KR101329936B1

KR101329936B1 - 플라바논 유도체를 포함하는 피부 외용제

Info

Publication number: KR101329936B1
Application number: KR1020087022372A
Authority: KR
Inventors: 나오꼬 기다; 아끼히로 다다; 아끼꼬 가나마루
Original assignee: 포라 가세이 고교 가부시키가이샤
Priority date: 2006-02-15
Filing date: 2007-02-15
Publication date: 2013-11-14
Also published as: WO2007094384A1; JP5124440B2; CN101384246B; EP1987810A1; US20110021619A1; EP1987810A4; CA2642524C; CA2642524A1; CN101384246A; KR20080094950A; AU2007215822A1; AU2007215822B2; HK1126397A1; MY154397A; US20090030070A1; JPWO2007094384A1; EP1987810B1; SG169995A1

Abstract

본 발명은 대주름이나 창상으로 대표되는 피부 결손 부위에 있어서, 진피 내에 존재하는 섬유 아세포의 콜라겐류 생산능 등의 생체 조직 재생능을 높이기 위해서, 파레롤 등의 플라바논 유도체를 피부 외용제의 유효 성분으로서 이용하는 것에 관한 것이다. 또한, 창상 치유를 촉진시키는 효과가 우수한 물질을 양호한 효율로 스크리닝하기 위해서, 진피 창상 모델을 이용하여 콜라겐 섬유 다발의 재구축 작용을 시험한다.

플라바논 유도체, 피부 외용제, 섬유 아세포, 콜라겐 생산능, 스크리닝 방법.

Description

플라바논 유도체를 포함하는 피부 외용제 {EXTERNAL PREPARATION FOR SKIN CONTAINING FLAVANONE DERIVATIVE}

본 발명은 피부 외용제에 관한 것이고, 더욱 상세하게는 플라바논 유도체를 함유하는 피부 외용제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 섬유 아세포의 콜라겐 생산능을 증강시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 창상 치유 효과를 갖는 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

피부는 각층, 표피, 기저층, 진피로 구성되어 있고, 통상 인식되는 「피부」의 성상에 있어서 큰 영향을 주는 것은 진피의 구조라고 알려져 있다. 이 진피의 중요 구성 성분 중 하나는 탄성 등에 큰 영향을 주는 콜라겐류라고 알려져 있다. 진피에서는 콜라겐류로는 콜라겐 I, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 콜라겐 V, 콜라겐 VII 등이 알려져 있고, 각각이 중요한 기능을 담당하고 있으며 이들은 섬유 아세포가 생산하는 프로콜라겐으로부터 파생한다(예를 들면, 하기 비특허 문헌 1, 비특허 문헌 2, 비특허 문헌 3을 참조). 섬유 아세포에 의한 프로콜라겐을 포함하는 콜라겐류의 생산능은 노화나 자외선 손상에 의해서 저하되는 것도 알려져 있고, 이 저하가 피부 기능 저하의 원인이 되었다. 즉, 이와 같이 저하된 섬유 아세포의 콜라겐류 생산능을 회복시키는 것이 피부 기능 회복의 중요한 인자가 된다.

인간은 연령과 함께 그 형태가 변화되고, 노화의 징후를 보인다. 피부에서의 이와 같은 징후 중 하나로 주름의 형성을 들 수 있고, 이와 같은 징후 형성의 억제가 화장료의 큰 테마가 되었다. 이와 같은 주름 형성의 발생 메카니즘 중 하나는 진피 콜라겐 섬유 다발 구조의 붕괴 내지는 그 구조의 혼란이라고 알려져 있다. 때때로, 진피 콜라겐 섬유 다발 구조의 붕괴 내지는 그 구조의 혼란은, 부분적으로 진피 콜라겐 섬유 다발 그 자체의 누락을 야기한다. 이 상태의 피부 부분은 창상 피부와 유사한 구조를 갖는다고 알려져 있고, 이것이 흔히 말하는 「대주름(large wrinkle)」이다. 진피 콜라겐 섬유 다발 구조의 붕괴 내지는 그 구조의 혼란을 개선하기 위해서, 모노테르펜 또는 트리테르펜 등의 테르펜 내지는 그의 유도체에 의해 진피 콜라겐 섬유 다발을 재구축하는 것이 알려져 있다(예를 들면, 하기 특허 문헌 1을 참조). 또한, 식물 추출물에도 진피 콜라겐 섬유 다발 재구축 작용을 갖는 것이 존재하는 것이 알려져 있다(예를 들면, 하기 특허 문헌 2, 특허 문헌 3을 참조). 이와 같은 식물 추출물 중, 진피 콜라겐 섬유 다발 재구축 작용이 우수한 것으로서는, 고추나물 추출물이 알려져 있다(예를 들면, 하기 특허 문헌 4를 참조). 이들 테르펜류 및 추출물은 섬유 아세포 자체의 콜라겐 생산능을 향상시키는 작용을 갖고, 주위에 콜라겐 섬유 다발이 존재하는 경우에는, 이 섬유 다발에 따라서 콜라겐 섬유 다발을 구축할 수 있다. 그러나, 이들 성분은, 진피 콜라겐 섬유 다발 자체가 누락되어 섬유 아세포 주위에 존재하지 않는 경우에는, 충분히 콜라겐 섬유 다발을 구축할 수 없다. 따라서, 상기 성분이나 추출물은, 대주름 등의 콜라겐 섬유가 누락된 부위에 있어서는 콜라겐 섬유 다발의 재구축을 충분히 촉진시킬 수 없고, 상기 증상의 개선 효과를 충분히 발휘하지 못한다고 하는 문제가 있었다.

또한, 피부는 중요한 생체 방어 조직임과 동시에 호흡기이기도 하므로, 이 피부의 결손은 방어 기구와 호흡 기능을 모두 위협하게 된다. 이 때문에, 화상 등으로 표피의 1/3을 잃으면, 생명을 위협받는다는 정설도 확립되었다. 이와 같은 상황에서, 결손된 피부 부위를 빠르게 재생시키는 기술의 개발은 오랜 세월에 걸쳐 요망되었다. 창상 치유 작용을 갖는 성분으로서는, 예를 들면 쿠르쿠마 추출물이나 락토페린 등이 알려져 있지만(예를 들면, 하기 특허 문헌 5, 특허 문헌 6을 참조), 이들에는 진피 콜라겐 섬유 다발 구조의 재구축 작용은 없기 때문에 피부 조직을 재생하는 작용은 충분하지는 않다. 이와 같은 배경에 있어서 세포 증식을 촉진시키고, 콜라겐 생산능을 높이는 창상 치유를 위한 소재로서, 이눌린류(예를 들면, 하기 특허 문헌 7을 참조), 콜라겐 가수분해물류(예를 들면, 하기 특허 문헌 8을 참조), 락토페린류(예를 들면, 하기 특허 문헌 6을 참조) 등이 개발되어 왔다. 이들 성분의 창상 치유 작용은 섬유 아세포의 증식 활성이나 피부 조직 재생에 관여하는 효소의 RNA 발현 등을 통해 확인되었다. 그러나, 이들 성분에 의해서, 실제로 피부가 분명히 재생되는 것과 같은 현상은 전혀 관찰되지 않았다. 또한, 이들 성분은 창상에 의해서 콜라겐 섬유 다발 구조가 누락된 것과 같은, 결손된 생체 부위의 구축에 영향을 주는 것은 전혀 관찰되지 않았다.

이와 같이, 콜라겐 섬유 다발 구조의 누락 등에 의해서 결손된 생체 조직에서 조직을 재생하고, 주름의 개선이나 창상 치유 등에 우수한 효과를 갖는 성분은 아직 발견되지 않았다.

한편, 파레롤은 플라바논 구조를 갖는 화합물이고, 각종 식물에 함유되는 것으로 알려져 있으며 그의 합성 방법도 이미 알려져 있다(예를 들면, 하기 특허 문헌 9, 특허 문헌 10, 특허 문헌 11을 참조). 그러나, 피부 외용제에 함유시키는 기술은 전혀 알려져 있지 않고, 진피 콜라겐 섬유 다발 재구축 작용에 대해서도 창상 치유 촉진 작용에 대해서도 전혀 알려져 있지 않았다.

또한, 케라티노사이트의 작용이 섬유 아세포에 의한 콜라겐류 생산능의 향상에 영향을 주는 것이, 공배양에 의한 검토로 알려졌다(예를 들면, 하기 비특허 문헌 4를 참조). 그러나, 케라티노사이트에 영향을 줌으로써, 섬유 아세포의 콜라겐류 생산능을 증대시키는 것과 같은 성분은 알려져 있지 않았다.

한편, 상술한 이눌린류, 콜라겐 가수 분해물류, 락토페린류 등의 창상 치유를 위한 물질은 모두 섬유 아세포의 콜라겐 생산능을 지표로, 상기 콜라겐 생산능을 높이는 물질로서 스크리닝된 것이다. 그러나, 섬유 아세포의 콜라겐 생산능의 향상은 창상 치유 촉진을 위한 필요 조건이기는 하지만, 충분 조건은 아니고, 콜라겐 생산능을 향상시키는 성분이라도 창상 치유 촉진 효과를 갖지 않는 것도 존재하는 것이 현실이다.

또한, 섬유 아세포의 유주능(migration activity)을 지표로 한, 창상 치유 촉진 효과의 스크리닝 방법도 고안되었다(예를 들면, 하기 비특허 문헌 5를 참조). 이 방법에서는 섬유 아세포를 이용하여 콜라겐 겔을 제조하고, 이것에 결손부를 형성하고, 이 결손부에 유주해 오는 섬유 아세포를 계수한다. 그러나, 섬유 아세포 의 유주능 향상은 창상 치유 촉진을 위한 필요 조건이기는 하지만 충분 조건은 아니기 때문에, 섬유 아세포의 유주능를 지표로 스크리닝된 성분이라도 충분한 창상 치유 촉진 효과를 나타내지 않는 것도 존재한다.

즉, 이들 스크리닝 방법에서는, 창상 치유 촉진에 필요한 섬유 아세포의 콜라겐 생산능을 향상시키는 작용, 및 섬유 아세포의 유주능을 향상시키는 작용을 함께 갖는 성분을 스크리닝할 수 없었다. 이러한 배경에 있어서 우수한 창상 치유 촉진 작용을 갖는 성분을 얻는 기술의 개발이 요망되었다.

특허 문헌 1: 일본 특허 공개 제2002-104921호 공보

특허 문헌 2: 일본 특허 공개 제2002-29988호 공보

특허 문헌 3: 일본 특허 공개 제2002-29987호 공보

특허 문헌 4: 일본 특허 공개 제2002-29986호 공보

특허 문헌 5: 일본 특허 공개 (평)11-199461호 공보

특허 문헌 6: 일본 특허 공개 (평)07-196529호 공보

특허 문헌 7: 일본 특허 공표 2004-501176호 공보

특허 문헌 8: 일본 특허 공개 제2003-137807호 공보

특허 문헌 9: 국제 공개 제02/092110호 공보

특허 문헌 10: 유럽 특허 출원 공개 제122053호 명세서

특허 문헌 11: 일본 특허 공개 (소)58-21678호 공보

비특허 문헌 1: Keene et al., J. Cell Biol., 104, 611-621(1987)

비특허 문헌 2: Shimizu et al., Lab. Invest., Jun., 76(6), 753-63(1997)

비특허 문헌 3: Vazquez F. et al., Maturitas, 25, 209-15(1996)

비특허 문헌 4: Eming S. A. et al., Hum. Gene Ther., 9(4), 529-39(1998)

비특허 문헌 5: Roman O'Leary, Mark Rerek, and Edward John Wood, Biol. Pharm. Bull., 27 (2), 266-270(2004)

<발명의 개시>

본 발명은, 혼란된 진피 콜라겐 섬유 다발 구조(이하, 단순히 「콜라겐 섬유 다발」이라고도 함)의 재구축 작용이 우수한 피부 외용제를 제공하는 것을 과제로 한다. 특히, 대주름이나 창상으로 대표되는 피부 결손 부위에 있어서, 진피 내에 존재하는 섬유 아세포의 콜라겐류 생산능 등으로 대표되는 생체의 조직 재생능을 높임으로써, 창상 치유를 촉진시키는 기술을 제공하는 것을 과제로 한다.

또한, 본 발명은 피부 조직을 재생하는 기술을 제공하는 것을 과제로 한다. 구체적으로는, 케라티노사이트에 작용함으로써 섬유 아세포의 콜라겐류 생산능을 증강시키는 기술을 제공하는 것을 과제로 한다.

또한, 본 발명은, 창상 치유를 촉진시키는 효과가 우수한 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은, 섬유 아세포의 콜라겐류 생산능을 증강시키고, 창상 치유를 촉진시키는 작용을 가지며, 피부 외용제에 함유시키는 것이 가능한 성분을 탐색한 결과, 파레롤 등의 플라바논 유도체가 이러한 작용이 우수한 것을 발견하였다. 또한, 플라바논 유도체는 케라티노사이트에 작용함으로써 섬유 아세포의 콜라겐류 생산능을 증강시키는 것도 발견하였다. 또한, 플라바논 유도체를 함유하는 화장료는 주름을 개선하는 효과가 우수하고, 플라바논 유도체를 함유하는 피부 외용 의약은 창상 치유를 촉진시키는 효과가 우수한 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

또한, 본 발명자들은 창상 치유를 촉진시키는 작용을 갖는 성분을 탐구하는 과정에서, 피부의 창상 모델을 이용한 방법에 의해 콜라겐 섬유 다발의 재구축 작용을 시험함으로써, 창상 치유의 촉진에 효과적인 물질을 양호한 효율로 스크리닝할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

[1] 제1 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 플라바논 유도체 및/또는 그의 염을 함유하는 피부 외용제(이하, 「본 발명의 피부 외용제」라고도 함)이다.

화학식 1에 있어서, 식 중 R1, R2, R3, R4, R5는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타낸다.

상기 플라바논 유도체는 바람직하게는 파레롤이다.

또한, 상기 플라바논 유도체 및/또는 그의 염을 10^-6 내지 0.1 질량％ 포함하는 물레나물과 고추나물 추출물로서 함유하는 것도 바람직한 형태이다.

또한, 본 발명의 피부 외용제는 피부 구조를 정상화하기 위해서 사용할 수 있다. 특히, 혼란된 진피 콜라겐 섬유 다발 구조를 재구축하기 위해서 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 피부 결손 부위의 재생 및 재생 조직에 의한 상기 결손 부위의 폐색을 촉진시키고, 창상을 치유하기 위해서 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 케라티노사이트의 섬유 아세포 콜라겐류 생산능을 증대시키는 작용의 증강을 위해서 이용하는 것도 바람직하다.

[2] 제2 발명은 피부 외용제의 제조에 있어서의 상기 화학식 1로 표시되는 플라바논 유도체 및/또는 그의 염의 사용이다.

[3] 제3 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 플라바논 유도체 및/또는 그의 염을 포함하는 피부 외용제를 피부에 투여하는 것을 특징으로 하는, 피부 구조를 정상화시키는 방법이다.

상기 제2 및 제3 발명에 있어서의 플라바논 유도체의 바람직한 양태 및 피부 외용제의 바람직한 용도는 제1 발명과 동일하다.

[4] 제4 발명은 케라티노사이트의 섬유 아세포 콜라겐류 생산능을 증대시키는 작용을 증강시키는 방법이며, 케라티노사이트와 섬유 아세포의 공존하에서 상기 화학식 1로 표시되는 플라바논 유도체 및/또는 그의 염을 투여하는 것을 특징으로 하는 방법이다.

상기 플라바논 유도체의 바람직한 양태는 제1 발명과 동일하다.

상기 투여는 경피적 투여일 수도 있고, 구체적으로는 상기 플라바논 유도체 및/또는 그의 염을 피부 외용제에 함유시켜 피부에 도포하는 것이 바람직하다.

[5] 제5 발명은 창상 치유 효과를 갖는 물질을 스크리닝하는 방법이며, 동물의 정상 섬유 아세포를 피검 물질의 존재하에 배양하고, 얻어진 배양물에 콜라겐 배지 용액을 첨가하여 콜라겐 겔을 제조하고, 상기 콜라겐 겔 내의 상기 섬유 아세포를 상기 피검 물질의 존재하에 배양한 후, 상기 콜라겐 겔에 결손부를 형성하고, 상기 결손부를 형성한 콜라겐 겔 및 상기 피검 물질을 공존시켜 상기 섬유 아세포를 배양하고, 상기 배양하는 동안, 상기 결손부의 보충, 수축의 정도를 관찰하는 것을 특징으로 하는 방법(이하, 「본 발명의 스크리닝 방법」이라고도 함)이다.

또한, 본 발명의 스크리닝 방법에 있어서는, 피검 물질의 존재하에서의 상기 결손부의 보충, 수축의 정도와, 피검 물질의 비존재하에서의 상기 결손부의 보충, 수축의 정도를 비교함으로써 창상 치유 촉진 효과를 갖는 피검 물질을 스크리닝할 수 있다.

구체적으로는, 피검 물질의 존재하에서의 상기 결손부의 보충, 수축의 정도가 피검 물질의 비존재하에서의 상기 결손부의 보충, 수축의 정도에 비해 큰 경우에, 상기 피검 물질은 창상 치유 촉진 효과를 갖는다고 판별할 수 있다.

도 1은 실시예 1에서 얻어진 결과를 나타낸 도면이다. 그래프 1은 헤파린 미처리하에서의 배양 일수와 세포수의 관계를 나타내고, 그래프 2는 헤파린 0.01 ％ 처리하에서의 배양 일수와 세포수의 관계를 나타낸다.

도 2는 실시예 2의 창상 치유 모델에서 관찰된 섬유 아세포의 거동을 나타내는 사진이다.

도 3은 실시예 3에서 관찰된 콜라겐 섬유 다발 구축의 거동을 나타내는 사진이다.

도 4는 실시예 6에서 관찰된 콜라겐 겔의 결손부의 상태를 나타내는 사진이다.

도 5는 실시예 9의 실험 1에서 얻어진 결과를 나타낸 도면이다. 각 농도의 파레롤 용액을 첨가한 경우의 OD값(450 nm)을 나타낸다.

도 6은 실시예 9의 실험 2에서 얻어진 결과를 나타낸 도면이다. 각 농도의 파레롤 용액을 첨가한 경우의 케라티노사이트의 증식률을 나타낸다.

도 7은 실시예 9의 실험 2에서 관찰된 케라티노사이트의 형태를 나타내는 사진이다.

도 8은 실시예 9의 실험 3에서 얻어진 결과를 나타낸 도면이다. 각 농도의 파레롤 용액을 첨가한 경우의 프로콜라겐 생산량을 나타낸다.

도 9는 실시예 11에서 관찰된 콜라겐 겔의 결손부 상태를 나타내는 사진이다.

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

(A) 본 발명에서 사용되는 플라바논 유도체 및 그의 염

본 발명에서 사용되는 플라바논 유도체는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물이다.

화학식 1에 있어서 R1, R2, R3, R4, R5는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타낸다.

상기 R1, R2, R4의 1개 이상은 수소 원자인 것이 바람직하고, 특히 바람직하게는 3개 모두가 수소 원자이다. 알킬기로서는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 부틸기 등을 예시할 수 있지만, 메틸기인 것이 특히 바람직하다.

또한, 상기 R3, R5의 1개 이상은 탄소수 1 내지 4의 알킬기인 것이 바람직하고, 특히 바람직하게는 둘 모두 탄소수 1 내지 4의 알킬기이다. 알킬기로서는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 부틸기 등을 예시할 수 있지만, 메틸기인 것이 보다 바람직하다. 특히 모두 메틸기인 것이 특히 바람직하다.

이러한 플라바논 유도체로서는, 예를 들면 파레롤, 메틸파레롤, 디메틸파레롤 등을 들 수 있다.

이와 같은 플라바논 유도체는 일본 특허 공개 (소)58-21678호 공보에 따르면, 기지의 화합물로부터 합성할 수 있지만, 이것은 식물체 중에도 존재하기 때문 에 식물체 추출물로부터 분리 정제할 수도 있다. 화학식 1로 표시되는 화합물의 하나인 파레롤은 물레나물과 고추나물 식물체 추출물로부터 단리 정제할 수 있다. 이 제조 과정의 일례를 하기에 나타낸다. 물론, 식물체 유래의 플라바논 유도체 및/또는 그의 염을 후술하는 피부 외용제에 함유시킬 때는, 목적으로 하는 효과를 발휘할 수 있는 농도의 플라바논 유도체 및 그의 염을 함유하는 추출물을 이용할 수도 있다.

<제조예 1>

물레나물과 고추나물(Hypericum erectum Thunberg(Guttiferae))의 지상부의 건조물 1 kg에 80 ％ 에탄올 수용액 10 ℓ를 첨가하여 교반하에 4 시간 환류를 행하였다. 냉각 후 불용물을 여과로 제거하고, 감압 농축시킨 후, 동결 건조시켜 비정질물을 51 g 얻었다. 이것을 물에 분산시키고, 다이아이온 HP20에 충전시켜 5 ℓ의 물, 이어서 5 ℓ의 50 ％ 에탄올 수용액을 흘려 세정하고, 99 ％의 에탄올로 용출시켜 용출분을 분획화하고, 분획을 박층 크로마토그래피와 HPLC로 체크하면서, 동일한 단일 물질을 포함하는 분획은 합하고, 복수개의 성분을 포함하는 분획은 재차 크로마토그래피로 정제하였다. 얻어진 단일 성분을 포함하는 분획의 콜라겐 섬유 다발 재구축 작용을 조사하고, 이 작용이 강한 분획에 포함되는 단일 성분의 구조를 양성자 NMR, 원소 분석, 질량 분석, ¹³C-NMR로 동정하였다. 이 성분은 파레롤이고, 수량은 3.2 mg이었다. 또한, 파레롤은 80 ％ 에탄올 수용액 추출물의 용매 제거물 중에 약 0.006 질량％ 함유되어 있었다.

상기 플라바논 유도체의 염으로서는, 생리적으로 허용되는 것이면 특별히 제한은 없고, 예를 들면 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 토류 금속염, 암모늄염, 트리에틸아민염, 트리에탄올아민염, 모노에탄올아민염 등의 유기 아민염, 리신염, 알긴산염 등의 염기성 아미노산염 등을 바람직하게 예시할 수 있다.

상기 플라바논 유도체 및 그의 염은 섬유 아세포에 의한 진피 콜라겐 섬유 다발 구조의 재구축을 촉진시키는 작용을 갖는다. 구체적으로는, 상기 플라바논 유도체가, 콜라겐 섬유가 존재하지 않는 장소에서도 섬유 아세포를 유주시키고, 동시에 섬유 아세포 자체의 콜라겐 생산능을 높임으로써 조직의 결손 부분에 콜라겐 섬유 다발을 재구축시킨다. 또한, 피부 결손 부위에서의 피부 조직 재생을 촉진시키고, 또한 재생된 조직에 의한 결손 부위의 폐색 작용을 높임으로써 창상 치유를 촉진시킨다.

(B) 본 발명의 피부 외용제

본 발명의 피부 외용제는 상기 플라바논 유도체 및/또는 그의 염을 함유하는 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 식물체 추출물로서 상기 플라바논 유도체 및/또는 그의 염을 함유시킬 수 있다. 상기 플라바논 유도체로서는, 파레롤을 바람직하게 들 수 있다. 본 발명의 피부 외용제에 있어서는, 파레롤을 함유하는 고추나물 추출물을 함유시키는 것이 바람직하다.

상술한 바와 같이, 상기 플라바논 유도체 및 그의 염은 진피 콜라겐 섬유 다발 구조를 재구축하는 작용을 갖는다. 따라서, 본 발명의 피부 외용제는 피부 구 조를 정상화하기 위해서 사용할 수 있다. 「피부 구조를 정상화한다」는 것은, 피부를 구성하는 표피, 진피, 피하 조직의 구조 파괴 정도를 작게 하는 것을 말한다. 구체적으로는, 예를 들면 혼란된 진피 콜라겐 섬유 다발 구조를 재구축하는 것을 포함한다. 「혼란된 진피 콜라겐 섬유 다발 구조를 재구축한다」는 것은, 진피 내에 존재하는 콜라겐 섬유 다발 구조가 혼란된 부위에 있어서 진피 콜라겐 섬유 다발 구조를 구축하는 것을 말한다. 「진피 콜라겐 섬유 다발 구조가 혼란되어 있다」는 것은, 콜라겐 섬유 다발 구조가 정상적인 구조를 유지할 수 없게 되는 것을 말하고, 예를 들면 콜라겐 섬유 다발이 가늘어 약해지거나, 콜라겐 섬유량이 적어지거나, 콜라겐 섬유가 끊어지거나, 콜라겐 섬유 다발이 누락되거나 하는 것 등을 포함한다. 또한, 「피부 구조를 정상화한다」는 것은, 피부 결손 부위를 재생하는 것도 포함한다. 또한, 피부 결손 부위를 재생하고, 재생 조직에 의한 상기 결손 부위의 폐색을 촉진시킴으로써 상기 결손 부위로부터 감염이 생기는 것을 막고, 피부의 방어 기구, 호흡 기능을 부활시키는 것도 포함한다. 「피부의 결손」이란, 피부 구조가 파괴된 상태를 말하고, 예를 들면 피부 거칠음, 주름, 창상 등이 생기는 것을 말한다. 본 발명의 피부 외용제는 특히 창상 치유에 바람직하다. 또한, 「피부 구조를 정상화한다」는 것은, 케라티노사이트의 섬유 아세포 콜라겐 생산능을 증대시키는 작용을 증강시키는 것도 포함한다.

본 발명의 피부 외용제는 피부에 외용으로 적용되는 것이면 특별히 한정없이 응용할 수 있고, 예를 들면 의약부외품을 함유하는 화장료, 피부 외용 의약, 피부 외용 잡화 등을 예시할 수 있다. 그 중에서도 화장료 및 피부 외용 의약에 응용되 는 것이 특히 바람직하다. 예를 들면, 주름의 개선, 경도의 피부 거칠음 개선 등을 목적으로 하는 경우에는, 화장료로 하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 광 노화에 의한 진피 콜라겐 섬유 다발의 혼란을 재구축하거나, 창상이나 심한 광 손상으로 결손된 진피 콜라겐 섬유 다발 구조의 재생을 위해 사용하는 것이 바람직하다. 한편, 심한 피부 거칠음의 개선이나 창상 치유를 목적으로 하는 경우에는, 피부 외용 의약으로 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 피부 외용제의 제형은 특별히 제한되지 않고, 사용 목적에 따라서 통상 피부 외용제가 취할 수 있는 제형을 취할 수 있다. 예를 들면, 화장료의 제형으로서는 로션, 유액, 엣센스, 크림, 팩 등의 기초 화장료에 상용되는 제형이 바람직하다. 피부 외용 의약의 제형으로서는 연고, 로션, 크림, 밀크, 엣센스 등이 바람직하다.

본 발명의 피부 외용제에서의 상기 플라바논 유도체 및/또는 그의 염의 함유량은 피부 외용제의 용도, 대상, 투여 방법 등에 의해서 조절할 수 있지만, 바람직한 하한값은 1×10^-6 질량％이고, 보다 바람직하게는 1×10^-4 질량％이다. 바람직한 상한값은 1 질량％이고, 보다 바람직하게는 0.1 질량％이다.

또한, 특히 창상 치유를 목적으로 한 피부 외용 의약에 있어서는, 상기 플라바논 유도체 및/또는 그의 염의 함유량의 하한값을 바람직하게는 1×10^-6 M, 보다 바람직하게는 1×10^-4 M, 상한값을 바람직하게는 1 M, 보다 바람직하게는 0.1 M로 하는 것도 좋다.

또한, 본 발명의 피부 외용제에 상기 플라바논 유도체 및/또는 그의 염을 함유하는 식물체 추출물을 함유시키는 경우에는, 상기 플라바논 유도체 및/또는 그의 염을 정제함으로써 그의 농도를 높인 것을 이용하는 것이 바람직하다. 한편, 본 발명의 피부 외용제는 정제되지 않은 고추나물 추출물을 포함하는 진피 콜라겐 섬유 다발 재구축용 피부 외용제이며, 상기 추출물에 포함되는 플라바논 유도체/및 또는 그의 염 이외의 플라바논 유도체/및 또는 그의 염을 포함하지 않는 것은 포함하지 않는다. 본 발명의 피부 외용제에 사용할 수 있는 식물체 추출물로서는, 고추나물 식물체의 추출물을 정제하여 파레롤 농도를 높인 추출물을 바람직하게 들 수 있다. 식물체 추출물에서의 상기 플라바논 유도체 및/또는 그의 염의 농도는 바람직하게는 10^-6 내지 0.1 질량％, 보다 바람직하게는 10^-5 내지 0.01 질량％이다. 이러한 식물체 추출물을 이용하는 경우의, 피부 외용제에서의 식물체 추출물의 함유량은 바람직하게는 0.001 내지 10 질량％, 보다 바람직하게는 0.01 내지 1 질량％이다. 여기서, 식물체 추출물의 함유량이란, 용매 제거물에 있어서의 함유량이다.

본 발명의 피부 외용제에는, 상기 필수 성분 이외에 통상 피부 외용제에서 사용되는 임의 성분을 함유할 수 있다. 이와 같은 임의 성분으로서는, 예를 들면 마카다미아넛유, 아보가드유, 옥수수유, 올리브유, 유채씨유, 참기름, 피마자유, 홍화유, 면실유, 호호바유, 야자유, 팜유, 액상 라놀린, 경화 야자유, 경화유, 목랍, 경화 피마자유, 밀랍, 칸델릴라 왁스, 카르나우바 왁스, 이보타 왁스, 라놀린, 환원 라놀린, 경질 라놀린, 호호바 왁스 등의 오일, 왁스류; 유동 파라핀, 스쿠알란, 프리스탄, 오조케라이트, 파라핀, 셀레신, 바셀린, 미세결정질 왁스 등의 탄화수소류; 올레산, 이소스테아르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 베헨산, 운데실렌산 등의 고급 지방산류; 세틸알코올, 스테아릴알코올, 이소스테아릴알코올, 베헤닐알코올, 옥틸도데카놀, 미리스틸알코올, 세토스테아릴알코올 등의 고급 알코올 등; 이소옥탄산세틸, 미리스트산이소프로필, 이소스테아르산헥실데실, 아디프산디이소프로필, 세박산디-2-에틸헥실, 락트산세틸, 말산디이소스테아릴, 디-2-에틸헥산산에틸렌글리콜, 디카프르산네오펜틸글리콜, 디-2-헵틸운데칸산글리세린, 트리-2-에틸헥산산글리세린, 트리-2-에틸헥산산트리메틸올프로판, 트리이소스테아르산트리메틸올프로판, 테트라-2-에틸헥산산펜타에리트리톨 등의 합성 에스테르유류; 디메틸폴리실록산, 메틸페닐폴리실록산, 디페닐폴리실록산 등의 쇄상 폴리실록산; 옥타메틸시클로테트라실록산, 데카메틸시클로펜타실록산, 도데카메틸시클로헥산실록산 등의 환상 폴리실록산; 아미노 변성 폴리실록산, 폴리에테르 변성 폴리실록산, 알킬 변성 폴리실록산, 불소 변성 폴리실록산 등의 변성 폴리실록산 등의 실리콘유 등의 오일제류; 지방산 비누(라우르산나트륨, 팔미트산나트륨 등), 라우릴황산칼륨, 알킬황산트리에탄올아민에테르 등의 음이온 계면 활성제류; 염화스테아릴트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 라우릴아민옥시드 등의 양이온 계면 활성제류; 이미다졸린계 양쪽성 계면 활성제(2-코코일-2-이미다졸리늄히드록시드-1-카르복시에틸옥시-2나트륨염 등), 베타인계 계면 활성제(알킬베타인, 아미드베타인, 술포베타인 등), 아실메틸타우린 등의 양쪽성 계면 활성제류; 소르비탄 지방산 에스 테르류(소르비탄모노스테아레이트, 세스퀴올레산소르비탄 등), 글리세린 지방산류(모노스테아르산글리세린 등), 프로필렌글리콜 지방산 에스테르류(모노스테아르산프로필렌글리콜 등), 경화 피마자유 유도체, 글리세린 알킬에테르, POE 소르비탄 지방산 에스테르류(POE 소르비탄모노올레에이트, 모노스테아르산폴리옥시에틸렌소르비탄 등), POE 소르비트 지방산 에스테르류(POE-소르비트모노라우레이트 등), POE 글리세린 지방산 에스테르류(POE-글리세린모노이소스테아레이트 등), POE 지방산 에스테르류(폴리에틸렌글리콜모노올레에이트, POE 디스테아레이트 등), POE 알킬에테르류(POE2-옥틸도데실에테르 등), POE 알킬페닐에테르류(POE 노닐페닐에테르 등), 플루로닉형류, POEㆍPOP 알킬에테르류(POEㆍPOP2-데실테트라데실에테르 등), 테트로닉류, POE 피마자유ㆍ경화 피마자유 유도체(POE 피마자유, POE 경화 피마자유 등), 수크로스 지방산 에스테르, 알킬글루코시드 등의 비이온 계면 활성제류; 폴리에틸렌글리콜, 글리세린, 1,3-부틸렌글리콜, 에리트리톨, 소르비톨, 크실리톨, 말티톨, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 디글리세린, 이소프렌글리콜, 1,2-펜탄디올, 2,4-헥산디올, 1,2-헥산디올, 1,2-옥탄디올 등의 다가 알코올류; 피롤리돈 카르복실산나트륨, 락트산, 락트산나트륨 등의 보습 성분류; 표면이 처리될 수도 있는 운모, 탈크, 카올린, 합성 운모, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 무수 규산(실리카), 산화알루미늄, 황산바륨 등의 분체류; 표면이 처리될 수도 있는 적산화철, 황산화철, 흑산화철, 산화코발트, 군청, 감청, 산화티탄, 산화아연의 무기 안료류; 표면이 처리될 수도 있는 운모 티탄, 어인박(魚燐箔; fish scale foil), 옥시염화비스무스 등의 펄(pearl)제류; 레이크화될 수도 있는 적색 202호, 적색 228호, 적색 226호, 황색 4호, 청색 404호, 황색 5호, 적색 505호, 적색 230호, 적색 223호, 등색 201 호, 적색 213호, 황색 204호, 황색 203호, 청색 1호, 녹색 201호, 자색 201호, 적색 204호 등의 유기 색소류; 폴리에틸렌 분말, 폴리메타크릴산메틸, 나일론 분말, 오르가노폴리실록산 엘라스토머 등의 유기 분체류; 파라아미노벤조산계 자외선 흡수제; 안트라닐산계 자외선 흡수제; 살리실산계 자외선 흡수제; 신남산계 자외선 흡수제; 벤조페논계 자외선 흡수제; 당계 자외선 흡수제; 2-(2'-히드록시-5'-t-옥틸페닐)벤조트리아졸, 4-메톡시-4'-t-부틸디벤조일메탄 등의 자외선 흡수제류; 에탄올, 이소프로판올 등의 저급 알코올류; 비타민 A 또는 그의 유도체, 비타민 B₆ 염산염, 비타민 B₆ 트리팔미네이트, 비타민 B₆디옥타노에이트, 비타민 B₂ 또는 그의 유도체, 비타민 B₁₂, 비타민 B₁₅또는 그의 유도체 등의 비타민 B류; α-토코페롤, β-토코페롤, γ-토코페롤, 비타민 E 아세테이트 등의 비타민 E류, 비타민 D류, 비타민 H, 판토텐산, 판테틴, 피롤로퀴놀린퀴논 등의 비타민류 등; 페녹시에탄올 등의 항균제 등을 바람직하게 예시할 수 있다.

그 중에서도 창상 치유 촉진을 목적으로 한 피부 외용 의약에 함유시키는 임의 성분으로서 특히 바람직한 것은, 창상에 의해 결손된 피부 조직 재생에 효과적인 성분이고, 구체적으로는 미생물 감염을 막기 위한 페니실린, 프라디오마이신, 테트라사이클린 또는 이들의 염 등의 항생 물질, 아크리놀이나 이소딘 등의 살균제 등을 바람직하게 예시할 수 있다. 또한, 트라닐라스트 등의 반흔(瘢痕) 형성 억제제도 바람직하다. 이들 피부 조직 재생에 효과적인 성분의 함유량은 0.1 내지 10 질량％인 것이 바람직하다.

본 발명의 피부 외용제는 상기 플라바논 유도체 및/또는 그의 염과 상기 임의 성분을 통상법에 따라서 처리함으로써 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 피부 외용제의 사용 방법은 피부 외용제의 용도, 제형, 사용 부위, 증상 등에 따라서 조절할 수 있다.

(C) 케라티노사이트의 섬유 아세포 콜라겐류 생산능을 증대시키는 작용을 증강하는 방법

본 발명의 케라티노사이트의 섬유 아세포 콜라겐류 생산능을 증대시키는 작용을 증강하는 방법(이하 「본 발명의 방법」이라고도 함)은 케라티노사이트와 섬유 아세포의 공존하에서 상기 화학식 1로 표시되는 플라바논 유도체 및/또는 그의 염을 투여하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법에서 사용되는 상기 플라바논 유도체 및/또는 그의 염은 상기 (A)에서 설명한 바와 같다. 상기 플라바논 유도체 및/또는 그의 염은 케라티노사이트에 작용함으로써 섬유 아세포의 콜라겐류 생산능을 증대시키는 작용을 갖는다.

「콜라겐류」란, 콜라겐 및 콜라겐으로 파생 분화되기 전의 프로콜라겐을 합한 개념이다.

케라티노사이트와 섬유 아세포의 공존하라는 것은, 시험관 내 또는 생체 내에서 이들 세포가 공존하는 상태를 말한다. 예를 들면, 시험관 내에서는, 이들 세포를 공배양함으로써 이러한 상태를 만들 수 있고, 생체 내이면, 표피 및 진피를 포함하는 피부에 이러한 상태가 존재한다.

상기 플라바논 유도체 및/또는 그의 염의 투여는, 시험관 내에서는, 예를 들면 케라티노사이트와 섬유 아세포의 공배양에 사용되는 배지에 상기 플라바논 유도체 및/또는 그의 염을 혼재시킴으로써 행할 수 있다. 이 경우의 혼재(투여)량은 배지 중의 농도로, 하한값이 바람직하게는 10^-8 M이고, 보다 바람직하게는 10^-7 M이고, 상한값이 바람직하게는 10^-3 M이고, 보다 바람직하게는 10^-5 M이다.

또한, 생체 내에서 투여하는 방법으로서는 경피적 투여를 들 수 있다. 경피적 투여 방법은 통상 이용되는 방법이면 특별히 제한되지 않지만, 상기 플라바논 유도체 및/또는 그의 염을 함유하는 피부 외용제를 피부에 도포하는 방법이 바람직하다. 본 발명의 방법에 사용할 수 있는 피부 외용제는 상술한 본 발명의 피부 외용제이고, 그의 바람직한 양태도 상술한 바와 같다.

(D) 본 발명의 스크리닝 방법

본 발명의 스크리닝 방법은 동물의 정상 섬유 아세포를 피검 물질의 존재하에 배양하고, 얻어진 배양물에 콜라겐 배지 용액을 첨가하여 콜라겐 겔을 제조하고, 상기 콜라겐 겔 내의 상기 섬유 아세포를 상기 피검 물질의 존재하에 배양한 후, 상기 콜라겐 겔에 결손부를 형성하고, 상기 결손부를 형성한 콜라겐 겔 및 상기 피검 물질을 공존시켜 상기 섬유 아세포를 배양하고, 상기 배양하는 동안, 상기 결손부의 보충, 수축의 정도를 관찰하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 스크리닝 방법에서 사용되는 동물의 정상 섬유 아세포는 통상 시험에 이용되는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 동물로서는, 예를 들면 마우스, 래트, 토끼, 인간 등을 바람직하게 들 수 있고, 동물종 차가 적기 때문에 인간이 특히 바람직하다. 정상 섬유 아세포란, 암화되지 않은 세포이며, 조직된 콜라겐 겔을 형성시키는 능력을 가지고 있는 것을 말한다. 이러한 정상 섬유 아세포는 구강 내 점막이나 피부 등에서 채취할 수 있고, 이것을 초대 배양하여 이용할 수도 있지만, 확립된 배양 세포계로 시판되는 것도 알려져 있고, 이러한 시판품을 이용할 수도 있다. 이러한 시판품으로서는, 예를 들면 산꼬 준야꾸 가부시끼가이샤 제조의 「정상 인간 피부 섬유 아세포(초대 배양)」, 쿠라보 가부시끼가이샤 제조의 「정상 인간 섬유 아세포」 등을 바람직하게 예시할 수 있다.

한편, 이하 이러한 동물의 정상 섬유 아세포를 단순히 섬유 아세포라고도 한다.

섬유 아세포는 미리 전(前)배양하여 세포수를 적당한 수로 늘리고 나서 다음 배양에 사용되는 것이 바람직하다. 전배양은 통상적인 배양 세포의 배양 조건, 예를 들면 10 ％ FBS 첨가 DMEM(기브코(GIBCO)사 제조) 등을 배지로 하여, 5 ％ 탄산 가스 기류 조건하에 37 ℃에서 60 내지 90 ％ 전면생장이 될 때까지 행할 수 있다. 전배양에 의해서 얻어진 세포 덩어리는 0.01 내지 0.1 ％의 트립신 존재하에 개개 세포로 풀어 세포 부유액으로 만들고, 이하의 피검 물질의 존재하에서의 배양에 사용하는 것이 바람직하다. 이 때, 트립신과 함께 에틸렌디아민사아세트산염을 존재시키면 보다 바람직하다.

섬유 아세포의 피검 물질의 존재하에서의 배양에 있어서, 피검 물질의 첨가 방법은 특별히 제한되지 않고, 미리 배지에 첨가해둘 수도 있고, 세포 파종과 동시 에 첨가할 수도 있고, 세포 파종 후, 적당한 시간 배양한 후에 첨가할 수도 있다. 바람직하게는 우선 세포를 플레이트에 파종하고, 피검 물질을 포함하지 않는 배지를 이용하여 배양한 후, 피검 물질을 포함하는 배지로 교환하여 배양하는 방법을 들 수 있다. 피검 물질의 첨가량은 임의의 농도로 할 수 있다. 바람직하게는 피검 물질의 유효량을 시험하기 위해서 각종 피검 물질의 농도를 갖는 배지를 이용하여 배양하는 것이 바람직하다. 또한, 배양에 사용되는 섬유 아세포의 세포수는 특별히 제한되지 않고, 배양에서 사용되는 플레이트 크기에 따라서 조정할 수 있다. 예를 들면, 10³/cm² 내지 10⁵/cm²의 세포수가 되도록 조정하는 것이 바람직하다. 배양 조건도 전배양과 동일하게 통상적인 조건에서 행할 수 있다. 배양 시간은 세포수를 적당한 수로 늘릴 수 있는 한 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 3 내지 5 일 정도를 기준으로 할 수 있다. 그 사이에, 필요에 따라서 배지를 신선한 것으로 교환한다.

구체적으로는, 예를 들면 전배양에서 얻은 섬유 아세포를 개개 세포로 풀어진 세포 부유액을 플레이트에 파종하고, 24 시간 전후 배양한 후, 각종 농도의 피검 물질의 용액을 첨가하여 3 내지 5 일 배양을 행하는 것이 바람직하다.

다음에, 상기에서 얻어진 섬유 아세포의 배양물에 콜라겐 배지 용액을 첨가함으로써 콜라겐 겔을 제조한다. 첨가하는 콜라겐 배지 용액량 및 콜라겐 배지 용액 중의 콜라겐의 농도는, 콜라겐 겔을 제조할 수 있고 콜라겐 겔 중에 섬유 아세포를 분산시킬 수 있는 범위이면 특별히 제한되지 않는다. 콜라겐 배지 용액으로 서는, 예를 들면 0.3 내지 0.8 질량％ 제I형 콜라겐 용액, DMEM 배지, 100 내지 300 mM HEPES, 2 내지 4 질량％ 탄산수소나트륨 용액, 0.05 내지 0.15 N 수산화나트륨 수용액, FBS, 물을 4:4:2:2:1:2:3 정도의 비율로 혼합한 것 등을 사용할 수 있다. 콜라겐 배지 용액의 첨가량으로서는, 예를 들면 콜라겐 배지 용액과 섬유 아세포의 배양물의 비율을 8 내지 10 질량부:1 내지 2 질량부로 할 수 있다.

다음에, 제조한 콜라겐 겔 내의 상기 섬유 아세포를 상기 피검 물질의 존재하에서 배양한다. 즉, 상기에서 제조한 콜라겐 겔을 상기 피검 물질을 포함하는 배지 중에 둠으로써 콜라겐 겔 내의 상기 섬유 아세포를 부유 배양한다.

배양에 사용되는 배지에서의 피검 물질의 농도는 상기 피검 물질 존재하에서의 섬유 아세포의 배양에 이용한 배지 농도에 대응시킬 수 있다. 배양 시간은 콜라겐 겔의 수축 상황에 의해 조절할 수 있다. 구체적으로는, 겔 크기가 콜라겐 용액을 첨가하여 겔을 제조한 시점보다 1/5 내지 1/10 정도의 크기까지 수축된 시점까지 배양하는 것이 바람직하다. 이러한 배양 시간으로서 3 내지 5 일간을 기준으로 할 수 있다.

다음에, 수축된 콜라겐 겔에 결손부를 형성한다. 결손부란, 콜라겐 겔의 일부가 관통하여 구멍 상태가 된 부분을 말한다. 결손부의 형상 및 크기는 형상의 변화를 관찰하는 데 적합하면 되고, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 수축된 콜라겐 겔의 중앙부를 펀치로 원형으로 펀칭하여 도넛형 겔로 만들 수 있다. 이러한 펀치에 의한 펀칭에는, 예를 들면 직경 1 내지 5 mm의 생검 트레판(disposable biopsy punch)을 사용할 수 있다.

한편, 이러한 콜라겐 겔의 손상 모델의 제조 방법은 문헌 [Roman O'Leary, Mark Rerek, and Edward John Wood, Biol. Pharm. Bull., 27 (2), 266-270(2004)]에 개시되어 있다.

다음에, 결손부를 형성한 콜라겐 겔을 피검 물질의 존재하에 두어, 콜라겐 겔에 포함되는 섬유 아세포의 배양을 행한다. 배양에 사용되는 플레이트는 제조된 콜라겐 겔의 크기에 따라서 선택할 수 있다. 예를 들면, 콜라겐 겔의 직경이 2 내지 7 mm 정도인 경우에는, 6웰의 플레이트를 선택할 수 있다. 또한, 콜라겐 겔은 웰 저면에 정착시키는 것이 바람직하다. 콜라겐 겔의 정착은, 예를 들면 웰 중앙부에 콜라겐 용액을 적하하고, 거기에 콜라겐 겔을 올려두고 37 ℃에서 15 분간 배양함으로써 행할 수 있다. 배지 중의 피검 물질의 농도는, 상기 섬유 아세포의 피검 물질 존재하에서의 배양에 이용한 배지에서의 농도에 대응시킬 수 있다. 배양 조건도 상기 배양 조건과 동일하게 통상적인 조건에서 행할 수 있다. 배양 기간, 즉 관찰 기간은 특별히 제한되지 않지만, 5 내지 20 일을 기준으로 할 수 있다.

상기 배양하는 동안, 콜라겐 겔의 결손부의 보충, 수축의 정도를 관찰한다. 이 관찰 결과를 기록함으로써 피검 물질의 콜라겐 재구축 작용을 판정할 수 있다. 예를 들면, 결손부의 형상은 사진 등에 의해 객관적으로 기록할 수 있고, 이와 같은 사진을, 필요에 따라서 디지털 화상 데이터로 변환시키거나 하여 비교, 판정할 수 있다. 구체적으로는, 피검 물질의 존재하에서의 상기 결손부의 보충, 수축의 정도가 피검 물질의 비존재하에서의 상기 결손부의 보충, 수축의 정도에 비해 큰 경우에, 상기 피검 물질은 창상 치유 촉진 효과를 갖는다고 판별할 수 있다. 또한 보충, 수축의 정도를 스코어 등을 이용하여 수치로 치환하여 평가할 수도 있다. 예를 들면, 피검 물질의 존재하에서의 상기 결손부의 부피가 피검 물질 비존재하에서의 상기 결손부 부피의 85 ％ 이하, 바람직하게는 50 ％ 이하인 경우에, 상기 피검 물질은 창상 치유 촉진 효과를 갖는다고 판별할 수 있다.

이와 같은 방법으로 피검 물질의 창상 치유 촉진 효과를 평가함으로써, 섬유 아세포의 유주를 촉진시키는 것만으로 섬유 아세포의 콜라겐 생산을 촉진시키지 않는 물질이나, 섬유 아세포의 콜라겐 생산을 촉진시키는 것만으로 섬유 아세포의 유주(이동)을 촉진시키지 않는 물질을 제외할 수 있어, 손상 치유에 효과적인 물질의 스크리닝을 보다 효율화할 수 있다.

실시예 1

파레롤의 진피 콜라겐 섬유 다발 재구축 작용에 대하여 시험관 내의 실험으로 확인하였다. 즉, 헤파린 첨가 배지 중에서 섬유 아세포를 콜라겐 겔 내 배양하면, 세포가 생산하는 콜라겐 섬유가 손상을 받아, 강고한 콜라겐 섬유 다발이 형성되지 않는 것을 이용하여, 이 헤파린 첨가계에 파레롤을 공존시켜 콜라겐 섬유의 손상 경감의 정도를 조사하였다. 수기(手技)는 이하에 나타낸다.

<사용 세포 및 시약류>

ㆍ정상 인간 섬유 아세포(쿠라보)

ㆍ10 ％ FBS 첨가 DMEM(기브코)

ㆍWST-8/1-메틸 PMS(셀 카운팅 키트-8: 도진 가가꾸 겡뀨쇼)

또한, 파레롤은 디메틸술폭시드(DMSO)에 용해시켜 이용하였다.

MTT 에세이로 파레롤의 독성을 시험하고, 헤파린 첨가계로의 파레롤의 첨가량을 구하였다.

<프로토콜>

1. 80 ％ 전면생장으로 증식한 섬유 아세포를 0.05 ％ 트립신ㆍEDTA로 분산시켰다. 이것을 96웰/플레이트에 3×10³ 세포/웰의 농도로 파종하였다.

2. 24 시간 후, 농도 조정한 파레롤을 10 ㎖/웰씩 첨가하였다(n=8).

3. 파레롤 첨가 24 시간 후, 48 시간 후, 72 시간 후에 WST-8/1-메틸 PMS를 10 ㎖/웰로 첨가, 37 ℃에서 4 시간 인큐베이션하였다.

4. 측정 파장 450 nm, 참고 파장 650 nm에서 흡광도를 측정하였다.

<결과>

검토한 모든 농도에서 현저한 세포 독성은 확인되지 않았다. 반대로, 파레롤을 첨가함으로써 세포 증식을 촉진시키는 효과가 확인되었다. 특히, 파레롤의 농도가 10^-6 ㎖/㎖-DMEM, 5x10^-7 ㎖/㎖-DMEM, 10^-7 ㎖/㎖-DMEM에 있어서 증식 촉진이 보였기 때문에, 이하의 콜라겐 생산 시험은 이 3 가지의 농도에서 행하는 것으로 하였다.

상기 결과를 바탕으로 헤파린 첨가계를 이용하여 파레롤의 콜라겐 생산 촉진 작용에 대하여 시험하였다.

<사용 세포 및 시약류>

ㆍ정상 인간 섬유 아세포(쿠라보)

ㆍHEPARIN(시그마(SIGMA): H-3149)

ㆍDMEM(기브코)

ㆍFBS

<프로토콜>

1. 10 ％ FBS를 포함하는 배지에서 전면생장으로 증식한 섬유 아세포를 트립신 처리에 의해 분산시키고, 원심 분리를 행하였다.

2. 상청을 제거하여 10 ％ FBS를 포함하는 DMEM에 재현탁시키고, 섬유 아세포를 12 웰 플레이트(4.5 cm²/웰)에 3×10³ 세포/cm²로 파종하였다.

3. 세포 파종 4 시간 후에, 상청의 DMEM을 제거하고, 0.4 ％ FBS를 포함하는 DMEM으로 교환하여 세포 증식 억제 조건하에서 72 시간 배양을 행하였다(37 ℃, 5 ％ CO₂).

4. 0.4 ％ FBS를 포함하는 DMEM을 제거하여 10 ％ FBS를 포함하는 DMEM으로 교환함으로써 세포 증식 억제를 해제하였다. 이 때의 배양 조건은 헤파린에 의한 영향을 보기 위해서, 10 ％ FBS-DMEM, 0.1 ％ 헤파린/10 ％ FBS-DMEM, 1.0 ％ 헤파린/10 ％ FBS-DMEM(각 n=3)으로 하였다. 또한, 여기에 파레롤을 10^-6 ㎖/㎖-DMEM, 5 x 10^-7 ㎖/㎖-DMEM, 10^-7 ㎖/㎖-DMEM 농도로 첨가한 것을 제조하였다.

<결과>

결과를 도 1의 그래프에 나타내었다. 그래프 1은 헤파린 미처리 조건, 그래프 2는 0.1 ％ 헤파린 처리 조건에서 각 농도의 파레롤 용액을 배지에 첨가한 경우의 세포 증식 효과를 나타낸다. 모든 조건에 있어서 파레롤을 첨가한 군이 대조군인 DMSO 첨가군보다 세포 증식이 촉진되는 경향이 나타났다. 이로부터, 파레롤에 섬유 아세포 증식 촉진 작용이 존재하는 것을 알 수 있었다.

실시예 2

파레롤이 세포 증식 촉진 작용을 갖는 것이 상기 실험에 의해서 확인되었다. 또한, 파레롤의 섬유 아세포의 이동능에의 영향을 확인하기 위해서, 삼차원 콜라겐 겔을 생검 트레판으로 펀칭하여 제조한 「창상 치유 모델」을 이용하여, 창상 부위로부터 파생하는 섬유 아세포의 거동을 파레롤 첨가군과 미첨가군에서 비교하였다.

<사용 세포 및 시약류>

ㆍ정상 인간 섬유 아세포(쿠라보)

ㆍ10 ％ FBS 첨가 DMEM(기브코)

ㆍ콜라겐 배지 용액(0.5 ％ 제I형 콜라겐:5×DMEM:200 mM HEPES:2.2 ％ NaHCO₃:0.1 N NaOH:FBS:물을 4:4:2:2:1:2:3의 비율로 혼합)

ㆍ생검 트레판(선단 직경 φ3.0 mm)

<프로토콜>

1) 실시예 1의 프로토콜의 4에서 얻은 섬유 아세포의 배양물과 콜라겐 배지 용액을 1:9(부피)의 비율로 혼합하여 콜라겐 겔을 제조하고, 10 ％ FBS 배지로 1 주간 부유 배양하였다.

2) 겔 크기가 콜라겐 배지 용액을 첨가하여 콜라겐 겔을 제조한 시점부터 1/5 내지 1/10 정도의 크기까지 수축되면, 직경 3 mm의 생검 트레판으로 겔 중앙부를 펀칭하였다.

3) 6웰 플레이트를 준비하고, 웰 중앙에 콜라겐 용액을 15 ㎕ 적하하고, 거기에 펀칭한 삼차원 콜라겐 겔을 올려놓고 10 분간 배양하였다(37 ℃, 5 ％ CO₂)

4) 적하한 콜라겐이 단단해지고, 삼차원 콜라겐 겔이 웰 저면에 접착되면, 10 ％ FBS-DMEM, 0.1 ％ 헤파린/10 ％ FBS-DMEM, 1.0 ％ 헤파린/10 ％ FBS-DMEM을 3 ㎖/웰로 첨가하였다.

5) 또한, 4)의 각 배양 조건에 파레롤을 10^-6 ㎖/㎖-DMEM으로 첨가한 군을 제조하였다.

<결과>

「창상 치유 모델」을 제조하고 나서 24 시간 후의 섬유 아세포의 거동을 관찰하였다. 생검 트레판으로 펀칭한 창상 부위로부터 파생한 섬유 아세포의 사진을 도 2에 나타내었다. 헤파린을 첨가하지 않은 10 ％ FBS-DMEM에서는, 파레롤을 첨가한 군이 첨가하지 않은 군보다 섬유 아세포의 이동 거리가 길고, 세포가 활발하게 움직이는 경향이 있었다. 한편, 0.1 ％ 헤파린/10 ％ FBS-DMEM, 1.0 ％ 헤파린/10 ％ FBS-DMEM에서는, 파레롤을 첨가한 군과 첨가하지 않은 군 사이에 세포 이동차는 보이지 않고, 둘다 헤파린 작용에 의해서 이동이 억제되었다.

이로부터, 파레롤은 헤파린의 섬유 아세포의 이동능에의 영향을 억제하는 것이 아니라 섬유 아세포에 직접 작용하여 세포의 이동능을 높이는 것을 추찰할 수 있었다.

실시예 3

하기에 나타내는 절차에 따라서, 헤파린의 첨가에 의한 콜라겐 섬유 다발의 구축 저해를 억제하는 작용 유무를 파레롤에 대하여 조사하였다. 결과를 도 3에 나타내었다. 파레롤은 헤파린의 콜라겐 섬유 다발 구축 저해를 억제함으로써, 진피 콜라겐 섬유 다발 재구축 작용을 발휘하는 것을 알 수 있었다.

<프로토콜>

0.5 ％ 제I형 콜라겐:5×DMEM:200 mM HEPES:2.2 ％ NaHCO₃:0.1 N NaOH:FBS:물을 4:4:2:2:1:2:3의 비율로 혼합하여 콜라겐 용액을 제조한다.(냉각시키면서 행한다)

↓

콜라겐 용액:물=9:1의 비율로 혼합하여 하층 콜라겐 용액을 제조한다.

↓

48웰 플레이트에 하층 콜라겐 용액을 100 ㎕/웰씩 분주한다.

↓

CO₂ 인큐베이터 안에서 굳힌다. (15 분 정도)

↓

NHDF를 정법에 따라서 회수한다.

↓

(세포를 셀 스트레이너로 개개로 분리시킨다.)

↓

세포를 카운팅하여(트립판 블루) 1×10⁵ 세포/㎖로 조정한다.

↓

콜라겐 용액:세포 부유액=9:1(부피)의 비율로 혼합하여 300 ㎕/웰씩 분주한다.

(세포가 불균일해지지 않도록 시시로 섞으면서 작업한다.(최종 1×10⁴ 세포/㎖))

↓

CO₂ 인큐베이터 안에서 4 시간 정치.

↓

주사 바늘의 바늘로 겔을 웰 내벽으로부터 분리하여 겔 수축을 방해하지 않도록 한다.

↓

1.8 ％ 헤파린/10 ％ FBS-DMEM을 500 ㎕/웰 첨가.(최종 1 ％ 헤파린/웰)

↓

파레롤(DMSO에 용해)을 0.9 ㎕/웰 첨가.(1000배 희석)

↓

CO₂ 인큐베이터 안에서 배양. (5 일간)

↓

SEM 관찰의 시료로 한다.

실시예 4

하기에 나타내는 처방에 따라서 본 발명의 피부 외용제인 화장료(엣센스)를 제조하였다. 즉, 가, 나, 다를 80 ℃로 가열하고, 가에 교반하에 서서히 나를 첨가하여 유화시키고, 또한 다를 첨가하여 중화시키고, 교반 냉각시켜 엣센스 1을 얻었다. 동일하게 조작하여 엣센스 1의 파레롤을 에탄올로 치환한 비교예 1도 제조하였다.

<시험예 1>

1군에 5명씩, 2군 총 10명의 40 내지 50세의 패널리스트를 이용하여, 상기에서 제조한 엣센스 1 및 비교예 1의 화장료에 대하여 8 주간의 사용 테스트를 행하였다. 이들 화장료를 아침 저녁 2회 연일 사용하게 하고, 사용 테스트 전후에서 눈꼬리의 복제물을 채취하였다. 경사 45도로부터의 광 조사하에 주름에 의해 생길 수 있는 음영을 현미경에서 화상으로 취입하고, 2진화를 행하여 시야에서의 음영 면적비를 구하고, 이러한 값의 군의 평균값을 구하였다. 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 이로부터, 본 발명의 피부 외용제인 화장료(엣센스)는 우수한 주름 개선 효과를 갖는 것을 알 수 있었다.

실시예 5

<시험예 2>

엣센스 1과 동일하게 하기 처방에 따라서 본 발명의 피부 외용제인 엣센스 2를 제조하였다. 이것을 시험예 1의 방법으로 평가한 결과, 시험 전의 주름 면적비가 8.2±3.2 ％였던 것이, 시험 후 3.9±1.1 ％가 되었고, 효과가 확인되었다.

실시예 6

콜라겐 겔을 펀칭하여 결손부를 형성한 「창상에 의한 피부 조직 결손 모델」을 이용하여, 파레롤의 결손 부위의 조직 재생 촉진 작용을 조사하였다. 절차를 이하에 나타낸다. 이 결과는 도 4에 나타내었다. 이 도면으로부터, 파레롤의 종료 농도가 10^-5 M, 10^-6 M이면, 펀치 구멍의 수축은 명료하게 촉진되었지만, 10^-7 M에서는 수축 촉진이 불명료한 것을 알 수 있었다. 이로부터, 본 발명의 피부 외용제에 있어서 파레롤의 하한값은 10^-6 M인 것이 바람직한 것을 알 수 있었다.

1) 80 ％ 전면생장으로 증식한 정상 인간 섬유 아세포를 0.05 ％ 트립신ㆍEDTA로 분산시켰다. 이것을 3×10⁵ 세포/25 cm²로 파종하였다.

2) 24 시간 후에, 파레롤(Farrerol; 종료 농도 10^-5 M, 10^-6 M, 10^-7 M) 및 DMSO를 첨가한 배지로 교환하여 4 일간 배양하였다.

3) 각각의 조건에서의 배양에 의해 얻은 배양물에, 실시예 2와 동일하게 콜라겐 배지 용액을 첨가하여 콜라겐 겔을 제조하였다. 제조한 콜라겐 겔을, 2)의 배양 조건과 동일한 배지에서 1 주간 부유 배양하였다. 즉, 2)에서 10^-5 M, 10^-6 M, 10^-7 M의 파레롤을 포함하는 배지에서 배양한 섬유 아세포는, 콜라겐 겔 제조 후에도 각각 파레롤 종료 농도가 10^-5 M, 10^-6 M, 10^-7 M의 배지를 이용하여 배양하였다.

4) 겔 크기가 콜라겐 배지 용액을 첨가하여 콜라겐 겔을 제조한 시점보다 1/5 내지 1/10 정도의 크기까지 수축되면, 직경 3 mm의 생검 트레판으로 겔 중앙부를 도넛형으로 펀칭하여 「창상 모델」을 제조하였다.

5) 6웰 플레이트를 준비하여 웰 중앙부에 5 ㎕의 콜라겐을 적하하고, 거기에 창상 모델의 콜라겐 겔을 올려놓고 37 ℃에서 15 분간 배양하였다.

6) 적하한 콜라겐이 굳어 겔이 웰 저면에 접착되면, 3)과 동일한 조건의 배지를 3 ㎖ 첨가하여 「창상에 의한 피부 조직 결손 모델」로서 배양을 행하였다. 그 후, 콜라겐 겔의 창상 부위가 막혀가는 과정을 육안 관찰하였다.

실시예 7

하기에 나타내는 처방에 따라서 본 발명의 피부 외용제인 화장료(엣센스)를 제조하였다. 즉, 가, 나, 다를 80 ℃로 가열하고, 가에 교반하에 서서히 나를 첨가하여 유화시키고, 또한 다를 첨가하여 중화시키고, 교반 냉각시켜 엣센스 3을 얻었다. 동일하게 조작하여, 엣센스 3의 파레롤을 에탄올로 치환한 비교예 2도 제조하였다.

<시험예 3>

엣센스 3과 비교예 2를 이용하여, 패널리스트를 이용하여 창상에 의한 결손 부위의 조직 재생 촉진 작용을 검토하였다. 즉, 패널리스트의 상완 내측부에 트리밍 다이(trimming die)를 대고, 메스로 표피를 벗겨내어 1 mm×1 mm의 부위를 3개 제조하였다. 1개 부위는 엣센스 3을, 표피를 제거한 날부터 5 일간 1 일 1회 도포하고, 1개 부위는 비교예 2를, 표피를 제거한 날부터 5 일간 1 일 1회 도포하며, 나머지 1개 부위는 아무 처치도 행하지 않았다. 도포 후 1 주간 및 2 주간 관찰을 행하여 결손 부위의 조직 재생의 정도를 관찰하였다. 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 이로부터, 본 발명의 피부 외용제인 엣센스 3은 결손 부위의 조직 재생 촉진 작용이 우수한 것을 알 수 있었다. 또는, 반흔의 생성도 전혀 관찰되지 않았다.

실시예 8

<시험예 4>

하기에 나타내는 처방에 따라서 실시예 7과 동일한 방법에 의해, 본 발명의 피부 외용제인 피부 외용 의약 1을 제조하였다. 시험예 3과 동일한 평가를 행한 결과, 피부 외용 의약 1은 항생 물질이 공존함에도 불구하고, 우수한 결손 피부 조직의 재생 촉진 작용을 나타내었다.

실시예 9

이하에 나타내는 절차에 따라서 파레롤의 케라티노사이트에 대한 작용을 검토하였다.

<실험 1: 파레롤의 케라티노사이트에 대한 세포 독성 평가>

[사용 세포 및 시약류]

ㆍ 정상 인간 표피 각화 세포(쿠라보 가부시끼가이샤 제조)

ㆍ휴메디아(Humedia) KG2(기브코사 제조)

ㆍWST-8/1-메틸 PMS(셀 카운팅 키트-8: 도진 가가꾸 겡뀨쇼 가부시끼가이샤 제조)

[샘플 제조]

DMSO에 용해된 10^-2 M 파레롤을 DMSO로 희석하여 농도 조정한 파레롤의 샘플을 제조하였다.

[프로토콜]

1) 80 ％ 전면생장으로 증식한 정상 인간 표피 각화 세포를 0.05 ％ 트립신ㆍEDTA로 분산시켰다. 이것을 96웰/플레이트에 3×10³ 세포/웰, 6×10³ 세포/웰의 2 조건의 세포 농도로 파종하였다.

2) 24 시간 후, 농도 조정한 파레롤의 샘플을 100 ㎕/웰씩 첨가하였다(n=8).

3) 샘플 첨가 24 시간 후, 48 시간 후에 WST-8/1-메틸 PMS를 10 ㎕/웰로 첨가하여 37 ℃에서 4 시간 인큐베이션하였다.

4) 측정 파장 450 nm, 참고 파장 650 nm에서 흡광도(OD값)를 측정하였다.

<결과>

MTT에 의한 평가 결과를 이하의 도 5의 그래프에 나타내었다. OD값은 파레롤의 농도 의존적으로 증가하는 것이 나타났다. 3×10³ 세포/웰의 24 시간에 있어서는, 대조군인 DMSO에 비교하여 10^-5 M 파레롤은 2배 이상의 OD값을 나타내었다. 48 시간에 있어서도 DMSO에 비교하여 1.7배 정도의 값을 나타내었다. 그러나, 세포수가 적어 원래의 OD값이 낮았기 때문에, 파종 세포수를 배로 만든 6×10³ 세포/웰에서 재현성을 확인하였다. 그 결과, 거의 동일한 결과를 얻을 수 있었다.

한편, 육안 평가에 있어서는, DMSO에 비교하여 파레롤 첨가군에서의 세포 증식이 촉진된 인상을 받지 않았다.

<실험 2: 파레롤의 케라티노사이트에 대한 세포 증식 효과(직접 평가)>

[사용 세포 및 시약류]

ㆍ정상 인간 표피 각화 세포(쿠라보 가부시끼가이샤 제조)

ㆍ휴메디아 KG2(기브코사 제조)

[프로토콜]

1) 정상 인간 표피 각화 세포를 6×10³ 세포/㎖로 제조하고, 이것을 96웰/플레이트에 1 ㎖씩 파종하였다.

2) 24 시간 후에 상청을 제거하여, DMSO로 농도 조정한 파레롤의 샘플을 첨가한 배지를 1 ㎖씩 첨가하였다.

3) 샘플 첨가 24 시간 후, 48 시간 후, 72 시간 후에 세포를 0.05 ％ 트립신ㆍEDTA로 분산시키고, 이것을 혈구 계산판을 이용하여 셀 카운팅하였다. 한편, 실험 1에서는 WST-8에서의 평가를 세포수의 지표로 하였지만, 이 방법은 미토콘드리아 내의 탈수소 효소에 작용하여 간접적으로 세포수를 평가하는 방법이기 때문에, 본 검토에서는 직접적으로 세포수를 측정하였다.

[결과]

셀 카운트의 결과를 도 6에 나타내었다. 그래프는 대조군(DMSO 첨가군)의 세포수를 100 ％라 한 경우의 세포 증식률로 나타낸다. 대조군과 비교하여, 농도 의존적으로 세포 증식률은 억제되는 경향이 나타났다. 10^-5 M 파레롤을 첨가한 군의 세포 증식률은 24 시간 후에 75.1±5.2 ％로 억제되고, 그 밖의 농도에 있어서도 10^-6 M에서는 75.5±5.8 ％, 10^-7 M에서는 77.1±8.6 ％의 세포 증식률에 머물렀다. 48 시간 후에는, 10^-5 M 파레롤을 첨가한 군에서는 약 71.9±16.6 ％의 증식률이었지만, 그 이하의 농도에서는 대조군과 동등한 정도의 세포 증식률을 나타내었다. 또한, 세포 형태에 있어서는 변화는 확인되지 않았다(도 7). 즉, 직접 평가에 의한 결과는 WST-8에 의한 간접적인 세포수의 평가와는 일치하지 않았다. 이 결과로부터, 파레롤은 케라티노사이트 1 세포당 미토콘드리아 내의 시트르산 회로의 반응을 촉진시킨 것으로 추측된다. 따라서, 시트르산 회로의 반응시에 생기는 NADH의 작용에 의해, 다음 반응 단계인 산화적 인산화 반응도 촉진되는 것이 예상되고, 그 결과 세포 내의 에너지원이 되는 ATP의 생성, 즉 에너지 대사능이 항진되었을 가능성이 시사된다.

<실험 3: 표피 각화 세포를 통한 섬유 아세포에의 영향의 검토>

[개요]

표피 각화 세포와 섬유 아세포 사이에 어떠한 상호 작용이 있는가, 또한 공배양에서 파레롤이 섬유 아세포에 대하여 작용하는가를 발견하기 위해서 프로콜라겐 생산량을 지표로 한 평가를 실시하였다. 방법은 문헌 [Eming SA et al., Hum. Gene. Ther., 9(4), 529-39(1998)]에 기재된 방법에 준하였다.

[사용 세포 및 시약류]

ㆍ정상 인간 표피 각화 세포(쿠라보 가부시끼가이샤 제조)

ㆍ휴메디아 KG2(쿠라보 가부시끼가이샤 제조)

ㆍ정상 인간 섬유 아세포(쿠라보 가부시끼가이샤 제조)

ㆍDMEM(기브코사 제조)

ㆍPIP EIA 키트(다카라 바이오 가부시끼가이샤 제조)

[프로토콜]

1) 표피 각화 세포

1일째: 24웰 플레이트에 3×10⁴ 세포/웰 파종한다.

6일째: PBS로 세정 후, DMEM+2 ％ FBS로 배지 교환하여 파레롤(10^-6 M, 10^-7 M, 10^-8 M, DMSO)를 첨가한다.

7일째: 배양 상청을 채취

2) 섬유 아세포

3일째: 24웰 플레이트에 2.5×10⁴ 세포/웰 파종한다.

7일째: PBS로 세정 후, 표피 각화 세포의 배양 상청(900 ㎕)을 첨가하여 48 시간 배양한다.

9일째: PBS 및 무혈청 DMEM으로 세정 후, 무혈청 DMEM 500 ㎕로 배지 교환하고, 2 시간 배양하여 배양 상청을 회수하고, 원심 상청(15000 rpm, 5 초)의 프로콜라겐량을 하기 방법에 따라서 측정하였다.

[프로콜라겐 생산량의 정량]

1) 표준 항체액을 100 ㎕씩 플레이트의 각 웰에 첨가한 후, 미리 제조한 각 농도의 PIP 표준액(320, 160, 80, 40, 20, 10 ㎕/㎖: 검체 희석은 DMEM으로 실시함) 및 검체를 20 ㎕씩 마이크로피펫으로 2연(連)씩 첨가하고, 37 ℃에서 3 시간 반응한다.(제1차 반응)

2) 반응액을 버리고, PBS로 4회 세정 후, 기질 용액(TMBZ)을 100 ㎕씩 8연 피펫으로 각 웰에 첨가하고, 실온(20 ℃ 내지 30 ℃)에서 15 분 반응시킨다.(제2차 반응)

3) 정지 용액을 100 ㎕씩, 기질 용액을 넣은 순서대로 각 웰에 첨가하여 반응을 정지시킨 후 잘 혼화한다.

4) 배지를 대조로서 0으로 조절하고, 파장 450 nm에서 흡광도를 플로팅하여 표준 곡선을 제조하여 검체의 흡광도로부터 대응하는 PIP 농도를 판독한다.

[결과]

결과를 도 8에 나타내었다. 파레롤의 농도 의존적으로 프로콜라겐 생산량이 유의하게 증가하였다. 한편, 섬유 아세포 배양시에 파레롤을 첨가하고, 그 후 표피 각화 세포의 배양 상청을 첨가한 방법으로 평가한 다른 계에서는, 프로콜라겐의 생산량에 큰 변화가 보이지 않았다. 이로부터, 파레롤이 섬유 아세포에 대하여 직접적으로 프로콜라겐 생산 증가를 촉진시키는 작용은 작다고 생각된다. 따라서, 파레롤은 표피 각화 세포에 작용하여, 표피 각화 세포가 섬유 아세포의 콜라겐류의 생산을 높이는 작용을 증대시킨다고 판단할 수 있다. 이와 같이, 공배양계에서 각화 세포를 통해 섬유 아세포의 콜라겐 생산능을 변화시킬 수 있기 때문에, 예를 들면 삼차원 배양 피부 등에 있어서 삼차원 피부의 성상을 원하는 형태로 변화시키는 것으로도 응용할 수 있다.

실시예 10

하기에 나타내는 처방에 따라서 파레롤을 함유하는 피부 외용제(화장료: 로션)를 제조하였다. 즉, 처방 성분을 실온에서 교반 가용화하여 로션을 얻었다. 이 로션을 쥐나 인간의 피부에 경피 투여함으로써 피부 진피에서의 프로콜라겐의 생산량을 늘릴 수 있고, 이로써 진피 내의 콜라겐량을 증대시킬 수 있다. 이것은, 피부에는 각화 세포(케라티노사이트)와 섬유 아세포가 공존하기 때문이다.

실시예 11

<피검 물질의 제조>

스크리닝의 피검 물질로서 고추나물 추출물을 제조하였다. 즉, 물레나물과 고추나물(Hypericum erectum Thunberg(Guttiferae))의 지상부의 건조물 1 kg에 80 ％ 에탄올 수용액 10 ℓ를 첨가하여 교반하에 4 시간 환류를 행하였다. 냉각 후 불용물을 여과로 제거하고, 감압 농축시킨 후, 동결 건조시켜 비정질을 51 g 얻었다. 이것을 물에 분산시키고, 다이아이온 HP20에 충전시켜 5 ℓ의 물, 이어서 5 ℓ의 50 ％ 에탄올 수용액을 흘려 세정하고, 99 ％의 에탄올로 용출시켜 용출분을 분획화하고, 분획을 박층 크로마토그래피와 HPLC로 체크하면서, 동일한 단일 물질을 포함하는 분획은 합하고, 복수개의 성분을 포함하는 분획은 재차 크로마토그래피로 정제하여, 단일 성분을 포함하는 분획을 7개 얻었다.

<스크리닝예>

상기에서 얻어진 단일 성분을 포함하는 분획을 피검 물질로 하고, 이하의 방법을 이용하여 각 피검 물질의 콜라겐 구축 작용을 평가함으로써 창상 치유 효과를 갖는 물질을 스크리닝하였다. 구체적인 절차는 후술한다.

동물의 섬유 아세포를 포함하는 콜라겐 겔을 펀칭하여 결손부를 형성한 「창상 모델」을 이용하여, 피검 물질 존재하에서의 결손부의 보충, 수축의 정도를 관찰하였다. 절차를 이하에 나타낸다. 시험 물질 중, 가장 결손부의 보충, 수축의 정도가 가장 컸던 것에 대하여, 단일 성분의 구조를 양성자 NMR, 질량 분석, ¹³C-NMR로 동정한 결과, 파레롤이었다. 한편, 상기 추출물로부터의 파레롤의 수량은 3.2 mg이었다. 파레롤은 80 ％ 에탄올 수용액 추출물의 용매 제거물 중에 약0.006 질량％ 함유되었다.

또한, 파레롤의 종료 농도를 10^-5 M, 10^-6 M, 10^-7M으로 조정하여, 각각의 농도에서의 결손부의 수축 정도를 관찰하였다. 이 결과를 도 9에 나타내었다. 이 도로부터, 파레롤의 종료 농도가 10^-5 M, 10^-6 M이면, 펀치 구멍(결손부)의 수축은 명료하게 촉진되었지만, 10^-7 M에서는 수축의 촉진이 불명료한 것을 알 수 있었다. 이로부터, 파레롤의 콜라겐 구축 촉진 효과는, 파레롤을 적어도 10^-6 M 이용함으로써 창상 치유 촉진 효과를 발휘할 수 있는 것을 알 수 있었다. 이와 같이 본 발명의 스크리닝 방법에 따르면, 창상 치유 촉진 작용을 갖는 피검 물질의 유효 농도를 구할 수도 있다.

<절차>

1) 전배양에 의해 80 ％ 전면생장으로 증식한 정상 인간 섬유 아세포를 0.05 ％ 트립신ㆍEDTA로 분산시켰다. 이것을 3×10⁵ 세포/25 cm²(1×10⁴ 세포/cm²)로 플레이트에 파종하였다.

2) 24 시간 배양한 후, 파레롤(종료 농도 10^-5 M, 10^-6 M, 10^-7 M) 및 DMSO를 첨가한 배지로 교환하여 4 일간 배양하였다.

3) 얻어진 배양물에 실시예 3과 동일하게 콜라겐 배지 용액을 첨가하여 콜라겐 겔을 제조한 후, 2)에서 사용한 배지를 이용하여 콜라겐 겔 내의 섬유 아세포를 배양하였다. 배지에서의 피검 물질의 농도는 2)의 배지에서의 농도에 대응시켰다. 즉, 2)에서, 10^-5 M, 10^-6 M, 10^-7 M의 파레롤을 포함하는 배지에서 배양한 섬유 아세포는, 콜라겐 겔 제조 후에도 각각 파레롤의 종료 농도가 10^-5 M, 10^-6 M, 10^-7 M인 배지에서 배양하였다.

4) 1 주간의 배양 후, 콜라겐 겔의 크기가 콜라겐 용액을 첨가한 시점보다 1/5 내지 1/10 정도의 크기까지 수축하였다. 계속해서, 직경 3 mm의 생검 트레판으로 콜라겐 겔의 중앙부를 도넛형으로 펀칭하여 「창상 모델」을 제조하였다.

5) 6웰 플레이트를 준비하여 웰 중앙부에 5 ㎕의 콜라겐 용액을 적하하고, 창상 모델의 콜라겐 겔을 올려놓고 37 ℃에서 15 분간 배양하고, 콜라겐 겔을 웰 저면에 접착시켰다.

6) 계속해서, 각 웰에 2)의 배지와 동일한 배지를 3 ㎖씩 첨가하고, 상기 콜라겐 겔에 포함되는 섬유 아세포의 배양을 7 일간 행하였다. 이 배양 기간 중, 콜라겐 겔의 창상 부위가 막혀가는 과정을 육안 관찰하였다.

본 발명의 피부 외용제는 화장료나 피부 외용 의약 등에 응용할 수 있다. 또한, 본 발명의 피부 외용제를 이용하여 창상 치유를 촉진시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 섬유 아세포 콜라겐 생산능의 증강 방법을 이용하여, 예를 들면 삼차원 배양 피부 등에 있어서 삼차원 피부의 성상을 원하는 형태로 변화시켜 인공 피부를 만드는 데에도 응용할 수 있다.

또한, 본 발명의 스크리닝 방법을 이용하여 피부 외용 의약에 바람직한 창상 치유 촉진 작용을 갖는 물질을 스크리닝할 수 있다.

Claims

파레롤 또는 그의 염, 또는 파레롤 및 그의 염 둘 다를 함유하는 주름 개선용 피부 외용제.
제1항에 있어서, 상기 파레롤 또는 그의 염, 또는 파레롤 및 그의 염 둘 다의 함유량이 1×10^-6 내지 1 질량％인 것을 특징으로 하는 피부 외용제.
제1항에 있어서, 상기 파레롤 또는 그의 염, 또는 파레롤 및 그의 염 둘 다를 포함하는 물레나물과 고추나물(Hypericum erectum Thunberg(Guttiferae)) 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제.
제3항에 있어서, 상기 추출물 내 파레롤 또는 그의 염, 또는 파레롤 및 그의 염 둘 다의 함유량이 10^-6 내지 0.1 질량％인 것을 특징으로 하는 피부 외용제.
파레롤 또는 그의 염, 또는 파레롤 및 그의 염 둘 다를 함유하는 창상 치유용 피부 외용제.
제5항에 있어서, 상기 파레롤 또는 그의 염, 또는 파레롤 및 그의 염 둘 다의 함유량이 1×10^-6 내지 1 질량％인 것을 특징으로 하는 피부 외용제.
제5항에 있어서, 상기 파레롤 또는 그의 염, 또는 파레롤 및 그의 염 둘 다를 포함하는 물레나물과 고추나물 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제.
제7항에 있어서, 상기 추출물 내 파레롤 또는 그의 염, 또는 파레롤 및 그의 염 둘 다의 함유량이 10^-6 내지 0.1 질량％인 것을 특징으로 하는 피부 외용제.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제