KR101608045B1

KR101608045B1 - 봉독으로부터 멜리틴의 분리방법

Info

Publication number: KR101608045B1
Application number: KR1020130130990A
Authority: KR
Inventors: 정봉열; 배근원; 하재석; 김재준
Original assignee: 주식회사 휴메딕스
Priority date: 2013-10-31
Filing date: 2013-10-31
Publication date: 2016-03-31
Also published as: KR20150049865A

Abstract

본 발명은 양이온 교환 수지를 이용하여 봉독으로부터 순수한 멜리틴을 고수율로 분리하는 방법을 제공한다. 본 발명의 분리방법에 따르면, 봉독으로부터 순수한 멜리틴을 간단하게 고효율로 제조할 수 있다.

Description

봉독으로부터 멜리틴의 분리방법 {Method for Isolating Melittin from Bee Venom}

본 발명은 봉독으로부터 멜리틴의 분리방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 양이온 교환 수지를 이용하여 봉독으로부터 순수한 멜리틴을 고수율로 분리하는 방법에 관한 것이다.

봉독은 예로부터 의학적인 치료 효과를 인정받아 왔다. 기원전 4세기 히포크라테스는 봉독을 “이상하고도 신비한 약”으로 부르며, 관절염과 같은 염증 치료에 사용하고자 하였다. 또한 우리나라는 고구려의 시조 동명성왕 무렵부터 봉료로서 질병을 치료하였으며, 신라 신문왕 때 그리고 동의보감을 저술한 허준 때 궁중에서 봉침으로 질병을 다스렸으며, 고종 황제 때는 봉독을 이용하여 양민을 치료한 것으로 보아 봉침은 우리의 뿌리 깊은 민중의술이었다.

최근 연구 결과, 봉독은 항암작용, 류마티스 관절염 치료, 다발성 경화증이나 관절염과 같은 퇴행성 질환의 통증 완화, 혈압을 낮추고 혈액 중의 임파세포 및 적혈구의 재생과 증가, 부신 아드레날린 분비 촉진, 국소부위의 충혈작용 및 혈액 환류의 개선과 살균작용이 있다고 알려져 있다.

봉독치료 시 주의할 점은 1만 명 당 1명꼴로 두드러기나 호흡곤란을 일으키는 알레르기 환자가 있기 때문에 반드시 사전 알레르기 반응 검사를 해야 한다는 것이다. 또한 봉독치료 이후에 붓고 가려운 증상이 있으며, 몸살을 심하게 앓기도 한다.

봉독은 주성분으로서, 약 40여 가지 펩타이드, 탄수화물, 효소, 아미노산 등으로 이루어져 있다고 보고되어 있으며, 이 중 멜리틴이 40-50%, 포스포리파제 A2가 10-12%를 차지한다.

멜리틴은 용혈작용뿐만 아니라 항균 및 항진균 작용이 있으며, 최근 항암 작용, 항염증 작용, 항통증 작용, 항바이러스제제의 조성물로서 많은 효능이 보고되고 있다. 한편, 포스포리파제 A2 (phospholipase A2: PLA2)는 용혈작용이 있어 혈압저하, 혈류개선 효과가 있으며, 세포막의 인지질을 유리시켜 세포를 강하게 만들어준다. 특히 봉독의 항염증 작용은 멜리틴, 아파민, 비만세포 과립감소 펩타이드(MCD peptide), 아돌라핀, 단백효소억제제 등이 작용한다고 알려져 있다.

그런데, 포스포리파제 A2는 염증을 일으키며, 봉독 성분 중 가장 강력한 알러젠으로 알려져 있다. 또한 0.5~1% 정도의 히스타민(histamin)은 염증과 가려움을 일으킬 수 있다. 아파민과 비만세포 과립감소 펩타이드는 신경세포의 칼륨 채널을 막는 신경독소이다.

따라서, 봉독으로부터 상기 독성 성분을 제거하고 멜리틴만을 분리할 수 있는 방법의 개발이 절실히 요구되어 왔다.

대한민국 등록특허 제10-0744755호에는, 봉독을 완충용액에 넣은 다음 원심분리하여 지질표층을 제거한 후, 상등액을 pH 3.0~pH 4.0의 초산염 완충용액으로 1차 겔 필트레이션 크로마토그래피하여 멜리틴을 분리한 다음, 분리된 멜리틴을 염산 용액으로 2차 겔 필트레이션 크로마토그래피하여 탈염한 후 NaOH로 중화시켜, 알러지 발생의 원인 효소인 포스포리파제 A2가 함유되지 않도록 멜리틴을 분리하는 방법이 개시되어 있다.

그러나 상기 방법은 멜리틴과 포스포리파제 A2의 분리능이 좋지 않아 순수 멜리틴의 수율이 낮고, 탈염과 중화 단계를 거쳐야 하므로 공정이 복잡하며, 정제 시간이 길고, 정제 효율이 낮은 문제점이 있다.

대한민국 등록특허 제10-0744755호

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 한 목적은 봉독으로부터 순수한 멜리틴을 고수율로 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 봉독으로부터 순수한 멜리틴을 간단하게 고효율로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 실시형태는 봉독으로부터 멜리틴의 분리방법에 관한 것으로, 본 발명의 분리방법은

(i) 봉독을 증류수 또는 완충용액에 용해시킨 후 원심분리하여 침전물과 지질층을 제거하고 중간 수용액층을 취하여 정제된 봉독 용액을 수득하는 단계;

(ii) 정제된 봉독 용액을 양이온 교환 수지 컬럼에 주입하고 상기 증류수 또는 완충용액으로 평형화시키는 단계;

(iii) 상기 증류수 또는 완충용액에 0.2 내지 5 M의 염이 포함된 용액을 0에서 100% 기울기(gradient) 용리하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 실시형태에서, 봉독은 꿀벌의 독낭 안에 들어 있는 것을 전기적 충격, 물리적 방법, 화학적 방법 등에 의해 추출하여 얻어진 것으로서 상업적으로 입수할 수 있다.

상기 단계 (i)에서 증류수 또는 완충용액에 첨가되는 봉독은 그 첨가량을 반드시 한정할 필요는 없으며, 작업의 편의성을 고려하여 증류수 또는 완충용액 100 중량부에 대하여 0.5 내지 10 중량부 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시형태에서, 증류수 또는 완충용액은 중성 또는 알칼리성일 수 있으며, 멜리틴과 포스포리파제 A의 분리능 측면에서 pH 7 내지 12가 바람직하고, pH 10 내지 11.5가 보다 바람직하다.

상기 완충용액으로는 포스페이트 완충용액, 트리스 완충용액, 포타슘클로라이드 완충용액 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 증류수는 수산화나트륨 등을 첨가하여 pH를 조절할 수 있다.

상기 증류수 또는 완충용액은 단계 (i) 내지 (iii)에서 동일한 용액을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 단계 (i)에서 수득한 정제된 봉독 용액은 0.2 내지 0.45 um 필터를 통과시켜 녹지 않은 불순물을 제거할 수 있다.

아울러 상기 정제된 봉독 용액은 투석막을 이용하여 2 내지 25 ℃에서 하룻밤동안 투석하여 사용할 수도 있다.

상기 단계 (ii)에서 양이온 교환 수지는 양이온 교환능이 있는 작용기가 도입된 폴리머로서, 폴리머 매트릭스로는 예를 들어, 폴리스틸렌(polystyrene), 폴리페놀릭(polyphenolic) 레진, 셀룰로우스(cellulose), 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide), 테스트란, 세파로스(Sepharose) 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 양이온 교환능이 있는 작용기로서는 예를 들어, RCH₂SO₃ ^-H⁺, C₆H₅SO₃ ^-H⁺, C₆H₅PO₃ ^2-(Na⁺)₂, RCOO^-Na⁺, C₆H₅CH₂N(CH₂COO^-H⁺)₂, 카복시메틸(carboxymethyl), 포스페이트(phosphate), 설포에틸(sulfoethyl), 설포프로필(sulfopropyl), 디에틸(2-히드록시프로필 4차 아미노)(diethyl(2-hydroxylpropyl quaternary amino)) 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 세파로스 포스페이트 또는 세파로스 카복시메틸이 사용될 수 있다.

멜리틴은 pH 12 이하에서 양이온 교환 수지에 결합하는 것으로 나타났으며, pH가 높을수록 약하게 결합하였다. 이는 멜리틴의 등전점(pI)이 pH 12.2이기 때문이다.

한편, 포스포리파제 A2는 pH 10 내지 12에서 양이온 교환 수지에 결합하지 않고 그대로 컬럼을 통과하였다. 따라서 본 발명에 따르면 멜리틴으로부터 포스포리파제 A2를 완전히 분리할 수 있다.

상기 단계 (iii)에서는 단계 (ii)에서 사용된 증류수 또는 완충용액에 0.2 내지 5 M의 염을 첨가한 용액을 0에서 100% 기울기(gradient) 용리하여 염의 농도에 따라 이온 강도(conductivity)에 의해 양이온 교환 수지에 결합된 성분들을 분리할 수 있다. 결합력이 높을수록 염 농도를 증가시키면서 성분들을 분리해 낼 수 있다.

상기 염으로는 이온 강도를 조절할 수 있는 것을 제한 없이 사용할 수 있으며, 염화나트륨(NaCl)이 바람직하다.

상기 단계 (iii)에서 용출된 분획물에서 멜리틴의 함유는 표준 시료와의 전기영동, HPLC 등을 통해 확인할 수 있다.

따라서 멜리틴만이 함유된 분획물들을 수집하고 동결건조하여 고순도 멜리틴을 수득할 수 있다. 수득한 멜리틴은 포스포리파제 A2 등 독성 성분이 완전히 제거되어 알러지 발생 등 부작용 없이 항균제, 항염 치료제, 항암 치료제, 항바이러스제, 화장품, 의약외품 등에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 봉독으로부터 멜리틴 이외에 다른 성분이 포함되지 않은 고순도 멜리틴을 고수율로 분리할 수 있다. 본 발명의 분리방법은 양이온 교환 수지 컬럼을 이용하여 봉독으로부터 순수한 멜리틴을 간단하게 고효율로 제조할 수 있다.

도 1은 실시예 1에서 정제된 봉독을 양이온 교환 수지 컬럼 크로마토그래피한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 실시예 1에서 정제된 봉독을 양이온 교환 수지 컬럼 크로마토그래피하여 분리된 분획들의 전기영동 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 실시예 2에서 정제된 봉독을 양이온 교환 수지 컬럼 크로마토그래피한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 실시예 2에서 정제된 봉독을 양이온 교환 수지 컬럼 크로마토그래피하여 분리된 분획들의 전기영동 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 실시예 3에서 정제된 봉독을 양이온 교환 수지 컬럼 크로마토그래피한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 실시예 3에서 정제된 봉독을 양이온 교환 수지 컬럼 크로마토그래피하여 분리된 분획들의 전기영동 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 실시예 4에서 정제된 봉독을 양이온 교환 수지 컬럼 크로마토그래피한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 실시예 4에서 정제된 봉독을 양이온 교환 수지 컬럼 크로마토그래피하여 분리된 분획들의 전기영동 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 실시예 5에서 정제된 봉독을 양이온 교환 수지 컬럼 크로마토그래피한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 실시예 5에서 정제된 봉독을 양이온 교환 수지 컬럼 크로마토그래피하여 분리된 분획들의 전기영동 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 실시예 1 내지 5에서 얻은 멜리틴 분획물을 N-말단 서열 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 실시예 1 내지 5에서 얻은 멜리틴 분획물을 HPLC 분석한 결과를 나타낸 도면이다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오직 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업자에게 있어서 자명하다.

실시예 1:

봉독 10 mg을 1 ml의 증류수(pH 7.0)에 용해시켜 봉독이 녹은 것을 확인한 후, 3,000 rpm에서 30분간 원심분리하고, 주사기를 이용하여 침전물과 지질층 사이에 있는 중간 수용액층을 취하였다. 그런 다음, 투석막 (1kDa dialysis tubing, Cellu Sep)을 이용하여 4℃에서 하룻밤동안 투석을 진행하였다.

정제된 봉독 용액을 양이온 교환 수지 컬럼(SP capto^TM Impres, GE)에 주입한 후, 증류수(pH 7.0)로 평형을 이루게 하였다. 평형을 확인 한 후, 증류수(pH 7.0)에 1 M의 NaCl이 포함된 용액을 0-100% 기울기(gradient) 용리하여 멜리틴을 분리하였다.

용출된 각 분획을 흡광도 280 nm에서 측정하고, 각 분획의 성분을 확인하기 위해 전기영동하여 쿠마시 블루 염색(Coomassie blue staining)하여, 그 결과를 각각 도 1 및 도 2에 나타내었다.

상기 결과로부터, pH 7.0에서 포스포리파제 A2와 멜리틴이 모두 양이온 교환 수지에 결합하며, 1 M NaCl로 기울기 용리하였을 때 순차적으로 포스포리파제 A2 분획물과 멜리틴 분획물이 얻어짐을 확인할 수 있었다.

실시예 2:

증류수(pH 7.0) 대신에 10 mM 인산나트륨(sodium phosphate) pH 10.6을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 멜리틴을 분리하고, 용출된 각 분획의 흡광도를 측정하고 성분을 확인하여 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.

상기 결과로부터, pH 10.6에서 포스포리파제 A2는 양이온 교환 수지에 결합하지 않고 flowthrough로 제거되며, 1 M NaCl로 기울기 용리하였을 때 멜리틴 분획물이 얻어짐을 확인할 수 있었다.

실시예 3:

증류수(pH 7.0) 대신에 10 mM 인산나트륨(sodium phosphate) pH 11.5를 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 멜리틴을 분리하고, 용출된 각 분획의 흡광도를 측정하고 성분을 확인하여 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.

상기 결과로부터, pH 11.5에서 포스포리파제 A2는 양이온 교환 수지에 결합하지 않고 flowthrough로 제거되며, 1 M NaCl로 기울기 용리하였을 때 멜리틴 분획물이 얻어짐을 확인할 수 있었다.

실시예 4:

증류수(pH 7.0) 대신에 10 mM KCl pH 12를 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 멜리틴을 분리하고, 용출된 각 분획의 흡광도를 측정하고 성분을 확인하여 그 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다.

상기 결과로부터, pH 12에서 포스포리파제 A2는 양이온 교환 수지에 결합하지 않고 flowthrough로 제거되며, 1 M NaCl로 기울기 용리하였을 때 멜리틴 분획물이 얻어짐을 확인할 수 있었다.

실시예 5:

증류수(pH 7.0) 대신에 증류수(pH 12)(증류수에 최종 농도 5 mM로 수산화나트륨을 첨가한 용액)를 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 멜리틴을 분리하고, 용출된 각 분획의 흡광도를 측정하고 성분을 확인하여 그 결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다.

실험예 1:

실시예 1 내지 5에서 수득한 멜리틴 분획물을 BCA kit를 이용하여 정량한 결과, 각각 2.2, 2, 3.5, 3.5, 3 mg의 순수한 멜라틴이 얻어짐을 확인할 수 있었다.

실험예 2:

봉독 100 mg을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1 내지 5와 동일한 방법으로 멜리틴을 분리하고, 수득한 멜리틴 분획물을 BCA kit를 이용하여 정량한 결과, 각각 25, 28, 34, 33, 30 mg의 순수한 멜라틴이 얻어짐을 확인할 수 있었다.

실험예 3:

봉독 1 g을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1 내지 5와 동일한 방법으로 멜리틴을 분리하고, 수득한 멜리틴 분획물을 BCA kit를 이용하여 정량한 결과, 각각 243, 280, 340, 348, 330 mg의 순수한 멜라틴이 얻어짐을 확인할 수 있었다.

실험예 4:

실시예 1 내지 5에서 얻은 멜리틴 분획물을 N-말단 서열 분석하여, 그 결과를 도 11에 나타내었다. N-말단 서열을 확인한 결과는 다음과 같았다.

Gly-Ile-Gly-Ala-Val

시험에서 확인된 아미노산 서열은 기존 문헌에서 확인된 것과 동일하였다(http://en.wikipedia.org/wiki/Melittin).

또한 멜리틴 분획물을 HPLC로 분석하여, 그 결과를 도 12에 나타내었다. 시험 대조군은 상업적으로 판매하는 멜리틴(M2272, Sigma)과 포스포리파제 A2(P9279, Sigma)를 사용하였다.

실시예 1 내지 5에서 얻은 멜리틴 분획물과 상업적으로 판매하는 멜리틴은 RT(7.3 ~ 7.4 분)이 같은 것을 확인하였다. 또한 포스포리파제 A2는 전혀 검출되지 않았다.

Claims

(i) 봉독을 pH 10 내지 11.5의 포스페이트 완충용액에 용해시킨 후 원심분리하여 침전물과 지질층을 제거하고 중간 수용액층을 취하여 정제된 봉독 용액을 수득하는 단계;
(ii) 정제된 봉독 용액을 양이온 교환 수지 컬럼에 주입하고 상기 포스페이트 완충용액으로 평형화시키는 단계;
(iii) 상기 포스페이트 완충용액에 0.2 내지 5 M의 염이 포함된 용액을 0에서 100% 기울기(gradient) 용리하는 단계를 포함하는, 봉독으로부터 멜리틴의 분리방법.
제1항에 있어서, 봉독은 꿀벌의 독낭 안에 들어 있는 것을 전기적 충격, 물리적 방법 또는 화학적 방법에 의해 추출하여 얻어진 것임을 특징으로 하는 분리방법.
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서, 포스페이트 완충용액은 단계 (i) 내지 (iii)에서 동일한 용액을 사용함을 특징으로 하는 분리방법.
제1항에 있어서, 단계 (i)에서 수득한 정제된 봉독 용액은 0.2 내지 0.45 um 필터를 통과시켜 녹지 않은 불순물을 제거함을 특징으로 하는 분리방법.
제1항에 있어서, 단계 (i)에서 수득한 정제된 봉독 용액은 투석막을 이용하여 2 내지 25 ℃에서 하룻밤동안 투석하여 사용함을 특징으로 하는 분리방법.
제1항에 있어서, 양이온 교환 수지는 양이온 교환능이 있는 작용기가 도입된 폴리머로서, 폴리머 매트릭스로는 폴리스틸렌(polystyrene), 폴리페놀릭(polyphenolic) 레진, 셀룰로우스(cellulose), 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide), 테스트란 및 세파로스(Sepharose)로 구성된 군으로부터 선택된 하나가 사용되고, 양이온 교환능이 있는 작용기로서는 C₆H₅SO₃ ^-H⁺, C₆H₅PO₃ ^2-(Na⁺)₂, C₆H₅CH₂N(CH₂COO^-H⁺)₂, 카복시메틸(carboxymethyl), 포스페이트(phosphate), 설포에틸(sulfoethyl), 설포프로필(sulfopropyl) 및 디에틸(2-히드록시프로필 4차 아미노)(diethyl(2-hydroxylpropyl quaternary amino))로 구성된 군으로부터 선택된 하나가 사용됨을 특징으로 하는 분리방법.
제1항에 있어서, 양이온 교환 수지가 세파로스 포스페이트 또는 세파로스 카복시메틸임을 특징으로 하는 분리방법.
제1항에 있어서, 단계 (iii)에서 염이 염화나트륨(NaCl)임을 특징으로 하는 분리방법.
제1항에 있어서, 단계 (iii)에서 용출된 멜리틴만이 함유된 분획물들을 수집하고 동결건조하여 고순도 멜리틴을 수득함을 특징으로 하는 분리방법.