KR101154616B1

KR101154616B1 - 캄페롤 및 퀘르세틴을 함유하는 히알루론산 생성 촉진용조성물

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Publication number: KR101154616B1
Application number: KR1020040117888A
Authority: KR
Inventors: 김승훈; 강병영; 남개원; 이해광; 문성준; 장이섭
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2004-12-31
Filing date: 2004-12-31
Publication date: 2012-06-08
Also published as: JP2010500282A; KR20060078292A; CN101111244B; CN101111244A; EP1830834A1; US20110124719A1; US20080300301A1; WO2006070978A1; EP1830834A4

Abstract

본 발명은 캄페롤(Kaempferol) 및 퀘르세틴(Quercetin) 중 어느 하나 이상을 함유하는 히알루론산 생성촉진용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 캄페롤 또는 퀘르세틴은 인간 표피 피부세포주에 존재하는 히알루론산 합성효소(hyaluronic acid synthase; HAS) 유전자의 발현을 증가시켜 인체세포에서 히알루론산(hyaluronic acid) 생성을 촉진하는 효능이 있으므로, 본 발명에 의한 캄페롤 및 퀘르세틴 중 어느 하나 이상을 함유하는 조성물은 히알루론산 생성촉진용 조성물로서, 피부 탄력 증진, 피부 건조 방지 또는 피부 노화 방지용 화장료 조성물, 또는 퇴행성 관절염 치료 또는 예방용 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

캄페롤, 퀘르세틴, 인간 표피 피부세포주, 히알루론산, 화장료, 약학, 조성물.

Description

캄페롤 및 퀘르세틴을 함유하는 히알루론산 생성 촉진용 조성물{Composition for promoting production of hyaluronic acid containing Kaempferol and Quercetin}

도 1a 및 1b는 캄페롤 및 퀘르세틴에 의한 히알루론산 합성효소의 발현을 mRNA 수준에서 확인해보기 위하여 인간 표피 피부세포주, 즉 각질형성세포주 HaCaT 세포에 캄페롤과 퀘르세틴을 각각 농도별로 처리한 후 히알루론산 합성효소(hyaluronic acid synthase; HAS)들의 유전자들을 정량적 역전사 PCR한 결과로, 도 1a는 캄페롤에 의한 결과도이고, 도 1b는 퀘르세틴에 의한 결과도이다.

도 2는 캄페롤 및 퀘르세틴에 의한 히알루론산의 생성 촉진을 알아보기 위하여, 캄페롤과 퀘르세틴을 인간 표피 피부세포주, 즉 각질형성세포주 HaCaT 세포에 각각 0.1μM, 1μM, 10μM의 농도로 처리한 후 히알루론산 생성의 증가정도를 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)로 확인하고, 그 결과를 정량화 한 것에 관한 도이다.

도 3는 캄페롤 및 퀘르세틴의 세포독성을 알아보기 위하여, 캄페롤과 퀘르세틴을 인간 표피 피부세포주, 즉 각질형성세포주 HaCaT 세포에 각각 0.1μM, 1μM, 10μM의 농도로 처리한 후 MTT{3,(4,5-dimtthylthiazol-2-yl) 2, 5- diphenyltetrazolium bromide} 어세이(assay)를 통해 해당 농도에서 세포독성에 미치는 영향을 살펴보고, 그 결과를 정량화 한 것에 관한 도이다.

본 발명은 캄페롤(Kaempferol) 및 퀘르세틴(Quercetin) 중 어느 하나 이상을 함유하는 히알루론산 생성촉진용 조성물에 관한 것이다.

히알루론산(hyaluronic acid)은 황산기가 부착되지 않은 글루코스아미노글리칸(nonsulfated glycosaminoglycan)의 일종으로, 글루쿠로닉산과 N-아세틸글루코사민 잔기가 반복적으로 사슬 모양으로 연결되어 있는 선형의 분자량 20만～40만의 고분자 물질이다. 히알루론산은 세포외 기질의 주요 구성성분으로, 수분 보유, 세포간 간격 유지, 세포성장인자 및 영양성분의 저장 및 확산에 관여할 뿐만 아니라, 세포의 분열과 분화, 이동 등에도 관여하는 것으로 보고된 바 있다.

포유류의 체내에 존재하는 히알루론산의 50% 이상이 피부, 특히 표피의 세포간 간격과 진피의 결체 조직에 분포한다고 보고되었고, 이러한 히알루론산은 주로 각질형성세포와 섬유아세포에 의해 합성되는 것으로 알려졌다. 인간 피부에서 히알루론산의 양은 노화와 함께 감소되는 것으로 보고되었는데, 피부에서 히알루론산 양의 감소는 노화에 따른 피부 탄력 저하 및 수분 함유량 감소의 직접적인 원인 중 하나라고 여겨지고 있다(Fleischmajer R. et al., Biochem Biophys Acta., 279, pp265-275, 1972; Longas MO. et al., Carbohydr Res., 159, pp127-136, 1987; Ghersetich I. et al., Int. J. Dermatol., 33, pp119-122, 1994).

한편, 인체의 관절낭(joint capsule)은 밖의 섬유층과 안쪽의 활막층으로 구성되어 있는데, 활막에서 만들어지는 활액(synovial fluid)은 히알루론산(hyaluronate, hyaluronic acid)과 당단백질(glycoprotein)을 함유하고 있고, 이 두 성분은 관절을 윤활시키는 작용을 한다. 퇴행성 관절염이 생기면 관절 내 윤활작용을 하는 히알루론산의 생성이 감소되고 단백효소에 의한 파괴가 증가되어 관절 내 히알루론산이 감소하는 것이 보고되었다. 즉, 관절 내 히알루론산이 감소됨에 따라 관절에서 외부 충격을 흡수하거나 분산시키지 못해 관절손상이 심해질 수 있는 것이다. 이에, 히알루론산을 관절로 주입하여 관절염을 완화시키는 방법이 1997년 미국 FDA에서 인정되어 현재 시술되고 있으나, 궁극적으로는 신체 내의 히알루론산 합성을 증가시키는 방법이 더 좋은 효과를 줄 수 있다.

피부 세포 배양 상태에서의 히알루론산의 합성은 여러 종류의 성장인자와 트랜스레티노인산, N-메틸세린 등에 의해 증가된다는 보고(Heldin P. et al., Biochem. J., 258, pp919-922, 1989; Heldin P. et al., Biochem. J., 283, pp165-170, 1992; Suzuki M. et al., Biochem. J., 307, pp817-821, 1995; Tirone E. et al., J. Biol. Chem., 272, pp4787-4794, 1997; Tammi R. et al., J. Invest. Dermatol., 92, pp326-332, 1989; Akiyama H. et al., Biol. Pharm. Bull., 17 , pp361-364, 1994; Sakai S. et al., Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol., 12, pp276-283, 1999)와 피부에 도포 된 여성호르몬(estradiol) 및 그 유사물질이 히알 루론산의 합성을 증가시킨다는 보고(Sobel H. et al., Steroids, 16, pp1-3, 1970; Bentley JP. et al., J. Invest. Dermatol., 87, pp668-673, 1986; Miyazaki K. et al., Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol., 15, pp175-183, 2002)가 있으나, 히알루론산 대사에 대한 자세한 기작은 아직까지 밝혀지지 않았다. 단지, 히알루론산의 합성은 세포막의 안쪽 표면에서 히알루론산 합성효소(hyaluronic acid synthase)에 의해 진행되며, 합성되는 동안 세포막을 뚫고 나와 세포 외 기질에 축적되는 것으로 알려졌다(Weigel PH. et al., J. Biol. Chem., 272, pp13997-14000, 1997).

포유동물에서 히알루론산 합성효소의 유전자는 서열상의 유사성이 높은 히알루론산 합성 효소 1(hyaluronan synthase1; HAS1), 히알루론산 합성 효소 2(hyalruonsn synthase2; HAS2) 및 히알루론산 합성 효소 3(hyaluronan synthase3; HAS3)의 세가지 형태가 보고되었다. 이와 관련하여, 표피성장인자(Epidermal growth factor; EGF)를 표피세포 배양액 속에 첨가하였을 때 히알루론산 합성 효소 (hyaluronic acid synthase; HAS)의 유전자 발현이 증가되었음이 보고된 바 있다(Pienimaki JP. et al., J. Biol. Chem., 276, pp20428-20435, 2001). 그러나, 히알루론산의 세포 및 조직에서의 분포, 히알루론산과 관련된 각종 인자 및 효소, 예를 들면 히알루론산 합성효소(hyaluronic acid synthase; HAS) 또는 히알루론산 활성을 조절하는 인자에 대한 연구는 매우 미흡한 실정이다.

이에, 히알루론산의 상기와 같은 적용가능성에 주목하여, 히알루론산을 효과적으로 생산 및 주입하거나, 또는 인체 내의 히알루론산의 합성을 증가시킬 수 있는 방법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나, 괄목 할만한 연구결과는 아직 알 려진 바가 없는 실정이다.

한편, 플라보노이드(Flavonoid)류인 플라보놀(flavonol)의 일종인 하기 화학식 1로 표시되는 캄페롤(Kaempferol)과 하기 화학식 2로 표시되는 퀘르세틴(Quercetin)은 일반적인 식용 폴리페놀 화합물로서, 이들은 식용 식물에 많이 존재하며 건강에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로, 이러한 디페닐프로판 골격(diphenylpropane skeleton)을 가진 플라보노이드류들은 항암, 항산화 및 항염, 항알레르기의 효능도 가진 것으로 알려져 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

이에, 본 발명자들은 히알루론산을 보다 효과적으로 인체에 공급할 수 있는 방법에 대하여 꾸준히 연구한 결과, 항암 효과, 항산화 효과 및 항염, 항알레르기 효과 등이 있는 것으로 알려진 플라보노이드(flavonoid)류인 캄페롤(Kaempferol)과 퀘르세틴(Quercetin)이 상기 공지의 효능 뿐만 아니라, 인체 세포 내의 히알루론산 합성효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증가시켜 결과적으로 인체 내의 히알루론산의 생성을 촉진하는 효능이 있음을 발견하였다.

즉, 캄페롤과 퀘르세틴을 인간 표피 피부 세포주에 처리할 경우, 세포에 의한 히알루론산의 생성이 촉진되고 생체 내의 히알루론산의 양이 증가하므로, 히알루론산의 유용성을 이용하는 각종의 용도, 예를 들면 피부 탄력 증진, 피부 건조 방지 또는 피부 노화 방지와 같은 피부 개선용 또는 퇴행성 관절염의 치료 또는 예방과 같은 의약용으로 이용할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 캄페롤과 퀘르세틴을 유효성분으로 함유하는 히알루론산 생성촉진용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 히알루론산 생성촉진용 조성물의 히알루론산 합성효소의 효능을 이용하는 각종의 용도, 예를 들면 피부 탄력 증진, 피부 건조 방지 또는 피부 노화 방지와 같은 피부 개선용, 또는 퇴행성 관절염 치료 또는 예방용 등으로 캄페롤과 퀘르세틴의 이용 가능성을 제공하는데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 캄페롤(Kaempferol) 및 퀘르세틴(Quercetin) 중 어느 하나 이상을 함유하는 히알루론산 생성촉진용 조성물을 제공한다.

상기 히알루론산 생성촉진용 조성물은 히알루론산 합성효소(hyaluronic synthase; HAS) 유전자의 발현을 증가시켜 히알루론산 생성을 촉진하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 히알루론산 생성촉진용 조성물은 피부 탄력 증진용 화장료 조성물임을 특징으로 한다.

또한, 상기 히알루론산 생성촉진용 조성물은 피부 건조 방지용 화장료 조성물임을 특징으로 한다.

또한, 상기 히알루론산 생성촉진용 조성물은 피부 노화 방지용 화장료 조성물임을 특징으로 한다.

또한, 상기 히알루론산 생성촉진용 조성물은 퇴행성 관절염의 치료 또는 예방용 약학 조성물임을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 히알루론산 생성촉진용 조성물은, 전체 조성물 중 캄페롤 및 퀘르세틴 중 어느 하나 이상을 0.001 내지 99.9 중량%의 농도로 함유하는 것이 바람직하다. 이는 상기 성분이 0.001 중량% 미만의 농도에서는 그 효과를 얻기 어려우며, 99.9 중량% 초과의 농도에서는 제형 안정성에 문제가 발생할 수 있고 또 불순물의 존재로 인해 99.9 중량%를 초과할 수 없기 때문이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 플라보노이드류인 캄페롤과 퀘르세틴의 히알루론산 생성 촉진 효과를 알아보기 위하여, 캄페롤과 퀘르세틴을 인간 표피 피부 세포주, 즉 각질형성세포주인 HaCaT 세포에 각각 처리했을 때 히알루론산 합성효소 (hyaluronic acid synthase, HAS) 유전자의 발현이 증가되고, 또한, 히알루론산 생성이 증가됨을 확인하였다. 즉, 캄페롤과 퀘르세틴을 24시간 동안 처리한 인간 표피 피부 세포주인 HaCaT 세포는 이들을 처리하지 않은 세포에 비해 히알루론산 합성효소 유전자 발현이 증가함을 확인하였다. 다시 말하면, 캄페롤과 퀘르세틴은 인간 표피 피부 세포내의 히알루론산 합성효소 유전자의 발현을 촉진하는 효능이 있는 것이다. 동시에 인간 표피 피부 세포주에서 히알루론산의 양이 캄페롤과 퀘르세틴 처리에 의해 증가됨을 확인하였다.

따라서, 상기와 같이 본 발명에 따라 히알루론산 합성효소 유전자의 발현을 증가시키고 히알루론산의 생성을 촉진하는 효능이 있는 것으로 밝혀진 캄페롤과 퀘르세틴은 히알루론산의 유용성을 이용하는 각종 피부 외용제의 유효성분으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 피부 탄력 증진, 피부 건조의 방지 또는 피부 노화의 방지와 같은 화장료 조성물에 첨가할 수 있다.

또한, 히알루론산을 투여함으로써 질병, 예를 들면 퇴행성 관절염과 같은 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물에도 첨가할 수 있다. 그러나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 캄페롤 및 퀘르세틴 중 어느 하나 이상을 함유하는 화장료 조성물은, 상기한 성분 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유하는 것도 무방하다.

또한, 상기 화장료 조성물은 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명에 의한 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 유액, 화장수, 크림, 로션, 에센스, 팩, 젤과 같은 피부 점착타입의 화장료, 파우더, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션과 같은 제형을 갖는 화장료, 샴푸, 린스, 바디크렌저, 미용액, 클렌징 폼, 클렌징크림, 클렌징 워터, 비누와 같은 세정 화장료의 제형을 가질 수 있다.

각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기의 캄페롤 및 퀘르세틴 중 어느 하나 이상 이외에 다른 성분들은 기타 화장료의 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의선정하여 배합할 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제 한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.01~5 중량%, 보다 바람직하게는 0.01~3 중량%로 배합된다.

본 발명의 캄페롤 및 퀘르세틴 중 어느 하나 이상을 함유하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 캄페롤 및 퀘르세틴 중 어느 하나 이상의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 캄페롤 및 퀘르세틴 중 어느 하나 이상을 함유하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취, 분무제와 같은 경피투여형 제형을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 대상자의 연령, 성별, 체중, 증상, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학 조성물을 0.01 내지 1000 mg/일로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 할 수도 있 고, 수회 나누어 할 수도 있다. 또한, 그 투여량은 연령, 성별, 체중, 질병의 정도, 투여경로 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 캄페롤 및 퀘르세틴 중 어느 하나 이상은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 시험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

<시험예 1> 인간 표피 피부 세포주 HaCaT에서의 히알루론산 합성 효소 (hyaluronic acid synthase; HAS) 유전자 발현 증가 효과

캄페롤(Kaempferol)과 퀘르세틴(Quercetin)에 의한 인간 표피 피부 세포주 HaCaT에서의 히알루론산 합성 효소(hyaluronic acid synthase; HAS) 유전자 발현 증가 효과를 알아보기 위하여, HaCaT 세포에 캄페롤과 퀘르세틴을 각각 농도별로 처리한 후 히알루론산 합성효소의 유전자 발현을 mRNA 수준에서 확인하기 위하여 히알루론산 합성효소(hyaluronic acid synthase; HAS) 유전자들을 정량적 역전사 PCR하여, 캄페롤과 퀘르세틴에 의한 히알루론산 합성효소(hyaluronic acid synthase; HAS) 유전자들의 변화를 하기와 같이 조사하였다.

1-1. 세포 배양

자발적으로 불사화된 인간 각질형성(케라티노사이트) 세포주 HaCaT를 사용하였으며, 상기 세포주는 푸세니그 박사(Dr. N.E. Fusenig, Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ), Heidelberg, Germany)로부터 구하였다.

먼저, 상기 세포를 10% 우태아 혈청(HyClone), 소듐 비카르보네이트 3.6g/ℓ 및 항체(스트렙토마이신 100㎍ 및 페니실린 100IU/ℓ)(Life Technologies, Inc.)을 함유하는 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's media)에서 적절한 배양 조건(37℃, 5% CO₂, 95% 공기)하에서 배양하였다. 세포는 3일에 한번씩 신선한 배지로 교체해 주고 밀도가 최상에 도달하자마자 1:5의 분할 비로 2차 배양하였다. 캄페롤 또는 퀘르세틴을 처리하기 72시간 전에 조직배양 플라스크 75㎠당 1×10⁵ 개의 세포를 분주하여, 10% 우태아 혈청을 함유하는 배지에서 48시간동안 배양하였다. 그런 다음 무혈청 배지(serum-free medium)에서 24시간동안 배양하고, 캄페롤과 퀘르세틴을 각각 0.1μM, 1μM, 10μM의 농도로 처리하여 24시간동안 배양하였다. 대조군은 1:1,000 희석하여 비히클(vehicle)(디메틸설폭시드, DMSO)이 보충된 배지에서 배양하였다. 이러한 대조군의 배양에서는 DMSO의 성장 및 분화에 미치는 어떤 영향도 관찰되지 않았다.

1-2. RNA 제조

상기 시험예 1-1에서 배양한 HaCaT 세포는 인산 완충 용액(Life Technologies, Inc.)으로 두 번 세척하였고, 모든 세포의 RNA는 제조업자의 지시에 따라 트라이졸(Trizol) 시약(GibcoBRL Life Technologies, Grand Island, NY)을 사용하여 분리하였다. RNA 농도는 광도측정법으로 측정하였고, RNA 질은 아가로오스 겔 전기영동으로 체크하였다.

1-3. PCR을 통해 히알루론산 합성 효소의 mRNA 합성에 미치는 영향 측정

정량적인 역전사 PCR을 통해 캄페롤과 퀘르세틴이 세 종류의 히알루론산 합성 효소의 아형 히알루론산 합성 효소 1(hyaluronan synthase1; 이하, HAS1로 함), 히알루론산 합성 효소 2(hyalruonsn synthase2; 이하, HAS2로 함) 및 히알루론산 합성 효소 3(hyaluronan synthase3; HAS3)의 mRNA 합성에 미치는 영향을 하기와 같이 측정해 보았다.

먼저, 상기 시험예 1-2에서 제조하여 정량한 RNA를 역전사하고, 이어서 세 종류의 히알루론산 합성 효소의 아형 HAS1, HAS2 및 HAS3에 특이적 프라이머 존재 하에 각각의 정량적인 PCR을 수행하였다. 보다 상세히 살펴보면, 총 RNA 4㎍을 M-MuLV 역전사 중합효소(20U/㎕, MBI Fermentas) 1μL, RNAse 억제제(20U/㎕) 1μL, 5 x 반응 완충용액(Reaction Buffer) 4μL, 10mM dNTP 믹스(mix) 2μL, 올리고(oligo)(dT) 프라이머(0.5μg/μL) 1μL를 함유하는 반응 혼합물 2㎕에서 역전사하였다{MBI 퍼멘타스(Fermentas)의 첫 번째 가닥 cDNA 합성 키트(First Strand cDNA Synthesis Kit), #K1612를 사용하여 제조업자 지시에 따라 수행}. 처음 RNA와 올리 고(oligo)(dT) 프라이머와 DEPC-H₂O를 섞어 총 11μL가 되게 한 후 70℃에서 5분간 반응 후 얼음에 넣는다. 이후 5 x 반응 완충용액(Reaction Buffer), RNAse 억제제, dNTP를 넣고 37℃에서 5분간 반응 후 M-MuLV를 넣고 다시 37℃에서 60분간 반응시켜 역전사를 진행한다. 이후 70℃에서 10분간 가열하여 역전자 효소의 활성을 제거하였다. 이후, 계속해서 상기의 반응 혼합물 3㎕를 취하여 PCR 반응에 사용하였다. 각각의 PCR은 타카라 이엑스 태그(TaKaRa Ex Taq) DNA 중합효소(5U/㎕, TaKaRa), 10 x 이엑스 태그 완충용액(Ex Taq Buffer), MgCl₂, dNTP 혼합물(Mixture) 및 25pM의 적절한 센스(sense) 또는 안티센스(antisense) PCR 프라이머(하기 표 1 참조)를 함유하는 반응 혼합물 20㎕ 내에서 퍼킨-엘머 사이클러 9600(Perkin-Elmer Cycler 9600)(Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster, CA)을 사용하여 수행하였다.

프라이머 이름		서열
HAS1	정방향(Forward)	5-AGG TCA TGT ACA CAG CCT TC-3
HAS1	역방향(Reverse)	5-CAG CAG AGG GAC GTA GTT AG-3
HAS2	정방향(Forward)	5-GCT ACC AGT TTA TCC AAA CG-3
HAS2	역방향(Reverse)	5-GGA GTT TCT GTA CAT TCC CA-3
HAS3	정방향(Forward)	5-GAG GAC TGG TAC CAT CAG AA-3
HAS3	역방향(Reverse)	5-ACC GTT CTT TGC ATT TTA GA-3

한편, PCR 반응 조건은 다음과 같다. 94℃에서 5분간 한번의 변성 사이클을 거친 다음 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분 30초간의 사이클을 30회 반복하였다. PCR 결과를 아가로오스 겔에 전기영동하고, 에티디움 브로마이드 (ethidium bromide)로 염색하여 관찰한 결과를 도 1에 나타내었다. 이 때, GAPDH를 증폭한 결과를 표준화를 위한 기준으로 하였다.

그 결과, 도 1a 및 1b에 나타낸 바와 같이, 히알루론산 합성 효소 유전자들 중 아형2 유전자(HAS2)의 경우 대조군과 캄페롤 또는 퀘르세틴 처리군에서 모두 발현되는 것을 확인할 수 있었고, 아형3 유전자(HAS3)의 경우는 대조군에서는 소량 검출되었으나, 1μM과 10μM 농도의 캄페롤 또는 퀘르세틴을 처리한 HaCaT 세포에서는 대조군에 비해 다소 증가한 것을 알 수 있었다.

<시험예 2> 인간 표피 피부 세포주 HaCaT 배양 배지에서의 히알루론산의 증가

캄페롤과 퀘르세틴에 의해 실제 히알루론산의 생성을 촉진하는지 알아보기 위하여, 인간 표피 피부 세포주 HaCaT 배양 배지에 캄페롤과 퀘르세틴을 농도별로 처리한 후 히알루론산 합성이 촉진되어 배지로 배출되는 양을 HA-ELISA 키트(Kit)를 이용하여 확인 정량화하였다.

좀 더 구체적으로, 인간 표피 피부 세포주 HaCaT를 상기 시험예 1-1의 세포 배양방법에 따라 배양을 수행한 후 캄페롤과 퀘르세틴에 의해 합성이 촉진되어 배지로 분비된 히알루론산의 양을 알아보기 위해 배지를 수거하여 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)를 수행하였다. ELISA를 수행하기 위해 이셀론(Echelon)사의 히알루론산 효소-결합 면역흡착제 분석 키트(Hyaluronan Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Kit) (HA-ELISA, Product No: K-1200)를 구입하였다. 위의 세포 배양을 통해 수거한 배지를 HA-ELISA 킷트(Kit)를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 수행하여 캄페롤과 퀘르세틴에 의해 HaCaT 세포에서 합성되어 배지로 배출되는 히알루론산의 합성량을 정량화 하였다. 대조군은 1:1,000 희석하여 비히클(vehicle)(디메틸설폭시드, DMSO)이 보충된 배지에서 배양하였고, 이러한 대조군의 배양에서는 DMSO의 성장 및 분화에 미치는 어떤 영향도 관찰되지 않았다. 한편, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 캄페롤의 경우 1μM과 10μM에서 각각 대조군에 비해 95%의 신뢰도로 통계적으로 유의하게 7%와 8%의 합성능이 증가함을 알 수 있었다. 퀘르세틴의 경우는 1μM과 10μM에서 각각 대조군에 비해 95%의 신뢰도로 통계적으로 유의하게 11%와 24% 합성능이 증가함을 알 수 있었다.

<시험예 3> 인간 표피 피부 세포주 HaCaT에서 캄페롤과 퀘르세틴의 농도별 세포 독성 확인

인간 표피 피부 세포주 HaCaT에서 캄페롤과 퀘르세틴의 농도별 세포 독성을 알아보기 위하여, HaCaT 세포에 캄페롤과 퀘르세틴을 농도별로 처리한 후 세포 독성 정도를 MTT 어세이를 통해 정량화하여 확인하였다.

3-1. 세포 배양

자발적으로 불사화된 인간 케라티노사이트 세포주 HaCaT를 사용하였으며, 상기 세포주는 푸세니그 박사(Dr. N.E. Fusenig, Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ), Heidelberg, Germany)로부터 구하였다. 상기 세포 를 10% 우태아 혈청(HyClone), 소듐 비카르보네이트 3.6g/ℓ 및 항체(스트렙토마이신 100㎍ 및 페니실린 100IU/ℓ)(Life Technologies, Inc.)를 함유하는 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's media)에서 적절한 배양 조건(37℃, 5% CO₂, 95% 공기) 하에 배양하였다. 세포는 3일에 한번씩 신선한 배지로 교체해 주고 밀도가 최상에 도달하자마자 1:5의 분할 비로 2차 배양하였다. 캄페롤 또는 퀘르세틴을 처리하기 72시간 전에 조직배양 플라스크 96 웰 플레이트(well plate)의 각 웰당 1 ×10⁴ 개의 세포를 분주하여, 10% 우태아 혈청을 함유하는 배지에서 48시간동안 배양하였다. 그런 다음 무혈청 배지(serum-free medium)에서 24시간동안 배양하고, 캄페롤과 퀘르세틴을 각각 0.1μM, 1μM, 10μM의 농도로 처리하여 24시간동안 배양하였다. 대조군은 1:1,000 희석하여 비히클(vehicle)(디메틸설폭시드, DMSO)이 보충된 배지에서 배양하였다.

3-2. MTT 어세이(assay)

상기 시험예 3-1에서 배양한 세포를 인산 완충 용액 (Phosphate-Buffered Saline)으로 세척한 후 제조업자의 지시에 따라 MTT {3,(4,5-dimtthylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma} 어세이를 수행하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 대조군의 배양에서는 DMSO의 성장 및 분화에 미치는 어떤 영향도 관찰되지 않았다. 캄페롤과 퀘르세틴의 경우도 대조군에 비해 95%의 신뢰도로 통계적으로 유의하게 히알루론산 합성 평가 농도인 0.1μM과 1μM, 10μM에서 세포 독성이 없음을 확인할 수 있었다.

<참조예 1> 통계 분석

상기 시험예 1 내지 3의 데이터 분석에서 사용한 대응표본 t-검정(Paired t-test)은 시그마스탯(SigmaStat)(SPSS, Inc., Chicago, IL)을 사용하여 수행하였다. 유의성은 p = 0.05 기준으로 고려되었고, 데이터는 평균 ±표준오차로 나타내었다.

상기와 같은 결과를 통하여, 캄페롤과 퀘르세틴을 인간 표피 피부 세포주에 처리하였을 때 히알루론산 합성효소 유전자의 발현이 증가되어, 결과적으로 히알루론산의 생성이 촉진됨을 확인할 수 있었다.

하기에 상기 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 비누 제조

캄페롤......................................1.00 (%)

유지........................................적당량

수산화나트륨................................적당량

염화나트륨..................................적당량

향료........................................소 량

정제수로 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비에 의해 비누를 제조하였다.

제제예 2. 로션 제조

퀘르세틴...................................3.00 (%)

L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염.............1.00

수용성 콜라겐 (1 % 수용액)..................1.00

시트르산나트륨..............................0.10

시트르산....................................0.05

감초 엑기스.................................0.20

1,3-부틸렌글리콜............................3.00

정제수로 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비(%)에 의해 로션을 제조하였다.

제제예 3. 크림 제조

캄페롤 및 퀘르세틴.........................1.00(%)

폴리에틸렌글리콜모노스테알레이트............2.00

자기유화형모노스테아르산글리세린............5.00

세틸알코올..................................4.00

스쿠알렌....................................6.00

트리2-에틸헥산산글리세릴....................6.00

스핑고당지질................................1.00

1.3-부틸렌글리콜............................7.00

정제수로 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비(%)로 크림을 제조하였다.

제제예 4. 팩 제조

캄페롤......................................2.00(%)

폴리비닐알코올..............................13.00

L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염..............1.00

라우로일히드록시프롤린.......................1.00

수용성 콜라겐 (1 % 수용액)...................2.00

1,3-부틸렌글리콜.............................3.00

에탄올.......................................5.00

정제수로 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비(%)로 팩을 제조하였다.

제제예 5. 미용액 제조

퀘르세틴.....................................2.00(%)

히드록시에틸렌셀룰로오스(2 % 수용액).........12.00

크산탄검(2 % 수용액)..........................2.00

1,3-부틸렌글리콜...............................6.00

진한 글리세린..................................4.00

히알루론산나트륨 (1 % 수용액)..................5.00

정제수로 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비(%)로 미용액을 제조하였다.

제제예 6. 산제의 제조

캄페롤........................................100 mg

유당..........................................100 mg

탈크...........................................10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 7. 정제의 제조

퀘르세틴.....................................50 mg

옥수수전분...................................100 mg

유당.........................................100 mg

스테아린산 마그네슘...........................2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 8. 캅셀제의 제조

캄페롤 및 퀘르세틴...........................50 mg

옥수수전분...................................100 mg

유당.........................................100 mg

스테아린산 마그네슘...........................2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 9. 주사제의 제조

캄페롤 및 퀘르세틴...........................50 mg

주사용 멸균 증류수...........................적량

pH 조절제....................................적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 10. 액제의 제조

퀘르세틴....................................100 mg

이성화당.....................................10 g

만니톨........................................5 g

정제수........................................적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

이상에서 알 수 있는 바와 같이, 플라보노이드류인 캄페롤과 퀘르세틴은 인간 표피 피부세포주에 존재하는 히알루론산 합성효소(hyaluronic acid synthase; HAS) 유전자의 발현을 증가시켜 인체세포에서 히알루론산(hyaluronic acid) 생성을 촉진하는 효능이 있으므로, 본 발명에 의한 캄페롤 및 퀘르세틴 중 어느 하나 이상을 함유하는 조성물은 히알루론산 생성촉진용 조성물로서, 피부 탄력 증진, 피부 건조 방지 또는 피부 노화 방지용 화장료 조성물, 또는 퇴행성 관절염 치료 또는 예방용 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

삭제
피부 건조 방지용 화장료 조성물로서,

상기 조성물은,

캄페롤(Kaempferol) 및 퀘르세틴(Quercetin) 중 어느 하나 이상을 함유하며, 히알루론산 합성효소(hyaluronic synthase; HAS) 유전자의 발현을 증가시켜 히알루론산 생성을 촉진함으로써 피부 건조를 방지하는 것을 특징으로 하는 피부 건조 방지용 화장료 조성물.
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제 2항에 있어서, 상기 조성물은 전체 조성물 중 캄페롤 및 퀘르세틴 중 어느 하나 이상을 0.001 내지 99.9 중량%로 함유하는 것임을 특징으로 하는 피부 건조 방지용 화장료 조성물.