KR100883757B1

KR100883757B1 - 신경전달물질 배출을 조절하기 위한 폴리페놀 화합물

Info

Publication number: KR100883757B1
Application number: KR1020070023991A
Authority: KR
Inventors: 권대혁; 신연균; 정창화; 양유수
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2007-03-12
Filing date: 2007-03-12
Publication date: 2009-02-12
Also published as: KR20080083438A; WO2008111796A1; US8263643B2; US20110112181A1

Abstract

본 발명은 식물 폴리페놀 물질을 유효성분으로 포함하는 신경전달물질 배출 조절용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 SNARE 복합체 형성의 저해제로서 신경전달물질 배출을 조절함으로써 SNARE가 관여하는 세포내 반응의 조절제로 유용하다. 본 발명의 SNARE 복합체 형성 저해제는 주름개선용, 통증완화용 조성물로 활용될 수 있다.

Description

신경전달물질 배출을 조절하기 위한 폴리페놀 화합물{POLYPHENOL COMPOUNDS WITH MODULATING NEUROTRANSMITTER RELEASE}

도 1은 재조합 대장균에서 단백질의 발현 및 정제를 통해 얻은 SNARE 단백질들의 SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacryamide gel electrophoresis) 분석 결과를 도시한 것이다.

도 2a 및 도 2b는 본 발명에서 폴리페놀 화합물의 SNARE 복합체 형성 저해능을 SDS-PAGE에 의해 측정한 결과를 막대그래프로 표시한 것이다.

도 3은 본 발명의 폴리페놀 화합물의 SNARE 복합체 형성 저해능을 알아보기 위한 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한 것이다(겔(gel) 사진 상단의 숫자는 처리된 폴리페놀 농도이며, 우측에는 각 폴리페놀 화합물의 명칭을 제시한 것이다).

도 4는 본 발명의 폴리페놀 화합물로부터 SNARE 복합체 형성 저해제를 탐색하기 위한 막 융합현상(membrane fusion assay) 저해의 결과를 도시한 것이다(여기서, 빨간색 원형은 대조군 반응 (control reaction)이 진행되는 경로를 나타낸 것이다).

도 5는 본 발명의 폴리페놀 화합물과 각 SNARE 단백질간의 결합능력을 UV/VIS 스펙트럼을 이용해 확인한 결과를 도시한 것이다.

도 6은 본 발명의 폴리페놀 화합물과 PC12 세포에서 신경전달물질 방출 저해 에의 결과를 도시한 것이다.

도 7은 본 발명의 SNARE 억제제의 작용 메카니즘 (mechanism)의 모식도이다.

본 발명은 신경전달물질 배출을 조절하는 화합물 및 이를 함유한 조성물에 관한 것이다.

근육의 이완과 수축을 조절하기 위하여 근육의 상층에는 신경근육 접합부 (neuromuscular junction)가 있으며, 이 신경 말단 (nerve terminal)에는 시냅스 소포가 장전되어 있다. 근육들은 일종의 신경소포 내부에서 전달되는 신경전달물질의 메시지를 받아 수축하게 된다. 이런 신경전달물질들이 방출되려면, SNARE(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor; SNAP Receptor)라 불리는 수용복합체가 있어야만 하며, 이 복합체가 신경물질들이 근육과 도킹하게 한다.

보다 구체적으로, 신경전달물질의 배출 시에 신경전달물질을 담고 있는 시냅스 소포 (synaptic vesicle)는 시냅스전막 (presynaptic membrane)과 융합되어야 두 경계 간의 통로가 형성될 수 있으며, 이 때 막융합의 근원적인 힘은 3종의 단백질 복합체로 존재하는 SNARE에 의해 제공된다. 특히, 시냅스 소포와 시냅스전막 간의 막융합에 의해 신경전달물질 배출 통로가 열리게 되는데 표적 막 (target membrane)에 부착되어 있는, 신탁신 (Syntaxin) 1a 단백질과 SNAP-25 단백질의 복 합체인 t-SNARE 복합체와, 소포 (vesicle)에 부착되어 있는 v-SNARE가 관여하게 되는데, 이들 SNARE 단백질은 꽈배기처럼 꼬여 있게 된다.

상기 막융합시에는 당분야에 널리 공지되어 있는 지질이중층 (lipid bilayer)의 재배열이 일어나게 된다. 생체막들은 서로 강하게 밀어내고 있으므로 이들 막은 자발적으로 융합되지 않고 외부에서 강한 힘이 주어져 막들간의 반발력을 극복하여야 하는데, 이때 막들간의 반발력을 이겨낼 정도의 강한 힘을 만들어 내는 것이 SNARE 단백질이다. 즉 SNARE 복합체의 형성은 막간 반발력을 극복하는 힘의 원천이며, 신경전달물질의 배출을 포함하는 세포외 배출작용 (exocytosis)의 핵심 현상인 것이다[참조, Weber etc., Cell, 92, 759-772(1998)].

만약, SNARE 수용복합체가 약간 불안정하다면, 전달체는 신경전달물질을 활성적으로 분비할 수 없으며, 따라서 근육 수축이 덜 일어나며 이것은 주름생성이 감소된다는 것을 의미한다(도 7).

이러한 메카니즘을 기초로 하여 많은 주름 생성 억제를 위한 물질들이 연구되고 시판되고 있다.

BoNT (Botulinum neurotoxin, 이하 '보톡스'로 약술함)은 신경전달물질 배출에 관여하는 핵심 단백질인 SNARE 단백질을 절단하는 프로테아제 (protease)이다. 보톡스는 SNARE 단백질을 절단함으로써 신경전달을 차단하고 결과적으로 보톡스가 침투된 근육세포가 마비되도록 한다.

또한, 문헌 [Blanes-Mira et al., International Journal of Cosmetic Science. 24, 303-310, 2002]에는 소위 "바르는 보톡스"라는 아르기렐린 (Argireline)이라는 합성 헥사펩타이드가 기술되어 있다. 이러한 헥사펩타이드는 EEMQRR의 아미노산 서열을 가지고 있는데, 이러한 서열은 SNAP-25의 N-말단 영역의 아미노산 서열과 일치하는 부위이다. 즉 무손상(intact) SNAP-25가 결합하여야 할 부위에 작은 헥사펩타이드가 대신 끼어듦으로써 무손상 SNAP-25가 다른 SNARE 단백질인 신탁신 (Syntaxin) 1a 및 VAMP2와 결합하는 것을 방해하는 역할을 하게 되는 신경전달을 방해하는 일종의 경쟁적인 저해제이다.

현재 바르는 보톡스 제품의 주성분인 아르기렐린은 효과가 불확실하고, 합성 펩타이드의 특성상 가격적으로 불리하며, 소비자 친화적이지도 않다는 약점을 가지고 있다.

그러나, 천연물 유래 또는 합성 폴리페놀 화합물을 사용하여 신경전달물질 억제를 개발하는 것은 펩타이드 소재에 비하여 월등히 저렴한 원료를 제공할 수 있고, 천연물 소재이므로 최종 제품 개발시 소비자에게 친화적으로 접근 가능하므로 펩타이드 소재에 비해 산업적 응용이 수월한 형태라 사료된다.

따라서, 본 발명자들은 폴리페놀 화합물을 사용하여 폴리페놀과 SNARE 단백질간의 결합능력, 막 융합현상 저해와 SDS-PAGE 상에서 SNARE 복합체 형성을 억제하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신경전달 물질 배출 조절 효능을 갖는 폴리페놀 화합물을 유효 성분으로 포함하는 SNARE 억제용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 폴리페놀 화합물을 유효 성분으로 포함하는 신경전달 물질 억제용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명은 신경전달을 억제함으로써 상기 폴리페놀 화합물을 유효 성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 폴리페놀 화합물을 유효 성분으로 포함하는 통증완화용 약학적 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 특정 폴리페놀 화합물을 이용한 SNARE 억제용 조성물을 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 캠페롤(kaempferol), 케르세틴(quercetin), 미리세틴(myricetin), 루테올린(luteolin), 델피니딘(delphinidin), 시아니딘(cyanidin), 부테인(butein), 엘라지산(ellagic acid) 및 이들의 유도체로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합물을 유효 성분으로 포함하는 SNARE 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 천연에서 유래된 폴리페놀 성분 중 각 분류별로 31종을 대상으로 우수한 SNARE 복합체 형성 조절제를 개발하고자 연구를 거듭한 결과, 천연물에서 유래된 유효성분 중 폴리페놀 화합물인 캠페롤, 케르세틴, 미리세틴, 루테올린, 델피니딘, 시아니딘, 부테인, 엘라지산이 신경 전달 경로에 관여하는 SNARE 복합체 형성을 저해함을 발견하였으며(도 2a 및 2b), 이를 신경전달물질 배출 조절에 가장 효능이 뛰어난 천연물로 선정하였다. 이렇게 선정된 화합물은 막융합 저해 실험에서 양호한 저해 효과를 나타내고, SNARE 단백질에 대한 결합능의 실험에 서 SNARE 단백질 중 Vps와 강하게 결합하는 효과를 나타내는 바, SNARE 복합체 형성을 저해함을 확인하였다.

상기 폴리페놀 화합물은 각 화합물이 갖고 있는 유리 수산기의 수, 위치 및 분자크기에 따라 밀접한 관련성이 있는 구조적 특징을 가지며, 따라서, 이들 화합물의 구조에서 활성이 높은 B링을 제외한 A와 C링의 수산기에 당, 메틸기 등이 결합된 유도체도 이와 유사한 활성을 나타낼 수 있을 것이다.

이러한 활성 성분은 천연물로부터의 추출과 같이 천연으로부터 얻어질 수 있으며, 유기화학합성 분야에서 널리 공지된 합성 방법에 의해 얻어질 수 있다.

본 발명의 SNARE 억제용 조성물에서 활성성분은 단독으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 둘 이상의 활성성분의 조합물로서도 사용될 수 있다. 이러한 조합은 당업자라면 용이하게 이해될 수 있는 것으로, 본 발명에서는 이에 대해 특별히 제한하지 않는다.

다른 양태로, 본 발명은 캠페롤, 케르세틴, 미리세틴, 루테올린, 델피니딘, 시아니딘, 부테인, 엘라지산 및 이들의 유도체로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합물을 유효 성분으로 포함하는 신경전달 물질 억제용 조성물을 제공한다.

상기 활성성분은 SNARE 복합체 형성을 저해함으로써 신경전달 물질을 억제하는 역할을 수행할 수 있으며, 이는 PC1 세포내에서 도파민 유도체인 노르에피네피린의 방출 저해를 통하여 확인할 수 있다.

본 발명의 신경전달 물질 억제용 조성물에서 활성성분은 단독으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 둘 이상의 활성성분의 조합물로서도 사용될 수 있다. 이러한 조 합은 당업자라면 용이하게 이해될 수 있는 것으로, 본 발명에서는 이에 대해 특별히 제한하지 않는다.

또 다른 양태로, 본 발명은 캠페롤, 케르세틴, 미리세틴, 루테올린, 델피니딘, 시아니딘, 부테인, 엘라지산 및 이들의 유도체로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 활성성분은 SNARE 복합체 형성을 억제함으로써, 신경전달물질을 활성적으로 분비할 수 없도록 하며, 따라서 근육 수축이 덜 일어나게 하여 피부 주름을 개선하는 효과를 나타낼 수 있다. 주름개선 효과에 대한 구체적인 실험에서 실질적으로 주름완화의 효과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명의 활성성분은 피부 주름 개선용 화장료 조성물 총 중량의 0.0001 내지 10.0 중량%를 포함할 수 있다. 상기 범위를 벗어난 경우, 양호한 피부 주름 완화 효과를 얻기 어렵다. 또한, 본 발명의 활성성분은 상기 범위 내에서 단독으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 둘 이상의 활성성분의 조합물로서도 사용될 수 있다. 이러한 조합은 당업자라면 용이하게 이해될 수 있는 것으로, 본 발명에서는 이에 대해 특별히 제한하지 않는다.

상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있지만 이에 제한되지 아니한다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토오스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 아니한다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있지만 이에 제한되지 아니한다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있지만 이에 제한되지 아니한다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지 방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도벤타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있지만 이에 제한되지 아니한다.

또 다른 양태로, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하고, 활성성분으로 캠페롤, 케르세틴, 미리세틴, 루테올린, 델피니딘, 시아니딘, 부테인, 엘라지산 및 이들의 유도체로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합물을 유효성분으로 포함하는 통증완화용 약학적 조성물을 제조하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 활성성분은 SNARE 복합체 형성을 저해함으로써 신경전달 물질을 억제하는 역할을 수행할 수 있는 바, 진통제와 같은 통증완화용 약학적 조성물로 이용가능하다.

본 발명의 활성성분은 통증완화용 약학적 조성물 총 중량의 0.0001 내지 50 중량%를 포함할 수 있다. 상기 범위를 벗어난 경우, 양호한 통증 완화 효과를 얻기 어렵다. 또한, 본 발명의 활성성분은 상기 범위내에서 단독으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 둘 이상의 활성성분의 조합물로서도 사용될 수 있다. 이러한 조합은 당업자라면 용이하게 이해될 수 있는 것으로, 본 발명에서는 이에 대해 특별히 제한하지 않는다.

본 발명의 폴리페놀 화합물 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠 한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예컨대 약학조성물을 위해 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 제형에 따라 변화될 수 있으며, 일예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하고자 하는 것으로, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 분석

SNARE 복합체는 SDS에 의하여 풀어지지 않을 정도로 강한 복합체 (complex)를 형성한다. 이러한 성질을 이용하여, SNARE 복합체 형성 여부를 확인하기 위해, SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 본 실시예에서 사용된 폴리페놀 화합물들은 시그마-알드리치, 와코 케미칼, Extrasynthese에서 구입하여 사용하였다.

SNARE 단백질들을 생산하기 위해 생물학 기법으로 형질전환된 대장균 (E.coli Codon (+) RIL, Novagen)으로부터 각각 SNAP25 (NM011428), 신탁신(syntaxin) 1A (AF217197), VAMP2 (NM012663), SynH3 (AF217197) 및 Vps (NM012663)와 같은 SNARE 단백질들을 정제하였다.

상기의 방법으로 형질전환된 대장균에서 정제한 SNARE 단백질인 SNAP25, SynH3와 Vps 단백질을 각각 1:1:1의 몰농도 (40 μM)로 혼합했을 경우 형성되는 복합체가 폴리페놀 화합물의 첨가에 의해 억제되는지를 확인하였다. 각각의 단백질 10 ㎕를 1 ml 튜브에 일정한 간격으로 점적한 후 폴리페놀 화합물 100 μM을 넣고, 보텍스(vortex)를 사용하여 재빨리 혼합한 다음 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응이 종료되면 샘플 완충액을 넣어 반응을 정지시킨 후 12% SDS-PAGE상에서 전기영동하여 SNARE 복합체 형성여부를 확인하였으며(도 1), 그 결과를 도 2a 및 2b의 막대그래프와 표 1에 나타내었다. 참고로, 도 2a 및 2b에서 * 표시는 대조군과 비교시 p<0.05 내에서 유효한 차이가 있음을 나타내는 것이다.

SNARE 복합체 형성을 저해하는 폴리페놀 화합물의 구조적인 특징은 각 화합물이 갖고 있는 유리 수산기의 수, 위치 및 분자크기에 따라 밀접한 관련성이 있었다. 따라서, 상기 결과로부터 이들 화합물의 구조에서 활성이 높은 B링을 제외한 A와 C링의 수산기에 당, 메틸기 등이 결합된 유도체도 이와 유사한 활성을 나타낼 것으로 제안된다.

실험에 사용된 각 폴리페놀 화합물의 농도는 100 μM였다.

도 3은 상기 도 2a 및 2b와 표 1의 결과에서 선별된 8종의 폴리페놀 화합물인 캠페롤(kaempferol), 케르세틴(quercetin), 미리세틴(myricetin), 루테올린(luteolin), 델피니딘(delphinidin), 시아니딘(cyanidin), 부테인(butein), 엘라지산(ellagic acid)을 대상으로 농도별 SNARE 복합체 저해 효과를 측정한 결과이다.

도 3에서 보는 바와 같이, 이들 추출물들은 농도 의존적으로 SNARE 복합체를 효과적으로 저해하는 것이 확인되었다. 참고로, 도 3에서 겔(gel) 사진 상단의 숫자는 처리된 폴리페놀 농도이며, 우측에는 각 폴리페놀 화합물의 명칭을 제시한 것이다.

하기 표 2는 도 3의 결과를 토대로 수치화한 것으로, SNARE 복합체 형성을 50% 억제하는데 필요한 각 폴리페놀 화합물의 농도를 제시한 것이다. 실험결과, 미리세틴, 시아니딘, 델피니딘, 케르세틴, 캠페롤, 부테인, 엘라지산이 낮은 농도에서 SNARE 복합체 형성을 50% 억제하였다.

SNARE 복합체 형성 50%을 억제하는데 필요한 선별된 폴리페놀 화합물의 농도
폴리페놀 화합물	ED50 (μM)
케르세틴(Quercetin)	249.2
켐페롤(Kaempferol)	378.5
루테올린(Luteolin)	>400
미리세틴(Myricetin)	189.0
부테인(Butein)	360.6
엘라지산(Ellagic acid)	278.7
시아니딘(Cyanidin)	188.4
델피니딘(Delphinidin)	112.3
ED50은 SNARE 복합체 형성을 50% 억제하는데 필요한 폴리페놀의 양을 말한다.

실시예 2: 막융합 저해 효과

막융합현상 저해제를 탐색하기 위해, 8종의 선별된 폴리페놀 화합물에 대해 막융합 저해 효과를 시험하였다.

SNARE 단백질들을 생산하기 위해 생물학 기법으로 형질전환된 대장균 (E.coli Codon (+) RIL, Novagen)으로부터 각각 SNAP25 (NM011428), 신탁신 1a (AF217197) 및 VAMP2 (NM012663)라 불리는 SNARE단백질들을 정제하였다.

우선 형광물질이 표지된 미세한 피막입자인 리포좀(liposome)을 만들기 위해 POPC(62mol%), DOPS(35mole%), NBD-PS(1.5mol%) 및 형광물질인 로다민(Rhodamin-PE, 1.5mol%)을 혼합하여 10mM 리포좀(v-vesicle)을 만들었고, 형광물질이 표지되지 않은 리포좀을 만들기 위해 DOPS와 POPC를 몰농도가 35:65가 되도록 혼합하여 50mM 리포좀(t-vesicle)을 만들었다. 정제된 SNAP25와 신탁신 1a로 구성된 복합체를 만들기 위해 몰농도가 1:1이 되도록 혼합하여 실온에서 1시간 반응시킨 후 형광물질이 표지되지 않은 리포좀과 몰비율이 100:1이 되도록 혼합하였고, VAMP2는 형광물질이 들어있는 리포좀과 몰비율이 50:1로 결합시켰다. 이후, 상기 두 종류의 리포좀은 10 kDa 투석막을 이용하여 4℃에서 24시간 교반하면서 투석과정을 거친 후 3:7 (v-vesicle:t-visicle)의 비율로 섞어 형광강도 측정기기 (모델명: SpectraMax M2, 제조사: Molecular Device)를 이용하여 형광강도를 측정하였다. 결과는 도 4에 도시하였다.

도 4에서 형광강도는 SNARE 단백질간의 막 융합 현상을 의미하기 때문에, 형광강도가 낮다는 것은 그 만큼 막융합 저해 효과가 우수함을 나타내는 것이다.

빨간색 원형은 대조군 반응 (control reaction)이 진행되는 경로이며, 화합물 대신 에탄올만 첨가되었을 때에는 최대 형광 강도(fluorescence intensity)의 30% 정도까지 진행되었으며, 폴리페놀 화합물의 대부분은 거의 대조군과 유사한 반응 경로를 따랐다.

도 4는 폴리페놀 화합물에 의한 막 융합현상 저해제를 탐색하기 위하여 선별된 8종의 폴리페놀 화합물을 대상으로 실험한 결과를 보여주고 있다. 실험에 사용된 캠페롤(kaempferol), 케르세틴(quercetin), 미리세틴(myricetin), 루테올린(luteolin), 부테인(butein), 엘라지산(ellagic acid)은 막 융합을 저하시키는 효과가 인정되었다. 그 결과 (표 2 참조)는 도 4의 실험결과와 일부 일치하지 않는 것도 있었으나 캠페롤(kaempferol), 케르세틴(quercetin), 미리세틴(myricetin), 루테올린(luteolin), 부테인(butein), 엘라지산(ellagic acid)은 SNARE 복합체 형성을 저해하였다.

실시예 3: SNARE 단백질에 대한 각 폴리페놀 화합물의 결합능

생물학 기법으로 형질전환된 대장균 (E.coli Codon (+) RIL, Novagen)으로부터 생산된 각각의 GST-SNARE 단백질 (SNAP25, SynH3 및 Vps)을 Glutathione-Agarose 4B(Peptron) 비드에 결합된 상태에서 각 폴리페놀 화합물간의 결합능력을 측정하였다.

각 비드에 결합된 단백질에 버퍼 일정량을 넣고 잘 교반 한 후 즉시 정확한 양을 1.5 ml 튜브에 넣었다. 각 폴리페놀 화합물은 정해진 농도에 따라 단백질이 들어있는 튜브에 넣고 20분간 반응시킨 다음 상등액을 취해 흡광강도 측정기기 (모델명: SpectraMax M2, 제조사: Molecular Device)를 사용하여 200에서부터 700 nm까지 흡광도를 스캔하였다. 이때 고유의 폴리페놀 화합물의 흡광도가 저해되는지를 평가하여 폴리페놀 화합물과 SNARE 단백질의 결합능을 확인하였다.

실험결과, 케르세틴(quercetin), 미리세틴(myricetin), 루테올린(luteolin), 부테인(butein), 엘라지산(ellagic acid), 델피니딘(delphinidin), 시아니딘(cyanidin) 이 SNARE 단백질 중 Vps와 강하게 결합하는 것을 확인하였다. 이러한 결합능에 의해 SNARE 복합체 형성을 저해하는 것으로 판단된다.

도 5의 1은 캠페롤(kaempferol), 2는 케르세틴(quercetin), 3은 미리세틴(myricetin), 4는 루테올린(luteolin), 5는 부테인(butein), 6은 엘라지산(ellagic acid), 7은 델피니딘(delphinidin), 8은 시아니딘(cyanidin)이다.

실시예 4: PC12 세포에서 신경전달물질 방출 저해

PC12 세포는 콜라겐 코팅한 플레이트에 (60 mm dish) 10% 태아 송아지 혈청과 5% 태아 소 혈청, 항생물질이 들어간 Ham's F12K 배지에서 배양하였다. 계대배양은 배지를 흡입한 후 PBS 2 ml을 넣고 피펫팅하여 세포를 디시(dish) 벽으로부터 분리하여 1,000 x g에서 5분간 원심분리하여 세포를 모은 후, 새로운 배지를 넣어 피펫팅하여 세포 펠렛을 분산하여 새로운 배양 플레이트에 넣고 37℃, 5%의 CO₂ 가스가 공급되는 배양기내에서 배양하였다. 실험에 사용된 [³H]-노르에페네피린은 Amersham사에서 구입하여 사용하였다. PC12세포의 플레이트에서 배지를 흡입한 후 PBS를 넣고 세포를 플레이트 벽으로부터 떼어낸 후 세포수를 헤마사이토미터로 측정하여 2 x 10⁵ cell/ml의 농도로 새로운 배지에 분산하여 접종하였다. 24시간 후 노르에피네피린 검정 완충액 ([³H]-NE, 1.5μCi/ml)를 첨가한 후 탄산가스 배양기에서 90분간 도입하였다. 반응 후 완충액을 제거한 후 PBS로 3회 세정한 후 새로운 배지와 각 폴리페놀 화합물을 넣고 30분간 반응시켰다. 배지를 제거한 후 고농도의 K⁺완충액을 넣은 후 12분간 탄산가스 배양기에서 배양한 후 상등액을 회수하여 [³H]-노르에페네피린의 방출을 저해하는지를 scintillation counter로 측정하였다.

상기의 방법으로 폴리페놀화합물이 PC12 세포내에서 도파민 유도체인 노르에피네피린의 방출을 저해하는지를 확인하였으며, 그 결과를 도 6에 그 결과를 제시하였다. 실험에 사용된 8종의 화합물이 모두 신경전달물질 방출을 억제하였으며, 이 중 미리세틴, 델피니딘, 시아니딘, 부테인이 노르에피네피린의 방출을 저해하는 효과가 상대적으로 높게 측정되었다.

실시예 5: 주름개선 효과

본 실시예에서는 주름완화 측정실험을 행하였다.

각 제형예 별로 20 내지 40세 20명을 대상으로 1일 2회 제형예 1 및 2를 눈주위에 도포한 후, 눈주위 부위를 측정대상으로 하였다. 실리콘고무(Silflo사)를 이용하여 레플리카를 제작하고 0, 30, 60일 되는 당일에 Skin Visiometer(C+ K사)를 이용하여 영상 분석을 실시하였다. 평가방법은 주름이 확실히 개선(1), 약간의 주름개선(2), 주름개선 없음(3)의 3가지 주름 측정치를 기준으로 하였다. 폴리페놀 화합물 중 미리세틴에 대한 그 결과를 표 3에 나타내었다.

제형예	주름완화 (1)	약간의 주름완화 (2)	효과없음 (3)
제형 1	5	10	5
제형 2	5	8	7

<제형예 1>화장료 조성물의 제형 1

미리세틴을 함유한 화장료중 화장수(스킨 로션)의 제형예는 다음과 같다.

성분	함량 (중량%)
1. 미리세틴	0.05-2.5
2. 글리세린	3.0
3. 부틸렌 글리콜	2.0
4. 프로필렌 글리콜	2.0
5. 폴리옥시에칠렌(60)경화 피마자유	1.0
6. 에탄올	10.0
7. 트리에탄올아민	0.1
8. 방부제	미량
9. 색소	미량
10. 향료	미량
11. 정제수	잔량

11번에 2,3,4,8번을 순서대로 투입하여 교반하여 용해시킨 후 5번을 60℃정도 가열하여 용해시킨후 10번을 투입 교반하여 11번에 투입한다. 마지막으로 1,6,7,9번을 투입하여 충분히 교반한 뒤 숙성시킨다.

<제형예 2> 화장료 조성물의 제형 2

미리세틴이 함입된 입자를 함유한 화장료중 영양로숀의 제형예는 다음과 같다.

성분	함량 (중량%)
1. 미리세틴	0.05-2.5
2. 밀납	1.0
3. 폴리솔베이트	1.5
4. 솔비탄세스퀴올레이트	0.5
5. 유동파라핀	5.0
6. 스쿠알란	5.0
7. 소르비탄 스테아레이트	1.00
8. 글리세릴 스테아레이트/PEG-400 스테아레이트	1.00
9. 친유성 모노스테아린산 글리세린	0.50
10. 스테아린산	1.50
11. 부틸렌글리콜	5.00
12. 프로필렌글리콜	5.00
13. 카르복시비닐폴리머	0.1
14. 트리에탄올아민	0.2
15. 방부제	미량
16. 색소	미량
17. 향료	미량
18. 정제수	잔량

11,12,13,15,18를 혼합교반하면서 80∼85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 유화기를 작용시키고 2,3,4,5,6,7,8,9,10,14를 80∼85℃ 사이로 가열하여 투입한 뒤 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃ 까지 냉각한 뒤 17번을 투입하고 45℃ 까지 냉각한 뒤 16번을 투입하고 35℃ 에 1번을 투입하여 25℃ 까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.

상기 조성비는 화장료 조성물에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

<제형예 3> 약제학적 조성물 1

미리세틴이 함입된 입자를 함유한 연고의 제형예는 다음과 같다.

성분	함량(중량%)
미리세틴	0.03
백색 페트롤레움 젤리(약학적 등급)	90.6
실리카	9.18

<제형예 4> 약제학적 조성물 2

미리세틴이 함입된 입자를 함유한 10 ml 약병에 든 구강용 현탁액의 제형예는 다음과 같다.

성분	함량
미리세틴	0.20 g
글리세롤	1.00 g
70% 소르비톨	1.00 g
나트륨 사카리네이트	0.01 g
메틸 p-히드록시벤조에이트	0.08 g
향료	적당량
정제수	5 ml

<제형예 5> 약제학적 조성물 3

미리세틴이 함유된 스프레이 제형예는 다음과 같다.

하기 표 8과 같은 조성하에 각 성분을 배합하여 A용액, B용액을 각각 제조하고, 상기 두가지 용액을 혼합하여 에콰도 믹서를 이용하여 1,200rpm으로 균질화하였다. 그런 다음, 각 혼합용액의 유화를 확인하고 미세필터링을 거친 후 10일동안 숙성탱크에서 저장하였다. 숙성이 완료된 액제 50㎖를 알루미늄 재질의 에어로졸용 분사용기에 넣고 액화프로판가스 (LPG)를 3㎏/㎠의 내용압력이 되도록 충전하여 분사제를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
미리세틴	20.0
증류수	40
프로필렌글리콜	3
글리세린	2.5
솔비톨	1
루브라겔	1
에탄올	30
HCO-60	2.5

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리페놀 화합물 조성물은 SNARE 복합체 형성의 저해제로서 신경전달물질 배출을 조절함으로써 SNARE가 관여하는 세포내 반응의 조절제로 유용하다. 본 발명의 SNARE 복합체 형성 저해제는 주름개선용, 통증완화용 조성물로 활용될 수 있다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 기술분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims

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델피니딘, 시아니딘, 부테인 및 엘라지산으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 폴리페놀 화합물을 유효성분으로 포함하는, SNARE 복합체 형성 억제 및 신경전달물질 방출 조절을 통한 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
제3항에 있어서, 상기 화장료 조성물이 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 활성성분이 총 중량의 0.0001 내지 50 중량%를 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
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