KR102169116B1

KR102169116B1 - 신경전달물질 분비 억제 조성물

Info

Publication number: KR102169116B1
Application number: KR1020200002573A
Authority: KR
Inventors: 황우선; 김윤선; 진무현; 강내규
Original assignee: 주식회사 엘지생활건강
Priority date: 2019-02-22
Filing date: 2020-01-08
Publication date: 2020-10-22
Also published as: CN113498348B; CN113498348A; KR20200119779A; KR20200102920A

Abstract

본 발명은 신경의 막 전위 생성 억제를 통한 신경전달물질 분비 억제 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 스네어(SNARE) 복합체 형성 억제와 관련된 시너지 효과를 가짐으로써, 신경전달물질을 활성적으로 분비할 수 없도록 하며, 따라서 근육 수축이 덜 일어나게 하여 피부 주름을 개선하는 효과를 나타낼 수 있다.

Description

신경전달물질 분비 억제 조성물{Composition for inhibiting neurotransmitter secretion}

본 발명은 신경의 막 전위 생성 억제를 통한 신경전달물질 분비 억제 조성물 및 이를 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

노화는 시간이 흐름에 따라 신체 기능 및 능력이 퇴화하는 현상으로, 인간을 비롯한 대부분의 생물체에서 나타나는 보편적인 현상이다. 피부 주름의 증가는 노화에 따라 나타나는 외부적 변화 중에서도 눈에 띄는 변화 중 하나이다. 노화에 따라 얼굴 및 몸 전반에 걸쳐서 주름이 증가하게 되는데, 주름의 형성에는 노화뿐 만 아니라 피부 수분도, 자외선 노출 정도, 근육의 반복적인 움직임 등이 관여한다. 근육을 많이 움직이는 미간, 눈가, 입 주변 등에 깊은 주름이 생기는 경우가 많으며, 반복적인 근육의 움직임 또는 표정에 의해 생성되는 주름을 표정 주름이라고 한다.

보툴리눔 독소(Botulinum toxin)는 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 균이 생성하는 신경 독성 단백질이다. 보툴리눔 독소는 신경근 접합부에 작용하여 신경세포에서 신경전달물질인 아세틸콜린의 분비를 억제하여 근육을 마비시키는 역할을 한다. 신경세포에서 아세틸콜린이 분비되기 위해서는 축삭돌기 말단에서 SNARE 복합체가 형성이 되어야 하는데, 보툴리눔 독소(serotype A)의 경우 SNARE 복합체의 구성 단백질 중 하나인 SNAP-25를 절단하여 SNARE 복합체의 형성을 막으며, 결과적으로 아세틸콜린의 분비를 억제한다.

보툴리눔 독소는 근육을 마비시켜 주름을 개선하는 효과가 뛰어나다. 최근 보툴리눔 독소가 미용 목적으로 대중적으로 많이 활용되고 있지만 반수치사량이 10ng/kg밖에 되지 않는 강력한 독극물 이기 때문에 안전사고 위험성이 있으며, 전문의에 의해서만 시술되기 때문에 소비자들이 쉽게 접근하기 어렵다는 단점이 있다. 또한, 시술을 위해서는 침습적인 시술이 반드시 필요하다는 단점이 있다. 이러한 단점들을 보안하기 위하여 부작용이 낮고 화장료, 외용제 등에 적용될 수 있는 보톡스 유사 효능 소재의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

대한민국 등록특허공보 제10-0883757호

본 발명자들은 신경전달물질 분비 억제의 효과를 나타내면서 부작용이 없는 보톡스 유사 효능 물질을 개발하고자 연구 노력한 결과, 다양한 천연 원료 중에서 초피나무 열매 추출물을 스네어(SNARE) 형성 억제제와 조합하는 경우, 신경전달물질 분비 억제 효과 및 주름 개선 효과에 있어서 각각의 원료가 갖는 효과와 비교하여 현저한 상승효과가 있음을 밝혀냄으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 초피나무 열매 추출물 및 스네어(SNARE) 형성 억제제의 조합을 유효성분으로 포함하는 신경전달물질 분비 억제용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물 및 화장품을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 하나의 관점은 (i) 초피나무( Zanthoxylum piperitum) 열매 추출물 및 (ii) 스네어(SNARE) 형성 억제제의 조합을 유효성분으로 포함하는, 신경전달물질 분비 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

초피나무(Zanthoxylum piperitum)는 전통적으로 국소 마취, 진통효과가 있는 알싸한 신경 자극이 있는 식물이며, 잎, 줄기 또는 열매를 말려서 사용한다.　 초피나무의 잎, 줄기 또는 열매 추출물은 주로 항균, 항바이러스, 항알러지, 진통 및 자외선 차단 등에 효과가 있다고 알려져 있다.

본 발명의 조성물은 유효성분으로서 초피나무 열매 추출물 및 스네어(SNARE) 형성 억제제의 조합을 포함하는데, 본 명세서에서 사용되는 용어 '추출물'은 원물을 착즙, 또는 원물에 추출용매를 처리하여 얻은 추출 결과물이나 이를 제형화(예컨대, 분말화)한 가공물도 포함하는 의미를 갖는다.

본 발명의 조성물에서 이용되는 추출물을 원물에 추출용매를 처리하여 얻는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있는데 예컨대, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로는 (i) 물, (ii) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide) 등을 사용할 수 있고, 비극성 용매로는 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF 등을 사용할 수도 있다.

바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 추출물은 원물을 착즙하거나, 초음파 추출기를 사용하여 추출하거나, 또는 물, 탄소수가 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 추출 용매로 사용하여 추출한 것일 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 더욱 바람직하게는 본 발명에서 이용되는 추출물은 초피나무 열매의 에탄올 또는 에탄올 수용액 추출물이다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 '추출물'은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 원물을 착즙 또는 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 추출물뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물에 포함되는 것이다.

또한, 본 발명의 추출물은 이후 추가적인 과정, 예컨대 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거한 것, 또는 여과, 농축 및 건조를 모두 수행한 것일 수도 있다. 여과는 예를 들어 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 농축은 감압 농축기, 건조는 분무건조 하거나 동결건조법 등을 수행하여 분말 상태의 추출물을 얻을 수도 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기와 같이 제조한 초피나무 열매 추출물은 3 내지 50 ppm의 퀘르시트린(quercitrin)을 포함하는 것이고, 바람직하게는 4 ppm 이상, 5 ppm 이상, 6 ppm 이상, 7 ppm 이상, 8 ppm 이상, 9 ppm 이상, 10 ppm 이상, 11 ppm 이상, 12 ppm 이상, 13 ppm 이상, 14 ppm 이상, 15 ppm 이상, 16 ppm 이상, 17 ppm 이상, 18 ppm 이상, 19 ppm 이상, 20 ppm 이상, 30 ppm 이상, 40 ppm 이상 또는 50 ppm 이상의 퀘르시트린(quercitrin)을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 스네어(SNARE) 형성 억제제는 신경전달물질 배출 통로를 열리게 하는데 핵심 작용을 하는 SNARE 단백질을 절단하거나, 또는 SNARE 복합체를 불안정하게 하는 물질로 당업계에 알려져 있는 물질, 예컨대 한국 등록특허공보 제10-0883757호에 개시되어 있는 화합물들을 포함하나 이에 제안되는 것은 아니다. 구체적으로 본 발명의 조성물에 포함되는 스네어(SNARE) 형성 억제제는 아지렐린(Argireline), 보툴리늄 신경 독소 A형 경쇄(BoNT/A LC), 캠페롤, 케르세틴, 미리세틴, 루테올린, 델피니딘, 시아니딘, 부테인 및 엘라지산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상일 수 있다.

본 발명의 조성물에서 상술한 초피나무 열매 추출물 및 스네어 형성 억제제는 혼합물 또는 복합물로 포함될 수 있다. 상기 혼합물 또는 복합물은 초피나무 열매 추출물 및 스네어 형성 억제제 각각의 단일 물질에 대비하여 상승효과를 갖는 것을 특징으로 한다. 보다 구체적으로, 상승효과를 나타내기 위해서는 상기 전체 조성물 중에 포함되는 상기 초피나무 열매 추출물의 중량은 상기 스네어 형성 억제제의 중량과 비교하여 동량 이상이어야 한다.

국내 '화장품 전성분 표시지침' 에 따르면 1% 이하로 사용된 성분 함량순으로 많은 것부터 기재하도록 규정되어 있다.

제6조(표시의 순서): 성분의 표시는 화장품에 사용된 함량순으로 많은 것부터 기재한다. 다만, 혼합원료는 개개의 성분으로서 표시하고, 1% 이하로 사용된 성분, 착향제 및 착색제에 대해서는 순서에 상관없이 기재할 수 있다.

기존 주름 개선 화장품은 소위 "바르는 보톡스"라는 이름으로 아르기렐린(Argireline)을 1% 이하로 미량 포함하기도 하였는데, 이러한 미량의 아르기렐린 단독으로는 효과가 거의 없고, 그렇다고 아르기렐린을 1% 이상 고농도로 사용하기에는 합성 펩타이드의 특성상 가격적으로 불리하며, 또한 고농도 사용으로 인한 부작용이 우려된다는 약점을 가지고 있었다. 또한, 기존에 주름 개선 화장품은 아지렐린과 함께 초피나무 열매 추출물을 포함하기도 하였는데, 이 경우 로즈마리 잎 추출물, 녹차추출물 등 다수의 천연 식물 추출물들을 포함하면서 초피나무 열매 추출물을 컨셉원료로서 극미량 포함할 뿐이었다.

그러나, 본 발명자들이 밝혀낸 바에 따르면 초피나무 열매 추출물이 아지렐린보다 많거나, 적어도 동량으로 포함될 때만 상승효과가 나타날 수 있으며, 아지렐린보다 적은 량으로 컨셉원료로서 극미량 포함하는 경우에는 상승효과가 나타나지 않는다(도 6 참조).

일 구현예에서 본 발명의 신경전달물질 분비 억제용 조성물은 상기 (i) 초피나무 열매 추출물 100 내지 500 ppm 및 상기 (ii) 스네어 형성 억제제 10 내지 100 ppm을 포함하되, 포함된 초피나무 추출물의 중량이 스네어 형성 억제제의 중량과 비교하여 동량 이상인 것을 특징으로 할 수 있다. 여기서 ppm이란 조성물 전체 중량 1,000,000 mg 에 들어있는 물질의 mg 수(또는 mg/kg)를 의미한다.

다른 구현예에서 본 발명의 신경전달물질 분비 억제용 조성물에 포함되는 상기 초피나무 열매 추출물의 함량은 100 ppm이상, 200 ppm이상, 300 ppm이상, 400 ppm이상, 500 ppm이상, 600 ppm이상, 700 ppm이상, 800 ppm이상, 900 ppm이상, 또는 1000 ppm이상일 수 있고, 상기 스네어 형성 억제제의 ?t랑은 10 ppm 이상, 20 ppm 이상, 30 ppm 이상, 40 ppm 이상, 50 ppm 이상, 100 ppm 이상, 200 ppm 이상, 300 ppm 이상, 또는 400 ppm 이상일 수 있지만, 스네어 형성 억제제의 ?t랑이 초피나무 열매 추출물의 함량을 초과하지는 않는다.

이와 같이, 초피나무 열매 추출물이 아지렐린 등의 스네어 형성 억제제보다 많거나 적어도 동량으로 포함되는 본 발명의 조성물은, SNARE 복합체 형성 억제와 관련된 상승효과를 가짐으로써, 신경전달물질을 활성적으로 분비할 수 없도록 하며, 따라서 근육 수축이 덜 일어나게 하여 피부 주름을 개선하는 효과를 나타낼 수 있다. 본 발명은 이와 같은 실질적으로 주름완화의 효과에 근거하여 상기 초피나무 열매 추출물 및 스네어 형성 억제제의 조합을 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물은 보톡스 유사 효능을 나타내는데, 보톡스 유사 효능이란 주름 개선, 리프팅, 피지 분비 개선, 여드름 개선, 땀 분비 억제(다한증 개선), 눈 밑 꺼짐 개선, 눈 밑 애교살, 근육 이완 및 통증 완화, 편두통을 개선을 의미한다.

상기 화장료 조성물을 피부 외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

상기 주름 개선용 조성물이 피부 외용제 제형으로 제공될 경우, 이에 제한되는 것은 아니나, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제와 같은 제형을 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 주름 개선용 조성물은 화장품 제조에 이용될 수 있다. 상기 조성물을 화장품으로 사용하는 경우, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등과 같은 화장수, 훼이셜 로션, 바디로션 등과 같은 유액, 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등과 같은 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션, 파우더, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일과 같은 메이크업 제거제, 클렌징 폼, 비누, 바디 워쉬 등과 같은 세정제 등의 제형을 가질 수 있다.

또한, 상기 화장품은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 신경전달물질 분비 억제용 조성물은, SNARE 복합체 형성 억제와 관련된 시너지 효과를 가짐으로써, 신경전달물질을 활성적으로 분비할 수 없도록 하며, 따라서 근육 수축이 덜 일어나게 하여 피부 주름을 개선하는 효과를 나타낼 수 있다.

도 1은 초피나무 열매에 함유되어 있다고 알려진 하이페로사이드(hyperoside)와 퀘르시트린(quercitrin) 각각의 근 수축 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 신경세포에서 초피나무 열매 추출물의 전기 신호 전달 억제 능력을 나타낸 것이다.
도 3은 초피나무 열매 추출물의 신경전달물질 분비 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 초피나무 열매 추출물의 세포 독성 평가를 나타낸 것이다.
도 5는 초피나무 열매 추출물의 근육 마비 효능을 나타낸 것이다.
도 6은 초피나무 추출물과 아지렐린(아세틸 헥사펩타이드 8)과의 상승효과를 나타낸 것이다.
도 7은 아지렐린 단독 처리시 근 수축 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 초피나무 추출물과 보톡스 효능 물질인 BoNT/A LC와의 상승효과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

1. 초피나무 추출물의 제조 및 효능성분 확인 (도 1)

(1) 초피나무 추출물의 제조

초피나무(Zanthoxylum piperitum) 열매를 세척, 건조 및 분쇄하고 이를 사용하여 초피나무 에탄올 추출물을 제조하였다. 구체적으로 에탄올 추출물은 추출용매로서 70% 에탄올을 가하여 상온에서 2시간 동안 추출한 후, 얻어진 추출물을 여과하고 농축하여 분말화하는 방법으로 제조하였다.

(2) 효능 성분 확인

초피나무 열매에 함유되어 있다고 알려진 하이페로사이드(hyperoside)와 퀘르시트린(quercitrin) 각각의 근 수축 억제 효과를 테스트 하기 위해서 예쁜 꼬마 선충(Caenorhabditis elegans) 시스템을 도입하였다. 꼬마선충은 wild-type N2 strain을 이용하였으며 Caenorhabditis Genetics Center를 통하여 공급 받았다. Synchronized young-adult 스테이지의 꼬마선충을 M9(+0.01% PEG, 0.1% DMSO) 버퍼로 harvest하여 2번 와싱 및 스핀 다운시킨 후 적정량의 M9 버퍼로 희석하여 50 ul씩 e-튜브에 분배하였다. 각 화합물을 넣은 후 최종 반응 부피를 1 ml로 맞추었다. 1시간 동안 20 ℃ 인큐베이터에서 각 화합물을 처리 후 1 ml 모두 24 웰 플레이트에 옮겨 비디오 녹화를 하였다. 녹화된 비디오에서 좌, 우로 한 번 왕복하는 것을 수영 횟수 1회로 하여 10마리의 20초동안 수영 횟수를 측정하여 1분당 수영 횟수를 계산하였다. 근육 마비 효과는 100-(실험군의 수영 횟수)/(대조군의 수영 횟수) × 100으로 계산하였다. 오차 막대는 S.E.M (Standard Error of Mean)으로 계산하였고, 통계 처리는 Student's t-test로 하였다.

실험 결과, 하이페로사이드(hyperoside)의 근 수축 효과는 미비한데 반하여, 퀘르시트린(quercitrin)의 근 수축 억제 효과 확인되었다(도 1).

(3) 퀘르시트린 ( quercitrin ) 함량 확인

상기 제조한 초피나무 에탄올 추출물과 초피나무 열수 추출물, 초피나무 초음파 추출물에 포함되어 있는 퀘르시트린의 함량을 측정하였다. 초피나무 열수 추출물은 BIO FD&C사의 '초피나무열매추출물' 을 사용하였고, 초피나무 초음파 추출물은 더가든오브내추럴솔루션 사의 Jeju Chophi(초피나무열매추출물)을 사용하였다. 초음파 추출한 초피(Zanthoxylum piperitum) 추출물의 퀘르시트린의 함량은 4 ppm이고, 열수 추출물의 경우 퀘르시트린 함량 3 ppm, 에탄올 추출물의 경우 퀘르시트린 함량은 9 ppm인 것으로 측정되어, 다른 용매 추출법보다 에탄올 추출 시 퀘르시트린 함량이 크게 높아지는 것으로 확인되었다. 반면에 잔톡실룸 분게아눔(Zanthoxylum bungeanum) 추출물인 Indena사의 'Zanthalene'에서는 퀘르시트린이 불검출되었다(1 ppm 미만).

2. 신경세포에서 전기 신호 전달 억제 능력 (도 2)

(1) 실험방법

상기 제조한 초피나무 열매(Zanthoxylum piperitum fruit) 에탄올 추출물을 사용하여 신경세포에서 전기 신호 전달 억제 능력을 측정하였다. 구체적으로 신경 세포주인 NG108-15에서 KCl 자극에 의한 칼슘 이온 유입의 변화를 측정하기 위해 FLIPR Calcium Assay Kit를 사용하였다. NG108-15를 1 X 10⁴ cells/well이 되도록 폴리-L-라이신이 코팅된 96 웰 플레이트에 분주하였다. 분주 후 3일 째에 초피나무 열매 추출물을 serum-free DMEM에 희석해 한 시간 처리하였다. 이 후 로딩 버퍼를 처리하고 2 h 동안 37 ℃ CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 로딩 버퍼에는 칼슘 이온에 반응하는 형광물질을 포함하며 masking dye로 인해 세포 내 칼슘 이온에서만 반응해 형광을 나타낸다. 배양 후 FlexStation을 사용해 세포에 70 mM KCl로 자극을 주고 485/525 nm에서 형광을 측정하였다.

(2) 실험결과

신경세포에서 70 mM KCl로 탈분극을 유도하면 Ca² ⁺이 세포 내로 유입된다. 여기에 초피나무 열매 추출물을 함께 처리하면 탈분극에 의한 Ca² ⁺유입이 유의하게 억제 되었다(도 2). 이를 통하여 초피나무 열매 추출물이 신경세포에서 전기 신호의 전달을 억제하는 능력이 있음을 알 수 있었다.

3. 초피나무 열매 추출물의 신경전달물질 분비 억제 효과 (도 3)

(1) 실험방법

신경 세포와 근육 세포의 공동 배양 조건에서 신경전달물질 분비 변화를 알아보기 위해 Neurotransmitter Transporter Uptake Assay Kit를 사용하였다. 공동 배양 후 3일 째에 dye solution을 30 min 동안 처리하였고, 이후 상기 제조한 초피나무 열매 추출물을 HBSS buffer (HBSS + 20 mM HEPES)에 희석하여 30 min 동안 처리하였다. Dye solution은 신경전달물질을 모방하는 형광 물질과 masking dye를 포함하도록 하였다. Masking dye에 의해 형광 물질이 세포 내로 들어가면 형광을 나타내고 방출되면 형광이 사라진다. 처리 후 FlexStation을 사용해 세포에 70 mM KCl로 자극을 주고 485/525 nm에서 형광을 측정하였다.

(2) 실험결과

초피나무 열매 추출물이 전기 신호의 전달을 억제하여 최종적으로 신경전달물질 분비를 억제하는지 확인하였다. 신경전달물질은 신경 세포에 활동 전위가 발생할 때 시냅스 전 뉴런(Presynaptic neuron)에서 시냅스 틈으로 방출된다. 방출된 신경전달물질은 근육에 있는 시냅스 후 뉴런(postsynaptic neuron)의 수용체에 결합해 운동 뉴런에 활동 전위를 생성 시키고 이 후 신호는 근육 수축으로 변환 된다. 이 과정을 연구하기 위해서 신경근 접합부(neuromuscular junction)가 형성된 환경이 적절한 연구 조건이므로 NG108-15와 C2C12를 co-culture하여 신경근 접합부를 형성하는 in vitro 조건을 만들었다.

실험 결과, 대조군과 비교하였을 때, KCl 처리 후 형광 값이 줄어들었으므로 KCl 처리가 신경전달물질의 분비를 촉진했다는 것을 알 수 있었다. 여기에 초피나무 열매 추출물을 함께 처리하자 KCl에 의한 신경전달물질의 분비가 줄어드는 것이 관찰되었다(도 3). 이를 통하여 초피나무 열매 추출물이 신경전달물질의 분비를 억제함을 확인하였다.

4. 초피나무 열매 추출물의 세포 독성 평가 (도 4)

(1) 실험방법

초피나무 열매 추출물의 처리 농도에 대한 세포 독성을 확인하기 위해 세포 생존율 측정은 MTT assay로 진행하였다. NG108-15 세포를 1 X 10⁴ cells/well이 되도록 poly-L-lysine이 코팅된 96 웰 플레이트에 분주하였고, 24 h 동안 배양하여 plate에 부착시켰다. 이 후 두 물질을 농도별로 serum-free DMEM에 희석하여 세포에 처리 한 후 4 h 동안 CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 상등액을 제거한 후 serum-free DMEM에 녹인 0.5 mg/ml MTT 용액을 세포에 100 μL씩 처리하여 3 h 반응시켰다. 반응 후 MTT 용액을 제거하고 formazan crystal을 용해시키기 위하여 isopropanol 100 μL 넣어 10분 교반하고 마이크로플레이트 리더로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

(2) 실험결과

초피나무 열매 추출물을 12.5, 25, 50 ppm 처리했을 때, 모든 농도에서 100% 이상의 세포 생존율을 나타냄에 따라 세포 독성이 없는 것을 확인 할 수 있었다(도 4).

5. 초피나무 열매 추출물의 근육 마비 효능 (도 5)

상기 1. (2)에서 기술한 바와 같은 예쁜 꼬마 선충(Caenorhabditis elegans) 시스템을 사용하여 상기 제조한 초피나무 열매 추출물의 근육 마비 효능을 테스트 하였다.

실험 결과, 초피나무 열매 추출물을 꼬마선충에 처리하였을 때 농도에 따라 근육 마비 효과가 증가하였다. 초피나무 추출물 0.01%에서는 근육 마비 효과가 없었지만 초피나무 추출물 0.05% 처리시 8.5%, 초피나무 추출물 0.1% 처리시 24.1%의 근육 마비 효과가 나타났다(도 5). 이를 통하여 초피나무 열매 추출물을 처리하였을 때 개체 수준에서 근육 마비 효능이 있다는 것을 확인하였다. 또한, 이전의 세포 실험 결과를 바탕으로, 보톡스 기전과 유사하게 초피나무 열매 추출물이 신경세포에서 신경전달물질의 분비를 억제함으로써 근육의 마비를 유도한다는 점을 유추할 수 있다.

6. 초피나무 추출물과 아지렐린 조합의 상승효과 시험 (도 6 및 7)

초피나무 열매 추출물과 보톡스 효능 소재들간의 상승효과를 테스트 하였다. 먼저, 신경 세포에서 SNAP-25와 결합하여 SNARE 형성을 억제하는 아지렐린(아세틸 헥사펩타이드8, Acetyl hexapeptide-8)과의 상승효과를 테스트 하였다.

실험 결과, 초피나무 추출물을 아지렐린보다 적게(초피 50 ppm, 아지렐린 100 ppm) 사용하면 상승효과 나타나지 않으며, 최소한 초피나무 추출물을 아지렐린과 동량 이상 사용하였을 때 상승효과가 나타나는 것으로 확인되었다(도 6). 또한, 아지렐린(100 ppm)의 근 수축 억제 효과가 초피나무 추출물 500 ppm에 의해 약 15배 이상 증가하는 것으로 확인되었다(도 6).

이러한 효과를 아지렐린 단독 처방으로 나타내기 위해서는 어느 정도의 양을 처리해야 하는지 알기 위해 아지렐린의 양을 점차적으로 증가시키어 실험한 결과, 아지렐린 100 ppm 및 초피나무 추출물 500 ppm 조합과 동등한 수준의 효과를 얻기 위해서는 아지렐린 단독 처방시 100,000 ppm을 처방하여야 하는 것으로 확인되었다(도 7).

7. 초피나무 추출물과 BoNT/A LC 조합의 상승효과 시험 (도 8)

다음으로 초피나무 열매 추출물이 보툴리눔 독소의 효능 부분 소재에도 상승효과를 나타나는지를 테스트하였다. 보툴리눔 독소의 경우 독성이 매우 강하고 규제가 엄격하여 실험에 사용하기 어려워 보툴리눔 독소 단백질에서 효소 활성이 있는 부위인 라이트 체인 부위 (BoNT/A LC)를 이용하여 상승효과를 측정 하였다. 보툴리눔 독소의 근육 마비 효과와 같이 BoNT/A LC 단독으로 0.002% (20 ppm) 처리 시 50%가량의 근육 마비 효과가 있었으며, 이를 통하여 보툴리눔 독소와 같이 BoNT/A LC도 보톡스 효능을 나타냄을 알 수 있다. 상승효과를 테스트하기 위하여 BoNT/A LC에 초피나무 열매 추출물을 0.01% 함께 처리하였더니 20% 이상의 상승효과가 나타났다(도 8). 이 결과를 통하여 초피나무 열매 추출물이 보톡스 효능을 나타내는 소재들 전반에 걸쳐 상승효과를 나타냄을 알 수 있었다.

Claims

(i) 초피나무(Zanthoxylum piperitum) 열매 추출물 및 (ii) 스네어(SNARE) 형성 억제제의 조합을 유효성분으로 포함하는, 신경전달물질 분비 억제용 화장료 조성물로서,
상기 스네어 형성 억제제는 아지렐린(Argireline) 및 보툴리늄 신경 독소 A형 경쇄(BoNT/A LC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상이고,
전체 조성물 중에 포함되는 상기 초피나무 열매 추출물의 중량은 상기 스네어 형성 억제제의 중량과 비교하여 동량 이상인 것을 특징으로 하는 신경전달물질 분비 억제용 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 초피나무 열매 추출물은 초피나무 열매의 착즙 추출물, 초음파 추출물, 물 추출물, 탄소수가 1 내지 4의 저급 알코올 수용액 추출물, 및 탄소수가 1 내지 4의 저급 알코올 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 신경전달물질 분비 억제용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 초피나무 열매 추출물은 3 내지 50 ppm의 퀘르시트린(quercitrin)을 포함하는 것을 특징으로 하는 신경전달물질 분비 억제용 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 (i) 초피나무 열매 추출물 100 내지 500 ppm 및 상기 (ii) 스네어 형성 억제제 10 내지 100 ppm을 포함하되, 포함된 초피나무 추출물의 중량이 스네어 형성 억제제의 중량과 비교하여 동량 이상인 것을 특징으로 하는 신경전달물질 분비 억제용 화장료 조성물.
제1항, 제3항, 제4항 및 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물은 피부 주름 개선용인 것인 화장료 조성물.
제1항, 제3항, 제4항 및 제6항 중 어느 하나의 항에 따른 신경전달물질 분비 억제용 화장료 조성물을 포함하는 화장품.