之间的平均值之差。需要说明的是，双侧5和1%作为显著性水平。
(2)结果
(2-1)疼痛评价(两后肢重量分配比)
表3和图9表示由模型制作(0天)直至生物体材料采集日(第42天)为止的两后肢重量分配比的推移。介质给药组直至第14天为止发现源自处置的外科性侵袭的恢复，但是这以后经日地诱发变形性关节病，由于随之的疼痛施加于处置肢(右后肢)的体重的比例减少，在生物体材料采集日(第42天)示出28.%的低值。另一方面，被试验物质给药组直至第14天为止与介质给药组同样地发现源自处置的外科性侵袭的恢复，这以后与介质给药组相比，负荷于处置肢(右后肢)的重量的比例直至生物体材料采集日(第42天)为止示出高值，在第42天的测定中，发现显著差异(p=0.0053)。
[表3]
表3 疼痛评价(两后肢重量分配比)
(2-2)肿胀评价(两后肢关节肿胀比)
表4和图10表示生物体材料采集日(第42天)的两后肢的关节肿胀比。测定动物个体的关节宽，对组间之差进行研究，结果被试验物质给药组与介质给药组相比，肿胀得到显著抑制(p=0.0164)。
[表4]
表4 肿胀评价(两后肢关节肿胀比)
(2-3)病理组织学的评价
病理组织学上的检查要点如表5和6以及图11所示，代表例的病理组织图像如图12所示。
在介质给药组和被试验物质给药组的两组中，在股骨外髁和胫骨外髁大致没有发现源自变形性关节病模型制作的损伤。
对于股骨内髁而言，在介质给药组，6例中全部例子发现关节软骨表层消失、蛋白聚糖染色性降低、软骨细胞排列不整齐、软骨细胞消失、串状集簇形成，6例中5例发现软骨糜烂。特别是串状集簇形成在全部例子中为高的等级(平均值=2.50±0.43)。各观察结果的病理组织学的评分为9、21、17、11、8、20(平均值=14.33±2.33)，全部例子的关节软骨发现轻度～重度的变化。另一方面，对于被试验物质给药组的股骨内髁而言，6例中全部例子发现串状集簇形成，6例中5例发现软骨表层消失、软骨糜烂、软骨细胞排列不整齐。病理组织学评分为5、6、10、3、20、6(平均值=8.33±2.51)，与介质给药组的同部位的变化相比，6例中4例发现降低倾向，在病理组织学评分中也示出低值(p=0.0649)。
对于胫骨内髁而言，在介质给药组，6例中全部例子发现关节软骨表层消失、软骨粗糙化/龟裂、软骨细胞排列不整齐，6例中5例发现蛋白聚糖染色性降低。病理组织学的评分为8、27、14、5、3、18(平均值=12.50±3.69)，6例中4例的关节软骨发现轻度～重度的变化。在被试验物质给药组中，6例中全部例子发现软骨粗糙化/龟裂，6例中5例发现软骨表层消失、蛋白聚糖染色性降低。病理组织学评分为4、16、6、1、27、9(平均值=10.50±3.91)。

Claims (2)

1.下述式(1)的化合物在制备关节病治疗剂中的应用，所述关节病治疗剂含有下述式(1)的化合物作为有效成分，
式(1)的化合物是：1-油酰基环状磷脂酸或1-棕榈油酰基环状磷脂酸或它们的衍生物的卡巴环状磷脂酸。
2.下述式(1)的化合物在制备关节病治疗剂中的应用，其包括将下述式(1)的化合物给予伴随有关节病的患者，
式(1)的化合物是：1-油酰基环状磷脂酸或1-棕榈油酰基环状磷脂酸或它们的衍生物的卡巴环状磷脂酸。
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