KR101055094B1 - 양배추 포스포리파아제 d에 의한 난황 인지질로부터 포스파티딜세린의 생합성 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고등 식물인 양배추에서 추출된 포스포리파아제 D (PLD) 효소를 이용하여 난황 인지질 (egg phospholipid)이 화학적 변형 없이 천연적으로 포스파티딜세린(PS)을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 유전자조작 미생물 효소를 이용하는 기존 기술과 달리 고등식물인 양배추 포스포리파아제 D (PLD) 를 이용하는 방법을 제시하는 것이다.

본 발명은 난황 인지질 반죽(paste)을 칼슘 수용액에 용해하는 제 1 단계; 난황 인지질 - 칼슘 수용액에 세린(serine)을 용해시키는 제 2 단계; 용액에 실리카 겔을 혼합하는 제 3 단계; 양배추 포스포리파아제 D (PLD) 효소로서 혼합하여 반응시키는 제 4 단계; 반응된 난황 인지질을 분리하는 제 5 단계, 분리된 인지질에서 포스파티딜세린 (phosphatidylserine, PS) 를 정제하는 제 6 단계를 포함하는 난황 인지질로부터 포스파티딜세린 (PS) 의 제조 방법을 제공한다.

특히, 본 발명은 난황 인지질과 양배추 PLD를 이용하여 제조한 것이기 때문에, 식품으로서 안전성이 높고, 건강 기능성 소재로의 이용 가능성에도 탁월하다.

포스포리파아제, 포스파티딜세린, 양배추, 인지질, 난황 레시틴, phospholipase, phosphatidylserine, cabbage, phospholipid, egg lecithin

Description

양배추 포스포리파아제 D에 의한 난황 인지질로부터 포스파티딜세린의 생합성 방법 {The method for biosynthesis of phosphatidylserine by cabbage phospholipase D from egg yolk phospholipid}

본 발명은 난황 인지질 (egg phospholipid) 이 화학처리가 아닌 천연의 효소를 이용하여 포스파티딜세린의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 건강 기능성 식품 용도로 적합하다.

세포막 내의 지질은 한 분자 내에 두 개의 상반된 특징을 동시에 보유하고 있다. 친수성인 한 개의 머리와 소수성인 한두 개의 탄화수소 꼬리를 가지고 있다. 그러므로 양친매성의 성질을 가진다. 가장 풍부한 막지질은 인지질로 글리세롤에 인산기와 두 분자의 지방산이 결합된 형태이며, 친수성의 머리 부분의 끝은 인지질 군에 따라 특이한 기능기(functional head group)을 갖는다.

인지질은 뇌와 간에 많이 함유되어 있으므로 신경전달이나 효소계의 조절작용에 중요한 역할을 하는데, 특히 포스파티딜세린 (PS), 포스파티딜글리세롤 (phosphatidylglycerol, PG) 등의 인지질은, 각각 유용한 생리작용이나 특이한 물성을 갖고 있어, 의약품, 식품소재, 유화제, 화장품 등의 용도로 사용되고 있다. 예를 들면, 인지질 영양소인 포스파티딜세린(PS)은 뇌 세포막에서의 주요 산성 인지질 성분으로 막 관련 신경세포 과정에서 결정적인 역할을 수행한다. 그러므로 포스파티딜세린(PS)은 노인성 치매증이나 기억장해 등의 예방이나 치료 등을 목적으로 한 약제로서의 이용이 기대되고 있다. 더불어 포스파티딜세린(PS)은 인지 장애가 없는 사람 들에게도 인지를 최적화하는 것에 대해 도울 수 있다. 또한 식이성 포스파티딜세린(PS)은 효과적으로 빠르게 장에서 흡수되고, 혈액에 용해되고, 뇌혈관 장벽을 용이하게 가로질러 뇌에 있는 신경 세포에 도달한다.

이러한 포스파티딜세린은 동물의 조직에 널리 분포되어 있으나 대개 인지질의 8％ 이하로 비교적 그 양이 적으므로, 자연계로부터 대량의 PS를 순수 분리정제하기에는 상당한 어려움이 따른다. 또한 PS의 화학적 합성은 대량생산이 가능하고 원하는 지방산을 인지질에 함유하게 할 수 있는 장점이 있는 반면, 그 공정이 매우 복잡하고 길며 많은 노동력과 생산비가 요구된다. 그리고 PS의 분리정제를 위한 많은 방법이 보고되어 있으나 대부분은 산업적 규모의 생산에 있어서 한계점을 가진다. 따라서 PS생산을 위한 보다 저렴하고 간편한 방법을 모색하기 위해 효소에 의한 생산방법에 관한 연구가 많이 이루어졌다. 이는 대두 또는 난황 등의 레시틴으로부터 생촉매 작용을 이용하여 제조하는 방법이며, 포스포리파제 D(phospholipase D, PLD)와의 포스파티딜 전이 반응(transphosphatidylation)을 이용함으로써 인지질의 기능기가 개질된다.

PLD는 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC)을 반응 시작물질로 하여 글리세린 또는 세린과 같은 하이드록시기(OH)를 포함하는 알코올과의 포스파티딜화 반응 또는 물로 인한 가수분해 반응을 촉매 하여, PC를 PS 또는 PG, PA 등으로 전환시킨다. PS 생성을 위한 반응 시스템에서 반응 기질인 지질(lipid)이 수용액에서 리포좀을 형성하여 효소 내에 존재할 경우 효소 활성이 저하되는 점과 기질인 지질이 물에 불용성이라는 점으로 인해 유기용매 또는 계면활성제가 전형적으로 요구된다. 따라서 효소와 수용체인 세린이 녹아있는 수용액과 지질이 녹아있는 유기용매를 포함하는 이상계 시스템이 일반적으로 사용되며, 이때 효소반응은 물과 유기용매 사이의 표면(interfacial area)에서 일어난다. 그러나 대부분의 의약품과 식품의 생산에 있어 계면활성제와 유기용매의 사용은 문제시 되고 있다. 특히 헥산과 에틸아세테이트를 제외하고는 모두 식품용으로 사용할 수 없는 비교적 독성이 큰 용매들이고, 유기용매 사용에 의한 효소의 불활성화가 심하여 효소 재사용 등이 어렵다는 단점이 있다.

본 발명은 따라서 이러한 문제점을 해결하고자, 수용액 시스템을 적용하여 독성 유기용매를 사용하지 않을 뿐만 아니라 효소의 불활성화도 심하지 않으며 동시에 높은 반응효율로 포스파티딜세린 (PS) 을 합성하도록 한다. 그러나 균일상 반응에서는, 반응계에 다량의 물이 존재하기 때문에, 반응을 계속하면 포스포리파제 D가 갖는 가수분해활성에 의해, 반응의 중간 생성물인 포스파티딕 산 (Phosphatidic Acid; PA)이 많이 생성되고 최종 목적 생성물은 적게 생성된다. 그러므로 작용기 전이 반응 (transphosphatidylation) 을 증가시키는 방법을 제공하 는데 그 목적을 두고 있다.

상기와 같은 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 난황 인지질 칼슘 수용액에 세린과 실리카 겔을 넣고 양배추 PLD 효소를 반응시키는 포스파티딜세린의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 난황 인지질 반죽(paste)을 칼슘 수용액에 용해하는 제 1 단계; 난황 인지질 - 칼슘 수용액에 세린(serine)을 용해시키는 제 2 단계; 용액에 실리카 겔을 혼합하는 제 3 단계; 양배추 포스포리파아제 D (PLD) 효소로서 혼합하여 반응시키는 제 4 단계; 반응된 난황 인지질을 분리하는 제 5 단계, 분리된 인지질에서 포스파티딜세린 (phosphatidylserine, PS) 를 정제하는 제 6 단계를 포함하는 난황 인지질로부터 포스파티딜세린(PS) 의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 난황 인지질과 양배추 효소를 이용하므로 인체 안전성도 크게 향상되었다. 제조 과정 중 수용액 중에서 50 ∼ 60 ℃에서 수십시간 반응해도 변질되지 않는 것으로 확인되었다.

본 발명을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서는 칼슘 (CaCl₂) 수용액에 난황 인지질 (GL-90E, (주)고센바이오텍)을 녹이고, 세린 (L-serine) 을 포화시켜 기질로 사용한다. 교반속도는 300 ∼ 600 rpm으로 조절하며 양배추 PLD 효소를 첨가하여 반응시킨다. 특히 첨가되는 소재 종류를 최소로 줄여서 더 건강에 유익하게 개량하였다.

난황 인지질로부터 양배추 포스포리파아제 D (PLD) 로 포스파티딜세린 (PS) 의 제조 방법을 단계 별로 설명하면 다음과 같다.

제 1 단계 : 난황 인지질 반죽(paste)을 칼슘 수용액에 용해시키는 공정

칼슘을 10 ∼ 50 mM 최종농도로 조절하여 정제수에 녹인 후, 난황 인지질 20 ∼ 80 g/L 최종 농도로 넣고, 온도 50 ∼ 60 ℃ 로 가열 교반하며 용해시킨다.

제 2 단계 : 난황 인지질 - 칼슘 수용액에 세린을 용해시키는 공정

최종 수용액의 질량 기준으로 세린 (L-serine) 분말을 30 ∼ 40 ％ 첨가하여 포화 상태를 유지하는 것이다.

제 3 단계 : 용액에 실리카 겔을 혼합하는 공정

용액 속에서 흡착제로 작용할 실리카 겔을 혼합한다. 실리카 겔의 입자 크기는 70 ∼ 230 메쉬(mesh)로 하되, 첨가량은 인지질 질량의 20 ∼ 25 배로 조절하여 혼합한다.

제 4 단계 : 양배추 PLD를 효소로서 혼합하여 반응시키는 공정

양배추 포스포리파아제 D (PLD) 효소를 기질 mg 당 효소 1 unit 로 혼합하여 300 ∼ 600 rpm 으로 강하게 교반하면서 반응시킨다.

제 5 단계 : 반응 후 난황 인지질을 추출하는 공정

반응계로부터 인지질을 분리하기 위하여 충분히 예열된 주정 (에탄올 95％, 50 ∼ 60 ℃)을 가하여 인지질을 용해시켜 추출한다.

제 6 단계 : 포스파티딜세린 (PS) 을 정제하는 공정

추출된 인지질에서 포스파티딜세린 (PS) 을 정제하기 위하여 에탄올-아세트산에틸-물 수성2상계로 아세트산에틸과 물의 양을 기질 상태에 따라 조절하여 PS를 분배시켜 정제한다.

이와 같이 6단계 공정을 수행하는 포스파티딜세린 (PS) 의 제조한다.

이 방법을 기존 기술과 비교되는 특징이 있다. 미생물 유래 효소, 화학적인 계면활성제, 완충용액 등 여타의 화학물질을 사용하지 않음을 특징으로 한다. 이로서 식품 안전성을 높였다.

이하, 실시 예와 비교 예에 의거 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이 실시 예는 발명을 이해시키기 위한 예시일 뿐 발명의 범위를 제한하지는 않는다.

# 실시 예 1 : 기질 종류별 비교

기질 종류별로 실시한 결과 아래 표와 같은 결과를 얻었다 (표 1). 순수한 PC를 기질로 하였을 경우 PS 생성율이 25.6％로 가장 높았고, 난황 인지질(GL-90E, (주)고센바이오텍)의 경우 16.1％의 PS가 생성되었다. 또한 대두 인지질의 경우 PI를 많이 포함하고 있어 상대적으로 PC함량이 낮아 12.4％로 가장 적은 함량의 PS가 생성되었다.

표 1 기질의 종류에 의한 PS 생성율 변화

# 실시 예 2 : 흡착제의 종류별 비교

양배추 PLD를 이용하여 인지질에 대한 흡착제의 종류 및 비를 달리하여 생성된 PS의 양을 비교하였다. 흡착제를 첨가하지 않을 경우 포스파티딜기 전이반응이 일어나지 않았고, CaSO₄의 경우 PS 생성반응에서 좋은 흡착제로 쓰이고 있지만, 본 실험에서는 실리카 겔을 사용하였을 때의 결과가 더 좋았으며, 입자가 미세한 실리카 겔이 약 5％ 정도 더 높은 전환율을 보였다. (표 2) 그러나 미세한 실리카 겔 을 사용할 경우 수분을 다 흡수하여 교반하는 데 어려움이 있으므로 이를 사용하려면 더 많은 반응용액을 사용하여야 한다.

표 2 흡착제 사용에 의한 PS 생성율

# 실시 예 3 : 흡착제의 농도별 비교

실리카 겔의 첨가량을 달리하여 40 ℃에서 20 시간 동안 각각 반응한 결과 인지질 무게 대비 25 배의 실리카 겔을 사용한 경우 전환된 PS의 함량이 가장 높았다.(그림 2) 인지질 대비 30배의 실리카 겔을 사용할 경우 PS 생산율이 저하되었고, 또한 교반하는 데도 어려움이 있었다. 그러므로 PS를 생성하는 데 있어 흡착제의 사용이 요구되며, 인지질의 무게 대비 25배의 실리카 겔 (70∼230mesh)의 사용이 적합하였다.

# 실시 예 4 : 세린의 농도별 비교

양배추 PLD를 이용하여 세린의 농도에 따라 생성된 PS의 양을 비교하였다. 세린의 농도가 증가할수록 PS의 생성량은 증가하는 반면 PA의 생성량은 감소하였다.(도 3) 그러나 50％(w/w) 이상의 L-serine을 사용할 경우 다량의 세린이 반응 액에 용해되지 않았고, PS 생성율 또한 저하되었다. 그러므로 35∼40％(w/w)의 세린 용액이 반응 액으로 적합하였다.

# 실시 예 5 : 계면활성제의 영향 비교

포스파티딜기 전이반응에 사용되는 기질인 지질의 불용성으로 인해 PS의 전환율이 저하될 수 있으므로 계면활성제를 첨가하여 PS 생성반응을 수행하였다. 양배추 유래의 PLD를 이용한 PS 생성반응에서 Tween 80, Triton X-100, sorbitan monostearate를 첨가하여 그 결과를 비교하였다. Tween 80을 첨가하였을 경우 생성된 PS가 30％로 가장 높았다. 그러나 의약품과 식품의 생산에 있어 계면활성제의 사용은 문제시 되므로 이를 사용하지 않는 방법을 선택하도록 한다.

# 실시 예 6 : 시간 경과에 따른 효소 활성 안정성 확인

양배추 유래의 PLD가 50℃에서 40시간 이상까지 효소 활성이 안정함을 확인하였다. (도 4)

# 실시 예 7 : 수성2상계에 의한 분배 정제

PS를 포함한 인지질 1 질량에 알코올 1, 물 4, 아세트산에틸 4로 혼합 후 분배하면 아래 층 용액에 PS 농도가 농축된다. 45 ％-PS 인지질로 작업하면 63 ％-PS 인지질을 생산 하였다.

본 발명은 기질과 효소를 모두 천연 소재를 이용하므로 건강 기능성 식품 안전성이 높고, 두뇌 건강에 매우 유익하므로 응용의 범위가 매우 넓다.

도 1 은 난황 인지질로부터 양배추 포스포리파아제 D에 의한 포스파티딜세린의 생합성 방법의 전체 순서도이다. 공정 (표기: 정사각형, 마름모) 별로 투입되는 재료 (표기: 6각형)와 부산물 (표기: 사다리꼴), 주산물(표기: 타원형)을 표시한다.

도 2 는 Silica gel의 농도에 의한 PS 생성율 비교 그래프이다.

도 3 은 L-serine의 농도에 의한 PS 생성율 비교 그래프이다.

도 4 는 PS 생성율의 시간적 변화 비교 그래프이다.

Claims (2)

1. 난황 인지질로부터 양배추 포스포리파아제 D (PLD) 로 포스파티딜세린 (PS) 의 제조 방법으로서,

   제 1 단계 : 난황 인지질을 염화칼슘 수용액에 용해시키는 공정

   난황 인지질 20 ∼ 80 g/L, 염화칼슘 10 ∼ 50 mM 을 온도 50 ∼ 60 ℃ 로 정제수에 용해시키는 공정

   제 2 단계 : 난황 인지질 - 염화칼슘 수용액에 L-세린을 용해시키는 공정

   수용액의 질량 기준으로 L-세린을 30 ∼ 40 ％ 첨가하여 용해시키는 공정

   제 3 단계 : 용액에 실리카 겔을 혼합하는 공정

   실리카 겔의 입자크기는 70 ∼ 230 메쉬(mesh)로 하되, 첨가량은 인지질 질량의 20 ∼ 25 배로 조절하여 혼합하는 공정

   제 4 단계 : 양배추 PLD를 효소로서 혼합하여 반응시키는 공정

   양배추 포스포리파아제 D (PLD) 효소를 10 ∼ 200 unit 로 혼합하여 300 ∼ 600 rpm 으로 교반하면서 반응시키는 공정

   제 5 단계 : 반응 후 난황 인지질을 추출하는 공정

   반응계로부터 인지질을 분리하기 위하여 섭씨 50 ~ 60 도로 가온한 95%의 주정에탄올을 가하여 인지질을 용해시켜 추출하는 공정

   제 6 단계 : 포스파티딜세린 (PS) 을 정제하는 공정

   추출된 인지질에서 포스파티딜세린 (PS) 을 정제하기 위하여 에탄올-아세트산에틸-물 수성2상계로 추출을 하는 공정

   위 공정을 수행함을 특징으로 하는 포스파티딜세린 (PS) 의 제조 방법
2. 제 1항에 있어서, 미생물 유래 효소와 화학적인 합성 계면활성제를 사용하지 않음을 특징으로 하는 포스파티딜세린 (PS) 의 제조 방법

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