KR100901638B1

KR100901638B1 - 꽃 추출물을 함유하는 ｓｎａｒｅ 복합체 형성을 억제하기 위한 조성물

Info

Publication number: KR100901638B1
Application number: KR1020090024386A
Authority: KR
Inventors: 권대혁; 신연균; 정창화
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2009-03-23
Filing date: 2009-03-23
Publication date: 2009-06-09
Also published as: KR20090041370A

Abstract

본 발명은 호랑버들, 오미자, 황근, 부들, 싸리, 애기부들, 큰꿩의 비름, 진달래, 쪽, 마가목, 감나무, 동백나무, 생강나무, 굴피나무, 딱지꽃, 밤나무, 말오줌때, 서어나무, 료양화, Negesvari, Raj briksha, Dhayaro, 월계화 및 매괴화의 꽃 추출물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 꽃 추출물은 SNARE 복합체의 형성을 저해하여 신경전달물질 배출을 조절하고, BoNT(Botulinum neurotoxin)보다 저렴하게 원료를 제공할 수 있으며, 천연 소재이므로 소비자에게 친숙한 접근이 가능하여 산업적으로 매우 유용하다.

SNARE 복합체, 신경전달물질, 추출물, 보톡스(BoNT)

Description

꽃 추출물을 함유하는 ＳＮＡＲＥ 복합체 형성을 억제하기 위한 조성물 {SNARE complex formation inhibiting composition comprising natural extracts}

본 발명은 꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 SNARE 복합체 형성을 억제하기 위한 조성물에 관한 것이다.

신경전달물질의 배출은, 신경전달물질을 함유하는 신경말단에 위치하는 시냅스 소포 (synaptic vesicle)와 시냅스전막(presynaptic membrane)이 융합된 후 두 경계 간의 통로가 형성됨에 의해 발생된다. 소포 단백질 VAMP(synaptobrevin)와 원형질막 결합단백질인 신택신(Syntaxin) 1a, SNAP-25로 이루어진 3종의 단백질 복합체인 SNARE 단백질이 시냅스 소포와 시냅스 전막의 융합에 근원적인 힘을 제공한다. 여기서 시냅스 소포와 시냅스전막 간의 막 융합에 의해 신경전달물질 배출 통로가 열리는 것은, 표적 막(target membrane)에 부착되어 있는 신택신 1a 단백질과 SNAP-25 단백질 2종의 복합체인 t-SNARE 및 소포(vesicle)에 부착되어 있는 v-SNARE의 작용에 따른 결과이다. 상기 막 융합 시에는 지질이중층 (lipid bilayer)의 재배열이 일어나게 된다. 생체막들은 서로 강하게 밀어내므로, 이들 막은 자발적으로 융합되지 않고 외부에서 강한 힘이 주어져 막들 간의 반발력을 극복하여야 하는데, 이러한 힘을 제공하는 것이 SNARE 단백질인 것으로 알려졌다. 이와 같이 SNARE 복합체의 형성은 신경전달물질의 배출을 포함하는 세포외 배출작용(exocytosis)의 핵심 현상이다.

현재 피부 주름개선용으로 주사제로서 사용중인 보톡스(Botulinum neurotoxin)는 신경전달물질 배출에 관여하는 핵심 단백질인 SNARE 단백질을 절단하는 프로테아제로서, SNARE 단백질을 절단함으로써 신경전달을 차단하고 결과적으로 보톡스가 침투된 근육세포를 마비시킨다. 주사제로 사용중인 보톡스가 SNARE 단백질을 비가역적으로 절단함으로써 신경의 전달을 차단하는 반면, 소위 "바르는 보톡스"는 SNARE 복합체의 형성을 저해함으로써 신경전달을 방해하는 일종의 "경쟁적 저해제"이다. "바르는 보톡스"의 핵심 성분은 아르기렐린(Argireline) 이라고 불리는 헥사펩타이드이며, EEMQRR의 아미노산 서열을 가지고 있다 (참고 문헌: Blanes-Mira et al., International Journal of Cosmetic Science. 24, 303-310, 2002). 이는 SNAP-25의 N-말단 영역의 아미노산 서열과 일치하는 부위이다. 즉, 무손상 (intact) SNAP-25가 결합하여야 할 부위에 작은 헥사펩타이드가 대신 끼어듦으로써 무손상 SNAP-25가 다른 SNARE 단백질인 신택신 1 및 VAMP-2와 결합하는 것을 방해하는 역할을 하게 된다. 그러나, 상기의 바르는 보톡스 제품의 주성분인 아르기렐린은 효과가 불확실하고, 가격적으로 불리하며, 근육 마비 등의 피부 부작용으로 인해 전문의에 의해 시술되어야하고 독성이 강한 단점이 있다.

이에, 본 발명자들은 꽃 추출물을 이용하여 SNARE 복합체 형성에 대한 경쟁적 저해제를 발굴하고 이들의 막 융합현상 저해와 신경전달물질 배출 억제능 및 신 경세포 내에서 SNARE 복합체 형성을 억제하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위해 창출된 것으로서, 본 발명은 신경전달물질 배출에 관여하는 SNARE 복합체 형성을 저해하는 천연 조성물을 제공하는 것을 목적이 있다. 또한 본 발명은 상기 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경전달물질 억제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에 따른 천연 조성물은 천연에서 자생하는 식물들을 대상으로 우수한 SNARE 복합체 형성 조절제를 개발하고자 연구를 거듭한 결과, 꽃 추출물 중 호랑버들, 오미자, 황근, 부들, 싸리, 애기부들, 큰꿩의 비름, 진달래, 쪽, 마가목, 감나무, 동백나무, 생강나무, 굴피나무, 딱지꽃, 밤나무, 말오줌때, 서어나무, 료양화, Negesvari, Raj briksha, Dhayaro, 월계화 및 매괴화로부터 얻은 추출물이 신경 전달 경로에 관여하는 SNARE 복합체 형성을 저해함을 발견하였다.

본 발명에 따른 천연 조성물은 SNARE 복합체 형성의 저해제로서 종래의 보톡스를 이용하는 피부 미용술에 비해 안전하고, 월등히 저렴하게 원료를 제공할 수 있다. 또한 종래의 문제점으로 제기되었던 피부 주름 개선제들의 제형내의 안정성을 식물 추출물을 사용함으로써 해결하였다.

본 발명에서는 효능검정 대상인 천연물(표 1) 중 신경전달물질 배출 조절에 가장 효능이 뛰어난 24종의 꽃 추출물을 다음과 같이 선정하였다. 버드나무과(Salicaceae)의 호랑버들(학명:Salix hultenii), 목련과(Magnoliaceae)의 오미자(학명:Schisandra chinensis), 아욱과(Malvaceae)의 황근(학명:Hibiscus hamabo), 부들과(Typhaceae)의 부들(학명:Typha orientalis), 콩과(Leguminosae)의 싸리(학명:Lespedeza bicolor), 부들과(Typhaceae)의 애기부들（학명:Typha angustata), 돌나무과(Crassulaceae)의 큰꿩의 비름(학명:Sedum spectabile), 진달래과(Ericaceae)의 진달래(학명:Rhododendron mucronulatum), 마디풀과(Polygonaceae)의 쪽(학명:Persicaria tinctoria), 장미과(Rosaceae)의 마가목(학명:Sorbus commixta), 감나무과(Ebenaceae)의 감나무(학명:Diospyros kaki), 차나무과(Theaceae)의 동백나무(학명:Camellia japonica), 녹나무과(Lauraceae)의 생강나무(학명:Lindera obtusiloba), 가래나무과(Juglandaceae)의 굴피나무(학명:Platycarya strobilacea), 장미과(Rosaceae)의 딱지꽃(학명:Potentilla chinensis), 참나무과(Fagaceae)의 밤나무(학명:Castanea crenata), 고추나무과(Staphyleaceae)의 말오줌때(학명:Euscaphis japonica), 자작나무과(Betulaceae)의 서어나무(학명:Carpinus laxiflora), 진달래과(Ericaceae)의 료양화(학명: Rhododendron molle), 물레나무과(Guttiferae)의 Negesvari(학명:Mesua ferrea), 콩과(Leguminosae)의 Raj briksha(학명:Cassia fistula), 부처꽃과(Lythraceae)의 Dhayaro(학명:Woodfordia fruticosa), 장미과(Rosaceae)의 월계화(학명:Rosa chinensis) 및 장미과(Rosaceae)의 매괴화(학명:Rosa rugosa)로 꽃 부위를 사용하였다.

본 발명의 천연물 추출물의 제조 방법은 다음과 같다. 구입한 천연물 (100g)에 C₁~ C₄ 알코올 바람직하게는, 무수 메탄올이나 에탄올 및 물 1000ml를 가하여 환류 냉각기가 달린 추출기 (모델명:HB 4 basic, 제조사:IKA)에서 60~90℃에서 1시간30분 ~ 2시간30분동안 가온 추출하였다. 추출물을 와트만 No.2 여지로 여과한 후 남은 잔사물을 위와 같은 방법으로 1회 이상 더 추출하고, 얻은 추출액을 합하여 감압농축(모델명:Rotavapor, 제조사:Buchi, 온도: 40℃)한 후 동결 건조하여 건조 추출물을 수득하였다. 이러한 방법으로 제조된 꽃 추출물 중 호랑버들, 오미자, 황근, 부들, 싸리, 애기부들, 큰꿩의 비름, 진달래, 쪽, 마가목, 감나무, 동백나무, 생강나무, 굴피나무, 딱지꽃, 밤나무, 말오줌때, 서어나무, 료양화, Negesvari, Raj briksha, Dhayaro, 월계화 및 매괴화　추출물은 신경 전달 경로에 관여하는 SNARE 복합체 형성을 저해함을 확인하였다.

본 발명의 천연물 추출물 조성물은 유효 성분으로서 본 명세서에 기재한 천연물 추출물 이외에 화장료 및 약제에 통상적으로 사용되는 성분들을 포함한다. 상기 성분들은 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 향료 등의 통상적인 보조제 및 담체를 포함하지만 이에 제한되지 아니한다.

본 발명의 천연물 추출물 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예컨대 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있지만 이에 제한되지 아니한다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 및 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 및 산화아연 등이 이용될 수 있지만 이에 제한되지 아니한다.

본 발명의 제형이 파우더 및 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토오스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 및 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 및 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 아니한다.

본 발명의 제형이 용액 및 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 및 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르가 있지만 이에 제한되지 아니한다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 및 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 및 트라칸트 등이 이용될 수 있지만 이에 제한되지 아니한다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도벤타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 및 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있지만 이에 제한되지 아니한다.

이하, 본 발명을 하기 실시 예에 의거하여 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시 예는 본 발명을 예시하고자 하는 것으로, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명에 개시된 모든 문헌은 참조로서 통합된다.

실험 재료

1-팔미토일-1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(POPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜세린(DOPS), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포세린-N-(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)(NBD-PS) 와 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(리스사민 로다민 B 설퍼닐)(로다민-PE)는 아반티 폴라 리피드(알라바마주, 미국)사로부터 구입하였다. RPMI 1640, 10% 태아 송아지 혈청, 5% 태아 소 혈청은 GIBCO-BRL(그랜드 아일랜드, NY, 미국)로부터 구입하였다.

실시예 1: 호랑버들로부터 천연물 추출물의 제조

호랑버들 [학명: Salix hultenii, 버드나무과(Salicaceae)] 꽃을 한국식물추출물 은행에서 구입하여 100 g을 정제수로 세척하고 건조한 다음에 무수 메탄이나 에탄올 및 물올 1000 ml를 가하여 환류 냉각기가 달린 추출기(모델명:HB 4 basic, 제조사:IKA)에서 80℃에서 2시간 동안 가온 추출하였다. 추출물을 와트만 No.2여지로 여과한 후 남은 잔사물을 위와 같은 방법으로 1회 이상 더 추출하고, 여과된 추출액을 합하여 감압농축(모델명:Rotavapor, 제조사:Buchi, 온도:40℃)한 후 동결건조(모델명:FD5518, 제조사:본듸로, 온도:-45℃, 압력:50 mTorr)하여 건조 추출물을 수득하였다. 이러한 방법으로 제조된 꽃 추출물 중 호랑버들, 오미자, 황근, 부들, 싸리, 애기부들, 큰꿩의 비름, 진달래, 쪽, 마가목, 감나무, 동백나무, 생강나무, 굴피나무, 딱지꽃, 밤나무, 말오줌때, 서어나무, 료양화, Negesvari, Raj briksha, Dhayaro, 월계화 및 매괴화 추출물이 신경 전달 경로에 관여하는 SNARE 복합체 형성을 저해함을 확인하였다.

실시예 2: 나머지 천연물들로부터의 추출물 제조

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 추출하되, 하기 표 1에 기재한 천연물들로부터 추출하였다.

표 1. 실시예 2에 사용한 천연물

표 1.
Number	Scientific name	Family
1	Erysimum aurantiacum	Cruciferae
2	Aster spathulifolius	Compositae
3	Salix hultenii	Salicaceae
4	Prunus padus	Rosaceae
5	Spiraea prunifolia var. simpliciflora	Rosaceae
6	Aruncus dioicus var. kamtschaticus	Rosaceae
7	Schisandra chinensis	Magnoliaceae
8	Hibiscus hamabo	Malvaceae
9	Typha orientalis	Typhaceae
10	Lespedeza bicolor	Leguminosae
11	Pueraria thunbergiana	Leguminosae
12	Synulus excelsus	Compositae
13	Agastache rugosa	Labiatae
14	Aster koraiensis	Compositae
15	Eupatorium fortunei	Compositae
16	Aster yomena	Compositae
17	Typha angustata	Typhaceae
18	Miscanthus sinensis var. purpurascens	Gramineae
19	Aster scaber	Compositae
20	Caryopteris incana	Verbenaceae
21	Sedum spectabile	Crassulaceae
22	Aristolochia manshuriensis	Aristolochiaceae
23	Coreanomecon hylomeconoides	Papaveraceae
24	Serratula coronata var. insularis	Compositae
25	Rhododendron mucronulatum	Ericaceae
26	Persicaria tinctoria	Polygonaceae
27	Sorbus commixta	Rosaceae
28	Robinia pseudo-accacia	Leguminosae
29	Paulownia coreana	Scrophulariaceae
30	Pseudosasa japonica	Gramineae
31	Chionanthus retusa	Oleaceae
32	Majanthemum dilatatum	Liliaceae
33	Diospyros kaki	Ebenaceae
34	Campsis grandiflora	Bignoniaceae
35	Hydrangea paniculata	Saxifragaceae
36	Helianthus tuberosus	Compositae
37	Angelica fallax	Umbelliferae
38	Cosmos bipinnatus	Compositae
39	Farfugium japonicum	Compositae
40	Alnus japonica	Betulaceae
41	Camellia japonica	Theaceae
42	Weigela subsessilis	Caprifoliaceae
43	Prunus persica	Rosaceae
44	Alnus firma	Betulaceae
45	Morus bombycis	Moraceae
46	Lindera obtusiloba	Lauraceae
47	Platycarya strobilacea	Juglandaceae
48	Potentilla chinensis	Rosaceae
49	Castanea crenata	Fagaceae
50	Euscaphis japonica	Staphyleaceae
51	Spiraea blumei	Rosaceae
52	Carpinus laxiflora	Betulaceae
53	Lonicera japonica	Caprifoliaceae
54	Inula helianthus-aquatilis	Compositae
55	Rhododendron molle	Ericaceae
56	Chamomilla recutita	Compositae
57	Hibiscus sabdariffa	Malvaceae
58	Buddleia officinalis	Loganiaceae
59	Carthamus tinctorius	Compositae
60	Mesua ferrea	Guttiferae
61	Albizzia julibrissin	Leguminosae
62	Celosia cristata	Amaranthaceae
63	Gomphrena globosa	Amaranthaceae
64	Sophora japonica	Leguminosae
65	Butea minor	Leguminosae
66	Cassia fistula	Leguminosae
67	Matricaria chamomilla	Compositae
68	Nyctanthes arbor-tristis	Oleaceae
69	Woodfordia fruticosa	Lythraceae
70	Rosa chinensis	Rosaceae
71	Rosa rugosa	Rosaceae

실시예 3: SDS-PAGE

SNARE 복합체는 SDS에 의하여 풀어지지 않을 정도로 강한 복합체를 형성한다. 이러한 성질을 이용하여, SNARE 복합체 형성 여부를 확인하기 위해, SDS-PAGE를 수행하였다.

트롬빈으로 절단되는 아미노-말단 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)-태그를 지닌 pGEX-2T 벡터(GE 헬스케어사)를 사용하여 본 발명의 단백질 즉, 전장(full-length) 신택신 1a(도 1, 서열번호: 1), SNAP-25 (도 2, 서열번호: 2), 전장 VAMP-2(도 3, 서열번호: 3), 신택신 1a의 가용성 SNARE 모티프 (SynH3, 서열번호: 4) 및 VAMP의 가용성 SNARE 모티프 (VpS, 서열번호: 5)를 합성하였다. 모든 재조합 단백질은 대장균(DE3, 노바젠사)에서 발현시켰다. 모든 N-말단 GST 태그된 단백질을 글루타티온 아가로스 비드를 사용하여 친화 크로마토그래피로 정제하였다. 단백질을 분해 완충액 (50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH8.0)에서 트롬빈으로 절단하였다. 정제된 단백질 SNAP-25, SynH 3와 Vps을 각각 1:1:1의 몰농도(20

M)로 혼합하 여 형성되는 복합체에 대해, 천연물 추출물의 첨가에 의한 억제 여부를 확인하였다. 각각의 단백질 10 ㎕을 1 ml 튜브에 일정한 간격으로 점적한 후 천연물 추출물 2㎕을 넣고 보텍스를 사용하여 재빨리 혼합한 다음 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응이 종료되면 12% SDS-PAGE상에서 전기영동하여 SNARE 복합체 형성여부를 확인하였다. 결과를 도 4에 도시하였다. 도 4의 하단 숫자는 표 1의 일련번호를 의마한다.

그 결과 호랑버들(3), 오미자(7), 황근(8), 부들(9), 싸리(10), 애기부들(17), 큰꿩의 비름(21), 진달래(25), 쪽(26), 마가목(27), 감나무(33), 동백나무(41), 생강나무(46), 굴피나무(47), 딱지꽃(48), 밤나무(49), 말오줌때(50), 서어나무(52), 료양화(55), Negesvari(60), Raj briksha(66), Dhayaro(69), 월계화(70) 및 매괴화(71)의 추출물은 SNARE 복합체 형성을 저해하였다.

도 5는 황근(8), 굴피나무(47), 딱지꽃(48), 밤나무(49), 서어나무(52), 료양화(55), Dhayaro(69)가 가장 효과적으로 저해함을 제시한다.

실시예 4: 막융합 저해 효과

막융합현상 저해제를 탐색하기 위해, 상기 실시예 1 내지 실시예 2에서 수득한 추출물에 대해 막융합 저해 효과를 시험하였다. SNARE 단백질은 형질전환된 대장균에서 단백질을 과다 발현 시킨 후, 발현된 단백질을 글루타티온 아가로스 비드를 이용하여 선택적으로 정제하여 수득했다. 다음 형광물질이 표시된 미세한 피막입자인 리포좀을 제조하기 위해 1-팔미토일-1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(POPC, 62 mol%), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜세린(DOPS, 35 mol%), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포세린-N-(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)(NBD-PS, 1.5 mol%) 및 형광물질인 로다민(Rhodamin-PE, 1.5 mol%)을 혼합하여 10mM 리포좀(v-vesicle)을 제조했다. 다음 형광물질이 표식되지 않은 리포좀을 제조하기 위해 DOPS와 POPC를 몰농도가 35 : 65가 되도록 혼합하여 50mM 리포좀(t-vesicle)을 제조했다. 정제된 SNAP-25와 신택신 1a의 복합체를 만들기 위해 몰농도가 1 : 1이 되도록 혼합하여 실온에서 1시간 반응시킨 후 형광물질이 표식되지 않은 리포좀과 몰비율이 100 : 1이 되도록 섞고, VAMP-2는 형광물질이 들어있는 리포좀과 몰비율이 50 : 1로 결합시켰다. 후속하여, 2종의 리포좀을 투석한 후 1 : 9 (v-vesicle : t-vesicle)의 비율로 섞은 후, 형광강도 측정기기(모델명: SpectraMax M2, 제조사: Molecular Device)를 이용하여 형광강도를 측정하였다. 결과를 도 6a 및 도 6b에 도시하였다. 도 6a 및 도 6b에서 형광강도는 SNARE 단백질간의 막 융합 현상을 의미하므로, 보다 더 낮은 형광강도는 막융합 저해 효과가 우수함을 나타낸다. 빨간색 원형은 대조구 반응이 진행되는 경로이며, 추출물 대신 메탄올만 첨가한 경우 최대 형광 강도의 40% 정도까지만 진행되었고, 추출물의 대부분은 거의 대조구와 유사한 반응 경로를 따랐다. 도 6a 및 도 6b는 천연물 추출물에 의한 막 융합현상 저해제를 탐색하기 위하여 일부 천연물 추출물을 대상으로 실험한 결과를 제시한다. 도 6a는 실험에 사용된 꽃 추출물의 농도가 100 ㎍/ml, 도 6b는 10 ㎍/ml인 경우를 각각 나타낸다. 실험에 사용된 황근(8), 굴피나무(47), 딱지꽃(48), 밤나무(49), 서어나무(52), 료양화(55) 및 Dhayaro(69)가 가장 우수한 막융합 저해효과를 보였다. 이외에도 호랑버들, 오미자, 부들, 싸리, 애기부들, 큰 꿩의 비름, 진달래, 쪽, 마가목, 감나무, 동백나무, 생강나무, Negesvari, Raj briksha, 월계화 및 매괴화 추출물이 막 융합현상을 저해하는 효과를 나타내었다. 각종 추출물 100 ㎍/ml의 농도에서 막융합 저해 효과를 측정한 결과를 아래 표 2에 정리하였다. 대조구의 반응인 약 43%를 기준으로 표시하였으며, 30 ~ 60%를 보이는 추출물은 효과가 미미한 것으로 간주하였을 때, 호랑버들(3), 오미자(7), 황근(8), 부들(9), 싸리(10), 애기부들(17), 큰꿩의 비름(21), 진달래(25), 쪽(26), 마가목(27), 감나무(33), 동백나무(41), 생강나무(46), 굴피나무(47), 딱지꽃(48), 밤나무(49), 말오줌때(50), 서어나무(52), 료양화(55), Negesvari(60), Raj briksha(66), Dhayaro(69), 월계화(70) 및 매괴화(71) 추출물 (24종)이 효과적이었다.

표 2. 막융합 저해 효과의 측정 결과

표 2.
실시예번호	국명	학명	% of Maximum
0	Control	MeOH	44
1	부지깽이나물	Erysimum aurantiacum	35
2	해국	Aster spathulifolius	36
3	호랑버들	Salix hultenii	12
4	귀룽나무	Prunus padus	35
5	조팝나무	Spiraea prunifolia var. simpliciflora	32
6	눈개승마	Aruncus dioicus var. kamtschaticus	45
7	오미자	Schisandra chinensis	21
8	황근	Hibiscus hamabo	6
9	부들	Typha orientalis	16
10	싸리	Lespedeza bicolor	10
11	칡	Pueraria thunbergiana	48
12	큰수리취	Synulus excelsus	52
13	배초향	Agastache rugosa	32
14	벌개미취	Aster koraiensis	29
15	벌등골나물	Eupatorium fortunei	31
16	쑥부쟁이	Aster yomena	35
17	애기부들	Typha angustata	17
18	억새	Miscanthus sinensis var. purpurascens	44
19	참취	Aster scaber	39
20	층꽃나무	Caryopteris incana	45
21	큰꿩의비름	Sedum spectabile	10
22	등칡	Aristolochia manshuriensis	44
23	매미꽃	Coreanomecon hylomeconoides	42
24	산비장이	Serratula coronata var. insularis	35
25	진달래	Rhododendron mucronulatum	12
26	쪽	Persicaria tinctoria	20
27	마가목	Sorbus commixta	21
28	아까시나무	Robinia pseudo-accacia	38
29	오동나무	Paulownia coreana	35
30	이대	Pseudosasa japonica	41
31	이팝나무	Chionanthus retusa	35
32	큰두루미꽃	Majanthemum dilatatum	39
33	감나무	Diospyros kaki	12
34	능소화	Campsis grandiflora	42
35	나무수국	Hydrangea paniculata	49
36	뚱딴지	Helianthus tuberosus	45
37	사약채	Angelica fallax	41
38	코스모스	Cosmos bipinnatus	35
39	털머위	Farfugium japonicum	32
40	오리나무	Alnus japonica	30
41	동백나무	Camellia japonica	7
42	병꽃나무	Weigela subsessilis	38
43	복사나무	Prunus persica	32
44	사방오리	Alnus firma	31
45	산뽕나무	Morus bombycis	42
46	생강나무	Lindera obtusiloba	-12
47	굴피나무	Platycarya strobilacea	2
48	딱지꽃	Potentilla chinensis	-5
49	밤나무	Castanea crenata	-10
50	말오줌때	Euscaphis japonica	-5
51	산조팝나무	Spiraea blumei	45
52	서어나무	Carpinus laxiflora	4
53	인동	Lonicera japonica	53
54	수조양	Inula helianthus-aquatilis	32
55	료양화	Rhododendron molle	12
56	Camomila	Chamomilla recutita	45
57	Hibisco	Hibiscus sabdariffa	44
58	밀몽화	Buddleia officinalis	39
59	홍화	Carthamus tinctorius	35
60	Negesvari	Mesua ferrea	15
61	합환화	Albizzia julibrissin	45
62	계관화	Celosia cristata	38
63	천일홍	Gomphrena globosa	32
64	괴화	Sophora japonica	33
65	Bhuletro ko phul	Butea minor	38
66	Raj briksha	Cassia fistula	21
67	Chandra gandha	Matricaria chamomilla	44
68	Paarijaat	Nyctanthes arbor-tristis	48
69	Dhayaro	Woodfordia fruticosa	10
70	월계화	Rosa chinensis	20
71	매괴화	Rosa rugosa	17

실시예 5: PC12 세포에서 신경전달물질 방출 저해

PC12 세포(한국세포주은행)를 콜라겐 코팅한 플레이트에 (60 mm dish) 10% 태아 송아지 혈청과 5% 태아 소 혈청 및 항생물질을 포함하는 배지를 흡입한 후 PBS(Phosphate Buffered Saline) 2 ml을 넣고 피펫팅하여 세포를 디시(dish) 벽으로부터 분리한 후, 1,000 ×g에서 5분간 원심분리하여 세포를 모았다. 다음 새로운 RPMI1640 배지(GIBCO)를 넣어 피펫팅하여 세포 펠렛을 분산 시킨 후, 새로운 배양 플레이트에 넣고 37℃, 5%의 CO₂ 가스가 공급되는 배양기내에서 계대배양하였다. 실험에 사용된 [³H]-노르에페네피린은 아머샴사에서 구입하여 사용하였다. PC12세포의 플레이트에서 배지를 흡입한 후 PBS를 넣고 세포를 플레이트 벽으로부터 떼어낸 다음 세포수를 헤마사이토미터로 측정하여 2 ×10⁵ cell/ml의 농도로 새로운 배지에 분산하여 접종하였다. 24시간 후 노르에피네피린 검정 완충액 ([³H]-NE, 1.5

Ci/ml)를 첨가한 후 탄산가스 배양기에서 90분간 도입하였다. 반응 후 완충액을 제거한 후 PBS로 3회 세정한 후 새로운 배지와 각 추출물을 넣고 30분간 반응시켰다. 배지를 제거한 후 고농도의 K⁺완충액(115 mM NaCl, 30 mM KCl, 1.2 mM KH2PO4, 2.5 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO4, 11 mM 글루코스, 15 mM HEPES-tris, pH 7.4)을 넣은 후 12분간 탄산가스 배양기에서 배양한 후 상등액을 회수하여 [³H]-노르에페네피린의 방출을 저해하는지를 신틸레이션 계수관로 측정하였다. 상기의 방법으로 본 발명의 꽃 추출물이 PC12 세포내에서 도파민 유도체인 노르에피네피린의 방출을 저해하는지를 확인하였으며, 그 결과를 도 7에 제시하였다. 그 결과는 도 5, 도 6a 및 도 6b의 실험결과와 일부 일치하지 않는 것도 있었으나, 황근(8), 굴피나무(47), 딱지꽃(48), 밤나무(49), 서어나무(52) 및 Dhayaro(69) 등의 꽃 추출물이 PC12 세포내에서 도파민 유도체인 노르에피네피린의 방출을 저해하는 효과가 상대적으로 높게 측정되었다. 도 7에서 CPM은 Count Per minute을 의미한다.

실시예 6: PC12 세포에서 SNARE 복합체 형성 저해

PC12 세포는 콜라겐 코팅한 플레이트에 (60 mm dish) 10% 태아 송아지 혈청과 5% 태아 소 혈청, 항생물질이 들어간 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 배지를 흡입한 후 PBS 2 ml을 넣고 피펫팅하여 세포를 디시(dish) 벽으로부터 분리, 1,000 ×g에서 5분간 원심분리하여 세포를 다음 새로운 배지를 넣어 피펫팅하여 세포 펠 렛을 분산, 새로운 배양 플레이트에 넣고 37℃, 5%의 CO₂ 가스가 공급되는 배양기내에서 계대배양하였다. PC12세포의 플레이트에서 배지를 흡입한 후 PBS를 넣고 세포를 플레이트 벽으로부터 떼어낸 다음 세포수를 헤마사이토미터로 측정하여 2 ×10⁶ cell/100π의 농도로 새로운 배지에 분산하여 접종하였다. 24시간 후 각 꽃 추출물을 넣고 2시간 반응시켰다. 배지를 제거한 후 고농도의 K⁺완충액을 넣은 후 15분간 탄산가스 배양기에서 배양한 후 상등액을 제거한 다음 라이시스 버퍼를 사용하여 세포막을 분리하였다. 분리된 세포막 단백질은 5 ~ 21% SDS-PAGE 겔을 사용하여 전기영동을 실시하였다. 일렉트로트랜스퍼는 다음과 같이 실시하였다. NC 막(Nitrocellulose membrane)을 트랜스퍼 완충용액에서 5분간 담가준 다음 카세트(cassette)에 올려놓은 후 트랜스퍼할 겔을 트랜스퍼 완충용액으로 살짝 적셔주고 막 위에 올려놓았다. 겔 샌드위치(Gel sandwich)를 만들어서 트랜스퍼를 준비한 다음, 100 V에서 1시간 트랜스퍼한 후 장치를 해체하고, 트랜스퍼한 겔을 Ponceau S 용액(시그마-알트리크사)에 5분 정도 침지하여 염색하고 증류수로 씻어서 밴드를 확인하였다. 염색된 Ponceau S는 PBST로 완전 탈색시킨 후 블록킹 용액에서 1시간 (상온) 정도 교반하여 블록킹시켰다. PBST로 세척한 다음 1차 항체(SNAP-25)를 넣고 4℃ 하룻밤 교반하였다. 다음 PBST로 5분간 2회 세척한 후, 2차 항체(고트안티마우스 IgG 및 퍼옥시다제가 결합되어 친화성으로 분리된 항체, No. A4416, Lot. 125K6059, 시그마사)를 권장 희석비율(1:2000)에 따라 블록킹 용액으로 희석하여 상온에서 1시간 정도 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 PBST로 3회 세척한 후 ECL (enhanced chemiluminescense) 키트 내에 섞어 막에 골고루 반응시킨 후 검출하였다.

상기의 방법으로 꽃 추출물이 PC12 세포내에서 SNARE 복합체 형성을 저해하는지를 확인하였으며, 그 결과를 도 8에 제시하였다.

그 결과, 도 5, 도 6a 및 도 6b의 실험결과와 일부 일치하지 않는 것도 있었으나, 황근(8), 굴피나무(47), 딱지꽃(48), 밤나무(49) 및 Dhayaro(69) 등의 추출물이 PC12 세포내에서 SNARE 복합체 형성을 저해하는 효과가 상대적으로 높게 측정되었다. SNARE 복합체 1은 신택신 1a, SNAP-25 및 VAMP-2 각 1개로 이루어진 SNARE 복합체이고, SNARE 복합체 2는 SNARE 복합체가 도메인 스와핑을 통하여 거대화된 복합체이다. 또한, N.con은 항상 존재하는 SNARE 복합체의 양을 알기 위해 고농도의 K⁺완충액을 처리하기 이전을 의미하며, Con.은 다른 추출물의 첨가 없이 메탄올만을 첨가한 후 고농도의 K⁺완충액을 처리하여 SNARE 복합체의 형성이 얼마나 유도되었는지를 보여준다. 따라서 상기한 추출물의 처리를 통하여 상당한 양의 SNARE 복합체 형성이 억제되었음을 확인할 수 있다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시 예를 참조하여 설명하였지만, 본 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

현재 바르는 보톡스 제품의 주성분인 아르기렐린의 효과가 불확실하고, 합성 펩타이드의 특성상 가격적으로 불리하며, 피부 부작용을 유발하는 단점이 있는 반면, 본 발명에 따른 천연 조성물은 기존의 SNARE 복합체 형성을 억제하는 보톡스보다 저렴하게 원료를 제공할 수 있고, 천연 소재이므로 소비자에게 친숙한 접근이 가능하므로 산업적 응용이 수월한 형태이다.

도 1은 SNARE 복합체 형성에 관여하는 3개 단백질 중에서 신택신 1a 단백질의 아미노산 서열을 도시한 것이다.

도 2는 SNARE 복합체 형성에 관여하는 3개 단백질 중에서 SNAP-25 단백질의 아미노산 서열을 도시한 것이다.

도 3은 SNARE 복합체 형성에 관여하는 3개 단백질 중에서 VAMP-2 단백질의 아미노산 서열을 도시한 것이다.

도 4은 SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacryamide gel electrophoresis) 분석 결과를 도시한 것이다. 겔사진 하단의 숫자는 표 1의 일련번호를 제시한 것이다.

도 5는 도4의 결과로부터 선별된 꽃 추출물의 SDS-PAGE 분석 결과로서, SNARE 복합체 형성의 저해효과가 가장 우수한 꽃 추출물들을 도시한 것이다.

도 6a 및 도 6b는 본 발명의 꽃 추출물인 황근, 굴피나무, 딱지꽃, 밤나무, 서어나무, 료양화 및 dhayaro 꽃 추출물들이 SNARE 복합체 형성에 의한 막 융합현상제해함을 제시한다.

도 7는 본 발명의 황근, 굴피나무, 딱지꽃, 밤나무, 서어나무, 료양화 및 dhayaro 꽃 추출물들이 PC12 세포에서 신경전달물질 방출 저해에의 결과를 도시한 것이다.

도 8는 본 발명의 황근, 굴피나무, 딱지꽃, 밤나무 및 dhayaro꽃 추출물들이 PC12 세포에서 SNARE 복합체 형성 저해하는 것을, 항체 SNAP-25를 사용한 웨스턴 블럿을 수행하여 확인한 결과이다.

<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> SNARE complex formation inhibiting composition comprising natural extracts <130> IPM34421-02 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 288 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Syntaxin 1a <400> 1 Met Lys Asp Arg Thr Gln Glu Leu Arg Thr Ala Lys Asp Ser Asp Asp 1 5 10 15 Asp Asp Asp Val Thr Val Thr Val Asp Arg Asp Arg Phe Met Asp Glu 20 25 30 Phe Phe Glu Gln Val Glu Glu Ile Arg Gly Phe Ile Asp Lys Ile Ala 35 40 45 Glu Asn Val Glu Glu Val Lys Arg Lys His Ser Ala Ile Leu Ala Ser 50 55 60 Pro Asn Pro Asp Glu Lys Thr Lys Glu Glu Leu Glu Glu Leu Met Ser 65 70 75 80 Asp Ile Lys Lys Thr Ala Asn Lys Val Arg Ser Lys Leu Lys Ser Ile 85 90 95 Glu Gln Ser Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser Ser Ala Asp 100 105 110 Leu Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg Lys Phe Val 115 120 125 Glu Val Met Ser Glu Tyr Asn Ala Thr Gln Ser Asp Tyr Arg Glu Arg 130 135 140 Cys Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly Arg Thr Thr 145 150 155 160 Thr Ser Glu Glu Leu Glu Asp Met Leu Glu Ser Gly Asn Pro Ala Ile 165 170 175 Phe Ala Ser Gly Ile Ile Met Asp Ser Ser Ile Ser Lys Gln Ala Leu 180 185 190 Ser Glu Ile Glu Thr Arg His Ser Glu Ile Ile Lys Leu Glu Asn Ser 195 200 205 Ile Arg Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val Glu 210 215 220 Ser Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ala 225 230 235 240 Val Asp Tyr Val Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys 245 250 255 Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ile Met Ile Ile Ile Cys Cys 260 265 270 Val Ile Leu Gly Ile Ile Ile Ala Ser Thr Ile Gly Gly Ile Phe Gly 275 280 285 <210> 2 <211> 206 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SNAP-25 <400> 2 Met Ala Glu Asp Ala Asp Met Arg Asn Glu Leu Glu Glu Met Gln Arg 1 5 10 15 Arg Ala Asp Gln Leu Ala Asp Glu Ser Leu Glu Ser Thr Arg Arg Met 20 25 30 Leu Gln Leu Val Glu Glu Ser Lys Asp Ala Gly Ile Arg Thr Leu Val 35 40 45 Met Leu Asp Glu Gln Gly Glu Gln Leu Glu Arg Ile Glu Glu Gly Met 50 55 60 Asp Gln Ile Asn Lys Asp Met Lys Glu Ala Glu Lys Asn Leu Thr Asp 65 70 75 80 Leu Gly Lys Phe Cys Gly Leu Cys Val Cys Pro Cys Asn Lys Leu Lys 85 90 95 Ser Ser Asp Ala Tyr Lys Lys Ala Trp Gly Asn Asn Gln Asp Gly Val 100 105 110 Val Ala Ser Gln Pro Ala Arg Val Val Asp Glu Arg Glu Gln Met Ala 115 120 125 Ile Ser Gly Gly Phe Ile Arg Arg Val Thr Asn Asp Ala Arg Glu Asn 130 135 140 Glu Met Asp Glu Asn Leu Glu Gln Val Ser Gly Ile Ile Gly Asn Leu 145 150 155 160 Arg His Met Ala Leu Asp Met Gly Asn Glu Ile Asp Thr Gln Asn Arg 165 170 175 Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp Ser Asn Lys Thr Arg Ile 180 185 190 Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser Gly 195 200 205 <210> 3 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VAMP-2 <400> 3 Met Ser Ala Thr Ala Ala Thr Val Pro Pro Ala Ala Pro Ala Gly Glu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Pro Ala Pro Pro Pro Asn Leu Thr Ser Asn Arg Arg Leu 20 25 30 Gln Gln Thr Gln Ala Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met Arg Val 35 40 45 Asn Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp 50 55 60 Asp Arg Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser 65 70 75 80 Ala Ala Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Leu Lys Met Met 85 90 95 Ile Ile Leu Gly Val Ile Cys Ala Ile Ile Leu Ile Ile Ile Ile Val 100 105 110 Tyr Phe Ser Thr 115 <210> 4 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SyNH3 <400> 4 Ala Leu Ser Glu Ile Glu Thr Arg His Ser Glu Ile Ile Lys Leu Glu 1 5 10 15 Asn Ser Ile Arg Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu 20 25 30 Val Glu Ser Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu 35 40 45 His Ala Val Asp Tyr Val Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala 50 55 60 Val Lys Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ile 65 70 75 <210> 5 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VpS <400> 5 Met Ser Ala Thr Ala Ala Thr Val Pro Pro Ala Ala Pro Ala Gly Glu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Pro Ala Pro Pro Pro Asn Leu Thr Ser Asn Arg Arg Leu 20 25 30 Gln Gln Thr Gln Ala Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met Arg Val 35 40 45 Asn Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp 50 55 60 Asp Arg Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser 65 70 75 80 Ala Ala Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Leu Lys Met Met 85 90 95

Claims

딱지꽃 추출물을 유효 성분으로 포함하는, SNARE 복합체 형성 억제 및 신경전달물질 방출 조절을 통한 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 꽃 추출물이 물 또는 C₁ ~ C₄ 알코올로 추출된 것을 특징으로 하는, 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
제2항에 있어서, 상기 C₁ ~ C₄ 알코올이 메탄올 또는 에탄올 임을 특징으로 하는, 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화장료 조성물이 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.