NO337009B1

NO337009B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av fosfatidylserin

Info

Publication number: NO337009B1
Application number: NO20076158A
Authority: NO
Inventors: Susanna Vaccaro; Anna Maria Zanellato; Mara Pittarello; Antonio Gambillara
Original assignee: Fidia Farmaceutici
Priority date: 2005-05-30
Filing date: 2007-11-29
Publication date: 2015-12-21
Also published as: WO2006128639A3; ES2501015T3; PL2431020T3; CN101184494B; WO2006128639A2; MX2007015064A; CA2610575A1; IL187749A0; PT1890706E; BRPI0611316B8; CN101184494A; EP1890706B1; IL187749A; JP5113042B2; PT2431020E; ES2382748T3; AU2006254376A1; HK1119584A1; NO20076158L; CA2610575C

Abstract

Fremgangsmåte for fremstillingen av fosfatidylserin med formel CH2OR1CHOR2CH2O-P(=O)-OCH2-CH(NH2)-COOH X hvori R1 og R2 uavhengig representerer et mettet, mono-umettet eller polyumettet acyl C10-C30, X=OH eller OM, hvor M = alkalie eller jordalkaliemetall, ammonium, alkylammonium (inklusive det indre saltet) inklusive transfosfatidyleringsreaksjonen mellom fosfatidylkolin med generell formel CH2OR1CHOR2CH2O-P(=O)-OR3 X hvori R1 og R2 og X har ovennevnte betydninger, R3=CH2-CH2-NH2 o CH2-CH2-N+(CH3)3 og serin i D, L eller racemisk form katalysert med fosfolipase D-enzymet (PLD), karakterisert ved at reaksjonen utføres i et hydroalkoholisk middel inneholdende en alifatisk alkohol og ved nærvær av bivalent metalloksid.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter for fremstilling og rensing av fosfatidylserin (PS) med formel som angitt i krav l's ingress, for å oppnå sluttproduktet i høyt utbytte ved hjelp av bivalente metalloksider ( BMO), slik som angitt i krav l's karakteriserende del.

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Det funksjonelle forfallet av sentralnervesystemet (CNS) som forekommer under den fysiologiske prosessen av cerebral aldring, forårsaker ofte forringelse av de kognitive funksjonene hos eldre, noe som igjen forårsaker atferdsforstyrrelser og endring av det tidsmessige og romlige minnet.

Dette funksjonelle forfallet i CNS-aktivitet er koblet til både igangsettingen av bio-kjemiske og strukturelle endringer i lipidsammensetningen av nervemembranene og redusert aktivitet av de cerebrale enzymene som kan redusere nervesynapser.

Fosfatidylserin (PS) er det viktigste sure fosfolipidet i hjernen. Vitenskapelig forsk-ning har derfor i lengre tid vært fokusert på det å finne en farmakologisk behandling for aldersrelaterte kognitive forstyrrelser, basert på fosfolipider som kan for-hindre (og/eller delvis gjenopprette) den strukturelle og funksjonelle mangelen på aldringsnervemembraner.

Prekliniske og kliniske studier i mennesker har vist at oral administrasjon av PS kan, spesielt hos eldre, bestemme en vesentlig økning i lærekapasitet og tidsmes-sig og romlig minne, selv i tilfellet av spesielt ødeleggende patologier slik som Alzheimers sykdom (Cenacchi T. et al.; Aging Clin Exp Res; 1993; 5:123-133; Nun-zi MG et al.; Adv Exp Med Biol; 1992; 318:393-8).

Det har videre blitt vist at fosfatidylserin er i stand til å bekjempe økningen i hor-monet kortisol hos individer som gjennomgår psykisk stress (Monteleone P. et al.; Neuroendocrinology; 1990; 52(3):243-8), noe som derved reduserer glukosekata-bolismen, med større funksjonell bedring etter intens fysisk anstrengelse.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av PS som angitt i krav 1. Slikt fremstilt PS kan benyttes som den aktive bestanddelen i legemidler(og/eller kost-tillegg) for forebygging av ovennevnte aldersrelaterte patologier samt i kosttilskudd for alle tilfeller av intenst fysisk stress og videre i fremstil ling av liposomer for anvendelse innen området av kosmetikk og/eller som et kon-trollert frigivingssystem for legemidler.

Forskjellige fremgangsmåter for fremstilling og rensing av PS er allerede kjent fra den vitenskapelige litteraturen og patenter beskriver den enzymatiske omdannelsen av fosfat-idylkolin (PC) til PS ved en transfosfatidyleringsreaksjon katalysert ved enzymet/ fosfolipase D (PLD), med etterfølgende rensing fremkalt hovedsakelig ved å ekstrahere PS med organiske løsemidler.

I senere år har ulike fremgangsmåter blitt bearbeidet for å syntetisere PS ved enzymatisk omdannelse i tofasesystemer av vann/organisk løsemiddel eller i et vandig middel.

Patent nr. EP 0776976 beskriver en fremgangsmåte for den enzymatiske fremstillingen av PS i et system bestående av vann/toluen, hvori den organiske fasen inneholder utgangsfosfolipidet fra hvilket PS dannes, den vandige fasen inneholder hy-dra ksyaksepto ren og syntesereaksjonen forekommer i vann/løsemiddelgrense-snittet i nærværet av rå fosfolipase D fra fermenteringsbuljonger av stammer av mikroorganismer som fremstiller PLD.

Fra WO 00/77183 A er det kjent å anvende fosfolipase D for å omdanne fosfatidylkolin (PC) til fosfatidyleringsreaksjon mellom PC og serin.

For første gang i 1990 forsøkte forskere å forbigå tofasesystemet fordi det krevde store mengder løsemiddel som da var vanskelig å eliminere, med etterfølgende høye kostnader for fremstillingen og rensingen av PS (Comfurius P. et al., Journal of Lipid Research 1990, 31:1719-1721).

Det organiske løsemidlet ble derfor erstattet med en detergent/surfaktant i stand til å dispergere utgangsfosfolipidet i micelleform for å bringe med seg den enzymatiske reaksjonen av syntese utelukkende i et vandig middel.

Riktignok vedrører EP 1048738 en fremgangsmåte for den enzymatiske syntesen av PS i et vandig middel fullstendig fritt for enhver kontaminasjon ved organiske løsemidler i nærværet av gitte konsentrasjoner av spesifikke detergenter og kalsiumsalter.

DE 19917249 beskriver en fremgangsmåte for den enzymatiske fremstillingen av PS i et vandig middel uten anvendelse av sufaktanter, utelukkende med tilsetningen av kalsiumkloridsalt (CaCI2), men prosentdelen av enzymatisk omdannelse og graden av renhet av det oppnådde PS er ikke spesifisert.

Patentsøknad nr. EP 1310563 beskriver en fremgangsmåte for fremstillingen av PS

i en vandig fase uten anvendelse av detergenter og/eller kalsiumsalter, basert på homogeniseringen av utgangsstartblandingen bestående av fosfolipid, hydroksy-akseptor og PLD i vann, for å gi et endelig homogenat med en struktur lik den for en bi-lamellær fosfolipidmembran, hvori transfosfatidyleringsreaksjonen deretter kan forekomme.

Patentsøknad nr. EP 1427839 beskriver den enzymatiske syntesen av fosfolipider, inklusive PS, i vann, uten detergenter, men ved nærvær av metallioner som frigis fra de tilsvarende saltene når de fremstilles/oppløses i vann. Fremgangsmåten forekommer i to atskilte faser, hvori med utgangspunkt i blandinger av fosfolipider en første enzymatisk hydrolysereaksjon katalyseres med PLD for å fremstille fosfatidsyre, etterfulgt av en andre transfosfatidyleringsreaksjon, hvori PS dannes i nærværet av et overskudd av serin.

Til sist krever EP 12312134 en fremgangsmåte for den enzymatiske syntesen av PS ved anvendelse av, i vann, en fraksjon av PLD-enzymet fremstilt og renset fra Streptoverticillium hachijoense- stammen for et større utbytte i den endelige fremstillingen av PS.

Når det gjelder rensingen av PS (oppnådd enten ved transfosfatidylering i et vandig middel/organisk løsemiddel eller i et vandig middel), krever EP 1213294 en fremgangsmåte for rensing basert på anvendelsen av en blanding bestående av vann/polart organisk løsemiddel (slik som isopropanol) for å ekstrahere ovennevnte fosfolipid fra løsningen som inneholder det, som igjen er representert med et hy-drokarbonløsemiddel (slik som toluen), mens EP 0922707 vedrører en fremgangsmåte for ekstraksjon/rensing av PS fra en blanding av fosfolipider ved anvendelse av et difasesystem av organiske løsemidler slik som heptan og metanol.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av fosfatidylserin (PS) ifølge krav 1 som gir sluttproduktet i et svært høyt utbytte takket være en effektiv omdannelse av PC til PS ved den spesifikke virkningen av bivalente metalloksider (BMO) i medier som angitt i krav 1, nemlig i et hydroalkoholisk medium inneholdende en alifatisk alkohol eller i et aprotisk polart oppløsningsmiddel eller i et medium bestående av et tofase-system dannet av vann/organisk oppløsnings-middel.

Videre muliggjør transfosfatidyleringsfremgangsmåten katalysert ved PLD-enzymet at en høy prosentdel omdannes til PS uten hensyn til midlet, hvori den enzymatiske reaksjonen forekommer.

Foreliggende oppfinnelse muliggjør derfor fremstilling av PS katalysert ved PLD og BMO, som angitt i krav l's ingress og hvor fremgangsmåten er særpreget ved at den utføres i et medium valgt fra

- et hydroalkoholisk middel inneholdende en alifatisk alkohol,

- et aprotisk polart aprotisk løsemiddel, eller

- et tofasesystem bestående av vann/organiske løsemidler.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstillingen av PS (formel I) som angitt i krav 1, hvori en transfosfatidylering utføres ved PLD-enzymet i nærværet av BMO, og oppnår derved en overføring av en fosfatidylenhet fra fosfatidylkolin (PC) (formel II) som angitt i krav 1 til serin (som i dette tilfellet representerer hydroksyakseptoren); hvor reaksjonen kan finne sted: • i et hydroalkoholmiddel inneholdende en alifatisk alkohol som ikke danner et tofasesystem, eller

• i et aprotisk polart løsemiddel som ikke danner et tofasesystem, eller

• i et tofasesystem bestående av vann/organiske løsemidler.

hvori R<1>og R2 uavhengig representerer et mettet, mono-umettet og/eller polyumettet acyl Cio"C3o, X—OH eller OM, hvor M—alkali eller jordalkalimetall, ammonium, alkylammonium (inklusive det indre saltet) og som innbefatter transfosfatidyleringsreaksjonen mellom en forbindelse av den generelle formel II

hvori R<1>og R2 og X er som definert over og R3=CH2-CH2-NI-l2 eller CH2-CH2-N<+>(CH3)3eller rasemisk form katalysert av fosfolipase D-enzymet (PLD).

Det har overraskende blitt funnet at BMO drastisk endrer reaksjonssubstratet representert av utgangsfosfatidylkolinet, som bestemmer en endring slik at virkningen av PLD-enzym vesentlig øker når det gjelder endelig utbytte av PS, noe som således muliggjør en svært fordelaktig fremstilling av PS som angitt i krav 1 i en industriell skala. Denne vesentlige endringen forekommer i selve substratets struktur. Riktignok favoriserer BMO sprekkdannelsen av PC-vesiklene og derved penetre-ring av enzymet deri, noe som bestemmer en økning i prosentdelen omdannelse av PC til PS siden, ved å penetrere inne i vesiklene kan PLD-enzymet også virke på lipidlaget inn i vesikkelen, som ikke tidligere kunne penetreres ved hydrofile løs-ninger slik som de som inneholder selve enzymet.

Ifølge oppfinnelsen ble ulike bivalente metalloksider testet, slik som kalsiumoksid

(CaO), magnesiumoksid (MgO) og sinkoksid (ZnO), både hydroalkoholisk og i aprotisk middel, samt i tofasesystemer, hvori de ga utmerkede resultater, som vist i de etterfølgende eksemplene, sammenlignet med resultatene oppnådd ved hjelp av de samme fremgangsmåtene, men i nærværet av kalsiumklorid (CaCI2).

Det er riktignok kjent at kalsiumsalter, og spesielt CaCI2, som kalsiumionkilder satt til midlet, hvori transfosfatidyleringsreaksjonen forekommer (Comfurius P. et al., Journal of Lipid Research 1990, 31:1719-1721; Comfurius P. et al., Biochim Biophys Acta, 1977, 488:36-42), promoterer PLD-enzymets katalytiske aktivitet og derved øker fosfatidylkolinomdannelsen til PS (Okawa Y. et al.al; J Biochem.; 1975; 78:363-372).

For å differensiere og klarlegge at BMO er fullstendig forskjellig fra metallsalter og for å demonstrere deres effektivitet i de nye produksjonssystemene som er formålet med foreliggende oppfinnelse, har søkeren utført eksperimenter som sammen-ligner de ulike utbyttene fra omdannelsen av PC til PS i nærværet av kalsiumsalter og i nærværet av BMO.

Som det kan sees fra de oppnådde resultatene, viste utbyttet fra omdannelsen av fosfatidylkolin til PS seg konsekvent å ikke bare være ulikt, men også bestemt og vesentlig høyere enn det oppnådd med CaCI2.

Ved siden av oksidene beskrevet over kan ulike forskjellig BMO anvendes i den nye fremgangsmåten for fremstillingen av PS, slik som manganoksid, bivalent jern-oksid, koboltoksid, kobberoksid og alle de gjenværende bivalente metalloksidene i det periodiske system.

Eksempel på løsemidler, hvori fremgangsmåten av foreliggende oppfinnelse kan utføres er alifatiske alkoholer, slik som isopropanoler; aprotiske polare løsemidler, slik som dimetylsulfoksid (DMSO), dimetylformamid, acetonitril, N-metyl-pyrrolidon og organiske løsemidler, slik som n-heksan, toluen, n-butanol, benzen.

Den foretrukne alkoholen er isopropanol, det foretrukne aprotiske løsemidlet er DMSO og det foretrukne organiske løsemidlet er heksan.

Eksempel 1 beskriver omdannelsen av PC til PS med utgangspunkt i å starte et hydroalkoholisk middel inneholdende gitte prosentdeler av isopropanol tilsatt til en utgangsløsning bestående av acetatbuffer, hvori CaO (eller MgO eller ZnO) har blitt oppløst, sammenlignet med PS-produksjonsprosessen utført i det samme hydro-alkoholiske midlet, men i nærværet av CaCI2-salt.

Prosentdelen alkohol (isopropanol spesielt) som kan anvendes i foreliggende fremgangsmåte (uttrykt som volum % på volumet av utgangsbufferen) kan variere fra 0,1 til 50 %, fortrinnsvis fra 1,25 til 20 %, og mest foretrukket 10 %, i et hydroalkoholisk middel inneholdende en konsentrasjon av BMO (spesielt CaO) som varie rer mellom 0,1 og IM, fortrinnsvis mellom 0,3 og 0,6M og mest foretrukket lik 0,54

M.

Det maksimale utbyttet fra omdannelsen av PC til PS er 90 %, som er fjernt fra utbyttet oppnådd ved den samme produksjonsprosessen, men i nærværet av CaCI2.

Eksempel 2 på den annen side viser at det er mulig å oppnå utbytter enda høyere enn 80 % fra omdannelsen av PC/PS, ved å tilsette gitte mengder DMSO (uttrykt som volum % på volumet av bufferen anvendt) til utgangsbufferløsningen inneholdende gitte molare konsentrasjoner av CaO (eller MgO eller ZnO), og at de ovennevnte utbyttene av PS er svært forskjellig fra de oppnådd med den samme produksjonsprosessen, men i nærværet av CaCI2.

Prosentdelen av aprotisk løsemiddel (og DMSO spesielt) som skal anvendes, kan variere fra 0,1 til 50 %, fortrinnsvis fra 1,25 til 10 %, og mest foretrukket være 1,25 %, i et aprotisk medium inneholdende en konsentrasjon av BMO (CaO spesielt) som varierer mellom 0,1 og 1 M, fortrinnsvis mellom 0,3 og 0,6 M, og enda mer foretrukket kan den være lik 0,33 M.

Den enzymatiske reaksjonen av transfosfatidylering gir et svært høyt utbytte av PC/PS-omdannelse, selv i et tofasesystem bestående av vann/organisk løsemiddel.

Eksempel 3 beskriver fremstillingen av PS i et tofasesystem bestående av vann/ heksan, igjen i nærværet av CaO, MgO og ZnO. Mengden løsemiddel anvendt i de nye fremgangsmåtene som er formålet av foreliggende oppfinnelse er svært liten (som vist under), så lav at produksjonskostnader er begrenset og det er ikke vanskelig å eliminere løsemidlet fra sluttproduktet.

Konsentrasjonen av løsemiddel som skal anvendes i nevnte fremgangsmåte kan variere fra 0,1 to 40 % v/v (uttrykt som volum % på volumet av utgangsbufferen), fortrinnsvis fra 1 til 5 % v/v, og mest foretrukket 1,25 % v/v og 2,5 % v/v, i nærværet av BMO (og CaO spesielt) ved en konsentrasjon som varierer mellom 0,1 og IM, fortrinnsvis mellom 0,3 og 0,6 M og mest foretrukket lik 0,54 M.

I dette tilfellet var også det maksimale utbyttet fra omdannelsen av PC til PS over 80 %, helt forskjellig fra det oppnådd med den samme fremgangsmåten, men i nærværet av CaCI2.

Transfosfatidyleringsreaksjonen kan utføres ved ulike temperaturer, som strekker seg mellom 20 og 70 °C, fortrinnsvis ved 45 eller 55 °C.

Utgangsfosfatidsubstratet er representert ved fosfatidylkolin av animalsk og/eller vegetabilsk opprinnelse, naturlig eller syntetisk, til stede i renset form eller som råmateriale, ved utgangskonsentrasjoner som strekker seg mellom 10 og 500 mg/ml, fortrinnsvis mellom 200 og 300 mg/ml.

Det vandige utgangsmidlet som skal blandes/bindes med alkoholen, det aprotiske løsemidlet eller det organiske løsemidlet for å oppnå et hydroalkoholisk, aprotisk eller tofaset sluttmiddel, er representert ved vann eller en ubufret salinløsning eller en bufferløsning dannet, for eksempel ved natriumacetattrihydrat og eddiksyre ved konsentrasjoner på mellom 0,02 og 0,2 M.

Den optimale serinkonsentrasjonen, fortrinnsvis i L-form, kan variere mellom 1 g/g (gg) av utgangsfosfatid, opp til 5 gg, fortrinnsvis mellom 2 og 3 g/g av fosfatid.

Den optimale pH av bufferløsningen kan variere mellom 4 og 9 fordi den avhenger av opprinnelsen av den anvendte PLD, men fortrinnsvis mellom 5 og 6, og mest foretrukket lik 5,6 dersom en PLD av fermenterbar opprinnelse avledet fra mikroorganismen Streptoverticillium hachijoense anvendes.

Enzymet kan anvendes i renset eller delvis renset form, eller i en ikke-renset form etter enkel filtrering av mikroorganismen fra dens dyrkingsbuljong.

Eksempel 4 (og figur 1) beskriver et nytt system for den delvise rensingen av PLD for å oppnå et enzym som er vesentlig ikke kontaminert med proteiner av en ulik opprinnelse som kan gripe inn mot den katalytiske aktiviteten til PLD, en fremgangsmåte som ikke involverer for mange trinn, siden langvarige prosesser fører til overdrevne industrielle kostnader og en følgende mangel på gjennomførbarhet på en industriell skala.

Det delvis rensede enzymet beskrevet i eksempel 4 ble testet i produksjonsprosessen beskrevet i eksempel 3, sammenlignet med et enzym til stede i ikke-renset form (etter enkel eliminering av produsentmikroorganismen) og med svært rensede enzymatiske preparater (oppnådd ved anvendelse av ionebyttekromatografiske resiner og mono/polyklonale antistoffer rettet mot PLD-enzymet, men som også kan renses ved anvendelse av alle rensemetoder kjent for fagmannen): prosent delen av PC/PS-omdannelse var lik for alle de testede enzymatiske preparatene (renset, delvis renset og ikke-renset).

Den optimale mengden PLD for å sikre over 80 % omdannelse av PC til PS strekker seg mellom 1 og 100 enheter/g av utgangsfosfatid, fordi det avhenger av opprinnelsen til det anvendte PLD. For eksempel når PLD fra Streptoverticillium hachijoense anvendes, varierer den optimale konsentrasjonen mellom 1 og 10 enheter/g av fosfatid.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen muliggjør også separasjon og rensing av PS fra serin, PC og PLD (som representerer urenheter) som blir igjen i midlet, hvori transfosfatidyleringsreaksjonen har funnet sted.

For å separere og rense PS har følgende fremgangsmåter blitt utført.

1. Ved slutten av den enzymatiske transfosfatidyleringsreaksjonen separeres

PS ved å tilsette en løsning av natriumklorid, ved en konsentrasjon på mellom 2 og 6 % (fortrinnsvis 5 %), til reaksjonsmidlet, hvori det nylig fremstilte fosfolipidet er til stede: to faser vil således oppnås fordi PS forblir uløselig i denne løsningen mens residukomponentene (som er mest løselige) hovedsakelig forblir i subnatanten. PS, som har blitt avsatt i den øvre delen av reaksjonsmidlet, isoleres deretter ved å separere og eliminere subnatanten.

Det er alternativt mulig å starte en ny prosess for separasjon og rensing av PS, ved å filtrere PS-beholderen i reaksjonsmidlet for umiddelbart å eliminere alle dens re-sidukomponenter. En NaCI-løsning tilsettes deretter. To faser dannes og supernatanten elimineres fordi PS er funnet i subnatanten. NaCI-vaskinger kan gjentas to eller flere ganger, for å justere saltkonsentrasjonen om nødvendig. Disse vaskepro-sedyrene muliggjør den fullstendige elimineringen av alkoholene, aprotiske og organiske løsemidler anvendes i prosessene for å fremstille PS beskrevet over, som vist i eksempel 5. Deretter, etter behandling av ionene til stede i reaksjonsmidlet med en chelatdanner, presipiteres/vaskes produktet med en etanolløsning (ved en prosentdel på mellom 50 og 100 %, fortrinnsvis 95 %), eller med en blanding av ketonløsemidler (slik som aceton) i vann (ved en prosentdel på mellom 50 og 95 %); vasking med etanol kan gjentas flere ganger (justering av prosentdelen av etanol til stede, om nødvendig). Til sist utføres en endelig vask med etanol og mellom 90 og 100 %, etter hvilken det ferdige produktet kan eller kan ikke tørkes; 2. Separasjonen og rensingen av PS utføres ved ultrafiltrering ved slutten av den transfosfatidylerings enzymatiske reaksjonen, ved anvendelse av en porøs membran av porestørrelse stor nok til å tillate passeringen av små molekyler, sam-tidig som de store fanges. På grunn av dette er det foretrukket å anvende filtre med porer små nok til å fange molekyler med en molekylvekt på 100,000/300,000 Dalton eller mer.

Fremgangsmåtene for isolasjonen og rensingen av PS muliggjør eliminering av resi-duene av substansene som er igjen etter enzymatisk reaksjon og ble i begynnelsen inneholdt i transfosfatidyleringsmidlet slik som serin, PC, mineralsalter, kolin som frigis fra PC, PA, salter/oksider, og over alle, muliggjør den fullstendige rensingen av PS fra PLD-enzymet, hvorav ingen spor, som vist i eksempel 5, er tilbake. Den endelige PS således oppnådd har en svært høy grad av renhet.

Noen antioksidanter slik som askorbinsyre og/eller vitamin E kan inkluderes i fremgangsmåten for fremstilling og rensing av PS.

Oppfinnelsen er beskrevet mer detaljert i de følgende eksemplene.

Eksempel 1

Fremstilling av PS fra vegetabilsk PC i et hydroalkoholisk middel ( ved nærværet av isopropanol ) med CaO . MgO og ZnO 0 . 54M eller med CaCl7 _ 0 . 54M

To ulike hydroalkoholløsninger ble fremstilt, dannet ved to konsentrasjoner av isopropanol (lik 1,25 og 10 % av volumet av startbufferen) i acetatbuffer inneholdende CaO (eller MgO eller ZnO) 0,54 M, sammenlignet med fremstillingen av PS ved den samme fremgangsmåten, men i nærværet av CaCI2-salt, 0,54 M.

De testede oksidene og kalsiumklorid løses i 40 ml acetatbuffer 0,2 M (pH 5,6) til hvilken det deretter tilsettes 0,5 ml isopropanol for å nå 1,25 % v/v (bare for CaO), eller 4 ml isopropanol for å nå 10 % v/v (alkoholene kan også settes til bufferen inneholdende BMO etter oppløsning av serin).

De resulterende løsningene omrøres i en dobbeltvegget reaktor med kondensator i omkring 10 minutter, deretter tilsettes 20 g L-serin ved en temperatur på 55 °C, omrøring til fullstendig oppløsning. Deretter tilsettes 10 g soyafosfatidylkolin og omrøres i 10 minutter. 5,5 U PLD-enzym per gg PC tilsettes deretter og blandingen omrøres i 24-48 timer ved 55 °C.

Til slutt tas en prøve av hvert produkt og den vellykkede omdannelsen av PC til PS testes ved tynnskiktkromatografi (TLC).

Utbytte fra omdannelsen av PC til PS:

distribusjon av produktene til stede ved slutten av reaksjonen, uttrykt som % PA (fosfatidsyre frigitt av PC som et resultat av virkningen av PLD) og PS oppnådd etter transfosfatidyleringsprosessen. PA og PC må vurderes som residuer fra reaksjonen.

Utbytte fra omdannelsen av PC til PS oppnådd med isopropanol, 1,25 % v/v, i nærværet av CaO:

PA 8,0 %

PS 85,5 %

PC 6,5 %

Utbytte fra omdannelsen av PC til PS oppnådd med isopropanol, 10 % v/v, i nærværet av CaO:

PE-OH 4,0 %

PA 3,5 %

PS 89,5 %

PC 3,0 %

Utbytte fra omdannelsen av PC til PS oppnådd med isopropanol, 10 % v/v, i nærværet av CaCI2:

PE-OH 15,8 %

PA 10,7 %

PS 70,1 %

PC 3,4 %

Utbytte fra omdannelsen av PC til PS oppnådd med isopropanol, 10 % v/v, i nærværet av MgO:

PE-OH 9,0 %

PA 4,5 %

PS 84,0 %

PC 2,5 %

Utbytte fra omdannelsen av PC til PS oppnådd med isopropanol, 10 % v/v, i nærværet av ZnO:

PE-OH 10,0 %

PA 8,0 %

PS 80,0 %

PC 2, 0 %

(produktet definert som PE-OH dannes under transfosfatidyleringsreaksjonen fordi reaksjonen forekommer ved nærvær av alkohol).

Eksempel 2

Fremstilling av PS fra vegetabilsk PC i et aprotisk middel f ved nærværet av DMSO ) med CaO , MgO og ZnO 0 . 33M eller med CaCl2 _ 0 . 33M

DMSO ble anvendt ved ulike konsentrasjoner som varierer mellom en prosentdel på 1,25 og 10 % når det gjelder volumet av utgangsbuffer, i alle tilfeller i nærværet av CaO (eller MgO eller ZnO) 0,33M sammenlignet med fremstillingen av PS ved den samme fremgangsmåten, men i nærværet av CaCI2salt.

De testede kalsiumoksidene og kalsiumklorid løses i 40 ml acetatbuffer 0,2 M, ved pH 5,6. Løsningene således oppnådd omrøres i en dobbeltvegget reaktor med kondensator. Etter omkring 10 minutter omrøring tilsettes 20 g L-serin ved en temperatur på 45 °C and deretter fortsetter omrøring til fullstendig oppløsning oppnås.

Deretter tilsettes 10 g soya PC og 0,5 ml DMSO (tilsvarende 1,25 % v/v) eller 4 ml DMSO (tilsvarende 10 % v/v) og blandingen omrøres (DMSO kan tilsettes under prosessens startfase, etter oppløsning av BMO, som i det forrige eksemplet). Ti minutter etter tilsettes 5,5 U PLD-enzym per gg PC, og blandingen omrøres i 24-48 timer ved 45 °C.

Deretter tase prøver av de respektive produktene oppnådd ved slutten av reaksjonen og testes for vellykket omdanning av PC til PS.

Utbytte fra omdannelsen av PC til PS:

Utbytte fra omdannelsen av PC til PS oppnådd med DMSO 1,25 % v/v i nærværet av CaO:

PA 7,1 %

PS 86,3 %

PC 6,6 %

Utbytte fra omdannelsen av PC til PS oppnådd med DMSO 1,25 % v/v i nærværet av CaCI2:

PA 8,1 %

PS 66,7 %

PC 25,2 %

Utbytte fra omdannelsen av PC til PS oppnådd med DMSO 10 % v/v i nærværet av CaCI2:

PA 6 %

PS 69 %

PC 25 %

Utbytte fra omdannelsen av PC til PS oppnådd med DMSO 10 % v/v i nærværet av CaO:

PA 7,5 %

PS 72,5 %

PC 20 %

Utbytte fra omdannelsen av PC til PS oppnådd med DMSO 10 % v/v i nærværet av MgO:

PA 9,0 %

PS 71,0 %

PC 20 %

Utbytte fra omdannelsen av PC til PS oppnådd med DMSO 10 % v/v i nærværet av ZnO:

PA 8,5 %

PS 71,5 %

PC 20 %

Eksempel 3 a

Fremstilling av PS fra vegetabilsk PC i et tofasesystem ( ved nærværet av det organiske løsemidlet heksan ) med CaO , MgO og ZnO 0 . 54M eller med CaCl2 _ 0 . 54M

Først av alt ble et tofasesystem bestående av acetatbuffer inneholdende CaO (eller MgO eller ZnO) 0,54 M fremstilt, og deretter ble en mengde heksan lik 1,25 % av utgangsvolumet av bufferen tilsatt, sammenlignet med fremstillingen av PS ved den samme produksjonsprosessen, men i nærværet av CaCI2, 0,54 M.

De testede oksidene og kalsiumklorid oppløses deretter i 40 ml acetatbuffer 0,2 M (pH 5,6) til hvilket en mengde heksan lik 0,5 ml deretter tilsettes for å nå 1,25 % v/v (det valgte organiske løsemidlet kan tilsettes til bufferen inneholdende BMO før eller etter oppløsning av serin).

Løsningene således oppnådd omrøres i dobbeltvegget reaktor med kondensator.

Fremgangsmåten fortsetter deretter som beskrevet i eksempel 1.

Til slutt tas en prøve av hvert oppnådde produkt og testes for vellykket omdannelse av PC til PS.

Utbytte fra omdannelsen av PC til PS:

Utbytte fra omdannelsen av PC til PS oppnådd med heksan 1,25 % v/v i nærværet av CaO:

PA 7,5 %

PS 87,0 %

PC 5,5 %

Utbytte fra omdannelsen av PC til PS oppnådd med heksan 1,25 % v/v i nærværet av CaCI2:

PA 8,1 %

PS 68,4 %

PC 23,5 %

Utbytte fra omdannelsen av PC til PS oppnådd med heksan 1,25 % v/v i nærværet av MgO:

PA 8,5 %

PS 82,5 %

PC 9,0 %

Utbytte fra omdannelsen av PC til PS oppnådd med heksan 1,25 % v/v i nærværet av ZnO: PA 11,0 %

PS 80,0 %

PC 9,0 %

Eksempel 3 b

Fremstilling av PS fra vegetabilsk PC i et tofasesystem f ved nærværet av det organiske løsemidlet heksan ) med CaO 0 . 54M eller med CaCl7 _ 0 , 54M

Et tofasesystem bestående av acetatbuffer inneholdende CaO 0,54M ble fremstilt og deretter ble en mengde heksan lik 2,5 % av utgangsvolumet av bufferen tilsatt, sammenlignet med fremstillingen av PS ved den samme produksjonsprosessen, men i nærværet av CaCI2, 0,54M. Fra dette punktet og videre er fremgangsmåten den samme som i eksempel 3 a.

Utbytte fra omdannelsen av PC til PS:

Utbytte fra omdannelsen av PC til PS oppnådd med heksan 2,5 % v/v i nærværet av CaO:

PA 7,5 %

PS 86,0 %

PC 6,5 %

Utbytte fra omdannelsen av PC til PS oppnådd med heksan 2,5 % v/v i nærværet av CaCI2: PA 10,0 %

PS 65,0 %

PC 25,0 %

Eksempel 4

Delvis rensing av PLD - enzymet

PLD-enzymet anvendt i ny produksjonsprosesser kan renses delvis ved følgende trinn: • eliminere produksjonsmidlet ved tangentialstrøm mikrofiltrering gjennom filtre (fortrinnsvis med polyetersulfonmembraner: PES) med en porestørrelse på 0,2 nm; • tangentialstrøm ultrafiltrering gjennom filtre (fortrinnsvis i PES) med en molekylreduksjon på 10,000 D; • tangentialstrøm ultrafiltrering gjennom filtre med membraner (fortrinnsvis i PES) med en molekyl reduksjon på 300,000 D;

endelig tangentialstørm ultrafiltrering gjennom membraner (fortrinnsvis i

PES) med en molekylreduksjon på 10,000 D for å rekonsentrere enzymet og dialysere det mot TRIS-HCL-buffer, 50 mM pH=8.

Figur 1 viser funnene fra kromatografianalyse av PLD-enzym delvis renset som beskrevet over, sammenlignet med analyse av en fermenteringsbuljong renset alene fra midlet som fremstiller selve enzymet (figur 2).

Eksempel 5 a

Separasjon og rensing av PS ifølge fremgangsmåte 1

Reaksjonsmidlet, hvori PS har blitt fremstilt, suppleres med 1,5 volumer (når det gjelder utgangsreaksjonsvolum) av en 5 % løsning av NaCI, og blandingen omrøres ved en temperatur på 30 °C i minst 30 minutter. PS, som har blitt avsatt i den øvre delen av reaksjonsmidlet, isoleres deretter ved å separere og eliminere subnatanten. Supernatanten (PS) suppleres med 4 volumer av en 3 % løsning av NaCI og omrøres ved 30 + 10 °C i minst 30 minutter. Etter det separeres supernatanten og kastes (dette trinnet har blitt gjentatt 2 ganger), mens det til subnatanten (representert ved PS) tilsettes 2 volumer av en løsning av EDTA (etylendiaminotetra-eddiksyre) (ved en konsentrasjon på 40 gg/liter) fremstilt i en acetatbuffer, 0,1 M pH 7,5.

Etter ytterligere blanding (ved 25 + 10 °C i minst 1 time) ved omrøring av blandingen således oppnådd justeres pH til 7/7,5 og 2 volumer (når det gjelder volum av EDTA) av 95 % etanol tilsettes, og blandingen omrøres ved 25 + 10 °C i minst 1 time.

Etter en periode av sedimentering av PS, samles den og supernatanten (fasen bestående av etanol i vann) kastes fordi PS ikke vil oppløse seg i en hydroalkoholisk fase. Vasking med etanol/vann (med en prosentdel av etanol på 70-95 %) har blitt gjentatt etter hvilket en endelig vasking med 100 % etanol utføres, og som et endelig trinn kan PS tørkes.

Sluttprodukt: distribusjon av lipidfraksjonene isolert ifølge fremgangsmåte 1, med PS fremstilt som beskrevet i eksempel 3 med CaO 0,54 M.

PA 5,8 %

PS 94, 2 %

Eksempel 5 b

Separasjon og rensing av PS ifølge fremgangsmåte 1

Reaksjonsmidlet, hvori PS har blitt fremstilt suppleres med 1,5 volumdeler (når det gjelder utgangsreaksjonsvolumet) av en 5 % løsning av NaCI, og blandingen om-røres ved en temperatur på 20 °C i minst 30 minutter. PS, som har blitt avsatt i den øvre delen av reaksjonsmediet, isoleres deretter ved å separere og eliminere subnatanten. Supernatanten (PS) suppleres med 3 volumdeler av en 3 % løsning av NaCI og omrøres ved 20 + 10 °C i minst 30 minutter. Etter det separeres supernatanten og kastes (dette trinnet har blitt gjentatt 3 ganger), mens det til subnatanten (representert ved PS) tilsettes 3 volumer av en løsning av EDTA (ved en konsentrasjon av 30 gg/liter) fremstilt i en acetatbuffer, 0,1 M pH 7,0.

Etter ytterligere blanding (ved 20 + 10 °C i minst 1 time) ved omrøring av blandingen således oppnådd, justeres pH til 7/7,5 og 2 volumer (når det gjelder volumet av EDTA) av 100 % etanol tilsettes, og blandingen omrøres ved 20 + 10 °C i minst 1 time.

Etter en periode av sedimentering av PS, samles det og supernatanten (fasen bestående av etanol i vann) elimineres. Vasking med etanol/vann (med en prosentdel av etanol på 70 %) har blitt gjentatt etter hvilket en endelig vasking med 100 % etanol utføres, og som et endelig trinn kan PS tørkes.

Sluttprodukt: distribusjon av lipidfraksjonene isolert ifølge fremgangsmåte 1, med PS fremstilt som beskrevet i eksempel 3 med CaO 0,54M.

PA 6,8 %

PS 93, 2 %

Eksempel 5 c

Separasjon og rensing av PS ifølge fremgangsmåte 1

Før tilsetning av NaCI-løsningen filtreres PS for umiddelbart å fjerne alle residukomponentene av reaksjonsmidlet. Deretter tilsettes NaCI og isolasjons- og renseprosessen fortsetter som beskrevet i eksempel 5 a.

PA 5,0 %

PS 95, 0 %

Etter transfosfatidyleringsreaksjonen viser TLC-analyse av det oppnådde produktet (Vitello F. et al.; J Chromatog; 1978; 166(2):637-40) en 2 % konsentrasjon av serinresidu.

Mengden PLD i denne fasen ble bestemt ved fremgangsmåter i henhold til teknik-kens stand (Aurich I. et al.; Anal Biochem; 1999; 268:337-342) og vist å være 2 u/g.

Serinkonsentrasjonen ble målt igjen ved slutten av fremgangsmåten for rensingen av PS beskrevet tidligere og vist å være lavere enn/lik 0,2 %.

Residuaktiviteten av PLD-enzymet ble også bestemt på nytt og vist å være under grensen for bestemmelse ved denne fremgangsmåten.

For å vise det totale fraværet av selv det minste spor av organisk løsemiddel anvendt i fremgangsmåten for fremstilling av PS (beskrevet i eksempel 3) og således bekrefte nyheten og det oppfinneriske trinnet av foreliggende oppfinnelse, analy-serte søkeren den delvis rensede PS beskrevet i eksempel 5, i fasen som kommer umiddelbart før tilsetningen av alkoholløsninaen.

Denne analysen ble utført ved kjent teknikk av " Gasskromatografi med statisk overromsinjeksjon" som beskrevet i European Pharmacopoeia 5,0, seksjon 2,4,24: Identification and control of residual solvents.

Kalibreringskromatogrammet (figur 3) ble oppnådd ved anvendelse av en standard bestående av etylacetat og n-heksan tilsvarende 1000 ppm hver, lik 100 mg test-produkt.

Figur 4 viser det totale fraværet av n-heksan i PS renset ifølge fremgangsmåte 1.

Eksempel 6

Separasjon og rensing av PS ifølge fremgangsmåte 2

Dette reaksjonsmidlet, hvori PS ble fremstilt suppleres med 1,5 volumer (når det gjelder utgangsreaksjonsvolum) av en løsning av 5 % NaCI og det hele omrøres ved 45 °C i minst 30 minutter, etterfulgt av en periode for separasjon av PS som varer i minst 1 time.

To faser dannes: de separeres og subnatanten forkastes, mens supernatanten suppleres med 2,5 volumer av en løsning av EDTA 22 gg/liter, fremstilt i vann. Straks en temperatur på 28 °C har blitt nådd, utføres ultrafiltrering. Filtre som har porer av en størrelse som vil fange molekyler med en molekylvekt på 100,000/300,000 Daltons bør fortrinnsvis anvendes.

Sluttproduktet kan deretter frysetørkes.

Sluttprodukt: distribusjon av lipidfraksjonene isolert ifølge fremgangsmåte 2, med PS fremstilt, for eksempel, ifølge eksempel 1 med CaO 0,54 M.

PA 6,0 %

PS 94, 0 %

Serinkonsentrasjonen ble målt og slutten av PS-renseprosessen tidligere beskrevet og vist å være lavere enn/lik 0,2 %, mens ytterligere bestemmelse av residuaktiviteten av PLD-enzymet viste seg å være under grensen for bestemmelse ved denne fremgangsmåten.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstillingen av fosfatidylserin med formel

hvori R<1>og R2 uavhengig representerer et mettet, mono-umettet eller polyumettet acyl Cio-C3o, X—OH eller OM, hvor M—alkali eller jordalkaliemetall, ammonium, alkylammonium (inklusive innersaltet) og som innbefatter transfosfatidyleringsreaksjonen mellom en forbindelse av den generelle formel

hvori R<1>og R<2>og X harde ovennevnte spesifiserte betydninger, R<3>=CH2-CH2-NH2eller CH2-CH2-N<+>(CH3)3og serin i D, L eller racemisk form katalysert av fosfolipase D-enzymet (PLD), karakterisert vedat nevnte reaksjon utføres ved nærvær av bivalent metalloksid og i et medium valgt fra et hydroalkoholisk medium inneholdende en alifatisk alkohol; et aprotisk polart oppløsningsmiddel eller et medium bestående av et tofase-system dannet av vann/organisk oppløs-ningsmiddel.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor mediet er hydroalkoholisk inneholdende en alifatisk alkohol.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor mediet er et aprotisk polart oppløs-ningsmiddel.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor mediet består av et tofase-system dannet av vann/organisk oppløsningsmiddel.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, hvori de alifatiske alkoholene velges fra metanol, etanol, n-propanol, isopropanol.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, hvori den alifatiske alkoholen er isopropanol i en konsentrasjon mellom 0,1 og 50 % uttrykt som en volum% av volumet av startbufferen.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, hvori isopropanolkonsentrasjon er 10 %.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 3, hvori de aprotiske polare løsemidlene velges fra dimetylsulfoksid, acetonitril, dimetylformamid og N-metyl-pyrrolidon.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, hvori det aprotiske polare løsemidlet er dimetylsulfoksid i en konsentrasjon mellom 0,1 og 50 % uttrykt som en volum% av volumet av startbufferen.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, hvori dimetylsulfoksidkonsentrasjon er 1,25 %.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 4, hvori de organiske oppløsningsmidlene er valgt fra n-heksan, toluen, benzen og n-butanol.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, hvori det organiske oppløsningsmiddelet er n-heksan i en konsentrasjon mellom 0,1 og 40 % uttrykt som volum% av volumet av startbufferen.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, hvori n-heksankonsentrasjon er 1,25 % eller 2,5 %.

14. Fremgangsmåte ifølge de foregående krav, hvori det bivalente metalloksidet er kalsium eller magnesium eller sinkoksid i en konsentrasjon mellom 0,1 og 1 M.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, hvori konsentrasjonen av de valgte oksidene er 0,33 eller 0,54 M.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvori forbindelsen er fosfatidylcholin og serinkonsentrasjonen ligger i området mellom 1 og 5 g/g av fosfatidylcholin.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, hvori serinkonsentrasjonen ligger i området mellom 2 og 3 g/g av fosfatidylcholin.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvori forbindelsen er fosfatidylcholin og fos-fatidylcholinet er av animalsk og/eller vegetabilsk opprinnelse, naturlig eller syntetisk, til stede i renset form eller som råmateriale, ved en startkonsentrasjon på mellom 10 og 500 mg/ml, fortrinnsvis mellom 200 og 300 mg/ml.

19. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, hvori transfosfatidyle-ringsreaksjonenen utføres ved en temperatur på mellom 20 °C og 60 °C og fortrinnsvis ved 45 °C.

20. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, hvori transfosfatidyleringsreaksjonen utføres ved en temperatur på mellom 20 °C og 60 °C og fortrinnsvis ved 55 °C.

21. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, hvori PLD-enzymet er av fermentativ opprinnelse avledet fra mikroorganismen Streptoverticillium hachijoense, anvendt i renset, delvis renset eller ikke-renset form.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 21, hvor forbindelsen er fosfatidylcholin og konsentrasjonen av PLD som anvendes, varierer mellom 1 og 100 enheter/g av fosfatidylcholin.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 22, hvori konsentrasjonen av PLD som anvendes varierer mellom 1 og 10 enheter/g av fosfatidylcholin.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 21, hvor enzymet PLD avledet fra mikroorganismen Streptoverticillium hachijoense er renset ved hjelp av de følgende trinn: I) fjerning av fremstillingsmiddelet ved mikrofiltrering med en porestørrelse på 0,2 pm; II) ultrafiltrering gjennom filtre med en molekylær cut-off på 10.000 D; III) ultrafiltrering gjennom filtre med membraner med en molekylær cut-off på 300.000 D: IV) ultrafiltrering gjennom membraner med en molekylær cut-off på 10.000 D for å rekonsentrere enzymet og dialysere det mot Tris-HCI-buffer.