KR101122388B1 - 배추 포스포리파아제 d에 의한 난황 인지질로부터 포스파티딜세린의 생합성 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 국내산 배추에서 추출된 포스포리파아제 D (PLD) 에 의해 난황 인지질 (egg phospholipid)을 기질로 천연적으로 포스파티딜세린(PS)을 생합성하는 방법의 효율 향상에 관한 것이다.

상기와 같은 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 기질의 용해 순서를 바꾸고, 반응온도와 교반강도를 높여 기질 분자들의 반응계 내의 이동을 촉진하여 반응 속도를 높였다.

본 발명은 세린을 칼슘 수용액에 용해하는 제 1 단계; 세린 - 칼슘 수용액에 실리카 겔을 혼합하는 제 2 단계; 용액에 난황 인지질을 용해시키는 제 3 단계; 배추 PLD로 반응시키는 제 4 단계; 반응된 난황 인지질을 분리하는 제 5 단계, 분리된 인지질에서 PS를 정제하는 제 6 단계를 포함하는 난황 인지질로부터 PS의 제조 방법을 제공한다.

그 결과, 본 발명은 특히, 국내산 배추 PLD를 이용하여 제조한 것이기 때문에, 식품으로서 안전성이 높고, 건강 기능성에도 탁월하다.

포스포리파아제, 포스파티딜세린, 양배추, 인지질, 난황 레시틴, phospholipase, phosphatidylserine, chinese cabbage, phospholipid, egg lecithin

Description

배추 포스포리파아제 D에 의한 난황 인지질로부터 포스파티딜세린의 생합성 방법 {The method for biosynthesis of phosphatidylserine by chinese cabbage phospholipase D from egg yolk phospholipid}

본 발명은 난황 인지질 (egg phospholipid) 이 천연의 효소로 포스파티딜세린의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 건강 기능성 식품에 유용하다.

인지질은 뇌와 간에 많이 함유되어 있으므로 신경전달이나 효소계의 조절작용에 중요한 역할을 하는데, 특히 포스파티딜세린 (PS) 은 각각 유용한 생리작용이나 특이한 물성을 갖고 있어, 의약품, 식품소재, 유화제, 화장품 등의 용도로 사용되고 있다. 예를 들면, 인지질 영양소인 포스파티딜세린(PS)은 뇌 세포막에서의 주요 산성 인지질 성분으로 막 관련 신경세포 과정에서 결정적인 역할을 수행한다. 그러므로 포스파티딜세린(PS)은 노인성 치매증이나 기억장해 등의 예방이나 치료 등을 목적으로 한 약제로서의 이용이 기대되고 있다. 더불어 포스파티딜세린(PS)은 인지 장애가 없는 사람 들에게도 인지를 최적화하는 것에 대해 도울 수 있다. 또한 식이성 포스파티딜세린(PS)은 효과적으로 빠르게 장에서 흡수되고, 혈액에 용해되고, 뇌혈관장벽을 용이하게 가로질러 뇌에 있는 신경 세포에 도달한다.

이러한 포스파티딜세린은 동물의 조직에 널리 분포되어 있으나 대개 인지질의 8％ 이하로 비교적 그 양이 적으므로, 자연계로부터 대량의 PS를 순수 분리정제하기에는 상당한 어려움이 따른다. 따라서 PS생산을 위한 보다 저렴하고 간편한 방법을 모색하기 위해 효소에 의한 생산방법에 관한 연구가 많이 이루어졌다. 이는 대두 또는 난황 등의 레시틴으로부터 생촉매 작용을 이용하여 제조하는 방법이며, 포스포리파제 D(phospholipase D, PLD)와의 포스파티딜 전이 반응(transphosphatidylation)을 이용함으로써 인지질의 기능기가 개질된다.

그러나 대부분의 의약품과 식품의 생산에 있어 계면활성제와 유기용매의 사용은 문제시 되고 있다. 특히 헥산과 에틸아세테이트를 제외하고는 모두 식품용으로 사용할 수 없는 비교적 독성이 큰 용매들이고, 유기용매 사용에 의한 효소의 불활성화가 심하여 효소 재사용 등이 어렵다는 단점이 있다.

본 발명은 따라서 이러한 문제점을 해결하고자, 수용액 시스템을 적용하여 독성 유기용매를 사용하지 않을 뿐만 아니라, 효소의 불활성화와 흡착제 양을 줄이는 동시에, 높은 기질농도와 반응효율로 포스파티딜세린 (PS)을 합성하는 방법을 제공하는 것이 과제이다.

상기와 같은 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 기질의 용해 순서를 바꾸고, 반응온도와 교반강도를 높여 기질 분자들의 반응계 내의 이동을 촉진하여 반응 속도를 높였다.

본 발명은 세린을 칼슘 수용액에 용해하는 제 1 단계; 세린 - 칼슘 수용액에 실리카 겔을 혼합하는 제 2 단계; 용액에 난황 인지질을 용해시키는 제 3 단계; 배추 PLD로 반응시키는 제 4 단계; 반응된 난황 인지질을 분리하는 제 5 단계, 분리된 인지질에서 PS를 정제하는 제 6 단계를 포함하는 난황 인지질로부터 PS의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 배추 포스포리파아제를 이용하므로 식품 안전성과 건강 기능성이 크게 향상되었다.

본 발명을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

기질로는 PC 함량이 높은 기질인 GL-90E가 적합하다고 사료되며, 온도는 60℃에서 반응하는 것이 적절하다. 이때 액상의 PLD 효소를 사용할 경우 흡착제로써 실리카 겔을 반응 인지질 질량의 4배 를 첨가하는 것이 바람직하다. 이렇게 최적화한 조건하에서 평균 50％ 이상의 PS와 30％ 정도의 PA가 생성됨을 확인하였다.

본 발명에서는 칼슘 (CaCl₂ ) 수용액에 세린 (L-serine) 을 녹인 후, 실리카 겔을 혼합한 후, 난황 인지질(GL-90E, (주)고센바이오텍)을 녹여 기질로 사용한다. 교반속도는 300 ～ 600 rpm으로 조절하며 배추 PLD 효소를 첨가하여 반응시킨다. 특히 첨가되는 화학약품이 없어서 더 건강에 유익하게 개량하였다.

난황 인지질로부터 배추 포스포리파아제 D (PLD) 로 포스파티딜세린 (PS) 의 제조 방법을 단계 별로 설명하면 다음과 같다.

제 1 단계 : 세린을 칼슘 수용액에 용해시키는 공정

칼슘을 10 ～ 50 mM 최종농도로 조절하여 정제수에 녹인 후, 수용액의 질량 기준으로 세린 (L-serine) 분말을 30 ～ 40 ％ 첨가하여 용해시킨다. 포화 상태를 유지하는 것이다.

제 2 단계 : 세린 - 칼슘 수용액에 실리카 겔을 혼합하는 공정

용액 속에서 흡착제로 작용할 실리카 겔을 혼합한다. 실리카 겔의 입자 크기는 70 ～ 230 메쉬(mesh)로 하되, 첨가량은 인지질 질량의 1 ～ 5 배로 조절하여 혼합한다.

제 3 단계 : 용액에 난황 인지질을 용해시키는 공정

난황 인지질 20 ～ 100 g/L 최종 농도로 넣고, 온도 50 ～ 70 ℃ 로 가열 교반하며 용해시킨다.

제 4 단계 : 배추 PLD를 효소로서 혼합하여 반응시키는 공정

배추 포스포리파아제 D (PLD) 를 넣되, 기질 1 mg 당 효소 1 unit 를 혼합하여 300 ～ 600 rpm 으로 강하게 교반하면서 반응시킨다.

제 5 단계 : 반응 후 난황 인지질을 추출하는 공정

반응계로부터 인지질을 분리하기 위하여 충분히 예열된 주정 (에탄올 95％, 50 ～ 60 ℃)을 가하여 인지질을 용해시켜 추출한다.

제 6 단계 : 포스파티딜세린 (PS) 을 정제하는 공정

추출된 인지질에서 포스파티딜세린 (PS) 을 정제하기 위하여 에탄올-아세트산에틸-물 수성2상계로 분배 추출한다.

이와 같이 6단계 공정을 수행하는 포스파티딜세린 (PS) 의 제조한다.

이 방법을 기존 기술과 비교되는 특징이 있다. 본 발명에서는 칼슘 (CaCl₂ ) 수용액에 세린 (L-serine) 을 녹인 후, 실리카 겔을 혼합한 후, 난황 인지질(GL-90E, (주)고센바이오텍)을 녹여 기질로 사용한다. 교반속도는 300 ～ 600 rpm으로 조절하며 배추 PLD 효소를 첨가하여 반응시킨다.

이하, 실시 예와 비교 예에 의거 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이 실시 예는 발명을 이해시키기 위한 예시일 뿐 발명의 범위를 제한하지는 않는다.

＃ 실시 예 1 : 인지질의 PC 순도의 영향

PC의 함량이 높은 기질의 사용이 PS로의 전환 수율을 높일 수 있음을 확인하였다. 경제적 측면을 고려하여 본사에서 생산하는 GL-90E와 GL-70E(난황 인지질, (주)고센바이오텍)을 이용하여 생성된 PS의 양을 비교하였다. 이 때 기질의 인지질 조성은 표1 과 같았다.

표 1 GL-90E와 GL-70E의 인지질 조성(％)

그 결과 전환된 PA의 양은 유사하였으나, PS 전환 수율에서는 GL-90E가 높게 나타났으며, PC함량 차이를 고려하더라도 GL-70E에 비해 PS 전환 수율이 훨씬 높은 것으로 나타났다(표 2).

표 2 인지질의 PC 순도에 따른 PS 생성 전환 수율

＃ 실시 예 2 : PS 생성 속도 향상 예

기질의 농도를 반응계의 100 g/L 까지 높이고 실리카 겔의 농도를 100 g/L 로 기질과 같은 양으로 낮추고도 반응이 고속으로 향상시킬 조건을 온도와 혼합 속도를 조절하여 찾았다. (표 3, 표 4)

표 3 반응 조건

표 4 시간별 PS 생성 수율

본 발명은 산업상 이용가능성이 매우 높다. 기질과 효소를 모두 천연 소재를 이용하므로 식품 안전성이 높다. 그리고 두뇌 건강에 매우 유익하므로 건강 기능성 식품으로의 응용의 범위가 매우 넓다.

도 1 은 난황 인지질로부터 배추 포스포리파아제 D에 의한 포스파티딜세린의 생합성 방법의 전체 순서도이다. 공정 (표기: 정사각형, 마름모) 별로 투입되는 재료 (표기: 6각형)와 부산물 (표기: 사다리꼴), 주산물(표기: 타원형)을 표시한다.

Claims (2)

1. 난황 인지질로부터 배추 포스포리파아제 D (PLD) 로 포스파티딜세린 (PS) 의 제조 방법으로서,

   제 1 단계 : L-세린을 염화칼슘 수용액에 포화시키는 공정

   온도 50 ～ 70 ℃ 의 정제수에 염화칼슘을 10 ～ 50 mM 의 농도로 용해시킨 후, L-세린을 수용액의 30 ～ 40 중량％ 만큼 첨가하여 포화시키는 공정

   제 2 단계 : 난황 인지질 - 염화칼슘 수용액에 실리카 겔을 혼합하는 공정

   실리카 겔의 입자크기는 70 ～ 230 메쉬(mesh)로 하되, 첨가량은 인지질 질량의 1 ～ 5 배로 조절하여 혼합하는 공정

   제 3 단계 : 용액에 난황 인지질을 용해시키는 공정

   난황 인지질을 용액 1L 당 20 ～ 100 g 만큼 용해시키는 공정

   제 4 단계 : 배추 PLD를 효소로서 혼합하여 반응시키는 공정

   배추 포스포리파아제 D (PLD) 효소를 10 ～ 200 unit 로 혼합하여 교반하면서 반응시키는 공정

   제 5 단계 : 반응 후 난황 인지질을 추출하는 공정

   반응계로부터 인지질을 분리하기 위하여 섭씨 50 ~ 60도로 가온한 95% 주정에탄올을 가하여 인지질을 용해시켜 추출하는 공정

   제 6 단계 : 포스파티딜세린 (PS) 을 정제하는 공정

   추출된 인지질에서 포스파티딜세린 (PS) 을 정제하기 위하여 에탄올-아세트산에틸-물 수성2상계로 추출을 하는 공정

   위 공정을 수행함을 특징으로 하는 포스파티딜세린 (PS) 의 제조 방법
2. 제 1항에 있어서, 미생물 유래 효소, 화학적인 합성 계면활성제를 사용하지 않음을 특징으로 하는 포스파티딜세린 (PS) 의 제조 방법

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