ES2206099T3 - Un procedimiento para la preparacion de fosfatidilserinas. - Google Patents

Un procedimiento para la preparacion de fosfatidilserinas.

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ES2206099T3 ES00108605T ES00108605T ES2206099T3 ES 2206099 T3 ES2206099 T3 ES 2206099T3 ES 00108605 T ES00108605 T ES 00108605T ES 00108605 T ES00108605 T ES 00108605T ES 2206099 T3 ES2206099 T3 ES 2206099T3
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Abstract

Un procedimiento para la preparación de fosfatidilserinas de fórmula (I) en la que R1 y R2 son independientemente, acilos C10-C30 saturados, monoinsaturados o poliinsaturados, x = OH o OM, en la que M = metal alcalino o alcalinotérreo, amoniaco, alquilamonio (incluyendo la sal interior), comprendiendo la reacción de fosfátidos de fórmula general (II) en la que R1, R2 y x tienen los significados definidos anteriormente, y R3 = CH2-CH2-NH2 o CH2-CH2-N+(CH3)3, con serina racémica o enantioméricamente pura, preferiblemente con (L)-serina, en presencia de una fosfolipasa D (PLD), caracterizado porque el medio de reacción es una dispersión acuosa y porque la reacción se lleva a cabo en presencia de uno o más tensioactivos en cantidades inferiores a 0, 4 g por gramo de fosfátidos.

Description

Un procedimiento para la preparación de fosfatidilserinas.
La presente invención trata de un procedimiento para la preparación de fosfatidilserinas.
Más particularmente, la invención trata de un procedimiento para la preparación de fosfatidilserinas partiendo de fosfolípidos naturales o sintéticos, mediante reacción de los mismos con serina en un medio acuoso.
Las fosfatidilserinas son de múltiple importancia, en particular en la producción de composiciones farmacéuticas adecuadas para el tratamiento de desórdenes cerebrales involutivos de diferente naturaleza, tales como deterioro senil o patologías vasculares, en la preparación de formulaciones liposomales especiales, y más recientemente, la comercialización de composiciones dietéticas que contienen lecitinas naturales, en particular lecitina de soja, enriquecida en fosfatidil-(L)-serina, denominada en lo sucesivo PS, que contiene también residuos acilo de ácidos grasos poliinsaturados.
Dado que se necesitan cada vez más cantidades industriales de PS de bajo coste, el solicitante llevó a cabo un amplio estudio con objeto de encontrar las condiciones para la preparación de este producto satisfaciendo los requerimientos de practicabilidad en una escala industrial.
El documento US 5.700.668, en nombre del solicitante, describe un procedimiento para la preparación de PS que, al contrario que los de la técnica anterior (véase, en particular, Comfurius, P. y col., Biochim. Biophys. Acta 488, 36 (1977); Yamane y col., Biochim. Biophys. Acta 1003, 277 (1989); documentos JPA63 036.791 y JPA02 079.990; y J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 919 (1995)), permite preparar PS con buenos rendimientos en una escala industrial también a partir de materiales de partida impuros y sin necesidad de purificaciones cromatográficas.
El procedimiento descrito en dicha patente comprende la reacción de fosfátidos naturales o sintéticos con serina en un sistema bifásico consistente en una disolución del fosfátido de partida en un disolvente orgánico, típicamente tolueno, y de una disolución acuosa que contiene serina y fosfolipasa D. Manteniendo dicho sistema exhaustivamente agitado, los fosfátidos se transforman en PS, que puede recuperarse desde la fase orgánica mediante precipitación con acetona.
Un procedimiento similar, aunque proporciona fosfatidilserina a gran escala con buenos rendimientos, se desvía de la tendencia actual de procedimientos químicos industriales que implican un uso reducido de disolventes orgánicos y un mínimo de subproductos. Este procedimiento, de hecho, implica el uso (y reciclado) de cantidades importantes de disolventes orgánicos y su recuperación tanto durante la reacción como durante el aislamiento del producto final.
Comfurius y col., Journal of Lipoid Research, vol. 31, 1990, 1719-1721, describe reacciones a pequeña escala en las que la cantidad de tensioactivo que debe usarse para permitir la reacción completa es un 1% (p/v) cuando la concentración de sustrato es 10 mg/ml, y 2% cuando la concentración de sustrato es 25 mg/ml. Estos valores corresponden a una proporción de tensioactivo a sustrato de al menos 80%.
La presente invención aspira a proporcionar un procedimiento para la preparación de fosfatidilserinas a una escala industrial, lo que supera los inconvenientes mencionados anteriormente en relación con la técnica anterior.
Este problema se ha resuelto, de acuerdo con la invención, mediante un procedimiento para la preparación de fosfatidilserinas de fórmula (I)
1
en la que R_{1} y R_{2} son independientemente, acilos C_{10}-C_{30} saturados, monoinsaturados o poliinsaturados,
x = OH o OM, en la que M = metal alcalino o alcalinotérreo, amoniaco, alquilamonio (incluyendo la sal interior),
comprendiendo la reacción de fosfátidos de fórmula general (II)
2
en la que R_{1}, R_{2} y x tienen los significados definidos anteriormente, y R_{3} = CH_{2}-CH_{2}-NH_{2} o CH_{2}-CH_{2}-N^{+}(CH_{3})_{3},
con serina racémica o enantioméricamente pura, preferiblemente con (L)-serina, en presencia de una fosfolipasa D (PLD), caracterizada por que la reacción se lleva a cabo en una dispersión acuosa, preferiblemente en presencia de sales de calcio. La serina se añade habitualmente a una dispersión acuosa tamponada de fosfátidos.
El material de partida usado en el procedimiento puede ser tanto una fosfatidilcolina sintética (PC), como DiMiristoilFosfatidilColina (DMPC), como una fosfatidilcolina natural o una mezcla de fosfolípidos tales como lecitina de soja o de huevo, o una de las mezclas de fosfolípidos disponibles comercialmente, obtenidas mediante purificación parcial de lecitina de soja o de huevo.
En lo que se refiere al coste del proceso, es especialmente conveniente usar materiales de partida derivados de la lecitina debido tanto a su bajo coste como al hecho de que la fosfatidiletanolamina (PE), que es un importante componente de estas mezclas, se transforma en PS bajo estas condiciones de reacción.
El material de partida debería dispersarse exhaustivamente en un medio acuoso antes de la adición de otros reactivos, con objeto de estimular la reactividad.
La dispersión se lleva a cabo manteniendo el material fosfolípido de partida en agitación durante 1-10 horas a 20-50ºC con 3-10 volúmenes de agua o disoluciones salinas.
El uso de tensioactivos en esta etapa estimula la dispersión del sustrato y, por tanto, la tasa de reacción.
Pueden usarse convenientemente tensioactivos iónicos o no iónicos; más convenientemente, el tensioactivo es la sal sódica de bis(2- etilhexil)sulfosuccionato (AOT) o Tween 80® en cantidades desde 0,01 hasta 0,4 g por gramo de sustrato.
El efecto de estos tensioactivos es especialmente favorable cuando se usan fosfatidilcolinas, como DMPC, que presentan una baja tendencia a dispersarse en un medio acuoso.
Una característica adicional de esta invención es que es posible eliminar fácilmente los disolventes alcohólicos, en particular el etanol, que a menudo contaminan las preparaciones de fosfolípidos naturales (por ejemplo, fracciones enriquecidas en fosfatidilcolina obtenidas a partir de lecitina de soja) y que interfieren en la subsiguiente reacción de formación de PS al reaccionar en presencia de fosfolipasa D para dar los correspondientes fosfatidil derivados (como fosfatidiletanol cuando hay etanol presente en la mezcla).
Esta eliminación puede llevarse a cabo convenientemente mediante la dispersión del fosfolípido de partida en una disolución salina acuosa, decantando la suspensión y eliminando la fase líquida que contiene el alcohol disuelto en ella.
Como disolución salina acuosa puede usarse cualquier disolución salina con una densidad lo suficientemente alta como para separar fácilmente el material de partida, preferiblemente una disolución de cloruro cálcico o un tampón de acetato sódico/ácido acético, o ambos.
A la dispersión acuosa del material de partida se le añade una disolución acuosa que contiene serina, cloruro cálcico, un tampón para controlar el pH y fosfolipasa D.
La cantidad de serina variará convenientemente entre 4 y 20 moles de serina por mol de fosfolípido a convertir en PS. La serina puede estar en la forma D, L o racémica, para obtener en cualquier caso los correspondientes fosfatidil derivados.
El cloruro cálcico es la fuente de ión calcio que favorece las reacciones catalizadas por la fosfolipasa D; además, la presencia de ión calcio provoca la separación de la fosfatidilserina en una forma más fácilmente filtrable tras la finalización de la reacción.
La concentración de cloruro cálcico varía preferiblemente entre 0,05 y 0,5 M.
El pH de la disolución acuosa dependerá del origen de la enzima usada, y variará preferiblemente entre pH=4 y pH=9, incluido. En el caso de que las enzimas ejerzan su actividad en un medio sustancialmente ácido, la disolución acuosa estará tamponada preferiblemente con un tampón acetato de 0,02 M a 0,2 M.
Para llevar a cabo la reacción, debería usarse convenientemente una enzima con una actividad transfosfatidilante mayor que la actividad hidrolizante. Podría usarse ventajosamente una enzima de origen fermentativo, más convenientemente la enzima obtenida mediante fermentación del microorganismo depositado en el ATCC con el número 55717.
La enzima puede usarse tanto en su forma bruta, a saber, la mezcla de fermentación después de filtrar el microorganismo, o más preferiblemente, tras la purificación mediante ultrafiltración a través de membrana con un adecuado corte para eliminar impurezas de bajo peso molecular. La disolución rica en enzima de la ultrafiltración puede usarse como tal o puede criodesecarse para obtener la enzima en la forma sólida. La cantidad de enzima varía preferiblemente desde 10 a 100 unidades por gramo de fosfátido (la actividad enzimática se determina mediante el ensayo descrito en Biotechn Techn 7 795 (1993)).
La reacción se lleva a cabo preferiblemente a 25-60ºC, más preferiblemente desde 40 hasta 50ºC.
La PS se recupera mediante filtración de la mezcla de reacción, lavando el sólido con agua para eliminar la serina y las sales presentes.
Un aspecto particularmente ventajoso del procedimiento de acuerdo con la invención es que el producto de reacción (PS) se separa de la mezcla de reacción en una forma tal que la recuperación puede realizarse mediante simple filtración, sin necesidad de precipitar mediante la adición de disolventes.
La principal ventaja del procedimiento de acuerdo con la invención es la posibilidad, inesperada en vista de la técnica anterior, de llevar a cabo la reacción de transfosfatidilación de fosfatidilcolina y de fosfátidos similares en un medio acuoso, para obtener fosfatidilserina de buena pureza y con rendimientos altamente satisfactorios.
Las características y ventajas del procedimiento de la invención se detallarán adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1
Se añadieron 5 g de fosfatidilcolina de soja de un 95% de pureza a 30 ml de un tampón acetato 0,1 M a un pH de 4,5. La mezcla se agitó a 40ºC durante 1 hora para dispersar homogéneamente el fosfolípido en la fase acuosa. La disolución enzimática consistió en 80 ml de una disolución de fosfolipasa D con una actividad de 2 U/g, obtenida mediante fermentación del microorganismo depositado con el número ATCC55717, dializando después la disolución de enzima bruta a través de una membrana de ultrafiltración con un corte de 10.000 Dalton, hasta la completa eliminación de las impurezas de bajo peso molecular, se usaron como enzima. A esta disolución enzimática se añadieron 40 g de L-serina y 2,9 g de cloruro cálcico. La disolución resultante se añadió a la dispersión de fosfatidilcolina, y la mezcla se calentó a 45ºC.
La reacción se agitó durante 6 horas. El sólido se filtró, se lavó con agua y se secó. Peso final: 4,24 g.
Composición HPLC: PS 90,7%, PC 1,4% PA (ácido fosfatídico) 6,2%.
Ejemplo 2
Se añadieron 5 g de fosfatidilcolina de soja de un 95% de pureza a 30 ml de un tampón acetato 0,1 M a un pH de 4,5 que contenía 0,08 g de Tween 80®. La mezcla se agitó a 40ºC durante 1 hora para dispersar homogéneamente el fosfolípido en la fase acuosa. A 80 ml de una disolución de fosfolipasa D con una actividad de 2 U/g, obtenida según se describe en el ejemplo 1, se añadieron 40 g de L-serina y 2,9 g de cloruro cálcico. La disolución resultante se añadió a la dispersión de fosfatidilcolina, y la mezcla se calentó a 45ºC. Después de 90 minutos, el análisis por HPLC mostró la composición PS 69,7%, PC 11,6%, PA 5,3%.
La reacción se agitó durante 4 horas adicionales. El sólido se filtró, se lavó con agua y se secó. Peso final: 4,76 g.
Composición HPLC: PS 90,2%, PC 0,6% PA 6,4%.
Ejemplo 3
Se añadieron 5 g de fosfatidilcolina de soja de un 95% de pureza a 30 ml de un tampón acetato 0,1 M a un pH de 4,5 que contenía 0,3 g de AOT. La mezcla se agitó a 40ºC durante 1 hora para dispersar homogéneamente el fosfolípido en la fase acuosa. A 80 ml de una disolución de fosfolipasa D con una actividad de 2 U/ng, obtenida según se describe en el ejemplo 1, se añadieron 40 g de L-serina y 2,9 g de cloruro cálcico. La disolución resultante se añadió a la dispersión de fosfatidilcolina, y la mezcla se calentó a 45ºC.
Después de reaccionar durante 6 horas, el sólido se filtró, se lavó con agua y se secó. Peso final: 4,16 g.
Composición HPLC: PS 88,8%, PC 0,6% PA 4,1%.
Ejemplo 4
Se añadieron 25 g de una mezcla de fosfolípidos obtenida mediante enriquecimiento de lecitina de soja, cuyos principales componentes son PC 66%, PE 17%, PA 2%, a 100 ml de un tampón acetato 0,1 M a un pH de 4,5. La mezcla se agitó a 40ºC durante 1 hora para dispersar homogéneamente el fosfolípido en la fase acuosa. Se preparó separadamente una disolución de 80 ml de tampón acetato 0,1 M a un pH de 4,5, 40 g de L-serina y 2,9 g de cloruro cálcico. A esta disolución se añadieron 188 mg del sólido resultante de la criodesecación de la disolución de fosfolipasa D obtenida según se describe en el ejemplo 1; la actividad de este sólido es de 0,9 U/mg. La disolución resultante se añadió a la dispersión de fosfolípido, y la mezcla se calentó a 45ºC.
La mezcla se agitó durante 3 horas. El sólido se filtró, se lavó con agua y se secó. Peso final: 22,8 g.
Composición HPLC: PS 59,8%, PC 1,6% PA 6,1%, PE 6,7%.
Ejemplo 5
Se añadieron 25 g de la mezcla de fosfolípidos usada como material de partida en el ejemplo 4 a 100 ml de un tampón acetato 0,1 M a un pH de 4,5. La mezcla se agitó a 40ºC durante 1 hora para dispersar homogéneamente el fosfolípido en la fase acuosa. Se preparó separadamente una disolución de 80 ml de tampón acetato 0,1 M a un pH de 4,5, 10 g de L-serina y 2,9 g de cloruro cálcico. A esta disolución se añadieron 90 mg de la enzima criodesecada preparada según se describe en el ejemplo 4. La disolución resultante se añadió a la dispersión de fosfolípido, y la mezcla se calentó a 45ºC y se agitó durante 16 horas. Se determinó la composición final mediante HPLC: PS 39,1%, PC 8,3% PA 16,6%, PE 6,8%.
Ejemplo 6
La reacción se llevó a cabo en las mismas condiciones descritas en el ejemplo 5, pero manteniendo una temperatura de 55ºC durante la reacción. La reacción se interrumpió después de 16 horas. El análisis de HPLC mostró la siguiente composición: PS 41,7%, PC 8,3% PA 11,0%, PE 9,9%.
Ejemplo 7
La reacción se llevó a cabo en las mismas condiciones descritas en el ejemplo 4, pero sin la adición de cloruro cálcico. La reacción se interrumpió después de 20 horas. El análisis de HPLC mostró la siguiente composición: PS 41,2%, PC 15,9% PA 10,9%, PE 7,4%.
Ejemplo 8
Se añadieron 2 g de la mezcla de fosfolípidos usada como material de partida en el ejemplo 4 a una disolución de 3 g de cloruro cálcico en 40 ml de agua en un embudo de separación. La mezcla se agitó a 25ºC durante 1 hora; se interrumpió la agitación y, después de tres horas de reposo, se extrajeron 36 ml de fase acuosa a través de la válvula inferior. Se preparó separadamente una disolución de 6,5 ml de tampón acetato 0,1 M a un pH de 4,5 y 3,2 g de
L-serina. A esta disolución se añadieron 15 mg de la enzima criodesecada preparada según se describe en el ejemplo 4. La disolución resultante se añadió a la dispersión de fosfolípidos, y la mezcla se calentó a 45ºC.
La reacción se agitó durante 1 hora. Se determinó la composición final mediante HPLC: PS 55,7%, PC 9,4% PA 4,0%, PE 9,0%. La formación de fosfatidiletanol en esta reacción estuvo por debajo del límite de detectabilidad por TLC (0,1%).
Ejemplo 9
Se agitaron a 45ºC durante 1 hora, 5 g de DiMiristoilFosfatidilColina (DMPC), 1,6 g de Tween 80® y 30 ml de un tampón de acetato sódico 0,1 M a un pH de 4,5. La dispersión se añadió a una disolución de 80 ml de la disolución de fosfolipasa D acuosa obtenida según se describe en el ejemplo 1, 40 g de serina y 2,9 g de cloruro cálcico; la temperatura se llevó a 50ºC manteniendo la agitación durante 17 horas. El sólido se filtró, se lavó con agua y se secó. Peso final: 5,4 g.
Composición HPLC: PS 83,2%, PC 4,3%, PA 11,7%.
Ejemplo 10
Se agitaron a 50ºC durante 45 minutos, 5 g de DiMiristoilFosfatidilColina (DMPC), 1,0 g de AOT y 30 ml de un tampón de acetato sódico 0,1 M a un pH de 4,5. A la dispersión se añadió una disolución de 80 ml de la disolución de fosfolipasa D acuosa obtenida según se describe en el ejemplo 1, 40 g de L-serina y 2,9 g de cloruro cálcico; la temperatura se llevó a 50ºC manteniendo la agitación durante 20 horas. El sólido se filtró, se lavó con agua y se secó. Peso final: 3,66 g.
Composición HPLC: PS 85,2%, PC 10,5%, PA 3,5%.
Ejemplo 11
Se añadieron 10 g de una fracción de lecitina de soja no desoleada enriquecida en PC (composición: triglicéridos 50%, PC 35%, PE 8%) a 30 ml de un tampón de acetato sódico a pH 4,5 y se dejaron bajo agitación a 25ºC durante 1 hora. La mezcla se añadió a una disolución de 80 ml de la disolución de la enzima fosfolipasa D preparada según se describe en el ejemplo 1, 40 g de L-serina y 2,9 g de cloruro cálcico. La reacción se agitó a 45ºC durante 11 horas, se separó la fase acuosa y al sólido gomoso se añadieron 100 ml de acetona. Tras la filtración y el secado, se obtuvieron 3,9 g de producto. Análisis HPLC: PS 58%, PC 2,0%, PA 17,0%, PE 1,8%.

Claims (22)

1. Un procedimiento para la preparación de fosfatidilserinas de fórmula (I)
3
en la que R_{1} y R_{2} son independientemente, acilos C_{10}-C_{30} saturados, monoinsaturados o poliinsaturados, x = OH o OM, en la que M = metal alcalino o alcalinotérreo, amoniaco, alquilamonio (incluyendo la sal interior), comprendiendo la reacción de fosfátidos de fórmula general (II)
4
en la que R_{1}, R_{2} y x tienen los significados definidos anteriormente, y R_{3} = CH_{2}-CH_{2}-NH_{2} o CH_{2}-CH_{2}-N^{+}(CH_{3})_{3}, con serina racémica o enantioméricamente pura, preferiblemente con (L)-serina, en presencia de una fosfolipasa D (PLD), caracterizado porque el medio de reacción es una dispersión acuosa y porque la reacción se lleva a cabo en presencia de uno o más tensioactivos en cantidades inferiores a 0,4 g por gramo de fosfátidos.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la reacción se lleva a cabo en presencia de sales de calcio, preferiblemente en presencia de cloruro cálcico.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dichas sales de calcio son cloruro cálcico y están presentes en concentraciones que varían entre 0,05 y 0,5 M.
4. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la cantidad de serina varía desde 4 a 20 moles por mol de fosfolípidos.
5. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dichos fosfátidos contienen alcoholes como impurezas en cantidades inferiores al 0,1%.
6. Un procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicho alcohol es etanol.
7. Un procedimiento según la reivindicación 5, en el que los fosfolípidos, antes de someterse a la reacción con serina, se purifican de dichos alcoholes mediante la suspensión de dichos fosfolípidos en una disolución salina acuosa y la subsiguiente decantación de la fase líquida.
8. Un procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha disolución salina acuosa es una disolución tampón de cloruro cálcico y/o ácido acético/acetato sódico.
9. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha dispersión acuosa de fosfátidos se tampona a un pH que varía entre 4 y 9, preferiblemente entre 4 y 4,5.
10. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha reacción se lleva a cabo a temperaturas que varían entre 25 y 60ºC, preferiblemente entre 40 y 50ºC.
11. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha fosfolipasa D se obtiene a partir de caldos de fermentación centrifugados de cepas de microorganismos que producen PLD extracelular con una elevada capacidad de transfosfatidilación.
12. Un procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicha fosfolipasa D es producida por la cepa
Streptomyces ATCC 55717.
13. Un procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicha fosfolipasa D se purifica mediante ultrafiltración de una disolución de la misma.
\newpage
14. Un procedimiento según la reivindicación 13, en el que la ultrafiltración se lleva a cabo usando una membrana con un corte de 10.000 Dalton.
15. Un procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicha disolución ultrafiltrada se somete a criodesecado para obtener una fosfolipasa D en la forma sólida.
16. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha dispersión acuosa de fosfátidos se obtiene mezclando dichos fosfátidos con 3-10 volúmenes de agua o de disoluciones salinas, y manteniendo la mezcla resultante en agitación durante 1-10 horas a 20-50ºC.
17. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho uno o más tensioactivos están presentes en cantidades de 0,01-0,4 g por gramo de fosfátidos.
18. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho uno o más tensioactivos son bis(2-etilhexil)sulfosuccionato (AOT) o monooleato polioxietileno de sorbitán (Tween 80®).
19. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la fosfatidilserina de fórmula (I) se recupera de la mezcla de reacción mediante filtración y lavado con agua.
20. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dichos fosfátidos de fórmula (II) son mezclas de fosfatidilcolina y/o fosfatidiletanolamina de origen natural, elegidas de lecitinas de soja y de huevo, con un contenido en fosfolípido que varía desde el 20% al 95%.
21. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dichos fosfátidos de fórmula (II) son fosfatidilcolinas sintéticas.
22. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la serina se añade a una dispersión acuosa tamponada de fosfátidos.
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