KR100913917B1 - 신경전달물질 배출을 조절하는 천연물 추출물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 천연물 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경전달물질 배출 조절용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 SNARE 복합체 형성의 저해제로서 신경전달물질 배출을 조절함으로써 SNARE가 관여하는 세포내 반응의 조절제로 유용하다. 본 발명의 SNARE 복합체 형성 저해제는 피부 통증 완화용 조성물로 활용될 수 있다.

천연물 추출물, SNARE, 신경전달물질, 막융합

Description

신경전달물질 배출을 조절하는 천연물 추출물 {Plant Extracts Modulating Neurotransmitter Release}

본 발명은 천연물 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경전달물질 배출 조절용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 SNARE 복합체 형성의 저해제로서 신경전달물질 배출을 조절함으로써 SNARE가 관여하는 세포내 반응의 조절제로 유용하여, 피부 통증 완화용 조성물로 활용될 수 있다.

신경전달물질의 배출 시에 신경전달물질을 담고 있는 시냅스 소포 (synaptic vesicle)는 시냅스전막 (presynaptic membrane)과 융합되어야 두 경계 간의 통로가 형성될 수 있다. 이 때 막융합의 근원적인 힘을 제공하는 단백질은 SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)라고 불리는 3종의 단백질 복합체이다.

시냅스 소포와 시냅스전막 간의 막융합에 의해 신경전달물질 배출 통로가 열리게 되는데 표적 막 (target membrane)에 부착되어 있는 t-SNARE 복합체와 소포 (vesicle)에 부착되어 있는 v-SNARE가 관여한다. t-SNARE는 신탁신 (Syntaxin) 1a라고 하는 단백질과 SNAP-25라고 하는 단백질 2종의 복합체이다. 이들 SNARE 단백 질은 꽈배기처럼 꼬여 있다. 상기 막융합시에는 당분야에 널리 공지되어 있는 지질이중층 (lipid bilayer)의 재배열이 일어나게 된다. 생체막들은 서로 강하게 밀어내고 있으므로 이들 막은 자발적으로 융합되지 않고 외부에서 강한 힘이 주어져 막들간의 반발력을 극복하여야 하는데, 이때 막들간의 반반력을 이겨낼 정도의 강한 힘을 만들어 내는 것이 바로 SNARE 단백질이다. 즉 SNARE 복합체의 형성은 막간 반발력을 극복하는 힘의 원천이며, 신경전달물질의 배출을 포함하는 세포외 배출작용 (exocytosis)의 핵심 현상인 것이다.

한편, 근육의 이완과 수축을 조절하기 위하여 근육의 상층에는 신경근육 접합부 (neuromuscular junction)가 있으며, 이 신경 말단 (nerve terminal)에는 시냅스 소포가 장전되어 있다.

BoNT (Botulinum neurotoxin, 이하 보톡스로 약술함)은 신경전달물질 배출에 관여하는 핵심 단백질인 SNARE 단백질을 절단하는 프로테아제 (protease)이다. 보톡스는 SNARE 단백질을 절단함으로써 신경전달을 차단하고 결과적으로 보톡스가 침투된 근육세포가 마비되도록 한다.

보톡스가 SNARE 단백질을 비가역적으로 절단함으로써 신경의 전달을 차단하는 반면, 소위 "바르는 보톡스"는 SNARE 복합체의 형성을 저해함으로써 신경전달을 방해하는 일종의 "경쟁적 저해제"이다.

"바르는 보톡스"의 핵심 성분은 아르기렐린 (Argireline) 이라고 불리는 헥사펩타이드 (hexapeptide)이며, EEMQRR의 아미노산 서열을 가지고 있다 (참고 문헌: Blanes-Mira et al., International Journal of Cosmetic Science. 24, 303- 310, 2002). 이는 SNAP-25의 N-말단 영역의 아미노산 서열과 일치하는 부위이다. 즉 무손상 (intact) SNAP-25가 결합하여야 할 부위에 작은 헥사펩타이드가 대신 끼어듦으로써 무손상 SNAP-25가 다른 SNARE 단백질인 신탁신 (Syntaxin) 1a 및 VAMP2와 결합하는 것을 방해하는 역할을 하게 된다.

현재 바르는 보톡스 제품의 주성분인 아르기렐린은 효과가 불확실하고, 합성 펩타이드의 특성상 가격적으로 불리하며, 소비자 친화적이지도 않다는 약점을 가지고 있다. 그러나 천연물 추출물을 사용하여 신경전달 억제를 개발하는 것은 펩타이드 소재에 비하여 월등히 저렴한 원료를 제공할 수 있고, 천연물 소재이므로 최종 제품 개발 시 소비자에게 친화적으로 접근 가능하므로 펩타이드 소재에 비해 산업적 응용이 수월한 형태라 사료된다.

본 발명자들은 천연물 추출물을 사용하여 막 융합현상 저해와 SDS-PAGE 상에서 SNARE 복합체 형성을 억제하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 천연물 추출물을 유효 성분으로 포함하는 피부 진통제 또는 피부 통증 완화 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 천연에서 자생하는 식물들을 대상으로 우수한 SNARE 복합체 형성 조절제를 개발하고자 연구를 거듭한 결과, 천연물 중 개서어나무, 굴피나무, 기린초, 나도밤나무, 다릅나무, 딱지꽃, 말오줌때, 모시풀, 물양지 꽃, 바위수국, 밤나무, 보리수 나무, 복분자 딸기, 붉나무, 비목나무, 산딸기, 산딸나무, 아까시나무, 호두나무로부터 얻은 추출물이 신경 전달 경로에 관여하는 SNARE 복합체 형성을 저해함을 발견하였다.

본 발명에서는 효능검정 대상인 천연물(표 1) 중 신경전달물질 배출 조절에 가장 효능이 뛰어난 19종의 천연물을 다음과 같이 선정하였다. 개서어나무(학명: Carpinus tschonoskii)는 자작나무과(Betulaceae)의 식물로 잎과 꽃 부위를, 굴피나무(학명:Platycarya strobilacea)는 가래나무과(Juglandaceae)로 화서부위를, 기린초(학명: Sedum kamtschaticum)는 돌나물과(Crassulaceae)로 전초부위를, 나도밤나무(학명: Meliosma myriantha)는 나도밤나무과(Sabiaceae)로 화서부위를, 다릅나무는(학명:Maackia amurensis) 콩과(Leguminosae)로 잎 부분을, 딱지꽃(학명:Potentilla chinensis)은 장미과(Rosaceae)로 전초를, 말오줌때(학명: Euscaphis japonica)는 고추나무과(Staphyleaceae)로 줄기와 수피 부분을, 모시풀 (학명:Boehmeria nivea )은 쐐기풀과 (Urticaceae)로 지하부를, 물양지꽃(학명: Potentilla cryptotaeniae)은 장미과(Rosaceae)로 전초를, 바위수국(학명: Schizophragma)은 범의귀과(Saxifragaceae)로 잎을, 밤나무(학명: Castanea crenata)는 참나무과(Fagaceae) 식물로 꽃을, 보리수나무(학명: Elaeagnus umbellata)는 보리수나무과 (Elaeagnaceae)로 줄기, 잎 부위를, 복분자 딸기(학명:Rubus coreanus)는 장미과 (Rosaceae)로 잎, 줄기부위를, 붉나무(Rhus chinensis)는 옻나무과(Anacardiaceae)로 잎, 줄기부위를, 비목나무(Lindera erythrocarpa)는 녹나무과(Lauraceae)로 잎, 줄기 부위를, 산딸기(Rubus crataegifolius)는 장미과(Rosaceae)로 잎, 줄기 부위를, 산딸나무(Cornus kousa)는 층층나무과(Cornaceae)로 줄기, 수피부위를, 아까시나무(Robinia pseudo -accacia)는 콩과(Leguminosa)로 잎, 줄기 부위를, 호두나무(학명: Juglans sinensis)는 가래나무과(Juglandaceae)로 줄기, 수피를 사용하였다.

본 발명의 천연물 추출물의 제조 방법은 다음과 같다. 구입한 천연물 (100g)에 무수 메탄올 1000ml를 가하여 환류 냉각기가 달린 추출기 (모델명:HB 4 basic, 제조사:IKA)를 사용하여 80℃에서 2시간 동안 가온추출하였다. 추출물을 Whatman No.2여지로 여과한 후 남은 잔사물 (Residue)을 위와 동일한 방법으로 1회 이상 더 추출하고, 얻은 추출액을 합하여 감압농축(모델명:Rotavapor, 제조사:Buchi, 온도: 40℃)한 후 동결건조하여 건조 추출물을 수득하였다. 이러한 방법으로 제조된 천연물 중 개서어나무, 굴피나무, 기린초, 나도밤나무, 다릅나무, 딱지꽃, 말오줌때, 모시풀, 물양지 꽃, 바위수국, 밤나무, 보리수 나무, 복분자 딸 기, 붉나무, 비목나무, 산딸기, 산딸나무, 아까시나무, 호두나무 추출물이 신경 전달 경로에 관여하는 SNARE 복합체 형성을 저해함을 확인하였다.

본 발명의 조성물은 상기 제조방법에 따라 수득한 천연물 추출물을 포함한다.

본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.001 내지 50 % 중량으로 포함한다.

본 발명의 천연물 추출물 조성물은 유효 성분으로서 본 명세서에 기재한 천연물 추출물 이외에 화장료 또는 약제에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 천연물 추출물 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예컨대 약학조성물을 위해 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 화장료 조성물을 위해 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있지만 이에 제한되지 아니한다.

본 발명의 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에 이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있지만 이에 제한되지 아니한다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토오스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 아니한다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있지만 이에 제한되지 아니한다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등 이 이용될 수 있지만 이에 제한되지 아니한다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도벤타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있지만 이에 제한되지 아니한다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 천연물 추출물 조성물은 SNARE 복합체 형성의 저해제로서 신경전달물질 배출을 조절함으로써 SNARE가 관여하는 세포내 반응의 조절제로 유용하다. 본 발명의 SNARE 복합체 형성 저해제는 주름개선용, 피부 통증 완화용 조성물로 활용될 수 있다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 기술분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하고자 하는 것으로, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명에 개시된 모든 문헌은 참조로서 통합된다.

실시예

실시예 1: 개서어나무로부터 천연물 추출물의 제조

개서어나무 [학명: Carpinus tschonoskii, 자작나무과(Betulaceae)] 잎과 꽃을 한국식물추출물은행 (Plant Extract Bank, 대한민국 대전)에서 구입하였다. 구입한 개서어나무(100g)를 정제수로 세척하고 건조한 다음에 무수 메탄올 1000ml를 가하여 환류 냉각기가 달린 추출기(모델명:HB 4 basic, 제조사:IKA)를 사용하여 80℃에서 2시간 동안 가온추출하였다. 추출물을 Whatman No.2여지로 여과한 후 남은 잔사물(Residue)을 위와 동일한 방법으로 1회 이상 더 추출하고, 여과된 추출액을 합하여 감압농축(모델명:Rotavapor, 제조사:Buchi, 온도:40℃)한 후 동결건조(모델명:FD5518, 제조사:본듸로, 온도:-45℃, 압력:50 mTorr)하여 건조 추출물을 수득하였다(수율: 12.63%).

실시예 2 내지 실시예 100: 나머지 천연물들로부터의 추출물 제조

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 추출하되, 하기 표 1에 기재한 천연물들로부터 추출하였다.

표 1. 실시예 2-100에 사용한 천연물

실시예 번호	국 명	학 명	부 위	FAMILY	과 명	추출수율 (%)
2	개나리	Forsythia koreana	줄기	Oleaceae	물푸레나무과	11.40
3	개망초	Erigeron annuus	전초	Compositae	국화과	8.49
4	개머루	Ampelopsis brevipedunculata var. heterophylla	잎	Vitaceae	포도과	8.54
5	개서어나무	Carpinus tschonoskii	잎,꽃	Betulaceae	자작나무과	12.63
6	개서어나무	Carpinus tschonoskii	줄기-수피	Betulaceae	자작나무과	-
7	개옻나무	Rhus trichocarpa	종자	Anacardiaceae	옻나무과	6.30
8	개키버들	Salix purpurea var. multinervis	잎,줄기	Salicaceae	버드나무과	10.01
9	개키버들	Salix purpurea var. multinervis	화서	Salicaceae	버드나무과	6.27
10	검정말	Hydrilla verticillata	전초	Hydrocharitaceae	자라풀과	4.36
11	고욤나무	Diospyros lotus	열매	Ebenaceae	감나무과	9.46
12	국수나무	Stephanandra incisa	줄기	Rosaceae	장미과	5.80
13	굴피나무	Platycarya strobilacea	화서	Juglandaceae	가래나무과	20.15
14	금낭화	Dicentra spectabilis	전초	Fumariaceae	현호색과	6.20
15	기린초	Sedum kamtschaticum	전초	Crassulaceae	돌나물과	11.91
16	나도물통이	Nanocnide japonica	전초	Urticaceae	쐐기풀과	5.61
17	나도밤나무	Meliosma myriantha	화서	Sabiaceae	나도밤나무과	6.63
18	나도승마	Kirengeshoma koreana	잎,줄기	Saxifragaceae	범의귀과	5.77
19	노박덩굴	Celastrus orbiculatus	잎	Celastraceae	노박덩굴과	7.86
20	누리장나무	Clerodendrum trichotomum	잎,줄기,꽃	Verbenaceae	마편초과	4.78
21	눈갯버들	Salix graciliglans	잎,줄기	Salicaceae	버드나무과	8.01
22	눈갯버들	Salix graciliglans	화서	Salicaceae	버드나무과	7.86
23	다릅나무	Maackia amurensis	잎	Leguminosae	콩과	10.24
24	다릅나무	Maackia amurensis	줄기-수피	Leguminosae	콩과	3.52
25	닥나무	Broussonetia kazinoki	잎,줄기	Moraceae	뽕나무과	5.48
26	달맞이꽃	Oenothera odorata	전초	Onagraceae	바늘꽃과	5.58
27	당단풍	Acer pseudo - sibolianum	잎	Aceraceae	단풍나무과	13.86
28	당단풍	Acer pseudo - sibolianum	줄기-수피	Aceraceae	단풍나무과	3.15
29	대가래	Potamogeton malaianus var. latifolius	전초	Potamogetonaceae	가래과	4.31

표 1. (계속)

30	대팻집나무	Ilex macropoda	잎,줄기	Aquifoliaceae	감탕나무과	8.95
31	대팻집나무	Ilex macropoda	줄기-수피	Aquifoliaceae	감탕나무과	7.78
32	독활	Aralia continentalis	전초	Araliaceae	두릅나무과	6.32
33	돌배나무	Pyrus pyrifolia	잎,줄기	Rosaceae	장미과	9.90
34	동자꽃	Lychnis cognata	전초	Caryophyllaceae	석죽과	6.45
35	둥근배암차즈기	Salvia japonica	지상부	Labiatae	꿀풀과	3.20
36	딱지꽃	Potentilla chinensis	전초	Rosaceae	장미과	7.28
37	딱총나무	Sambucus williamsii var. coreana	잎,줄기	Caprifoliaceae	인동과	10.09
38	땅비싸리	Indigofera kirilowi	지상부	Leguminosae	콩과	4.17
39	떡쑥	Gnaphalium affine	전초	Compositae	국화과	4.06
40	뚱딴지	Helianthus tuberosus	전초	Compositae	국화과	6.41
41	만삼	Codonopsis pilosula	지상부	Campanulaceae	초롱꽃과	6.72
42	말오줌때	Euscaphis japonica	줄기-수피	Staphyleaceae	고추나무과	9.53
43	머위	Petasites japonicus	전초	Compositae	국화과	10.75
44	명아주	Chenopodium album var. centrorubrum	지상부	Chenopodiaceae	명아주과	7.49
45	모시풀	Boehmeria nivea	지하부	Urticaceae	쐐기풀과	5.34
46	물봉선	Impatiens textori	전초	Balsaminaceae	봉선화과	3.77
47	물양지꽃	Potentilla cryptotaeniae	전초	Rosaceae	장미과	5.55
48	미역줄나무	Tripterygium regelii	잎,줄기	Celastraceae	노박덩굴과	11.50
49	바위구절초	Chrysanthemum zawadskii var. alpinum	지상부	Compositae	국화과	6.76
50	바위수국	Schizophragma hydrangeoides	잎	Saxifragaceae	범의귀과	4.42
51	바위채송화	Sedum polystichoides	전초	Crassulaceae	돌나물과	8.84
52	박주가리	Metaplexis japonica	전초	Asclepiadaceae	박주가리과	8.98
53	밤나무	Castanea crenata	꽃	Fagaceae	참나무과	10.24
54	배초향	Agastache rugosa	지상부	Labiatae	꿀풀과	3.68
55	버드나무	Salix koreensis	줄기-수피	Salicaceae	버드나무과	13.24
56	벚나무	Prunus serrulata var. spontanea	줄기-수피	Rosaceae	장미과	6.41
57	벽오동	Firmiana simplex	줄기-수피	Sterculiaceae	벽오동과	6.69
58	보리수나무	Elaeagnus umbellata	잎,줄기	Elaeagnaceae	보리수나무과	4.36
59	복분자딸기	Rubus coreanus	잎,줄기	Rosaceae	장미과	7.43
60	붉나무	Rhus chinensis	잎,줄기	Anacardiaceae	옻나무과	12.37
61	비목나무	Lindera erythrocarpa	잎,줄기	Lauraceae	녹나무과	5.55
62	비수리	Lespedeza cuneata	전초	Leguminosae	콩과	6.70

표 1. (계속)

63	산가막살나무	Viburnum wrightii	잎,줄기,꽃	Caprifoliaceae	인동과	8.60
64	산괴불주머니	Corydalis speciosa	전초	Fumariaceae	현호색과	12.48
65	산딸기	Rubus crataegifolius	잎,줄기	Rosaceae	장미과	9.83
66	산딸나무	Cornus kousa	잎	Cornaceae	층층나무과	10.26
67	산딸나무	Cornus kousa	줄기-수피	Cornaceae	층층나무과	4.10
68	산수국	Hydrangea serrata for. acuminata	전초	Saxifragaceae	범의귀과	9.52
69	상수리나무	Quercus acutissima	줄기-수피	Fagaceae	참나무과	5.33
70	신나무	Acer ginnala	잎,줄기	Aceraceae	단풍나무과	23.18
71	아그배나무	Malus sieboldii	잎,줄기,꽃	Rosaceae	장미과	10.34
72	아까시나무	Robinia pseudo - accacia	잎,줄기	Leguminosae	콩과	5.20
73	애기똥풀	Chelidonium majus var. asiaticum	전초	Papaveraceae	양귀비과	3.84
74	얼치기완두	Vicia tetrasperma	전초	Leguminosae	콩과	11.40
75	익모초	Leonurus sibiricus	전초	Labiatae	꿀풀과	3.98
76	일본목련	Magnolia obovata	잎	Magnoliaceae	목련과	4.42
77	일본잎갈나무	Larix leptolepis	줄기-수피	Pinaceae	소나무과	15.56
78	장구채	Melandryum firmum	전초	Caryophyllaceae	석죽과	8.82
79	조팝나무	Spiraea prunifolia var. simpliciflora	잎,줄기,꽃	Rosaceae	장미과	8.69
80	족제비싸리	Amorpha fruticosa	잎,줄기	Leguminosae	콩과	7.09
81	졸방제비꽃	Viola acuminata	전초	Violaceae	제비꽃과	14.82
82	줄딸기	Rubus oldhamii	잎,줄기,열매	Rosaceae	장미과	6.15
83	쥐오줌풀	Valeriana fauriei	전초	Valerianaceae	마타리과	6.75
84	지칭개	Hemistepta lyrata	전초	Compositae	국화과	10.69
85	짚신나물	Agrimonia pilosa	전초	Rosaceae	장미과	15.53
86	찔레꽃	Rosa multiflora	잎,줄기	Rosaceae	장미과	7.74
87	참빗살나무	Euonymus sieboldiana	잎,줄기	Celastraceae	노박덩굴과	4.28
88	철쭉	Rhododendron schlippenbachii	잎,줄기	Ericaceae	진달래과	8.63
89	초피나무	Zanthoxylum piperitum	잎,줄기	Rutaceae	운향과	7.69
90	층층이꽃	Clinopodium chinense var. parviflorum	전초	Labiatae	꿀풀과	15.76
91	팥배나무	Sorbus alnifolia	잎,줄기	Rosaceae	장미과	15.05
92	푼지나무	Celastrus flagellaris	잎,줄기	Celastraceae	노박덩굴과	6.66
93	풀싸리	Lespedeza thunbergii var. intermedia	잎,줄기	Leguminosae	콩과	6.33

표 1. (계속)

94	풍선덩굴	Cardiospermum halicacabum	전초	Sapindaceae	무환자나무과	6.35
95	호두나무	Juglans sinensis	줄기-수피	Juglandaceae	가래나무과	14.33
96	호랑버들	Salix hultenii	잎,줄기	Salicaceae	버드나무과	6.08
97	화살나무	Euonymus alatus	잎,줄기	Celastraceae	노박덩굴과	5.76
98	환삼덩굴	Humulus japonicus	전초	Cannabinaceae	삼과	5.54
99	회솔나무	Taxus cuspidata var. latifolia	잎	Taxaceae	주목과	17.16
100	회솔나무	Taxus cuspidata var. latifolia	줄기	Taxaceae	주목과	5.72

상기 실시예 1 내지 실시예 100에 따른 방법으로 제조된 천연물 중 개서어나무, 굴피나무, 기린초, 나도밤나무, 다릅나무, 말오줌때, 모시풀, 물양지 꽃, 바위수국, 밤나무, 보리수 나무, 복분자 딸기, 붉나무, 비목나무, 산딸기, 산딸나무, 아까시나무, 호두나무 추출물이 신경 전달 경로에 관여하는 SNARE 복합체 형성을 저해함을 확인하였다.

실험예 1: 막융합 저해 효과

막융합현상 저해제를 탐색하기 위해, 상기 실시예 1 내지 실시예 100에서 수득한 추출물에 대해 막융합 저해 효과를 시험하였다.

SNARE 단백질들을 생산하기 위해 생물학 기법으로 형질전환된 대장균 (E.coli Codon (+) RIL, Novagen)으로부터 각각 SNAP25 (NM011428), Syntaxin 1a (AF217197) 및 VAMP2 (NM012663)라 불리는 SNARE단백질들을 정제하였다. 우선 형광물질이 표지된 미세한 피막입자인 라이포좀(liposome)을 만들기 위해 POPC(62mol%), DOPS(35mole%), NBD-PS(1.5mol%) 및 형광물질인 로다민(Rhodamin- PE, 1.5mol%)을 혼합하여 10mM 라이포좀(v-vesicle)을 만들었고, 형광물질이 표지되지 않은 라이포좀을 만들기 위해 DOPS와 POPC를 몰농도가 35:65가 되도록 혼합하여 50mM 라이포좀(t-vesicle)을 만들었다. 정제된 SNAP25와 Syntaxin 1a로 구성된 복합체를 만들기 위해 몰농도가 1:1이 되도록 혼합하여 실온에서 1시간 반응시킨 후 형광물질이 표지되지 않은 라이포좀과 몰비율이 100:1이 되도록 혼합하였고, VAMP2는 형광물질이 들어있는 라이포좀과 몰비율이 50:1로 결합시켰다. 그리고 나서 상기 두 종류의 라이포좀은 10 KDa 투석막을 이용하여 4℃에서 24시간 교반 하면서 투석과정을 거친 후 3:7 (v-vesicle:t-visicle)의 비율로 섞어 형광강도 측정기기 (모델명: SpectraMax M2, 제조사: Molecular Device)를 이용하여 형광강도를 측정하였다. 결과를 도 1 에 도시하였다.

도 1에서 형광강도는 SNARE 단백질간의 막 융합 현상을 의미하기 때문에, 형광강도가 낮다는 것은 그 만큼 막융합 저해 효과가 우수함을 나타낸다.

빨간색 원형은 대조구 반응 (control reaction)이 진행되는 경로이며, 추출물 대신 메탄올만 첨가되었을 때에는 최대 형광 강도 (fluorescence intensity)의 60% 정도까지 진행되었으며, 추출물의 대부분은 거의 대조구와 유사한 반응 경로를 따랐다.

도 1은 천연물 추출물에 의한 막 융합현상 저해제를 탐색하기 위하여 일부 천연물 추출물을 대상으로 실험한 결과를 보여주고 있다. 실험에 사용된 굴피나무(13), 기린초(15), 딱지꽃(36), 말오줌때(42), 밤나무꽃(53), 산딸기(65), 산딸나무(67), 호두나무(95)는 막 융합을 저하시키는 효과가 인정되었다. 이외에도 개 서어나무, 나도밤나무, 다릅나무, 모시풀, 물양지 꽃, 바위수국, 보리수 나무, 복분자 딸기, 붉나무, 비목나무, 산딸기, 아까시나무 추출물이 막 융합현상을 저해하는 효과를 나타내었다.

각종 추출물의 막융합 저해 효과를 아래 표 2에 정리하였다. 대조구의 반응인 약 43%를 기준으로 표시하였으며, 30~60%를 보이는 추출물은 효과가 미미한 것으로 간주하였을 때 개서어나무, 굴피나무, 기린초, 나도밤나무, 다릅나무, 딱지꽃, 말오줌때, 모시풀, 물양지 꽃, 바위수국, 밤나무, 보리수 나무, 복분자 딸기, 붉나무, 비목나무, 산딸기, 산딸나무, 아까시나무, 호두나무 추출물 (19종)이 효과적이었다.

표 2. 식물추출물의 막융합 저해 효과

실시예 번호	국 명	학 명	부 위	% Maximum
0	Control	DDW		42.9
1	가시오갈피	Acanthopanax senticosus	열매	35.7
2	개나리	Forsythia koreana	줄기	40.4
3	개망초	Erigeron annuus	전초	39.5
4	개머루	Ampelopsis brevipedunculata var. heterophylla	잎	45.5
5	개서어나무	Carpinus tschonoskii	잎,꽃	45.8
6	개서어나무	Carpinus tschonoskii	줄기-수피	25.9
7	개옻나무	Rhus trichocarpa	종자	32.5
8	개키버들	Salix purpurea var. multinervis	잎,줄기	35.7
9	개키버들	Salix purpurea var. multinervis	화서	39.9
10	검정말	Hydrilla verticillata	전초	72.1
11	고욤나무	Diospyros lotus	열매	34.6
12	국수나무	Stephanandra incisa	줄기	35.6
13	굴피나무	Platycarya strobilacea	화서	23.3
14	금낭화	Dicentra spectabilis	전초	47.7
15	기린초	Sedum kamtschaticum	전초	24.7
16	나도물통이	Nanocnide japonica	전초	64.6
17	나도밤나무	Meliosma myriantha	화서	30.0
18	나도승마	Kirengeshoma koreana	잎,줄기	100.0
19	노박덩굴	Celastrus orbiculatus	잎	49.6
20	누리장나무	Clerodendrum trichotomum	잎,줄기,꽃	97.4
21	눈갯버들	Salix graciliglans	잎,줄기	35.6
22	눈갯버들	Salix graciliglans	화서	39.4
23	다릅나무	Maackia amurensis	잎	29.9
24	다릅나무	Maackia amurensis	줄기-수피	32.9
25	닥나무	Broussonetia kazinoki	잎,줄기	53.1
26	달맞이꽃	Oenothera odorata	전초	41.5
27	당단풍	Acer pseudo - sibolianum	잎	34.5
28	당단풍	Acer pseudo - sibolianum	줄기-수피	40.3
29	대가래	Potamogeton malaianus var. latifolius	전초	100.0

표 2. (계속)

30	대팻집나무	Ilex macropoda	잎,줄기	65.6
31	대팻집나무	Ilex macropoda	줄기-수피	40.3
32	독활	Aralia continentalis	전초	47.4
33	돌배나무	Pyrus pyrifolia	잎,줄기	35.2
34	동자꽃	Lychnis cognata	전초	80.0
35	둥근배암차즈기	Salvia japonica	지상부	73.8
36	딱지꽃	Potentilla chinensis	전초	31.9
37	딱총나무	Sambucus williamsii var. coreana	잎,줄기	43.3
38	땅비싸리	Indigofera kirilowi	지상부	42.4
39	떡쑥	Gnaphalium affine	전초	46.1
40	뚱딴지	Helianthus tuberosus	전초	81.5
41	만삼	Codonopsis pilosula	지상부	55.5
42	말오줌때	Euscaphis japonica	줄기-수피	-7.0
43	머위	Petasites japonicus	전초	42.1
44	명아주	Chenopodium album var. centrorubrum	지상부	50.5
45	모시풀	Boehmeria nivea	지하부	28.3
46	물봉선	Impatiens textori	전초	100.0
47	물양지꽃	Potentilla cryptotaeniae	전초	22.1
48	미역줄나무	Tripterygium regelii	잎,줄기	48.9
49	바위구절초	Chrysanthemum zawadskii var. alpinum	지상부	54.3
50	바위수국	Schizophragma hydrangeoides	잎	-66.1
51	바위채송화	Sedum polystichoides	전초	32.0
52	박주가리	Metaplexis japonica	전초	47.2
53	밤나무	Castanea crenata	꽃	-41.2
54	배초향	Agastache rugosa	지상부	59.0
55	버드나무	Salix koreensis	줄기-수피	35.0
56	벚나무	Prunus serrulata var. spontanea	줄기-수피	37.8
57	벽오동	Firmiana simplex	줄기-수피	39.1
58	보리수나무	Elaeagnus umbellata	잎,줄기	-1.3
59	복분자딸기	Rubus coreanus	잎,줄기	6.3
60	붉나무	Rhus chinensis	잎,줄기	28.1
61	비목나무	Lindera erythrocarpa	잎,줄기	28.9
62	비수리	Lespedeza cuneata	전초	41.2
63	산가막살나무	Viburnum wrightii	잎,줄기,꽃	43.8
64	산괴불주머니	Corydalis speciosa	전초	71.9

표 2. (계속)

65	산딸기	Rubus crataegifolius	잎,줄기	15.3
66	산딸나무	Cornus kousa	잎	41.1
67	산딸나무	Cornus kousa	줄기-수피	19.8
68	산수국	Hydrangea serrata for. acuminata	전초	46.3
69	상수리나무	Quercus acutissima	줄기-수피	32.4
70	신나무	Acer ginnala	잎,줄기	42.8
71	아그배나무	Malus sieboldii	잎,줄기,꽃	30.1
72	아까시나무	Robinia pseudo - accacia	잎,줄기	19.2
73	애기똥풀	Chelidonium majus var. asiaticum	전초	35.7
74	얼치기완두	Vicia tetrasperma	전초	78.3
75	익모초	Leonurus sibiricus	전초	39.9
76	일본목련	Magnolia obovata	잎	100.0
77	일본잎갈나무	Larix leptolepis	줄기-수피	35.7
78	장구채	Melandryum firmum	전초	55.6
79	조팝나무	Spiraea prunifolia var. simpliciflora	잎,줄기,꽃	42.5
80	족제비싸리	Amorpha fruticosa	잎,줄기	36.1
81	졸방제비꽃	Viola acuminata	전초	55.2
82	줄딸기	Rubus oldhamii	잎,줄기,열매	49.7
83	쥐오줌풀	Valeriana fauriei	전초	40.8
84	지칭개	Hemistepta lyrata	전초	48.3
85	짚신나물	Agrimonia pilosa	전초	34.2
86	찔레꽃	Rosa multiflora	잎,줄기	32.6
87	참빗살나무	Euonymus sieboldiana	잎,줄기	71.6
88	철쭉	Rhododendron schlippenbachii	잎,줄기	36.8
89	초피나무	Zanthoxylum piperitum	잎,줄기	56.6
90	층층이꽃	Clinopodium chinense var. parviflorum	전초	40.1
91	팥배나무	Sorbus alnifolia	잎,줄기	36.7
92	푼지나무	Celastrus flagellaris	잎,줄기	37.1
93	풀싸리	Lespedeza thunbergii var. intermedia	잎,줄기	58.1
94	풍선덩굴	Cardiospermum halicacabum	전초	47.1
95	호두나무	Juglans sinensis	줄기-수피	27.0
96	호랑버들	Salix hultenii	잎,줄기	39.9
97	화살나무	Euonymus alatus	잎,줄기	45.0

표 2. (계속)

98	환삼덩굴	Humulus japonicus	전초	48.8
99	회솔나무	Taxus cuspidata var. latifolia	잎	49.9
100	회솔나무	Taxus cuspidata var. latifolia	줄기	41.5

실험예 2: SDS - PAGE

SNARE 복합체는 SDS에 의하여 풀어지지 않을 정도로 강한 복합체 (complex)를 형성한다. 이러한 성질을 이용하여, SNARE 복합체 형성 여부를 확인하기 위해, SDS-PAGE를 수행하였다.

상기 실험예 1에서와 동일한 방법으로 형질전환된 대장균에서 정제한 SNARE 단백질인 SNAP25, syntaxin 1a와 VAMP2 단백질을 각각 1:1:1의 몰농도 (40 μM)로 혼합했을 경우 형성되는 복합체를 천연물 추출물의 첨가에 의해 억제되는지를 확인하였다. 각각의 단백질 10 ul을 1ml 튜브에 일정한 간격으로 점적한 후 천연물 추출물 2 ul을 넣고 vortex를 사용하여 재빨리 혼합한 다음 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응이 종료되면 12% SDS-PAGE상에서 전기영동하여 SNARE 복합체 형성여부를 확인하였다. 결과를 도 2에 도시하였다.

도 2의 상단 숫자는 표 2의 일련번호이며, 하단 숫자는 융합 어세이의 결과와 비교 용이하도록 제시한 것이다.

그 결과 (도 2 참조)는 도 1의 실험결과와 일부 일치하지 않는 것도 있었으나 굴피나무(13), 기린초(15), 나도밤나무(17), 딱지꽃(36), 말오줌때(42), 밤나무(53), 산딸나무(67), 호두나무(95), 복분자딸기(59) 등의 추출물은 SNARE 복합체 형성을 저해하였다.

도 3은 상기 도 2의 결과에서 SNARE 복합체 형성을 저해한 기린초(15), 밤나무꽃(53), 산딸기(65) 추출물을 대상으로 농도별 SNARE 복합체 저해 효과를 측정하였다. 이들 추출물들은 농도 의존적으로 SNARE 복합체를 효과적으로 저해하는 것이 확인되었다.

도 4는 상기의 천연물 추출법과 동일하게 적용하여 기린초를 물, 에탄올 또는 헥산을 사용하여 각각 추출한 추출물에 대한 SNARE 복합체 형성저해 효과를 측정하였다. 실험결과, 기린초의 물과 에탄올 추출물은 SNARE 복합체를 효과적으로 저해하는 것이 확인되었다. 이외에도 개서어나무, 굴피나무, 나도밤나무, 다릅나무, 딱지꽃, 말오줌때, 모시풀, 물양지 꽃, 바위수국, 밤나무, 보리수 나무, 복분자 딸기, 붉나무, 비목나무, 산딸기, 산딸나무, 아까시나무, 호두나무 의 물과 에탄올 추출물이 신경 전달 경로에 관여하는 SNARE 복합체 형성을 저해함을 확인하였다.

실험예 3: 주름개선 효과

실험예 3은 주름완화 측정실험을 행하였다. 각 제조예 별로 20-40세 20명을 대상으로 1일 2회 비교제조예 2와 제조예 3을 눈주위에 도포한 후, 눈주위 부위를 측정대상으로 하였다. 실리콘고무(Silflo사)를 이용하여 레플리카를 제작 하고 0, 30, 60일 되는 당일에 Skin Visiometer(C+ K사)를 이용하여 영상 분석을 실시하였다. 평가방법은 주름이 확실 히 개선(1), 약간의 주름개선(2), 주름개선 없음(3)의 3가지 주름 측정치를 기준으로 하였다. 천연물 추출물 중 기린초 메탄올 추출물에 대한 그 결과를 표 3에 나타내었다. 또한 도 5는 눈주위 부위의 주름 완화 정도를 사진으로 확인한 결과이다.

표 3

제제예	주름완화 (1)	약간의 주름완화 (2)	효과없음 (3)
제제 1	5	10	5
제제 2	5	8	7

제제예 1.

말오줌때 추출물을 함유한 화장료중 화장수(스킨 로션)의 제제예는 다음과 같다.

1. 말오줌때 추출물 0.5-2.5

2. 글리세린 3.0

3. 부틸렌 글리콜 2.0

4. 프로필렌 글리콜 2.0

5. 폴리옥시에칠렌(60)경화 피마자유 1.0

6. 에탄올 10.0

7. 트리에탄올아민 0.1

8. 방부제 미량

9. 색소 미량

10. 향료 미량

11. 정제수 잔량

〈제조방법〉

11번에 2,3,4,8번을 순서대로 투입하여 교반하여 용해시킨 후 5번을 60℃정 도 가열하여 용해시킨후 10번을 투입 교반하여 11번에 투입한다. 마지막으로 1,6,7,9번을 투입하여 충분히 교반한 뒤 숙성시킨다.

제제예 2.

말오줌때 추출물이 함입된 입자를 함유한 화장료중 영양로숀의 제제예는 다음과 같다.

1. 말오줌때 추출물 0.5-2.5

2. 밀납 1.0

3. 폴리솔베이트 60 1.5

4. 솔비탄세스퀴올레이트 0.5

5. 유동파라핀 5.0

6. 스쿠알란 5.0

7. 소르비탄 스테아레이트 1.00

8. 글리세릴 스테아레이트/피이지-400 스테아레이트 1.00

9. 친유성 모노스테아린산 글리세린 0.50

10. 스테아린산 1.50

11. 부틸렌글리콜 5.00

12. 프로필렌글리콜 5.00

13. 카르복시비닐폴리머 0.1

14. 트리에탄올아민 0.2

15. 방부제 미량

16. 색소 미량

17. 향료 미량

18. 정제수 잔량

〈제조방법〉

11,12,13,15,18를 혼합교반하면서 80∼85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 유화기를 작용시키고 2,3,4,5,6,7,8,9,10,14를 80∼85℃ 사이로 가열하여 투입한 뒤 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃ 까지 냉각한 뒤 17번을 투입하고 45℃ 까지 냉각한 뒤 16번을 투입하고 35℃ 에 1번을 투입하여 25℃ 까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.

상기 조성비는 화장료 조성물에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

도 1은 본 발명의 천연물 추출물로부터 SNARE 복합체 (complex) 형성 저해제를 탐색하기 위한 막 융합현상 (membrane fusion assay) 저해의 결과를 도시한 것이다. 도 1에서 빨간색 원형은 대조구 반응 (control reaction)이 진행되는 경로를 나타낸다.

도 2는 본 발명의 천연물 추출물의 SNARE 복합체 형성 저해능을 알아보기 위한 SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacryamide gel electrophoresis) 분석 결과를 도시한 것이다. 겔 (gel) 사진 상단의 숫자는 표 2의 일련번호이며, 하단의 숫자는 융합 어세이 (fusion assay) 결과와 용이하게 비교하기 위해 제시한 것이다.

도 3은 본 발명의 기린초 (15), 밤나무꽃 (53), 산딸기 (65) 추출물의 농도별 SNARE 복합체 형성 저해 효과를 측정한 결과를 도시한 것이다.

도 4는 본 발명의 천연물 용매별 추출물 (기린초를 물, 에탄올 또는 헥산을 사용하여 추출)의 SNARE 복합체 형성 저해능을 알아보기 위한 SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacryamide gel electrophoresis) 분석 결과를 도시한 것이다.

도 5는 제형된 주름개선 화장품을 사용했을 때의 주름개선 효과를 나타내는 사진이다.

Claims (1)

1. 개서어나무의 줄기; 나도밤나무의 화서; 모시풀의 지하부; 바위수국의 잎; 밤나무의 꽃; 다릅나무의 잎 및 줄기; 산딸나무의 줄기 및 아까시나무의 잎 및 줄기로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 천연물로부터 추출된 추출물을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 피부 통증 완화용 약학 조성물.

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