KR20190047983A

KR20190047983A - 고순도 멜리틴, 진세노사이드 Ｒｂ１ 및 Ｒｇ３, 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20190047983A
Application number: KR1020170142413A
Authority: KR
Inventors: 신장철; 박정근; 심명보; 임지희; 김일광; 김철구
Original assignee: 주식회사 청진바이오텍
Priority date: 2017-10-30
Filing date: 2017-10-30
Publication date: 2019-05-09
Also published as: KR101978850B1

Abstract

본 발명은 고순도 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3, 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 발효주정 또는 프레타놀 A와 같은 식용 가능한 식물성 에탄올을 이동상으로 사용하여 정제봉독으로부터 분리한 순도 90% 이상의 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3 성분을 포함하는 발효 홍삼 추출물, 및 생열귀나무 열매 열수 추출물의 부탄올 분획물을 포함하는 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항균용 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 화장료 조성물의 유효성분 중 하나인 순도 90% 이상의 멜리틴은 식용 발효주정 또는 식품 첨가용 프레타놀 A와 같은 식물성 에탄올을 이동상으로 사용하여 정제봉독으로부터 분리된 단일물질로, 안전성과 안정성이 우수할 뿐만 아니라 항균 및 항염증 효과가 현저하다. 또한, 생열귀나무 열매 추출물을 화장료 조성물의 유효성분으로서 첨가함에 따라 항산화 및 항염증 기능을 강화할 수 있다. 아울러, 화장료 조성물의 유효성분으로서 진세노사이드 Rb1 및 Rg3 성분을 포함하는 발효 홍삼 추출물을 첨가함으로써, 세포 재생, 상처 회복, 노폐물 제거, 피로 완화, 노화방지 등의 다양한 효과를 기대할 수 있다. 이에, 고순도 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3, 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로서 이용하여 항산화, 항염증 또는 항균 효과를 지닌 기능성 화장품 제조에 유용하게 활용할 수 있다.

Description

고순도 멜리틴, 진세노사이드 Ｒｂ１ 및 Ｒｇ３, 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물 및 이의 제조방법{A functional cosmetic composition comprising high purity melittin, Ginsenoside Rb1, Rg3 and extracts from fruits of Rosa davurica pall and preparing method thereof}

본 발명은 고순도 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3, 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 발효주정 또는 프레타놀 A와 같은 식용 가능한 식물성 에탄올을 이동상으로 사용하여 정제봉독으로부터 분리한 순도 90% 이상의 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3 성분을 포함하는 발효 홍삼 추출물, 및 생열귀나무 열매 열수 추출물의 부탄올 분획물을 포함하는 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항균용 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

멜리틴(Melittin)은 봉독(Bee Venom)의 수많은 성분 중 가장 많이 포함되어 있고, 또한 봉독의 항균, 항염증 효과의 주된 성분이며, 봉독의 약 40~50%로 구성되어 있다. 의학적으로 관절염 완화, 동맥경화 완화, 요통 완화, 피부상처의 치료, 면역체계를 강화하는 기능과 항균 작용, 항염증 작용이 있는 것으로 보고되어 있다. 그리고 최근에 피부의 미백 작용 및 주름개선 작용에 관여한다는 사실이 알려짐으로서 미용의 목적으로도 이용가능성이 있다고 알려져 있다.

한국등록특허 제10-1608045호에 양이온 교환 수지를 이용하여 순수한 멜리틴을 분리한 방법이 개시되어 있다. 그러나 상기와 같은 종래의 기술에서는 완충용액을 제조하여 이용하고, 추후 탈염공정을 수행하기 때문에, 용액, 시약 및 수지의 재활용이 어려우므로 생산비용이 많이 들고 대량으로 생산하기에도 적합하지 않다.

또한, 한국등록특허 제10-0744755호에 젤 여과(gel filtration) 방법도 알려져 있지만, 멜리틴(2.8kD)과 아파민(2.02kD) 또한 2.0~3.0kD의 엠씨디(MCD), 세카핀(Secapine) 등의 성분들이 분자량의 크기에 따른 분리가 매우 어렵고, 따라서 멜리틴의 순도와 수율에 대한 큰 영향을 미친다.

한편, 수많은 봉독 화장료 중 대부분은 알러지 자극반응에 따른 안전성 문제를 해결하기 위한 연구를 진행하고 있으나, 정작 유효성분의 안정성 문제를 경시하고 있다. '수용액에서 정제봉독(PBV)과 봉독멜리틴(BVM)의 안정성 비교(Jung Keun Park et.al., Analytical Science & Technology., 29(4): 194-201, 2016)'에 봉독 성분은 수용액 상태에서 안정성이 급격히 감소되는 것으로 보고된 바 있다, 이는 수용액의 전도도와 봉독 성분의 효소 성분에 의한 분해 작용으로 인해서 파생되는 펩타이드 변성현상이다. 따라서 멜리틴의 활성도 및 안정성이 확보되지 못하는 문제가 발생된다.

근래에 홍삼 또는 발효 홍삼의 기능이 알려짐에 따라 화장품 영역도 언급되었고, 홍삼 화장품류가 활발히 개발되고 있는 추세이다. 이는 홍삼의 응용가치로 약용효과와 영양효과로 제시된다. 하지만 이것이 모두 피부에 다 적용되는 것은 아니다, 예를 들면, 균에 감염된 피부, 민감성 피부, 상처 입은 피부 등에 적용된다면 오히려 균의 번식, 알러지 자극 현상, 상처 회복이 더뎌지는 등 영향을 끼치게 된다.

생열귀나무(Rosa davurica pall)는 한국, 일본, 중국, 만주, 시베리아 등에 분포하며, 한국에는 강원도 화천, 정선 등 지역 해발 200~1,200m의 산허리 암석지 및 산간 계곡에 자생하고 있다. 생열귀나무 열매는 레몬보다 아스코르빈산(ascorbic acid) 함량이 10~30배 정도 많고, 당근보다 베타카로틴(β-carotene) 함량이 8~10배 가량 많다는 연구 결과가 보고된 바 있다. 식물이 자라는 위치의 해발 및 고도가 높을수록 함량이 높은 것으로 보고되었으며, 열매의 아스코르빈산 함량은 해발 500m에서 생육한 것은 5.3%, 해발 1,000m에서 생육한 것은 6%인 것으로 보고되었다. 열매의 약리작용은 아스코르빈산에 의한 효과이며, 항암 및 노화방지에도 탁월한 효능이 있는 것으로 밝혀져 성인병 예방 및 치료 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

한국등록특허 제10-1043813호에 생열귀 추출물을 함유하는 화장료 조성물의오존에 대한 피부 손상 방어 효능에 대해 개시하고 있고, 한국등록특허 제10-0460133호에 생열귀나무 추출물로부터 항산화 활성이 우수한 카테킨의 생산방법이 개시되어 있다. 생열귀나무 열매를 알코올로 추출한 경우, 열매의 성분 중 큰 분자량의 펙틴(pectin) 성분은 약 4-8%, 비극성 오일 성분은 5-10%로 구성되어 있다. 이에, 생열귀나무 열매 추출물의 펙틴 성분은 분자량 크기 때문에 화장품 원료로 활용할 시, 피부에 흡수가 잘되지 않으며, 피부 표면에 박막 형성의 원인으로 작용하므로, 분리 정제하여 펙틴 성분을 최소화시킬 필요가 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 다양한 기능성을 부가한 고기능성이며, 안전하고 안정적인 기능성 천연 화장품을 개발하기 위해 예의 연구노력한 결과, 발효주정 또는 프레타놀 A와 같은 식용 가능한 식물성 에탄올을 이동상으로 사용하여 정제봉독으로부터 분리한 순도 90% 이상의 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3 성분을 포함하는 발효 홍삼 추출물, 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 하여 항산화, 항염증, 또는 항균 효과를 부가한 부작용이 적은 고기능성 천연 화장품을 제조함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

한국등록특허 제10-1608045호 한국등록특허 제10-0744755호 한국등록특허 제10-1043813호 한국등록특허 제10-0460133호

Jung Keun Park et.al., Analytical Science & Technology., 29(4): 194-201, 2016

본 발명의 목적은 고순도 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3, 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항균용 화장료 조성물의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법에 따라 제조된, 고순도 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3, 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항균용 화장료 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 고순도 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3, 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항균용 화장료 조성물 및 이의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

하나의 양태로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 고순도 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3, 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항균용 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다:

고정상을 포함하는 컬럼에 정제봉독(purified bee venom, PBV) 수용액을 주입하여 흡착시키고, 식물성 에탄올을 이동상으로 사용하여 정제봉독으로부터 순도 90% 이상의 멜리틴을 분리하는 제1단계;

발효 홍삼 분말로부터 진세노사이드 Rb1 및 Rg3 성분을 포함하는 발효 홍삼 추출물을 수득하는 제2단계; 및

생열귀나무 열매 열수 추출물의 부탄올 분획물을 포함하는 생열귀나무 열매 추출물을 수득하는 제3단계.

본 발명에 있어서, 상기 제1단계는 이에 제한되지는 않으나, 고정상을 포함하는 컬럼에 정제봉독(purified bee venom, PBV) 수용액을 주입하여 흡착시키는 흡착 단계; 및 증류수:식물성 에탄올이 45:55 내지 30:70(v/v)이 되도록 이동상의 비율을 변화시켜 멜리틴을 용리하는 용리 단계;를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 식물성 에탄올은 발효주정 또는 프레타놀 A(prethanol A) 일 수 있으며, 식용 가능한 식물성 에탄올이라면 어느 것도 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 고정상은 이에 제한되지는 않으나, C4 수지일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 제2단계는 이에 제한되지는 않으나, 발효 홍삼 분말에 주정 수용액을 첨가한 후 초음파를 이용하여 추출물을 수득하는 단계; 상기 추출물을 대상으로 헥산(hexane), 클로로폼(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 부탄올(butanol)을 순차적으로 가하여 각각의 분획물을 수득하는 단계; 및 상기 수득한 분획물 중 부탄올 분획층을 크로마토그래피 방법을 이용하여 분리정제하여 진세노사이드 Rb1 성분이 8 내지 15% 포함되고, Rg3 성분이 35 내지 45% 포함되는 발효 홍삼 추출물을 수득하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.

상기 진세노사이드 Rb1 성분은 이에 제한되지는 않으나, 발효 홍삼 추출물 내에 8 내지 15%로 포함된 것일 수 있고, 9 내지 14%로 포함된 것일 수 있고, 10 내지 13%로 포함된 것일 수 있고, 11 내지 12%로 포함된 것일 수 있다.

또한, 진세노사이드 Rg3 성분은 이에 제한되지는 않으나, 발효 홍삼 추출물 내에 35 내지 45%로 포함된 것일 수 있고, 37 내지 44%로 포함된 것일 수 있고, 38 내지 42%로 포함된 것일 수 있고, 39 내지 41%로 포함된 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 진세노사이드 Rg3 성분은 이에 제한되지는 않으나, 20S-Rg3 및 20R-Rg3 일 수 있으며, 발효 홍삼 추출물 내에 상기 20S-Rg3 성분이 15 내지 20%, 또는 17 내지 18% 포함된 것일 수 있고, 20R-Rg3 성분이 20 내지 25% 또는 22 내지 23% 포함된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 제3단계는 이에 제한되지는 않으나, 생열귀나무 열매 분말에 정제수를 가하여 열수 추출물을 수득하는 단계; 상기 열수 추출물을 대상으로 헥산(hexane), 클로로폼(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 부탄올(butanol)을 순차적으로 가하여 얻은 각각의 분획물을 수득하는 단계; 및 상기 수득한 분획물 중 부탄올 분획층을 크로마토그래피 방법을 이용하여 분리정제하여 생열귀나무 열매 추출물을 수득하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 고순도 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3, 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항균용 화장료 조성물의 제조방법은 이에 제한되지는 않으나, 상기 제1단계, 제2단계 및 제3단계에 따라 순차적으로 수행되는 것일 수 있으며, 상기 각각의 단계에 한정되지 않고 개별적으로 비순차적으로 수행되는 것일 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 제조방법에 따라 제조된, 고순도 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3, 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항균용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "항산화"는 산화를 억제하는 작용을 의미하는 것으로, 인체는 산화촉진물질(prooxidant)과 산화억제물질(antioxidant)이 균형을 이루고 있으나 여러 가지 요인들에 의하여 이런 균형상태가 불균형을 이루게 되고 산화촉진 쪽으로 기울게 되면, 산화적 스트레스(oxidative stress)가 유발되어 잠재적인 세포손상 및 병리적 질환을 일으키게 된다. 이러한 산화적 스트레스의 직접적 원인이 되는 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)은 불안정하고 반응성이 높아 여러 생체물질과 쉽게 반응하고, 체내 고분자들을 공격하여 세포와 조직에 비가역적인 손상을 일으키거나 돌연변이, 세포독성 및 발암 등을 초래하게 된다. 따라서, 본 발명의 고순도 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3, 및 생열귀나무 열매 추출물을 화장품, 식품 또는 의약품 등에 포함시키면 항산화 효과를 달성함으로써, 노화 방지 및 건강증진에 기여할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 생열귀나무 열매 n-부탄올 분획물로부터 분리, 정제하여 수득한 생열귀나무 열매 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위하여, DPPH 자유라디칼 소거 활성을 측정한 결과, 생열귀나무 열매 추출물이 농도의존적으로 DPPH 자유라디칼의 소거 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 9). 따라서, 본 발명의 항산화 효과는 자유라디칼(free radical) 소거 활성에 의해 달성되는 것일 수 있다.

본 발명의 용어 "항염증"은 염증를 억제하는 작용을 의미하는 것으로, 염증 반응의 조절은 대단히 복잡한 것으로 알려져 있는데, 이는 생체 내 복구 체계의 증강 및 손상을 감소시키기 위한 것으로 알려져 있다. 염증 과정 중에는 많은 양의 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines), 일산화질소(nitric oxide, NO) 그리고 프로스타글란딘(prostaglandin E2, PGE2)이 유도성 일산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS)와 사이클로옥시게나아제(cyclooxygenase-2, COX-2)에 의해 생성된다. 염증은 다양한 염증성 질환을 유발하는 원인으로써, 본 발명의 고순도 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3, 및 생열귀나무 열매 추출물을 포함하는 조성물은 항염증 작용을 통해 다양한 염증성 질환에 대한 예방 및 개선 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 멜리틴 또는 생열귀나무 열매 n-부탄올 분획물로부터 분리, 정제하여 수득한 생열귀나무 열매 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위하여, RAW 264.7 뮤린 대식세포(RAW 264.7 murine macrophage cell)를 이용하여 일산화질소(nitric oxide, NO) 생성 저해 활성을 측정한 결과, 멜리틴 또는 생열귀나무 열매 추출물이 각각 농도의존적으로 NO 생성 저해 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 5 및 도 8). 따라서, 본 발명의 항염증 효과는 NO 생성 저해 활성에 의해 달성되는 것일 수 있다.

본 발명의 용어 "항균"은 세균이나 진균 등의 미생물의 생장 및 증식을 억제 또는 제어하는 작용을 의미하는 것으로, 본 발명의 미생물은 이에 제한되지는 않으나, 피부 상재균인 스타필로코코스 아우레우스(S. aureus) 또는 프로피오니박테리움 아크네스(P. acnes)일 수 있다. 여러 종류의 피부 질환은 주로 피부상재균에 의해서 발생되며 여드름균, 비듬균 등이 대표적이다. 여드름의 발병은 여드름균이 염증 반응을 유발하는 주된 요인으로 보고되고 있으며, 비듬균은 등, 목덜미와 같은 피부에서 이상적으로 증식하여 지루성 피부염을 유발시킨다. 아토피성 피부염의 원인은 아직 정확히 밝혀지지 않았으나, 발병 원인균으로 포도상구균으로 보고되고 있다. 이러한 피부상재균 및 기타 세균에 의한 피부질환의 발생을 감소시키고 피부를 보호하기 위해 방부제 및 항균제의 사용은 필수적이지만 기존에 사용되고 있는 합성물질들은 피부에 알러지를 유발할 수 있으므로 비교적 인체에 무해한 물질을 사용하는 것이 중요하다. 따라서, 본 발명의 고순도 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3, 및 생열귀나무 열매 추출물을 화장품, 식품 또는 의약품 등에 포함시키면 미생물, 특히 피부 미생물 생장 억제 효과를 달성함으로써, 피부 질환 예방 및 개선에 기여할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 멜리틴의 항균 효과를 확인하기 위하여, 피부상재균인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 또는 스테피로코코스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주에 대한 항균 활성을 측정한 결과, 멜리틴이 상기 두 균주에 대하여 생장 저해 활성이 우수함을 확인하였다(도 6 및 도 7). 따라서, 본 발명의 항균 효과는 피부 미생물에 대한 생장 억제 활성에 의해 달성되는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 순도 90% 이상의 고순도 멜리틴은 이에 제한되지는 않으나, 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.001 내지 0.002 중량%로 함유되는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 발효 홍삼 추출물은 이에 제한되지는 않으나, 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.002 내지 0.005 중량%로 함유되는 것일 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 있어서 상기 발효 홍삼 추출물은 이에 제한되지는 않으나, 진세노사이드 Rb1 성분이 8 내지 15%로 포함된 것일 수 있고, 9 내지 14%로 포함된 것일 수 있고, 10 내지 13%로 포함된 것일 수 있고, 11 내지 12%로 포함된 것일 수 있다.

또한, 발효 홍삼 추출물은 이에 제한되지는 않으나, 진세노사이드 Rg3 성분이 35 내지 45%로 포함된 것일 수 있고, 37 내지 44%로 포함된 것일 수 있고, 38 내지 42%로 포함된 것일 수 있고, 39 내지 41%로 포함된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 생열귀나무 열매 추출물은 이에 제한되지는 않으나, 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.045 내지 0.06 중량%로 함유되는 것일 수 있다.

본 발명에서 있어서, 상기 화장료 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 크림, 로션, 스킨, 에센스, 에멀젼 비누, 폼 클렌징, 팩, 샴푸, 린스, 바디워시 등의 다양한 형태로 제형화할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 상기 유화 제형으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 상기 가용화 제형으로는 유연화장수 등이 있다. 적합한 제형은 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 바이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태일 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태일 수 있다.

상기 화장료 조성물은 추가적으로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물의 유효성분 중 하나인 순도 90% 이상의 멜리틴은 식용 발효주정 또는 식품 첨가용 프레타놀 A와 같은 식물성 에탄올을 이동상으로 사용하여 정제봉독으로부터 분리된 단일물질로, 안전성과 안정성이 우수할 뿐만 아니라 항균 및 항염증 효과가 현저하다. 또한, 생열귀나무 열매 추출물을 화장료 조성물의 유효성분으로서 첨가함에 따라 항산화 및 항염증 기능을 강화할 수 있다. 아울러, 화장료 조성물의 유효성분으로서 진세노사이드 Rb1 및 Rg3 성분을 포함하는 발효 홍삼 추출물을 첨가함으로써, 세포 재생, 상처 회복, 노폐물 제거, 피로 완화, 노화방지 등의 다양한 효과를 기대할 수 있다. 이에, 고순도 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3, 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로서 이용하여 항산화, 항염증 또는 항균 효과를 지닌 기능성 화장품 제조에 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 정제봉독 수용액으로부터 발효주정(식물성 에탄올)(A) 또는 프레타놀 A(B)를 이용하여 분리된 고순도 멜리틴의 크로마토그램 피크를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 발효 홍삼 분말로부터 분별 추출을 통해 진세노사이드(Ginsenoside) Rb1 및 Rg3의 유효 성분 분획의 크로마토그램 피크를 나타낸 도이다.
도 3는 본 발명의 일실시예에 따라 발효 홍삼 분말의 n-부탄올 분획물로부터 수득한 진세노사이드 Rb1 및 Rg3 성분의 함량을 측정, 분석하여 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 생열귀나무 열매 열수 추출물로부터 분별 추출을 통해 생열귀나무 열매의 n-부탄올 분획물을 수득하고, 이를 분리 및 정제하는 공정을 개략적으로 나타낸 흐름도이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 고순도(90% 이상)의 멜리틴(melittin) 및 상기 멜리틴의 기준물질인 정제봉독(PBV, purified bee venom)의 항염증 효과를 분석, 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 액체배지감수성실험법을 이용하여 스타필로코코스 아우레우스(S. aureus) 균주에 대한 고순도(90% 이상) 멜리틴(melittin)의 항균 효과(A) 및 프로피오니박테리움 아크네스(P. acnes) 균주에 대한 기준물질인 봉독의 항균 효과(B)를 나타낸 사진이다. 여기에서, NC는 음성대조군으로 멜리틴 미처리군이며, PC는 양성대조군으로 항생제인 젠타마이신(gentamicin)을 처리한 군이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 MTT 용액 또는 알라마르 블루(Alamar blue) 용액을 이용하여 프로피오니박테리움 아크네스(P. acnes) 균주에 대한 고순도(90% 이상) 멜리틴(melittin)의 항균 효과를 나타낸 사진이다. 여기에서, NC는 음성대조군으로 멜리틴 미처리군이며, PC는 양성대조군으로 항생제인 젠타마이신(gentamicin)을 처리한 군이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 NO 생성에 대한 본 발명의 생열귀나무 열매 n-부탄올 분획물로부터 분리, 정제된 생열귀나무 열매 추출물에 의한 NO 생성 저해 활성 측정 결과 나타낸 그래프이다.
도 9은 본 발명의 일실시예에 따라 본 발명의 생열귀나무 열매 n-부탄올 분획물로부터 분리, 정제된 생열귀나무 열매 추출물의 농도의존적 DPPH 자유라디칼 소거 효과를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 식용 가능한 식물성 에탄올을 이용한 정제봉독 유래의 멜리 틴(melittin) 분리

고순도의 멜리틴을 분리하기 위하여, 정제수와 삼전순약공업주식회사(한국)의 발효주정(식물성 에탄올)(순도 95.1~96.9 v/v %, 경인식약청 허가 662-9호) 또는 덕산약품공업주식회사(한국)의 식품 첨가용 프레타놀 A(식물성 에탄올)(prethanol A, 순도 95%, 경인식약청 허가 25호)를 45:55(v/v, 0.2% TFA를 포함)부터 30:70(v/v, 0.2% TFA를 포함) 비율로 이동상을 구배(gradient) 방법으로 고순도의 멜리틴을 분리하였다.

구체적으로, 정제봉독[멜리틴 함량 64%, (주)청진바이오텍]을 증류수에 용해시켜 10~50㎎/㎖ 농도의 정제봉독 수용액을 준비하였다. Prep HPLC(Preparative High-performance liquid chromatography)에 C4 수지[YMC-Pack C4-HG(S-10 ㎛ / 12 ㎚ / 50 × 20 ㎜ I.D.)] 컬럼을 연결하고 이동상으로 안정화시켰다. 이때, 물[0.2 % TFA(Trifluoroacetic acid)를 포함]:발효주정(식물성 에탄올)(순도 95.1~96.9%, 0.2 % TFA를 포함)이 45:55(v/v)인 것, 또는 물[0.2 % TFA(Trifluoroacetic acid)를 포함]:식품 첨가물 프레타놀 A(식물성 에탄올)(prethanol A, 순도 95%)가 45:55(v/v)인 것을 이동상으로 사용하여 안정화시켰다. 상기 안정화된 컬럼에 정제봉독 수용액 시료 1㎖을 자동주입하여 흡착시켰다. 이후, 이동상의 비율(물:발효주정(식물성 에탄올) 또는 물:프레타놀 A(식물성 에탄올))을 0~11분 구간에서 45:55(v/v)로 유지하고, 12~13분 구간에서 30:70(v/v)로 이동상의 극성을 감소시켰으며, 14~30분 구간에서 그대로 유지하고 유속은 6㎖/min으로 하여 용리 과정을 수행하였다. 용리 과정 중 멜리틴은 24.4 ~ 26분 구간에서 용리되었다. 용리 과정에 소요되는 시간은 시료의 농도, 칼럼의 규격, 상태, 용액의 유속, 온도 등 여러 조건에 따라 차이가 있기 때문에 이에 제한되지 않는다.

상기와 같이 C4 수지 컬럼에 흡착된 봉독의 성분으로부터 분리된 멜리틴을 포함하는 이동상 회수액을 분리하여 하기와 같이 저온 농축하였다. 감압회전농축기를 이용하여 45℃에서 멜리틴 회수액에서 발효주정(식물성 에탄올) 또는 프레타놀 A(식물성 에탄올)를 회수한 뒤 남아 있는 증류수 층을 동결건조하여 멜리틴 분말을 수득하였다. 상기 과정에 따라 농도가 10~50㎎/㎖인 정제봉독(45~65%) 수용액으로부터 분리한 멜리틴을 Prep HPLC를 이용한 크로마토그램에서 확인할 수 있었다(도 1).

상기 크로마토그램 확인을 통해, 최종적으로 상기 과정에 따라 정제봉독 수용액으로부터 식용 가능한 발효주정(식물성 에탄올) 또는 프레타놀 A(식물성 에탄올)를 이용하여 순도 90% 이상의 고순도 멜리틴을 수득할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 2: 진세노사이드( Ginsenoside ) Rb1 및 Rg3 성분을 포함하는 발효 홍삼 추출물 제조

세정 처리한 6년생 생삼 10㎏을 95∼98℃의 증기로 3시간 동안 증자(蒸煮)하여 삼의 녹말 성분을 호화한 다음, 25℃의 실온에서 10시간 동안 건조하였다. 상기 건조한 삼을 25℃ 범위의 토양 미생물 배양액에 2시간 동안 침지하여 삼의 조직 속에 토양 미생물을 침투시켰다. 상기 토양 미생물을 침투시킨 삼을 발효실에 주입하고, 45℃의 온도 조건 및 85%의 습도 조건을 유지하면서 2일간 1차 발효를 하였다. 1차 발효 후, 온도 조건을 70∼85℃로 변경하고, 습도 조건은 85∼90%로 변경하여 유지하면서 7일간 2차 발효를 수행하였다. 2차 발효 후, 25℃의 실온 조건에서 2일간 함수율이 10.8 wt%가 되도록 건조하여 발효 홍삼을 제조하였다.

상기와 같이 제조한 발효 홍삼을 분말화하고, 이에 따른 발효 홍삼 분말로부터 고함량의 진세노사이드 Rb1 및 Rg3 성분을 포함하는 발효 홍삼 추출물을 제조하고자 하였다. 이때, 추출 용매로는 70% 주정 수용액을 사용하였다.

구체적으로, 150g의 발효 홍삼 분말에 1ℓ의 70% 주정 수용액을 가하고 40~50℃의 온도 조건에서 초음파를 이용하여 40분 동안 추출하였다. 상기 추출액은 감압 여과 장치를 이용하여 여액만 취하였으며, 이와 같은 방법으로 분리한 잔사에 대하여 동일한 조건으로 2회 더 반복 실시하였다. 이후 여과하여 얻어진 여액은 감압회전농축기로 농축하여 70% 주정 발효 홍삼 추출물을 수득하였다. 상기 수득한 70% 발효 홍삼 주정 추출물을 증류수에 현탁시키고, 분별 깔때기를 이용해 극성순서에 따라 순차적으로 분획하여 n-헥산(n-hexane, n-Hex), 클로로폼(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate, EtOAc), 및 n-부탄올(n-butanol, n-BuOH) 순서로 총 4개의 용매 분획층을 얻었다. 분별 추출 후 획득한 n-부탄올(n-butanol, n-BuOH) 분획층을 65℃에서 감압회전농축기로 농축하여 n-부탄올(n-butanol)을 제거하고 발효 홍삼 n-부탄올 분획물을 수득하였다. 상기 수득한 발효 홍삼 n-부탄올 분획물은 SPE 컬럼(solid phase extraction column)과 ODS 수지로 정제하였다.

ODS 수지인 C18(40㎛, 200Å)을 60% 주정에 혼합시키고, 실온에서 30분 동안 방치한 후 상층 용액을 제거하였다. 이와 같은 방법으로 3회 더 반복하여 하층 수지를 SPE 컬럼(Φ:20mm, L:80㎜)에 팩킹(packing)하였다. 팩킹 후, FPLC(Fast protein liquid chromatography)의 플로우 시스템(flow system)과 연결하여 이동상으로 안정화시켰다. 이때, 10% 주정을 이동상으로 이용하여 안정화시켰다. 베이스라인(baseline)이 안정화되면 상기 수득한 발효 홍삼 n-부탄올 분획물을 상기 준비한 컬럼(column)에 로딩(loading)하였다. 로딩 후, 25% 주정 및 70% 주정을 이용하여 발효 홍삼 n-부탄올 분획물을 용출시켰으며, 최종 70% 주정의 용출물을 회수하였다. 이후, 감압회전농축과 동결건조를 수행하여 주정과 수분을 제거하고, 최종적으로 진세노사이드(Ginsenoside) Rb1(11% 포함) 및 Rg3(40% 포함) 성분을 포함하는 발효 홍삼 추출물을 수득하였다.

상기 과정에 따라 발효 홍삼 분말로부터 수득한 진세노사이드(Ginsenoside) Rb1(11% 포함) 및 Rg3(40% 포함) 성분을 크로마토그램에서 확인할 수 있었다(도 2).

즉, 상기 크로마토그램 확인을 통해, 최종적으로 상기 과정에 따라 발효 홍삼 분말로부터 분별 추출을 통해 진세노사이드(Ginsenoside) Rb1 및 Rg3 성분이 고함량으로 포함되어 있는 발효 홍삼 추출물을 수득할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3: 발효 홍삼 분말의 n -부탄올 분획물로부터 수득한 진세노사이드(Ginsenoside) Rb1 및 Rg3 성분의 함량 분석

상기 실시예 2에서 발효 홍삼 분말로부터 추출, 분리, 정제를 통하여 최종적으로 n-부탄올 분획물로부터 수득한 진세노사이드 Rb1 및 Rg3의 함량을 분석하기 위하여, KSH2153(2013)의 방법을 기준으로 하여 실행하였다.

구체적으로, 발효 홍삼 분말로부터 분별 추출을 통해 수득한 n-부탄올 분획물 시료를 정확히 계량한 후, 1㎎/㎖ 농도로 제조하고 HPLC(high performance liquid chromatography)를 이용하여 측정하였다. 이때, 컬럼(column)은 Agilent HPLC Column XDB-C18, 분석용 4.6 × 250㎜, 5㎛인 것을 사용하였다. 한편, 분석 이동상인 아세토나이트릴(Acetonitrile)의 경우, 0~40분 구간 동안 20%~32%로 증가시켰으며, 40~55분 구간 동안 50%로 증가시켰다. 또한, 55~70분 구간 동안은 65%로 증가시키고, 71분에 90%로 증가시켰다. 81분에는 다시 20%로 감소시켰으며 110분까지 20%로 유지하였다. HLPC 측정시 유속은 1㎖/min으로 하였으며, 검출 파장은 203㎚로 설정하였다.

한편, 정성적 분석 부분은 표준물의 피크 타임(peak time)으로 확인하였다. 그 결과, 하기 도 3에 나타낸 바와 같이, 지표 성분 Rb1은 41.74분에 나타났으며, Rg3(S)는 57.11분, 그리고 Rg3(R)은 57.79분에 나타났다. 또한, 정량적 분석은 상대 함량으로 분석 시간에 나타내는 모두 피크의 적분 면적(peak width 30s, threshold 50 이상)에 지표 성분의 적분 면적 백분율로 계산하여 나타내었다. 계산 결과, Rb1은 11.14%, Rg3(S)는 17.61%, Rg3(R)은 22.44% 함량 포함되어 있는 것으로 분석되었다.

실시예 4: 생열귀나무 열매 열수 추출물 및 이의 용매 분획물 제조

건조 및 분쇄된 생열귀나무(Rosa davurica Pall) 열매를 정제수를 이용하여 90℃에서 30분 동안 열수 추출하였다. 상기 열수 추출물을 실온에서 냉각시킨 후 감압회전농축기를 이용하여 상기 추출액 총 부피의 1/3로 농축시켰다. 상기 수득한 생열귀나무 열수 추출물을 분별 깔때기를 이용해 극성순서에 따라 순차적으로 분획하여 n-헥산(n-hexane, n-Hex), 클로로폼(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate, EtOAc), 및 n-부탄올(n-butanol, n-BuOH) 순서로 총 4개의 용매 분획층을 얻었다. 분별 추출 후 획득한 n-부탄올(n-butanol, n-BuOH) 분획층을 감압회전농축기로 농축하여 n-부탄올(n-butanol)을 제거하고 생열귀나무 열매 n-부탄올 분획물을 수득하였다. 상기 수득한 생열귀나무 열매 n-부탄올 분획물은 SPE 컬럼(solid phase extraction column)과 ODS 수지로 정제하였다.

상기 실시예 2의 SPE 컬럼 팩킹 방법과 동일한 방법으로 SPE 컬럼을 준비하고, 상기 준비한 생열귀나무 열매 n-부탄올 분획물을 로딩하였다. 로딩 후, 이동상으로 5% 주정을 함유한 정제수 용액을 이용하여 생열귀나무 열매 n-부탄올 분획물을 용출시켰다. 이후, 상기 수득한 용출물을 감압회전농축기를 이용하여 수분을 제거하였으며, 최종적으로 항산화 및 항염증 효과가 있을 것으로 고려한 생열귀나무 열매 수용성 성분을 수득하였다.

하기 도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 일련의 과정에 따라, 항산화 및 항염증 효과가 있을 것으로 고려한 생열귀나무 열매로부터 수득한 생열귀나무 열매 n-부탄올 분획물을 수득하고, 이를 분리 및 정제하여 생열귀나무 열매 추출물을 수득할 수 있었다.

실시예 5: 멜리틴의 항염증 효과 분석

상기 실시예 1에서 분리된 순도 93%의 멜리틴의 항염증 효과(anti-inflammatory effect)를 분석하기 위하여, RAW 264.7 뮤린 대식세포(RAW 264.7 murine macrophage cell)를 이용하여 일산화질소(nitric oxide, NO) 생성 저해 활성을 측정하였다.

구체적으로, RAW 264.7 세포는 10% FBS(fetal bovine serum), 100㎍/㎖의 페니실린(penicillin), 및 100 U/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle medium, Gibco, Co., USA)를 이용하여 37℃, 5% CO₂조건하에서 배양하였으며, RAW 264.7 세포로부터 생성되는 NO의 양을 그리스 시약(Griess reagent) 반응법을 이용하여 측정하였다.

상기 RAW 264.7 세포에 기준물질인 정제봉독(PBV, purified bee venom) 및 상기 실시예 1에서 분리한 고순도(90% 이상)의 멜리틴을 농도별(0, 1, 2, 및 4㎍/㎖)로 각각 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 이때, 염증반응 유도물질인 1㎍/㎖의 LPS(lipopolysaccharide)는 상기 정제봉독 및 멜리틴 처리 2시간 전에 전처리(pre-treatment)하였다. 24시간 동안 배양한 후, 그리스 시약 키트(Griess reagent kit)를 이용하여 RAW 264.7 세포로부터 생성된 NO의 양을 세포 배양액 중에 존재하는 NO^2-의 형태로서 측정하였다.

구체적으로, 96웰 플레이트(96-well plate) 상에서 상기 24시간 동안 배양한 후 수득한 세포 배양액과 그리스 시약을 혼합하여 10분 동안 반응시킨 후 540㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 하기 도 5에 나타낸 바와 같이, 기준물질인 정제봉독과 비교하여 고순도 멜리틴의 NO 생성 저해 활성이 더 우수함을 확인하였다.

따라서, 상기 결과를 통해 정제봉독으로부터 분리된 고순도(90% 이상)의 멜리틴의 항염증 효과가 우수함을 알 수 있었다.

실시예 6: 멜리틴의 항균 효과 분석

상기 실시예 1에서 분리된 순도 93%의 멜리틴의 항균 효과(anti-bacterial effect)를 분석하기 위하여, 액체 배지감수성 실험(broth microdiliution susceptibility tests)을 수행하여 미생물 최소 저해 농도(MIC, maximal inhibitory concentration) 값을 측정하여 항균 효과 정도를 분석하였다. 한편, 김순태 등(Korean J Vet Serv (2006) 29(1): 19-26)에 따르면, 기준물질인 봉독은 MIC 값이 ≥64㎍/㎖인 것으로 보고된 바 있다.

구체적으로, 균주는 피부상재균으로서, 여드름을 유발하는 프로피오니박테리움 아크네스(propionibacterim acnes, P. acnes(KCTC 3314))와 피부 질환을 유발하는 스타필로코코스 아우레우스(staphyloccus aureus, S. aureus(KCTC 1926))를 사용하였다. 한편, 스타필로코코스 아우레우스(S. aureus) 균주는 접종 균주가 1×10⁶~1×10⁷cfu/㎖이 되도록 1~3일간 미리 배양하였다.

항균 효과를 분석하기 위한 측정 시료로서, 상기 실시예 1에서 분리한 고순도의 멜리틴 및 양성대조군으로서 항생제인 젠타마이신(20㎍/㎖)은 증류수에 녹여 0.45㎛의 필터로 여과하여 준비하였다. 이후, 멜리틴은 농도별(16, 32, 64, 128, 및 256㎍/㎖)로 희석하고 영양 배지(nutrient broth) 3㎖을 취한 후 라운드 바텀 튜브(round bottom tube)에 정량으로 넣고 잘 혼합하였다. 혼합 후, 상기 튜브에 상기 미리 배양하여 둔 스타필로코코스 아우레우스(S. aureus) 균주를 1×10⁶~1×10⁷cfu/㎖의 균주 수로 각각 접종하였다. 접종 후, 배양기(incubator)에서 오버나이트(overnight) 배양하였으며, 육안으로 배지의 탁도를 확인하였다(MIC≥16㎍/㎖, 도 6의 A).

또한, 기준물질인 봉독(bee venom, BV)은 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 및 512㎍/㎖로 농도별로 희석하고 상기와 같은 방법에 따라 동일하게 수행하여 육안으로 배지의 탁도를 확인하였다(MIC≥32㎍/㎖, 도 6의 B).

또한, 96-웰 플레이트(96-well plate) 상에서, 상기와 같이 농도별(16, 32, 64, 128, 및 256㎍/㎖)로 희석하여 준비한 고순도의 멜리틴을 프로피오니박테리움 아크네스(P.acnes(KCTC 3314)) 균주와 혼합하여 배양기에서 오버나이트 배양하였다. 배양 후, 5㎎/㎖의 MTT(tetrazoliumsalt[3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2-5-diphenylterazolium bromide]) 용액 또는 10× 알라마르 블루(Alamar blue) 용액을 20㎕씩 염색 처리하였다. 염색 처리 후 1시간 동안 배양기(incubator)에서 반응시킨 뒤, 색 변화를 확인하였다(MIC≥16㎍/㎖, 도 7).

따라서, 상기 결과를 통해 정제봉독으로부터 분리된 고순도(90% 이상)의 멜리틴의 항균 효과가 기준물질인 봉독에 비해 현저히 우수함을 알 수 있었다.

실시예 7: 생열귀나무 열매 추출물의 항염증 효과 분석

상기 실시예 4에서 생열귀나무 열매 n-부탄올 분획물로부터 분리, 정제하여 수득한 생열귀나무 열매 추출물의 항염증 효과(anti-inflammatory effect)를 분석하기 위하여, RAW 264.7 뮤린 대식세포(RAW 264.7 murine macrophage cell)를 이용하여 일산화질소(nitric oxide, NO) 생성 저해 활성을 측정하였다.

구체적인 실험 방법은 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 수행하였다. RAW 264.7 세포에 상기 실시예 4에서 생열귀나무 열매 n-부탄올 분획물로부터 분리, 정제하여 수득한 생열귀나무 열매 추출물을 농도별(1, 5, 10, 및 20㎎/㎖)로 각각 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 이때, 염증반응 유도물질인 1㎍/㎖의 LPS(lipopolysaccharide)는 상기 생열귀나무 열매 추출물 처리 2시간 전에 전처리(pre-treatment)하였다. 24시간 동안 배양한 후, 그리스 시약 키트(Griess reagent kit)를 이용하여 RAW 264.7 세포로부터 생성된 NO의 양을 세포 배양액 중에 존재하는 NO^2-의 형태로서 측정하였다.

그 결과, 하기 도 8에 나타낸 바와 같이, 생열귀나무 열매 추출물의 NO 생성 저해 활성이 더 우수함을 확인하였다.

따라서, 상기 결과를 통해 생열귀나무 열매 n-부탄올 분획물로부터 분리, 정제하여 수득한 생열귀나무 열매 추출물의 항염증 효과가 우수함을 알 수 있었다.

실시예 8: 생열귀나무 열매 추출물의 항산화 효과 분석

상기 실시예 4에서 생열귀나무 열매 n-부탄올 분획물로부터 분리, 정제하여 수득한 생열귀나무 열매 추출물의 항산화 효과(anti-oxidant effect)를 분석하기 위하여, DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 자유라디칼 소거 활성을 측정하였다. 이때, DPPH는 0.5 mM 농도가 되도록 에탄올에 용해시키고, 여기에 0.05M Tris-HCl 완충액(pH 7.4) 1㎖와 에탄올 1㎖를 가하여 제조하여 사용하였다.

구체적으로, 0.5㎍/㎖ 내지 200㎍/㎖ 농도 범위 내에서 2배씩 계단 희석(serial dilution)하여 농도별로 상기 실시예 4에서 최종적으로 수득한 생열귀나무 열매 추출물을 준비하였다. 이후, 96웰(well) 플레이트(plate)에 상기와 같이 준비한 DPPH 용액과 상기 희석하여 준비한 각각의 생열귀나무 열매 추출물 시료 용액을 혼합하여 30분간 반응시킨 후, ELISA 리더(ELISA Reader)를 이용하여 517㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 하기 도 9에 나타낸 바와 같이, 생열귀나무 열매 n-부탄올 분획물로부터 분리, 정제하여 수득한 생열귀나무 열매 추출물의 DPPH 자유라디칼 소거 활성능이 대조표준물질로서 강력한 항산화 물질로 알려져 있는 BHA와 비교하여 유사한 수준으로 우수함을 확인하였다.

따라서, 상기 결과를 통해 생열귀나무 열매 n-부탄올 분획물로부터 분리, 정제하여 수득한 생열귀나무 열매 추출물의 항산화 효과가 우수함을 알 수 있었다.

제조예 1: 고순도 멜리틴 , 진세노사이드 Rb1 및 Rg3 , 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항균용 화장료의 제조

상기 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 4에서 각각 정제봉독으로부터 분리한 고순도의 멜리틴, 발효 홍삼 분말의 n-부탄올 분획물로부터 수득한 진세노사이드 Rb1 및 Rg3 성분을 포함하는 발효 홍삼 추출물, 및 생열귀나무 열매 n-부탄올 분획물로부터 분리, 정제하여 수득한 생열귀나무 열매 추출물을 최종 수득하였다. 상기 최종 수득한 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3, 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 하여 기능성 천연 화장품을 제조하고자 하였다.

제조예 1-1: 토너 제조

상기 최종 수득한 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3, 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 토너는 하기 표 1과 같이 제조하였다.

구체적으로, 토너 타입의 천연 화장품을 제조하기 위해 하기 표 1에 기재되어 있는 구성 성분 중 알로에 베라 젤(Aloe vera gel), 하이드로라이트-5(Hydrolite-5), 1,3-부틸렌글리콜(1,3 Butylene Glycol), 및 GHDO-6(1,2-Hexanediol) 성분(No. 2~5 성분)을 계량한 후 70℃로 가열하였다. 가열 후, 정제수(DI-Water)(No. 1 성분)를 혼합하여 10분 동안 호모 믹서(Homo mixer)로 5,000~5,500 rpm의 속도로 믹싱(mixing) 시켰다. 10분 후 계속 믹싱하면서 가열을 정지하고 온도를 50℃까지 냉각시켜 아데노신(Adenosine), 알부틴(arbutin), 생열귀나무 열매 추출물, 홍삼 추출물 Rb1(11% 포함), Rg3(40% 포함), 멜리틴(순도 90% 이상) 및 향료(No. 6~11 성분)를 첨가하였다. 첨가 후 믹싱을 유지하고 실온까지 냉각시켜 완성하였다.

No.	원료명	함량(중량%)
1	정제수(DI-Water)	56.7388
2	알로에 베라 젤(Aloe vera gel)	34.0433
3	하이드로라이트-5(Hydrolite-5)	2.8369
4	1,3-부틸렌글리콜(1,3 Butylene Glycol)	2.8369
5	GHDO-6(1,2-Hexanediol)	3.4043
6	아데노신(Adenosine)	0.0454
7	알부틴(arbutin)	0.0454
8	생열귀나무 열매 추출물	0.0454
9	홍삼 추출물 Rb1(11% 포함), Rg3(40% 포함)	0.0024
10	멜리틴(순도 90% 이상)	0.0011
11	향료	2~3 방울
합계		100

제조예 1-2: 로션 제조

상기 최종 수득한 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3, 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 로션은 하기 표 2와 같이 제조하였다.

구체적으로, 트러블 개선을 위한 로션을 제조하기 위해 하기 표 2에 기재되어 있는 구성 성분 중 A조(수상) 원료 No. A2 내지 A9 성분까지 계량 후 No. A1 성분에 투입하고 80℃까지 가열하였다. 한편, 별도로 B조(유상) 원료 No. B1 내지 B7 성분을 계량 후 호모 믹서로 교반하면서 80℃까지 가열하였다. 이후, A조(수상) 원료의 온도와 B조(유상) 원료의 온도를 80℃까지 올린 뒤, 해당 성분이 완전히 용해된 후 B조(유상) 원료를 A조(수상) 원료에 투입하였다. 투입 후, 5,000~6,000 rpm의 속도로 호모 믹서로 10분간 믹싱하면서 유화시켰다. 유화시킨 후, No. B8 성분을 첨가하고 믹싱을 유지하면서 50~55℃까지 냉각하여 C조, D조 및 E조 성분을 첨가하였다. 이후, 10~20분간 교반하여 45℃까지 냉각 후 F조 성분을 첨가하고 10분간 연속 믹싱하여 완성하였다.

그룹 No.	원료명	함량(중량%)
A1	정제수(DI-Water)	76.157
A2	1,3-부틸렌글리콜(1,3-Butylene Glycol)	3.949
A3	니코틴아미드(Nicotinamide)	0.049
A4	EDTA-2Na	0.019
A5	알란토인(Allantion)	0.099
A6	DL-판테놀(DL-Panthenol)	0.100
A7	Carbopol ultrez 21	0.197
A8	MSM(Methyl Sulfonyl Methane)	0.099
A9	하이드로라이트-5(Hydrolite-5)	0.987
B1	스쿠알란(Squalane)	0.211
B2	실리콘 오일(Silicone oil(PMX-200))	0.211
B3	Lanette O	0.215
B4	Arlacel 165(Rheodol MS-165V)	0.338
B5	LANETTE® 16	0.127
B6	올리브유화왁스(Olivem 1000)	0.632
B7	몬타왁스 68(Montanov 68)	0.423
B8	DC345	2.106
C1	정제수(DI-Water)	12.163
C2	L-아르기닌(L-Arginine)	0.197
D1	알로에 베라 젤(Aloe vera gel)	0.098
D2	생열귀나무 열매 추출물 400㎎/㎖	0.041
D3	Rb1(11% 포함), Rg3(40% 포함)을 포함하고 있는 홍삼 추출물 80㎎/㎖	0.003
D4	멜리틴	0.002
E1	1,3-부틸렌글리콜(1,3-Butylene Glycol)	0.197
F1	Sensiva® SC 50	0.493
F2	페녹시에탄올(Phenoxyethanol)	0.493
F3	향료	0.049
F4	라벤더 오일(Lavender Oil)	0.049
F5	비타민 E 아세테이트(Vitamin E acetate)	0.296
TOTAL		100

제조예 1-3: 수분 크림 제조

상기 최종 수득한 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3, 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 수분 크림은 하기 표 3과 같이 제조하였다.

구체적으로, 수분 크림을 제조하기 위해 하기 표 3에 기재되어 있는 구성 성분 중 A조의 원료 No. A2 내지 A11 성분까지 계량 후 No. A1 성분에 첨가하여 5,000 rpm의 속도로 호모 믹서로 믹싱하였다. 한편, 별도로 B조의 원료 No. B1 및 B2 성분을 계량 후 B2 성분이 완벽히 용해될 때까지 40~45℃로 가열하고 A조 원료에 서서히 투입하였다. 믹싱을 계속 유지하고 C조 성분들을 계량 후 첨가하였다. 약 5분간 믹싱 후 임펠러 교반기로 교체한 뒤 1,500rpm의 속도로 교반하면서 미리 용해된 D조 원료를 첨가하였다. 이후, 5~10분간 교반하면서 냉각시켜 완성하였다.

그룹 No.	원료명	함량(중량%)
A1	정제수(DI-Water)	78.050
A2	글리세린(Glycerin)	5.174
A3	알란토인(Allantion)	0.155
A4	EDTA-2Na	0.021
A5	Carbopol ultrez 21	0.621
A6	DL-판테놀(DL-Panthenol)	0.103
A7	Lubrajel^TM CG	0.517
A8	Plucan-S20	3.104
A9	알로에 베라 젤(Aloe vera gel)	0.103
B1	정제수(DI-Water)	3.104
B2	Dow Corning®2501	1.035
C1	생열귀나무 열매 추출물 400㎎/㎖	0.06
C2	Rb1(11% 포함), Rg3(40% 포함)을 포함하고 있는 홍삼 추출물 80㎎/㎖	0.005
C3	멜리틴	0.002
C4	알로에 베라 젤(Aloe vera gel)	1.035
C5	1,3-부틸렌글리콜(1,3-Butylene Glycol)	2.069
C6	병풀 추출물(Centella asiatica)	0.103
C7	Sensiva® SC 50	0.517
C8	페녹시에탄올(Phenoxyethanol)	0.517
C9	향료	0.026
C10	라벤더 오일(Lavender Oil)	0.026
C11	Nikkol HCO 60	0.828
C12	비타민 E 아세테이트(Vitamin E acetate)	0.052
C13	하이드로라이트-5(Hydrolite-5)	0.500
D1	정제수(DI-Water)	2.066
D2	L-아르기닌(L-Arginine)	0.207
TOTAL		100

Claims

고정상을 포함하는 컬럼에 정제봉독(purified bee venom, PBV) 수용액을 주입하여 흡착시키고, 식물성 에탄올을 이동상으로 사용하여 정제봉독으로부터 순도 90% 이상의 멜리틴을 분리하는 제1단계;
발효 홍삼 분말로부터 진세노사이드 Rb1 및 Rg3 성분을 포함하는 발효 홍삼 추출물을 수득하는 제2단계; 및
생열귀나무 열매 열수 추출물의 부탄올 분획물을 포함하는 생열귀나무 열매 추출물을 수득하는 제3단계;를 포함하는, 고순도 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3, 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항균용 화장료 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 제1단계는,
고정상을 포함하는 컬럼에 정제봉독(purified bee venom, PBV) 수용액을 주입하여 흡착시키는 흡착 단계; 및
증류수:식물성 에탄올이 45:55 내지 30:70(v/v)이 되도록 이동상의 비율을 변화시켜 멜리틴을 용리하는 용리 단계;를 포함하는, 고순도 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3, 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항균용 화장료 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 식물성 에탄올은 발효주정 또는 프레타놀 A(prethanol A)인 것인, 고순도 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3, 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항균용 화장료 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 고정상은 C4 수지인 것인, 고순도 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3, 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항균용 화장료 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 제2단계는,
발효 홍삼 분말에 주정 수용액을 첨가한 후 초음파를 이용하여 추출물을 수득하는 단계;
상기 추출물을 대상으로 헥산(hexane), 클로로폼(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 부탄올(butanol)을 순차적으로 가하여 각각의 분획물을 수득하는 단계; 및
상기 수득한 분획물 중 부탄올 분획층을 크로마토그래피 방법을 이용하여 분리정제하여 진세노사이드 Rb1 성분이 8 내지 15% 포함되고, Rg3 성분이 35 내지 45% 포함되는 발효 홍삼 추출물을 수득하는 단계;를 포함하는, 고순도 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3, 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항균용 화장료 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 제3단계는,
생열귀나무 열매 분말에 정제수를 가하여 열수 추출물을 수득하는 단계;
상기 열수 추출물을 대상으로 헥산(hexane), 클로로폼(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 부탄올(butanol)을 순차적으로 가하여 얻은 각각의 분획물을 수득하는 단계; 및
상기 수득한 분획물 중 부탄올 분획층을 크로마토그래피 방법을 이용하여 분리정제하여 생열귀나무 열매 추출물을 수득하는 단계;를 포함하는, 고순도 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3, 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항균용 화장료 조성물의 제조방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 제조방법에 따라 제조된, 고순도 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3, 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항균용 화장료 조성물.
제7항에 있어서, 상기 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 멜리틴이 0.001 내지 0.002 중량%, 진세노사이드 Rb1 성분이 8 내지 15% 포함되고, Rg3 성분이 35 내지 45% 포함되어 있는 발효 홍삼 추출물이 0.002 내지 0.005 중량%, 및 생열귀나무 열매 추출물이 0.045 내지 0.06 중량%로 함유되는 것인, 고순도 멜리틴, 진세노사이드 Rb1 및 Rg3, 및 생열귀나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항균용 화장료 조성물.