JP2005343884A - 不活性型潜在型ＴＧＦｂの活性型ＴＧＦｂへの変換を誘導できる有効成分 - Google Patents

不活性型潜在型ＴＧＦｂの活性型ＴＧＦｂへの変換を誘導できる有効成分 Download PDF

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Abstract

【課題】不活性型潜在型ＴＧＦｂの活性型ＴＧＦｂへの変換を誘導できる有効成分の提供。
【解決手段】上記活性を有する天然抽出物を用いる。天然抽出物は、大豆、オート麦などにより例示される植物抽出物、絹抽出物、魚卵抽出物、魚粉などにより例示される動物由来抽出物である。これら有効成分は皮膚（特に真皮）中の活性型ＴＧＦｂ１濃度を増加させる組成物の製造に用いることが出来る。この使用から派生する使用、及び、上記抽出物を含む化粧組成物又は医薬組成物の製造に用いることが出来る。
【選択図】なし

Description

本発明は、潜在型トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦｂ１−Ｌ）を、ＴＧＦｂ１−Ｌの「活性」型であるトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦｂ１）に変換する天然抽出物、並びに、特に皮膚（特に真皮）中のＴＧＦｂ１濃度を増加させるための、化粧品、皮膚薬及び医薬品におけるその使用に関する。
増殖因子及びサイトカインのうち、ＴＧＦｂ１は、ケラチノサイト、繊維芽細胞、白血球及び血小板等の多くの細胞によって皮膚中で分泌され、細胞代謝を変化させて細胞外マトリックスを改築するという重要な特性を持つことから、治療において最も効率のよい調節因子の１種である（非特許文献１、２）。
人間では、ＴＧＦβファミリーにおいて４種のアイソフォームが現在までに同定されている。これらは、異なる染色体上に存在する全く異なる遺伝子から転写・翻訳される。ＴＧＦ−β１は１９ｑ１３染色体上に、ＴＧＦ−β２は１ｑ４１染色体上に、ＴＧＦβ−３は１４ｑ２４染色体上に、ＴＧＦ−β４は１ｑ４２．１染色体上に位置している。
ＴＧＦ−β１は「潜在」型と称される生物学的に不活性な形態で分泌・貯蔵されており、「活性化」しなければ生物学的有効性を獲得できない。
潜在型ＴＧＦｂ１は細胞外マトリックス中に貯蔵され、老齢患者においては貯蔵されるだけで使用されない。
生体内では様々な因子により潜在型ＴＧＦｂ１の活性化が誘導される：
−グルコシダーゼ（エンドグリコシダーゼ−Ｆ、ノイラミニダーゼ、Ｎ−グリカナーゼ）、
−マクロファージ中で分泌されるシアリダーゼ、
−セリンプロテアーゼ（プラスミン、カテプシンＤ及びストロメリシン（ＭＭＰ３））
−トロンボスポンジン−１（細胞表面にも細胞外マトリックスにも結合し、潜在型ＴＧＦｂ１の活性化において主要な生理的調節因子である付着タンパク質）。
活性型ＴＧＦｂ１は皮膚の成長及びホメオスタシスにおいて最も重要な多機能型増殖因子であり、特に細胞の中で、繊維芽細胞の増殖、その化学誘引、血管新生の促進、繊維芽細胞の筋繊維芽細胞への分化、及び、繊維芽細胞の増殖の制御を誘導できると考えられる。また、細胞外マトリックス中では、コラーゲンの合成を増加させ、コラゲナーゼを減少させ、プロテアーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ）の合成を増加させ、フィブロネクチンのアイソフォームの発現及びフィブロネクチン受容体の合成を増加させ、エラスチンの合成を増加させることもできる。しかしながら、プロテオグリカン及びヒアルロン酸の合成の増加にも関与している。
真皮中で観察される活性型ＴＧＦｂ１濃度が減少しても、繊維芽細胞は活性型ＴＧＦｂ１による刺激に応答する能力を維持している。
老化の際にこのように活性型ＴＧＦｂ１濃度が減少すると、繊維芽細胞の増殖の減少及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成成分の合成の減少が誘導され、ＥＣＭの細胞外タンパク質の有害な活性が阻害される。
物理処理（温度）、化学処理（酸性ｐＨ）又は酵素による活性化といった活性化法が提案されている。
しかしながらこれらの活性法は、：
−化粧剤を合理的に使用する際に激烈過ぎたり不適当であったり（例えば、化粧品に使用するには温度が高過ぎたりｐＨが酸性過ぎたり）する場合、又は、
−皮膚上にアレルギー反応を引き起こす可能性があるという理由から、若しくは、分子量が非常に高いために、ＴＧＦβが不活性型で存在している真皮を含む皮膚深層へ浸透できないという理由から、化粧品にはあまり使用しない酵素を使用する場合がある。
これらの方法では、化粧品に、皮膚科的に又は医薬品に許容される天然有効成分は得られない。
特許文献１のみが、潜在型ＴＧＦｂ１を活性化できる分子について記載している。この分子はトリペプチドであるリジン−フェニルアラニン−リジン（Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）の誘導体であり、その配列はトロンボスポンジン−１の配列中にある。しかしながら、化粧品として活性化するためには、このトリペプチドをエライジン酸と反応させ、エライジル鎖（ｅｌａｉｄｙｌ ｃｈａｉｎ）をグラフトさせて改変しなければならない。
この物質は、このように化学的に改変されているために、本発明の意味する天然物とは言えない。
また、当業者であれば、プロテアーゼ活性を有する物質や強力なタンパク変性剤の使用を考えるであろう。しかしながら本発明は、化粧品に、皮膚科的に又は医薬品に許容される物質の製造において障害のある使用は行わない。
フランス特許２，８１０，３２３ Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ Ｐら，Ｅｄ．Ｍｅｄｉａｓ Ｆｌａｓｈ（１９９８年） Ｍｅｌｉｓｓｏｐｏｕｌｏｓ Ａら，Ｅｄ．Ｍｅｄｉｃａｌｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅｓ（１９９８年）
発明の目標
本発明の主要な目的は、皮膚（特に真皮）中の活性型ＴＧＦｂ１濃度の減少を軽減することである。
本発明のある目的は、ＴＧＦｂ１−Ｌを活性型ＴＧＦｂ１に変換する、化粧品に、皮膚科的に又は医薬品に許容される天然有効成分を提供するという新しい技術的問題を解決することである。
上記有効成分が化粧品に、皮膚科的に又は医薬品に許容されると本発明者らが考えるのは、第一に、皮膚を刺激したりアレルギーを引き起こしたりする際にプロテアーゼ活性を有さない場合、第二に、ＨＣｌ型強酸、尿素、トレイトールの含硫黄還元剤、チオグリコール酸化合物等のタンパク質を強力に変性させるとして知られる化学物質でない場合においてである。
有効成分が天然であると本発明者らが考えるのは、有効成分が、例えば植物界（植物、藻類等）や鉱物界に属する抽出物及び／若しくは植物（タンパク質、多糖等）から抽出された成分等の自然界からの抽出物、植物からの抽出物、動物の分泌物からの抽出物、並びに／又は、（微生物存在下での発酵により最終的に得られる）動物体や植物から単離された成分からの抽出物である場合においてである。本発明の別の目的は、局所使用でき、繊維芽細胞の増殖を促進する天然有効成分を提供するという新しい技術的な問題を解決することである。
本発明の別の目的は、局所使用でき、活性型ＴＧＦｂ１の量を増加させて、その結果、細胞外マトリックス構成成分の合成を増大させて、細胞外マトリックスの細胞外タンパク質の有害な活性を阻害する天然有効成分を提供するという新しい技術的な問題を解決することである。本発明の別の目的は、局所使用でき、記載する機構により抗皺効果又は抗老化効果を有する天然有効成分を提供するという新しい技術的な問題を解決することである。
本発明は特に、上記有効成分を含む化粧組成物、皮膚医薬組成物及び医薬組成物を提供することを含む。
発明の要約
上記に記載した様々な問題を解決するために、本発明者らは、不活性型ＴＧＦｂ１−Ｌをｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて活性化できる活性化法を調べた。現在のところ、ＴＧＦｂ１は、不活性型（ＴＧＦｂ１−Ｌ）である場合にＬＡＰタンパク質（潜在的にタンパク質に結合している物質）に結合しており、ＴＧＦｂ１を活性化するためには、ＴＧＦｂ１とＬＡＰタンパク質との結合を切断することが必要である。
本発明者らは、ＴＧＦｂ１−Ｌを活性化する物質を明らかにして、皮膚（特に真皮）中の活性型ＴＧＦｂ１濃度を増大できる天然有効成分の提供を可能にするスクリーニング試験を開発した。
この試験により、大豆、オート麦、小型ヤシ（ｄｗａｒｆ ｐａｌｍ）、トウグワ、スプリングハリシュモク（Ｓｐｒｉｎｇ ｒｅｓｔｈａｒｒｏｗ）、木豆（ｐｉｇｅｏｎ ｂｅａｎ）、空豆、トマト、魚卵（ｆｉｓｈ ｒｏｅ）、エンドウ豆、魚、小麦、マンゴー、ナツメヤシ、絹、キーウィ、ジャガイモ、グレープフルーツ、パパイヤ、パイナップル、パッションフルーツ、スクテラリア（ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ）、トウモロコシ、リンゴ、キノア、パセリ又はユッカの局所使用できる天然抽出物はＴＧＦｂ１−Ｌを活性化できることが分かった。この試験は、好ましくは化粧品に及び／又は皮膚科的に許容される条件下でインキュベートした後で実施するＴＧＦｂ１−Ｌ活性化反応を含む。
上記抽出物は、特に当業者に公知の任意の抽出方法によっても得られる。
上記天然抽出物はＴＧＦｂ１−Ｌ（潜在型ＴＧＦｂ１）を活性型ＴＧＦｂ１（ＴＧＦｂ１）に変換することから、とりわけ、皮膚（特に真皮）中のＴＧＦｂ１濃度を増加させるための、化粧組成物、皮膚医薬組成物及び／又は医薬組成物を製造するために使用される。また、上記天然抽出物は、皮膚（特に真皮）中のＴＧＦｂ１濃度を増加させることに由来する特性のためにも使用される。
発明の詳細な記載
本発明は主として、好ましくは酵素的に不活性であり、特にＴＧＦｂ１とＬＡＰタンパク質（潜在的にタンパク質に結合している物質）との結合を切断することによって、化粧品に、皮膚科的に及び／又は医薬品に許容される条件下でＴＧＦｂ１−Ｌ（潜在型ＴＧＦｂ１）を活性型ＴＧＦｂ１（ＴＧＦｂ１）に変換する天然抽出物に関する。
有利には、この植物抽出物は、大豆、オート麦、小型ヤシ、トウグワ、スプリングハリシュモク、木豆、空豆、トマト、魚卵、エンドウ豆、魚、小麦、マンゴー、ナツメヤシ、絹、キーウィ、ジャガイモ、グレープフルーツ、パパイヤ、パイナップル、パッションフルーツ、スクテラリア、トウモロコシ、リンゴ、キノア、パセリ又はユッカ抽出物、及び、これら抽出物の混合物のいずれか１種の中から選択される。
本発明の化粧品に又は皮膚科的に許容される有効成分は、不活性型ＴＧＦｂ１−Ｌの活性型ＴＧＦｂ１への変換を、化粧品に又は皮膚科的に許容される物理化学的条件下において誘導し、また、これら有効成分は全くの天然物で、化学的改変を受けていない。
また本発明は、上記抽出物を少なくとも１種含む化粧組成物又は医薬組成物に関する。
有利には、上記抽出物の濃度は組成物総量に対して０．０１〜１０重量％である。
有利には、上記抽出物は、局所投与経路で許容される賦形剤、特に化粧品に又は皮膚科的に許容される賦形剤との混合物である。
これらの組成物について、上記賦形剤は、例えば、防腐剤、皮膚軟化剤、乳化剤、界面活性剤、保湿剤、濃化剤、調整剤、つや消し剤、安定剤、抗酸化剤、質感調整剤、増白剤、フィルム化剤（ｆｉｌｍｏｇｅｎｉｃ ａｇｅｎｔ）、可溶化剤、顔料、色素、香料及びソーラーフィルターからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む。これらの賦形剤は、好ましくは、アミノ酸及びその誘導体、ポリグリセリン、セルロースのエステル、ポリマー及び誘導体、ラノリン誘導体、リン脂質、ラクトフェリン、乳過酸化酵素、スクロース型安定剤、ビタミンＥ及びその誘導体、天然及び合成ワックス、植物油、トリグリセリド、不鹸化物、植物ステロール、植物エステル、シリコーン及びその誘導体、タンパク質加水分解物、ホホバ油及びその誘導体、脂溶性／水溶性エステル、ベタイン、アミン酸化物、植物抽出物、スクロースエステル、二酸化チタン、グリシン、並びに、パラベンからなる群より選択される。より好ましくは、ブチレングリコール、ステアレス−２、ステアレス−２１、グリコール−１５ステアリルエーテル、セテアリルアルコール、フェノキシエタノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、ブチレングリコール、天然トコフェロール、グリセリン、ジヒドロキシセチルナトリウム、イソプロピルヒドロキシセチルエーテル、ステアリン酸グリコール、トリイソノナオイン（ｔｒｉｉｓｏｎｏｎａｏｉｎｅ）、ヤシ油脂肪酸オクチル、ポリアクリルアミド、イソパラフィン、ラウレス−７、カルボマー、プロピレングリコール、グリセリン、ビサボロール、ジメチコン、水酸化ナトリウム、ＰＥＧ３０−ジポリヒドロキシステアリン酸塩、カプリン／カプリル酸トリグリセリル、オクタン酸セテアリル、アジピン酸ジブチル、ブドウ種子油、ホホバ油、硫酸マグネシウム、ＥＤＴＡ、シクロメチコン、キサンタンガム、クエン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、ミネラルワックス及び鉱物油、イソステアリン酸イソステアリル、プロピレングリコールジペラルゴン（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｄｉｐｅｌａｒｇｏｎａｔｅ）、イソステアリン酸プロピレングリコール、ＰＥＧ−８ミツロウ、水添パーム核脂肪酸グリセリド、水添パーム油脂肪酸グリセリド、ラノリン油、ゴマ油、乳酸セチル、ラノリンアルコール、ヒマシ油、二酸化チタン、ラクトース、スクロース、低密度ポリエチレン及び等張食塩水からなる群より選択される。
有利には、上記組成物は、特にビン又はチューブに入れた形での、水性若しくは油性の溶液、水性クリーム、水性ゲル又は油性ゲル、特にボディソープ、シャンプー；乳液；エマルション、マイクロエマルション又はナノエマルション、特に水中油又は油中水又は多相又はシリコーン含有マイクロエマルション又はナノエマルション；ローション、特にガラスビン、プラスチックビン若しくは計量ビンに入れた形の、又は、エアゾール状のローション；アンプル；液体セッケン；皮膚科的な棒（ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｂａｒ）；軟膏；フォーム；無水物質、好ましくは液状、ペースト状又は固体状の無水物質、例えばスティック状、特に口紅；からなる群より選択される形態で調剤される。
また本発明は、皮膚（特に真皮）中の活性型ＴＧＦｂ１濃度の増加を目的とする組成物を製造するための、上記抽出物の少なくとも１種の使用に関する。
また本発明は、繊維芽細胞の増殖の促進を目的とする組成物を製造するための、上記抽出物の少なくとも１種の使用に関する。
また本発明は、特に、コラーゲン合成の増加により、並びに／又は、プロテアーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ）合成の増加により、並びに／又は、プロテオグリカン及び／若しくはヒアルロン酸合成の増加により、並びに／又は、フィブロネクチンアイソフォームの発現及び／若しくはフィブロネクチン受容体の合成の増加により、並びに／又は、エラスチン合成の増加により、細胞外マトリックス構成成分の合成の増加を目的とする組成物を製造するための、上記抽出物の少なくとも１種の使用に関する。
また本発明は、細胞外マトリックスの細胞外タンパク質の有害な活性の阻害を目的とする組成物を製造するための、上記抽出物の少なくとも１種の使用に関する。
また本発明は、抗皺効果又は抗老化効果を有する組成物を製造するための、上記抽出物の少なくとも１種の使用に関する。
本発明のある実施形態によれば、上記抽出物は溶媒抽出によって調製する。上記溶媒は、極性溶媒であってもよいし非極性溶媒であってもよい。上記溶媒は、好ましくはペンタン、デカン、シクロヘキサン、ヘキサン、石油エーテル、モノクロロメタン、ジクロロメタン、クロロホルム、イソプロパノール、プロパノール、酢酸エチル、エタノール、メタノール、アセトン、ブチレングリコール、プロピレングリコール、ペンチレングリコール、グリセリン及び水、並びに、これら溶媒のうち少なくとも２種の混合物、特に水−アルコール又は水−グリコールの混合物からなる群より選択される。
有利には、上記抽出物は精製したものである。上記抽出物は主として水抽出によって得られるものであり、何らかの親和性の観点からＭＰジオール及びブチレングリコールが使用される。大豆、オート麦、エンドウ豆、小麦、トウモロコシ、キノア、及び、木豆又は空豆抽出物は種子から抽出したものであり、スプリングハリシュモク、トウグワ、ユッカ、スクテラリア及びパセリ抽出物は根から抽出したものであり、トマト、ジャガイモ、マンゴー、ナツメヤシ、キーウィ、グレープフルーツ、パパイヤ、パイナップル、パッションフルーツ、リンゴ及び小型ヤシ抽出物は果実又は液果から抽出したものである。絹（動物由来）、魚卵及び魚は抽出、乾燥させた後に処理する。
有利には、上記抽出物は、水、ブチレングリコール等のグリコール、水とグリコール（特にブチレングリコール）との混合物、ＭＰジオール及びエタノールから選択される溶媒中に０．０１％〜１０％（ｗ／ｗ）に希釈する。
当業者には、本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の実施例を参照した説明から明らかであろう。実施例は単に説明のための記載であって、本発明の範囲を何ら制限するものではない。実施例は本発明に不可欠であり、また、実施例を含む本明細書全体の中に記載される従来技術に照らして新規の特徴は全て、その機能、概略共に本発明に不可欠である。上記より、実施例は全て、一般的な範囲を示す。また、実施例において、特に指示のない限り、割合は重量で、温度は摂氏で、圧力は大気圧で表す。
図１は、実施例３１における小型ヤシ抽出物濃度に対するエラスチン遺伝子の転写の割合を示す。
＜大豆抽出物＞
大豆のタンパク質画分を、濃縮に使用できる任意の物理的又は化学的手段によって大豆種子から濃縮する。得られたタンパク質画分を従来の任意の工業的手法によって乾燥させ、その５０ｇを脱塩水９５０ｇ中に溶解する。機械を用いて１８時間撹拌した後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜オート麦抽出物＞
オート麦（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）のタンパク質画分を、濃縮に使用できる任意の物理的又は化学的手段によってオート麦種子から濃縮する。得られたタンパク質画分を従来の任意の工業的手法によって乾燥させ、その５０ｇを脱塩水５５０ｇとブチレングリコール４００ｇとの混合物中に溶解する。機械を用いて１８時間撹拌した後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜小型ヤシの果実の抽出物＞
小型ヤシ（Ｓｅｒｅｎｏａ ｒｅｐｅｎｓ）の親油性画分（油、ステロール、ワックス等）を、濃縮に使用できる任意の物理的又は化学的手段によって果実から濃縮する。超臨界ＣＯ２による抽出が好ましい。得られた脂質画分を、ろ過又は遠心分離等によって不溶画分から分離する。
実施例３ａ
この物質１０ｇをブチレングリコール９９０ｇ中に溶解する。機械を用いて１時間撹拌した後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
実施例３ｂ
この物質１００ｇをブチレングリコール９００ｇ中に溶解する。機械を用いて１時間撹拌した後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
実施例３ｃ
この物質３００ｇをブチレングリコール７００ｇ中に溶解する。機械を用いて１時間撹拌した後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜絹抽出物＞
絹（Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ）タンパク質のタンパク質加水分解物を、従来の酵素的又は化学的な加水分解によって調製する。得られたタンパク質画分を従来の任意の工業的手法によって乾燥させ、その５０ｇを脱塩水９５０ｇ中に溶解する。機械を用いて１８時間撹拌した後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜トウグワ抽出物＞
トウグワ（Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ）の根を粉砕して蒸留水中に浸漬した後、従来の任意の工業的手法によって乾燥させ、得られた物質５０ｇを脱塩水９５０ｇ中に溶解する。機械を用いて１８時間撹拌した後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜スプリングハリシュモク抽出物＞
スプリングハリシュモク（Ｏｎｏｎｉｓ ｓｐｉｎｏｓａ）の根を乾燥させ、任意の工業的手法によって粉砕した後、得られた物質５０ｇを脱塩水９５０ｇ中に溶解する。機械を用いて１８時間撹拌した後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜木豆又は空豆の抽出物＞
木豆又は空豆（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）のタンパク質画分を、濃縮に使用できる任意の物理的又は化学的手段によって木豆種子又は空豆種子から濃縮する。得られたタンパク質画分を従来の任意の工業的手法によって乾燥させ、その５０ｇを脱塩水９５０ｇ中に溶解する。機械を用いて１８時間撹拌した後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜トマト抽出物＞
トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）の果実を乾燥させて任意の工業的手法によって粉砕した後、得られた物質１０ｇをＭＰジオール９９０ｇ中に溶解する。機械を用いて１時間撹拌した後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜魚卵抽出物＞
サケ科魚卵は任意の従来技術によって乾燥させ、得られた物質５０ｇを脱塩水９５０ｇ中に溶解する。機械を用いて１８時間撹拌した後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜エンドウ豆のタンパク質抽出物＞
エンドウ豆（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）のタンパク質画分を、濃縮に使用できる任意の物理的又は化学的手段によってエンドウ豆種子から濃縮する。得られたタンパク質画分を従来の任意の工業的手法によって乾燥させ、その２００ｇを無水エタノール７００ｇと脱塩水３００ｇとの混合物８００ｇ中に溶解する。可溶性の抽出物を任意の従来技術によって乾燥させ、得られた物質３０ｇを脱塩水９７０ｇ中に分散させる。機械を用いて１８時間撹拌した後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜魚粉抽出物＞
魚肉懸濁物を、調製に使用できる任意の物理的又は化学的手段によってサケ科の魚（リング（ｌｉｎｇ）、コッド（ｃｏｄ）、ハドック（ｈａｄｄｏｃｋ）等）から調製する。得られた画分を従来の任意の工業的手法によって乾燥させ、その５０ｇを脱塩水９５０ｇ中に分散させる。機械を用いて１８時間撹拌した後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜小麦胚芽抽出物＞
小麦胚芽を、小麦種子（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）から機械を用いて分離し、粉砕に使用できる任意の物理的又は化学的手段によって粉砕して小麦胚芽粉末を調製する。得られた画分を従来の任意の工業的手法によって乾燥させ、その３０ｇを脱塩水９７０ｇ中に溶解する。機械を用いて１８時間撹拌した後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜ジャガイモ抽出物＞
ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）のタンパク質画分を、デンプン抽出工程におけるジャガイモから、濃縮に使用できる任意の物理的又は化学的手段によって濃縮する。得られたタンパク質画分を従来の任意の工業的手法によって乾燥させ、その１００ｇを脱塩水９００ｇ中に分散させる。機械を用いて１８時間撹拌した後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜スクテラリア抽出物＞
スクテラリア（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ）の根を高温（５０〜６０℃）のエタノール溶液を用いて濃縮し、抽出する。任意の従来技術によって不溶物をろ過した後、エタノール溶液を濃縮して従来の任意の工業的手法によって乾燥させ、その１０ｇを脱塩水９９０ｇ中に溶解する。機械を用いて１８時間撹拌した後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜トウモロコシ抽出物＞
トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）のタンパク質画分を、濃縮に使用できる任意の物理的又は化学的手段によってトウモロコシ種子から濃縮する。得られたタンパク質画分を従来の任意の工業的手法によって乾燥させ、その３０ｇを脱塩水９７０ｇ中に分散させる。機械を用いて１８時間撹拌した後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜バイオテクノロジーにより改変したマンゴーの抽出物＞
マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ）の粗抽出物を、抽出物の調製に使用できる任意の物理的又は化学的手段によって果実から調製する。得られた粗抽出物を従来の任意の工業的手法によって乾燥させ、その１００ｇを脱塩水９００ｇ中に溶解し、ここに乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を添加する。７２時間発酵させた後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜バイオテクノロジーにより改変したナツメヤシの抽出物＞
ナツメヤシ（Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｃｔｉｌｉｆｅｒａ）の粗抽出物を、抽出物の調製に使用できる任意の物理的又は化学的手段によって果実から調製する。得られた粗抽出物を従来の任意の工業的手法によって乾燥させ、その１００ｇを脱塩水９００ｇ中に溶解し、ここに乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を添加する。７２時間発酵させた後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜バイオテクノロジーにより改変したキーウィの抽出物＞
キーウィ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）の粗抽出物を、抽出物の調製に使用できる任意の物理的又は化学的手段によって果実から調製する。得られた粗抽出物を従来の任意の工業的手法によって乾燥させ、その１００ｇを脱塩水９００ｇ中に溶解し、ここに乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）を添加する。７２時間発酵させた後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜バイオテクノロジーにより改変したパパイヤの抽出物＞
パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）の粗抽出物を、抽出物の調製に使用できる任意の物理的又は化学的手段によって果実から調製する。得られた粗抽出物を従来の任意の工業的手法によって乾燥させ、その１００ｇを脱塩水９００ｇ中に溶解し、ここにビール酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を添加する。７２時間発酵させた後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜バイオテクノロジーにより改変したリンゴの抽出物＞
リンゴ（Ｍａｌｕｓ ｐｕｍｉｌａ）の粗抽出物を、抽出物の調製に使用できる任意の物理的又は化学的手段によって果実から調製する。得られた粗抽出物を従来の任意の工業的手法によって乾燥させ、その１００ｇを脱塩水９００ｇ中に溶解し、ここに乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）を添加する。７２時間発酵させた後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜キノア種子粉末の抽出物＞
キノア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａ）の粗抽出物を、抽出物の調製に使用できる任意の物理的又は化学的手段によって種子から調製する。得られた粗抽出物を従来の任意の工業的手法によって乾燥させ、その５０ｇを脱塩水９５０ｇ中に溶解する。機械を用いて１８時間撹拌した後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜パセリ根の抽出物＞
パセリ根（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）を乾燥させて、任意の工業的手法によって微細に粉砕し、その５０ｇを脱塩水９５０ｇ中に溶解する。機械を用いて１８時間撹拌した後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜パイナップル抽出物＞
パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）の粗抽出物を、抽出物の調製に使用できる任意の物理的又は化学的手段によって果実から調製する。得られた粗抽出物を従来の任意の工業的手法によって乾燥させ、その５０ｇを脱塩水９５０ｇ中に溶解する。機械を用いて１８時間撹拌した後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜バイオテクノロジーにより改変したパッションフルーツの抽出物＞
パッションフルーツ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ｅｄｕｌｉｓ）の粗抽出物を、抽出物の調製に使用できる任意の物理的又は化学的手段によって果実から調製する。得られた粗抽出物を従来の任意の工業的手法によって乾燥させ、その１００ｇを脱塩水９００ｇ中に溶解し、ここに乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を添加する。７２時間発酵させた後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜ユッカ抽出物＞
ユッカ（Ｙｕｃｃａ ｓｃｈｉｄｉｇｅｒａ）の乾燥粗抽出物を、抽出物の調製に使用できる任意の物理的又は化学的手段によって植物体の地上部分から調製し、得られた物質１０ｇをブチレングリコール９９０ｇ中に溶解する。機械を用いて１時間撹拌した後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜グレープフルーツ抽出物＞
グレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）の粗抽出物を、抽出物の調製に使用できる任意の物理的又は化学的手段によって果実から調製し、得られた物質をブチレングリコールと水との混合物中に溶解する。機械を用いて１時間撹拌した後、ろ過、遠心分離又は限外ろ過等の分離に使用できる方法により、不溶画分を可溶画分から分離する。可溶画分を、本発明の他の部分で使用する。
＜スクリーニング試験＞
上記ＴＧＦｂ１−Ｌを活性化できる物質を明らかにできるスクリーニング試験を開発した。すなわち、活性化されたＴＧＦｂ１−Ｌの割合を調べるために、活性型ＴＧＦｂ１酵素標識試験によって測定した。実験はヒト組み換えＴＧＦｂ１より行った。ＨＣｌ溶液（１Ｎ）４０μｌを、有効成分なしで４℃において１８時間インキュベートしたＴＧＦｂ１−Ｌ溶液（０．１μｇ／ｍｌ）２００μｌに添加する。ホモジナイズした後、試料を常温で１０分間インキュベートし、ＮａＯＨ（１．２Ｎ）／ＨＥＰＥＳ（１Ｍ）溶液４０μｌを加えて中和する。
活性型ＴＧＦｂ１の含有量を、下記のＥＬＩＳＡ法によって測定する。この値は放出されたＴＧＦｂ１の最大値と一致するが、このような酸性ｐＨにおける活性化は、化粧品又は皮膚医薬品に許容される条件には相当しない。
試験する有効成分５０μｌを、チューブ中のＴＧＦｂ１−Ｌ（０．１μｇ／ｍｌ）９５０μｌに添加して混合した後、試料を４℃において１８時間インキュベートする。スクリーニングした抽出物を５％水溶液の状態で試験した。
＜活性化されたＴＧＦｂ１の測定＞
次に、活性型ＴＧＦｂ１を、ヒト活性型ＴＧＦｂ１に対して高感度で特異的なＥＬＩＳＡ試験（酵素結合免疫吸着測定法）により反応媒体中で定量する。ＴＧＦｂ１が結合するＩＩ型ＴＧＦｂ１受容体を９６ウェルプレート上にあらかじめ固定し、標準品及び試料をウェル中に注入すると、存在しているＴＧＦｂ１は上記固定した受容体に結合する。結合していない物質を数回洗浄して除去した後、ＴＧＦｂ１に特異的な酵素結合ポリクローナル抗体をウェル中に添加する。その後、過剰な抗体を除去して、上記酵素の基質を含む溶液をウェル中に注入する。この基質が酵素によって変換されると着色した物質が生成する。硫酸溶液を用いて酵素反応を停止する。得られた色の強度を分光光度計によって４５０ｎｍにおいて測定する。この値は試験した試料によって活性化されたＴＧＦｂ１の量に比例する。
従って標準範囲から、ＯＤ測定値に対して、反応媒体中の活性化されたＴＧＦｂ１の濃度（ｐｇ／ｍｌ）を計算できる。
［ＴＧＦｂ１］＝ｆ（ＯＤ試料−ＯＤコントロール）。
＜実施例１〜２６に記載された抽出物の実施例２７のスクリーニングによる結果＞
次の表は５％水溶液の状態で試験した優良な物質のリストである。
Figure 2005343884
以下の実施例において、小型ヤシ抽出物は実施例３によって得られる。
＜本発明の物質の投与量効果：小型ヤシ抽出物＞
Figure 2005343884
＜小型ヤシ抽出物がフィブロネクチンの合成に及ぼす効果＞
フィブロネクチンの合成に関する研究は次の三つの段階を含む：ＴＧＦｂ１−Ｌを活性化すること、活性化されたＴＧＦｂ１−Ｌを単層正常ヒト真皮繊維芽細胞上でインキュベートすること、及び、合成されたフィブロネクチンを培地から測定すること。
実験はヒト組み換えＴＧＦｂ１−Ｌより行った。ＴＧＦｂ１−Ｌ溶液を濃度８μｇ／ｍｌに調製する。ＴＧＦｂ１−Ｌ（８μｇ／ｍｌ）をＰＢＳ １Ｘ中に８倍希釈し、１μｇ／ｍｌにおけるＴＧＦｂ１−Ｌの活性化を試験する。小型ヤシ抽出物１０μｌをＴＧＦｂ１−Ｌ（１μｇ／ｍｌ）９９０μｌに添加して撹拌した後、４℃において１８時間インキュベートする。
次に、活性化されたＴＧＦｂ１の溶液を、ＦＢＭ血清（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社、ドイツ）を含まない培地中に１０倍希釈する。実験コントロールを調製する：ＦＢＭコントロール及びＴＧＦｂ１−Ｌコントロールのネガティブコントロール２種、並びに、ＦＢＭ中に１０ｎｇ／ｍｌ及び１ｎｇ／ｍｌに希釈した活性型ＴＧＦｂ１ポジティブコントロール（シグマ社、フランス）。各溶液は、２ｍｌ／ウェルの割合で、６ウェルプレート中のコンフルエントになった単層培養繊維芽細胞上に注入する。５％ＣＯ２を含む雰囲気下で、３７℃において４８時間インキュベートして培養する。その後、フィブロネクチンを、ヒトフィブロネクチンに対して高感度で特異的なＥＩＡ試験（酵素免疫定量法）により培地中で定量する。フィブロネクチンが結合するフィブロネクチン受容体を９６ウェルプレート上にあらかじめ固定し、標準品及び試料をウェル中に注入すると、存在しているフィブロネクチンは上記固定した受容体に結合する。結合していない物質を数回洗浄して除去した後、フィブロネクチンに特異的な酵素結合ポリクローナル抗体をウェル中に添加する。その後、過剰な抗体を除去して、上記酵素の基質を含む溶液をウェル中に注入する。硫酸溶液を用いて酵素反応を停止する。得られた色の強度を分光光度計によって４５０ｎｍにおいて測定する。この値は合成されたフィブロネクチンの量に比例する。
結果を、ＴＧＦｂ１−Ｌネガティブコントロールに対する割合で示す。この結果からＴＧＦｂ１−Ｌコントロールがフィブロネクチンの合成を促進していると考えられ、このことは、繊維芽細胞がＴＧＦｂ１−Ｌを活性化できることから説明できる。このパラメーターは、有効成分によって活性化されたＴＧＦｂ１−Ｌの存在下で細胞により合成されたフィブロネクチンの量を、ＴＧＦｂ１−Ｌの存在下で細胞により合成されたフィブロネクチンの量と比較することによって除外されている。
Figure 2005343884
＜エラスチンをコードする遺伝子の転写に及ぼす小型ヤシ抽出物の投与量効果＞
エラスチンをコードする遺伝子の転写に関する研究は次の三つの段階を含む：ＴＧＦｂ１−Ｌを活性化すること、活性化されたＴＧＦｂ１を単層正常ヒト真皮繊維芽細胞上でインキュベートすること、及び、細胞層から抽出したＲＮＡ（リボ核酸）量をＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）によって測定すること。
実験はヒト組み換えＴＧＦｂ１−Ｌより行った。ＴＧＦｂ１−Ｌ溶液を濃度８μｇ／ｍｌに調製する。ＴＧＦｂ１−Ｌ（８μｇ／ｍｌ）をＰＢＳ １Ｘ中に８倍希釈し、１μｇ／ｍｌにおけるＴＧＦｂ１−Ｌの活性化を試験する。ＴＧＦｂ１−Ｌ（１μｇ／ｍｌ）１ｍｌを、チューブ中の必要量の小型ヤシ抽出物に添加することにより、次の濃度で試験できる：０．０１％、０．１％、１％及び３％。この混合物を４℃において１８時間インキュベートし、活性化されたＴＧＦｂ１−Ｌの溶液をＦＢＭ血清（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社、ドイツ）を含まない培地中に希釈する。
実験コントロールを調製する：ＦＢＭコントロール及びＴＧＦｂ１−Ｌコントロールのネガティブコントロール２種、並びに、ＦＢＭ中に１ｎｇ／ｍｌに希釈した活性型ＴＧＦｂ１ポジティブコントロール（シグマ社、フランス）１種。各溶液を、１ｍｌ／ウェルの割合で、２４ウェルプレート中のコンフルエントになった単層培養繊維芽細胞上に注入する。５％ＣＯ２を含む雰囲気下で、３７℃において２４時間インキュベートして培養する。培地を除去して細胞層を洗浄した後、総ＲＮＡを細胞から抽出する。抽出は、正に荷電しているシリカカラムを用いて細胞を溶解することにより行う。これによって負に荷電しているＲＮＡはカラム上に保持され、９６ウェルプレート中に溶出される。
抽出したＲＮＡの定量及び純度測定を、分光光度計を用いた２６０／２８０ｎｍにおける値を読み取ることにより行う。ＲＮＡ溶液の濃度を最終濃度５ｎｇ／ｍｌになるように調整し、９６ウェルＰＣＲプレート中へ、１枚のプレートに測定する遺伝子（エラスチン）を、もう１枚のプレートにハウスキーピング遺伝子（アクチン）を１０μｌ／ウェルずつ等分に注入する。ＲＴ−ＰＣＲ測定により、参照とする遺伝子アクチンと比較してエラスチン遺伝子のＲＮＡを増幅できる。この測定には、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｈ Ｓｙｂｅｒｇｒｅｅｎ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ社、フランス）及び増幅された遺伝子に特異的なプライマーを使用する。逆転写酵素活性化の段階（５０℃、３０分）、逆転写酵素の変性及びポリメラーゼ活性化の段階（９５℃、１５分）、並びに、開鎖（９５℃、１５秒）、プライマーの固定（６０℃、３０秒）及びポリメラーゼの作動（７２℃、３０秒）を含む５０サイクルのプログラムを作成する。得られた結果（図１）は、０．０１の蛍光で読み取ったサイクル番号に相当する。
図１は、小型ヤシ抽出物濃度に対するエラスチン遺伝子の転写の割合を示す。横軸は小型ヤシ抽出物の試験濃度（重量百分率）、縦軸はエラスチン遺伝子の転写の重量百分率を示す。
各試料の比率は、エラスチンで読み取ったサイクル番号と、アクチンで読み取ったサイクル番号から計算する。
小型ヤシ抽出物は、０．１％の濃度でエラスチン遺伝子の転写を２倍に、１％で２．８倍に、最終的に３％で３．７倍に増加させる。従って投与量効果が顕著である：小型ヤシ抽出物の濃度が増加すると、遺伝子の転写が増加し、かつ、顕著になる。
＜コラーゲンの合成に及ぼす小型ヤシ抽出物の効果＞
この実験は、活性化された又は活性化されていないＴＧＦｂ１−Ｌの、新たに合成されたタンパク質中の３Ｈプロリンの取り込みに及ぼす効果を調べるために行った。コラーゲンの合成に関する研究は次の三つの段階を含む：ＴＧＦｂ１−Ｌを活性化すること、活性化された又は活性化されていないＴＧＦｂ１−Ｌを単層正常ヒト真皮繊維芽細胞上でインキュベートすること、及び、プロリンを取り込ませて取り込まれた放射能を解析すること。
実験は、ヒト組み換えＴＧＦｂ１−Ｌより、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ及び１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用して行った。小型ヤシ抽出物１０μｌをチューブ中のＴＧＦｂ１−Ｌ溶液９９０μｌにそれぞれ添加し、混合する。その後、試料を４℃において１８時間インキュベートし、活性化されたＴＧＦｂ１−Ｌの溶液を、ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）１％を含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、フランス）中に１０倍希釈する。実験コントロールを調製する：ＤＭＥＭコントロール及びＴＧＦｂ１−Ｌコントロールのネガティブコントロール２種、並びに、ＤＭＥＭ中に２０μｇ／ｍｌに希釈したビタミンＣ及び１０ｎｇ／ｍｌに希釈した活性型ＴＧＦｂ１（シグマ社、フランス）のポジティブコントロール２種。各溶液を、９６ウェルプレート中のコンフルエントになった単層培養正常ヒト真皮繊維芽細胞上に注入する。５％ＣＯ２を含む雰囲気下で、３７℃において７２時間インキュベートして培養する。インキュベーションの最後の２４時間は、４２Ｃｉ／ｍｍｏｌの３Ｈ標識プロリン（アマシャムバイオサイエンス社、フランス）の存在下で行う。
取り込まれた放射能の解析は、ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）沈殿を行ってろ紙上に集めたものをＴＣＡ及び７０°エタノールで洗浄し、最後に液体シンチレーション法で計数することにより行った。
小型ヤシ抽出物は、注入したタンパク質の画分に及ぼすＴＧＦｂ１−Ｌの効果を増大させた。この効果は、１００及び１０００ｎｇ／ｍｌのＴＧＦｂ１−Ｌ存在下において明らかである。
Figure 2005343884
＜小型ヤシ抽出物は、経皮浸透した後でもＴＧＦｂ１−Ｌを活性化できる＞
経皮浸透に関する研究は次の三つの段階を含む：小型ヤシ抽出物の経皮浸透、浸透物によるＴＧＦｂ１−Ｌの活性化、及び、活性化されたＴＧＦｂ１−Ｌの測定。
経皮浸透実験は、フランツセルの供与液区画と受理液区画との間にラット皮膚生検を挿入して行う。小型ヤシ抽出物１ｇをラット皮膚上、ＰＢＳバッファーを含む受理液に塗布する。コントロールセルは有効成分なしで調製した。有効成分の経皮浸透を２４時間測定し、その後小型ヤシ抽出物を含む浸透物を回収する。この浸透物について、ＴＧＦｂ１−Ｌを活性化する能力を測定する。これを行うに当たり、ＨＣｌ溶液（１Ｎ）４０μｌを、有効成分なしで４℃において１８時間インキュベートしたＴＧＦｂ１−Ｌ溶液（０．１μｇ／ｍｌ）２００μｌ中に添加する。ホモジナイズした後、試料を常温で１０分間インキュベートし、ＮａＯＨ（１．２Ｎ）／ＨＥＰＥＳ（１Ｍ）溶液４０μｌを加えて中和する。
活性型ＴＧＦｂ１の含有量を上記ＥＬＩＳＡ法によって測定する。この値は放出されたＴＧＦｂ１の最大値と一致するが、このような酸性ｐＨにおける活性化は、化粧品又は皮膚医薬品に許容される条件には相当しない。
浸透物１００μｌをチューブ中のＴＧＦｂ１−Ｌ溶液（０．１μｇ／ｍｌ）９００μｌに添加して混合後、４℃において１８時間インキュベートする。次に、活性型ＴＧＦｂ１を、ヒト活性型ＴＧＦｂ１に対して高感度で特異的なＥＬＩＳＡ試験（酵素結合免疫吸着測定法）により反応媒体中で定量する。ＴＧＦｂ１が結合するＩＩ型ＴＧＦｂ１受容体を９６ウェルプレート上にあらかじめ固定し、標準品及び試料をウェル中に注入すると、存在しているＴＧＦｂ１は上記固定した受容体に結合する。結合していない物質を数回洗浄して除去した後、ＴＧＦｂ１に特異的な酵素結合ポリクローナル抗体をウェル中に添加する。その後、過剰な抗体を除去して、上記酵素の基質を含む溶液をウェル中に注入する。この基質が酵素によって変換されると着色した物質が生成する。硫酸溶液を用いて酵素反応を停止する。得られた色の強度を分光光度計によって４５０ｎｍにおいて測定する。この値は試験した試料によって活性化されたＴＧＦｂ１の量に比例する。
従って標準範囲から、ＯＤ測定値に対して、反応媒体中の活性化されたＴＧＦｂ１の濃度（ｐｇ／ｍｌ）を計算できる。
［ＴＧＦｂ１］＝ｆ（ＯＤ試料−ＯＤコントロール）。
Figure 2005343884
＜水中油エマルション型の化粧又は医薬製剤における本発明の物質の使用＞
「製剤３４ａ」
Ａ
水 ｑｓｐ １００
ブチレングリコール ２
グリセリン ３
ジヒドロキシセチルリン酸ナトリウム・ ２
イソプロピルヒドロキシセチルエーテル
Ｂ
ステアリン酸グリコールＳＥ １４
トリイソノナオイン ５
ヤシ油脂肪酸オクチル ６
Ｃ
ｐＨ５．５に調整したブチレングリコール、 ２
メチルパラベン、
エチルパラベン、プロピルパラベン
Ｄ
本発明の物質 ０．０１〜１０％
「製剤３４ｂ」
Ａ
水 ｑｓｐ １００
ブチレングリコール ２
グリセリン ３
ポリアクリルアミド、イソパラフィン、ラウレス−７ ２．８
Ｂ
ブチレングリコール、 ２
メチルパラベン、
エチルパラベン、プロピルパラベン
フェノキシエタノール、 ２
メチルパラベン、
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
ブチレングリコール ０．５
Ｄ
本発明の物質 ０．０１〜１０％
「製剤３４ｃ」
Ａ
水 ｑｓｐ １００
カルボマー ０．５０
プロピレングリコール ３
グリセリン ５
Ｂ
ヤシ油脂肪酸オクチル ５
ビサボロール ０．３０
ジメチコン ０．３０
Ｃ
水酸化ナトリウム １．６０
Ｄ
フェノキシエタノール、 ０．５０
メチルパラベン、
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
Ｅ
香料 ０．３０
Ｆ
本発明の物質 ０．０１〜１０％
＜油中水型の製剤における本発明の物質の使用＞
Ａ
ＰＥＧ３０−ジポリヒドロキシステアリン酸 ３
カプリン酸トリグリセリド ３
オクタン酸セテアリル ４
アジピン酸ジブチル ３
ブドウ種子油 １．５
ホホバ油 １．５
フェノキシエタノール、 ０．５
メチルパラベン、
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
Ｂ
水 ｑｓｐ １００
グリセリン ３
ブチレングリコール ３
硫酸マグネシウム ０．５
ＥＤＴＡ ０．０５
Ｃ
シクロメチコン １
ジメチコン １
Ｄ
香料 ０．３
Ｅ
本発明の物質 ０．０１〜１０％
＜シャンプー又はボディソープ状の製剤における本発明の物質の使用＞
Ａ
水 ｑｓｐ １００
キサンタンガム ０．８
Ｂ
ブチレングリコール、 ０．５
メチルパラベン、
エチルパラベン、プロピルパラベン
フェノキシエタノール、 ０．５
メチルパラベン、
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
Ｃ
クエン酸 ０．８
Ｄ
ラウレス硫酸ナトリウム ４０．０
Ｅ
本発明の物質 ０．０１〜１０％
＜口紅等の無水製品状の製剤における本発明の物質の使用＞
Ａ
ミネラルワックス １７．０
イソステアリン酸イソステアリル ３１．５
プロピレングリコールジペラルゴン ２．６
イソステアリン酸プロピレングリコール １．７
ＰＥＧ−８ミツロウ ３．０
水添パーム核油脂肪酸グリセリド、 ３．４
水添パーム油脂肪酸グリセリド
ラノリン油 ３．４
ゴマ油 １．７
乳酸セチル １．７
鉱物油、ラノリンアルコール ３．０
Ｂ
ヒマシ油 ｑｓｐ １００
二酸化チタン ３．９
ＣＩ １５８５０：１ ０．６１６
ＣＩ ４５４１０：１ ０．２５６
ＣＩ １９１４０：１ ０．０４８
ＣＩ ７７４９１ ２．０４８
Ｃ
本発明の物質 ０．０１〜５％
＜水性ゲル（アイライナー、痩身剤等）の製剤における本発明の物質の使用＞
Ａ
水 ｑｓｐ １００
カルボマー ０．５
ブチレングリコール １５
フェノキシエタノール、メチルパラベン、 ０．５
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
Ｂ
本発明の物質 ０．０１〜１０％
＜本発明の物質を含む製剤の化粧品としての許容性の評価＞
実施例２によって得られた化合物について、これを０．５％キサンタンゲル中に１０％配合して使用し、ウサギにおける眼刺激試験、ラットに１回経口投与した際に異常毒性がないことの確認試験、及び、モルモットにおける感作性試験によって毒性試験を行った。
＜ウサギの皮膚における一次刺激の評価＞
上記製剤を、ウサギ３匹の皮膚に、≪皮膚に対する急性刺激／腐食性≫の研究に関するＯＥＣＤ推奨の方法に従って、希釈せずに０．５ｍｌずつ塗布した。上記物質を、１９８２年２月２１日のフランス共和国の公式機関紙（「ＪＯＲＦ」）で公表された、１９８２年２月１日の決議の中で定義された基準に従って分類した。この試験結果から、試験した製剤は、純粋な状態で希釈せずに使用した場合、９１／３２６のＥＥＣ指令書の意義において、皮膚に対して刺激がないものとして分類されることが分かる。
＜ウサギにおける眼刺激試験＞
上記製剤を純粋な状態で、≪眼に対する急性刺激／腐食性≫の研究に関して１９８７年２月２４日にＯＥＣＤ指令書４０５番によって推奨されている方法に従い、０．１ｍｌを１回でウサギ３匹の眼中に滴下した。この試験の結果から、これらの製剤は、純粋な状態で希釈せずに使用した場合、９１／３２６のＥＥＣ指令書の意義において、眼に対して刺激がないものと考えられる。
＜ラットに１回経口投与した際に異常毒性がないことの確認試験＞
上記製剤を、１９８７年２月２４日のＯＥＣＤ指令書４０１番から着想して化粧品に適用したプロトコールに従って、雄ラット５匹及び雌ラット５匹に、２ｇ／体重１ｋｇの量を１回で経口投与した。ＬＤ０及びＬＤ５０は、２０００ｍｇ／ｋｇを超えることが分かった。従って、試験した製剤は、経口摂取が危険な製剤には分類されない。
＜モルモットにおける潜在的皮膚感作性試験＞
上記製剤に対して、ＯＥＣＤ４０６番の指令書に従ったプロトコールであるＭａｇｎｕｓｓｏｎ−Ｋｌｉｇｍａｎｎ極大試験を行った。これらの製剤は、皮膚との接触において感作性がないものとして分類される。
実施例３１における小型ヤシ抽出物濃度に対するエラスチン遺伝子の転写の割合を示す。

Claims (10)

  1. 皮膚、特に真皮中の活性型ＴＧＦｂ１濃度を増加させる組成物を製造するための、特にＴＧＦｂ１とＬＡＰタンパク質（潜在的にタンパク質に結合している物質）との結合を切断することにより、潜在型ＴＧＦβ−１（ＴＧＦｂ１−Ｌ）を活性型ＴＧＦβ−１（活性型ＴＧＦｂ１）に変換する、化粧品に、皮膚科的に又は医薬品に許容される天然抽出物の少なくとも１種の使用。
  2. 繊維芽細胞の増殖を促進する組成物を製造するための、特にＴＧＦｂ１とＬＡＰタンパク質（潜在的にタンパク質に結合している物質）との結合を切断することにより、ＴＧＦｂ１−Ｌを活性型ＴＧＦｂ１に変換する天然抽出物の少なくとも１種の使用。
  3. 特に、コラーゲン合成の増加、並びに／又は、プロテアーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ）合成の増加、並びに／又は、プロテオグリカン及び／若しくはヒアルロン酸合成の増加、並びに／又は、フィブロネクチンのアイソフォームの発現及び／若しくはフィブロネクチン受容体の合成の増加、並びに／又は、エラスチン合成の増加によって、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成成分の合成を増加させる組成物を製造するための、特にＴＧＦｂ１とＬＡＰタンパク質（潜在的にタンパク質に結合している物質）との結合を切断することにより、ＴＧＦｂ１−Ｌを活性型ＴＧＦｂ１に変換する天然抽出物の少なくとも１種の使用。
  4. 細胞外マトリックスの細胞外タンパク質の有害な活性を阻害する組成物を製造するための、特にＴＧＦｂ１とＬＡＰタンパク質（潜在的にタンパク質に結合している物質）との結合を切断することにより、ＴＧＦｂ１−Ｌを活性型ＴＧＦｂ１に変換する天然抽出物の少なくとも１種の使用。
  5. 抗皺効果又は抗老化効果を有する組成物を製造するための、特にＴＧＦｂ１とＬＡＰタンパク質（潜在的にタンパク質に結合している物質）との結合を切断することにより、ＴＧＦｂ１−Ｌを活性型ＴＧＦｂ１に変換する天然抽出物の少なくとも１種の使用。
  6. 前記抽出物は、大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｏｊａ）抽出物、オート麦（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）抽出物、小型ヤシ（ｄｗａｒｆ ｐａｌｍ）（Ｓｅｒｅｎｏａ ｒｅｐｅｎｓ）抽出物、絹抽出物、トウグワ（Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ）の根の抽出物、スプリングハリシュモク（Ｓｐｒｉｎｇ ｒｅｓｔｈａｒｒｏｗ）（Ｏｎｏｎｉｓ ｓｐｉｎｏｓａ）抽出物、木豆（ｐｉｇｅｏｎ ｂｅａｎ）又は空豆（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ ｅｑｕｉｎａ）抽出物、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）抽出物、魚卵抽出物、エンドウ豆（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）タンパク質抽出物、魚粉、小麦胚芽（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ）抽出物、ナツメヤシ（Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｃｔｉｌｉｆｅｒａ）抽出物、キーウィ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）抽出物、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）抽出物、グレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ ｐａｒａｄｉｓｉ）抽出物、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）抽出物、パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）抽出物、パッションフルーツ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ｅｄｕｌｉｓ）抽出物、スクテラリア（ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ）（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ）抽出物、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）抽出物、リンゴ（Ｍａｌｕｓ ｐｕｍｉｌａ）抽出物、キノア粉末（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａ）抽出物、パセリ根（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）抽出物又はユッカ（Ｙｕｃｃａ ｓｃｈｉｄｉｇｅｒａ）抽出物、及び、これら抽出物の混合物のいずれか１種の中から選択される
    ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
  7. 化粧品に、皮膚科的に及び／又は医薬品に許容される条件下で、特にＴＧＦｂ１とＬＡＰタンパク質（潜在的にタンパク質に結合している物質）との結合を切断することにより、ＴＧＦｂ１−Ｌを活性型ＴＧＦｂ１に変換する、化粧品に、皮膚科的に又は医薬品に許容される天然抽出物。
  8. 大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｏｊａ）抽出物、オート麦（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）抽出物、小型ヤシ（Ｓｅｒｅｎｏａ ｒｅｐｅｎｓ）抽出物、絹抽出物、トウグワ（Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ）の根の抽出物、スプリングハリシュモク（Ｏｎｏｎｉｓ ｓｐｉｎｏｓａ）抽出物、木豆又は空豆（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ ｅｑｕｉｎａ）抽出物、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）抽出物、魚卵抽出物、エンドウ豆（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）タンパク質抽出物、魚粉、小麦胚芽（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ）抽出物、ナツメヤシ（Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｃｔｉｌｉｆｅｒａ）抽出物、キーウィ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）抽出物、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）抽出物、グレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ ｐａｒａｄｉｓｉ）抽出物、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）抽出物、パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）抽出物、パッションフルーツ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ｅｄｕｌｉｓ）抽出物、スクテラリア（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ）抽出物、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）抽出物、リンゴ（Ｍａｌｕｓ ｐｕｍｉｌａ）抽出物、キノア粉末（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａ）抽出物、パセリ根（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）抽出物又はユッカ（Ｙｕｃｃａ ｓｃｈｉｄｉｇｅｒａ）抽出物、及び、これら抽出物の混合物のいずれか１種の中から選択される
    ことを特徴とする請求項７に記載の植物抽出物。
  9. 請求項７又は８に記載の抽出物の少なくとも１種、及び、化粧品に許容される賦形剤を含む
    ことを特徴とする化粧組成物。
  10. 請求項７又は８に記載の抽出物の少なくとも１種、及び、医薬品に許容される賦形剤を含む
    ことを特徴とする局所使用医薬組成物。
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