JP2001186898A - 多価不飽和脂肪酸残基をもつホスファチジルセリンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 安全性の点で懸念なく、食品用途をはじめ各
種産業分野で使用することができる多価不飽和脂肪酸残
基を有するホスファチジルセリンの効率的な工業的生産
方法を提供する。 【解決手段】 ヘキサンおよびアセトンの混液と水との
混合溶媒中、アシルグリセロリン脂質とセリンとをホス
ホリパーゼＤを用いてホスファチジル基転移反応せしめ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用の分野】本発明はアシルグリセロリン脂
質の効率的な生産方法に関する。より詳しくは、特定の
溶媒を用い、アシルグリセロリン脂質のホスファチジル
基を酵素的に変換することを特徴とするホスファチジル
基転移されたアシルグリセロリン脂質であるホスファチ
ジルセリンを効率良く製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】一般にリン脂質と呼ばれるアシルグリセ
ロリン脂質（以下、単にグリセロリン脂質あるいはリン
脂質という）は、その界面活性をはじめとする物理化学
的特性を生かして、単に乳化剤や分散剤としての利用の
みならずリポソーム等の基剤として薬剤運搬体、人工血
液、人工細胞等への応用が近年注目されている。また、
リン脂質自体が生理活性、薬理作用をもつ素材として、
医薬品、化粧品、農林水産業、飼料等の分野だけでな
く、一般加工食品や健康食品等の分野において高度利用
が鋭意検討されている。

【０００３】また、エイコサペンタエン酸やドコサヘキ
サエン酸等のいわゆるｎ−３系多価不飽和脂肪酸は水産
魚貝類から抽出される脂質や卵黄油の構成脂肪酸として
知られ、近年、血中脂質の低下、記憶力の向上、痴呆症
状の予防、血小板凝集抑制能などの機能を有することが
知られている（Ｈｕｃａｓ，Ｌａｎｃｅｔ，３３９，２
８６（１９８８）、Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ，Ｌｉｐｉｄ
ｓ，２６，４２１（１９９１）等）。また、エイコサペ
ンタエン酸やドコサヘキサエン酸は魚油（トリグリセリ
ド）の形態に比べて、グリセロリン脂質の形態であるも
のが摂取時の吸収性が高く、かつ多価不飽和脂肪酸自体
の酸化劣化に対する安定性も高い。このため、グリセロ
リン脂質型多価不飽和脂肪酸は、多価不飽和脂肪酸本来
の機能を発現させるうえで好適な形態であり、医薬品や
栄養補助食品等の原料・素材として期待できる。

【０００４】一方、アシルグリセロリン脂質の一種であ
るホスファチジルセリンは天然動植物の組織とりわけ大
豆や牛脳等の組織において細胞膜構成物質として比較的
多く存在しており、従来は前記動植物組織より抽出し、
濃縮・分画・分別等の精製処理を施して採取していた。
ホスファチジルセリンは、近年、記憶力や集中力を向上
させるなどの脳の機能を維持、改善し得る栄養学的かつ
医薬的に有望な素材として注目を集めている。また、一
般にグリセロリン脂質を大量生産するために、出発物質
のアシルグリセロリン脂質を化学的あるいは酵素的にホ
スファチジル基転移置換し、これから濃縮・分画等精製
する方法がこれまでに種々提案されてきた。（特開昭６
３−４２６９１号、特開昭６３−４４８９３号、特開平
１−１５３０９０号、特開平２−６５０９３号、特開平
２−４９５９３号各公報等。）

【０００５】ホスホリパーゼＤを用いてホスファチジル
基転移反応を利用してアシルグリセロリン脂質の塩基部
分を交換しようとする場合、一般的には水相と有機溶媒
相とからなる二相系で反応が行われる。即ち、主として
酵素、反応受容体、ｐＨ緩衝液、無機塩等を含む水相
と、主として親油性であるアシルグリセロリン脂質等を
含む有機溶媒相とを適宜に攪拌、混合して接触させる反
応系を利用してきた。

【０００６】このような酵素反応系において、ホスファ
チジル基転移反応を促進させる有機溶媒としては、石油
エーテル、ジエチルエーテル、メチルエチルエーテル、
ジイソプロピルエーテル、クロロホルム、ジクロロメタ
ン、四塩化炭素、ジクロロエタン、ｎ−オクタン、イソ
オクタン、酢酸エチル、ジオキサン、ベンゼン等、ある
いはこれらの混合溶媒が知られている。しかし、これら
の有機溶媒はアシルグリセロリン脂質を溶解することは
できるが、前記転移反応を促進させる効果は十分に満足
できるものではなく、また、目的物を食品等に利用しよ
うとする場合には安全性などの点から前記有機溶媒を使
用することができない。

【０００７】このようにアシルグリセロリン脂質の酵素
反応を二相溶媒系で行う場合には、酵素と交換させる塩
基性物質とアシルグリセロリン脂質とを効率よく接触さ
せる必要があり、アシルグリセロリン脂質を溶解し得る
親油性有機溶媒と、酵素及び交換させる塩基性物質を溶
解し得る水あるいは親水性溶媒との二相を使用すること
が必須条件であった。このため食品用途を考慮した場合
においても使用可能な安全性の高い反応溶媒が見出され
ていなかった。また、この観点から使用可能な有機溶媒
としてｎ−ヘキサン（以下、単にヘキサンという）があ
るが、これらを用いたとしてもホスファチジル基転移反
応率は極めて低いものにとどまっていた。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】かかる実状に鑑み、本
発明は、ホスファチジルセリンを食品等においても安全
性を懸念することなく使用することができ、当該リン脂
質を効率良く工業的に生産する方法を提供することを目
的とするものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは前述の課題
を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ヘキサンおよび通
常はアシルグリセロリン脂質を溶解しないとされている
アセトンの混液と水との混合溶媒を用いてホスファチジ
ル基転移反応を行わせることにより、従来の有機溶媒あ
るいはその混合溶媒を用いる場合の同反応に比べて極め
て塩基交換率が向上することを見い出し、本発明を完成
するに至った。

【００１０】すなわち、本発明によれば、アシルグリセ
ロリン脂質とセリンとをホスホリパーゼＤを用いてホス
ファチジル基転移反応せしめるにあたり、該反応溶媒と
して（Ａ）ヘキサンおよびアセトンの混液と（Ｂ）水と
の混合溶媒を用いることを特徴とする多価不飽和脂肪酸
残基をもつホスファチジルセリンの製造法が提供され
る。このような本発明において、ヘキサンおよびアセト
ンの混液はヘキサン／アセトン＝９９／１〜１／１（容
量比率）であることが好ましい。また、アシルグリセロ
リン脂質はアシル基をもつホスファチジルコリン、ホス
ファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンお
よびホスファチジルイノシトールからなる群から選ばれ
る１種または２種以上であることが望ましく、前記アシ
ル基としてはｎ−３系多価不飽和脂肪酸残基を含むもの
が好ましく、このｎ−３系多価不飽和脂肪酸としてはα
−リノレン酸、エイコサペンタエン酸およびドコサヘキ
サエン酸からなる群から選択される１種または２種以上
を含むものが望ましい。かかるアシルグリセロリン脂質
の好適な態様の例はイカ由来のものである。また、ホス
ホリパーゼＤはストレプトマイセス属に属する微生物を
起源とするものが望ましい。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明は、ホスホリパーゼＤのホ
スファチジル基転移活性を効率良く発現させることによ
って、食品用途をはじめ前記各種産業分野において使用
できる多価不飽和脂肪酸残基をもつホスファチジルセリ
ンを高効率で得る工業的生産方法である。

【００１２】本発明では、ホスホリパーゼＤを用いる酵
素反応における溶媒としてヘキサンおよびアセトンの混
液と水との混合溶媒を用いることを必須とする。

【００１３】ヘキサンおよびアセトンの混液において、
両者の比率は任意であるが、より望ましくは該混液中の
アセトン濃度が１〜５０容量％、さらに好ましくは１０
〜３０容量％とするのがよい。この範囲をはずれるとホ
スホリパーゼＤによるホスファチジル基転移反応の効率
が著しく低下する。

【００１４】前記混液の使用量は原料として用いるアシ
ルグリセロリン脂質重量の５０〜２００容量倍であり、
より好ましくは１００〜１４０容量倍である。５０容量
倍未満では原料基質を溶解した溶液の粘度が高くなって
反応効率の低下を招く原因になり、逆に２００容量倍を
超えるとホスファチジル基転移効率が悪くなる。

【００１５】原料とするアシルグリセロリン脂質はいか
なる起源のものを用いてもよいが、アシル基を有するホ
スファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミ
ン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルイノシ
トールからなる群から選ばれる１種または２種以上の組
成のものが好適である。また、アシル基は不飽和結合の
有無や炭素数については任意であり公知の脂肪酸残基等
でよいが、ｎ−３系多価不飽和脂肪酸残基を含むものが
望ましい。このような脂肪酸としてα−リノレン酸、エ
イコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等を例示で
き、これらの１種または２種以上を含むものが好適であ
る。かかるアシルグリセロリン脂質の原料としては大
豆、菜種、シソ、エゴマ、鶏卵、マグロ、イカ、イワ
シ、カツオ、アサクサノリ、スピルリナ、海産クロレ
ラ、モルティエレラ属に属する微生物菌体等を例示で
き、これらの組織や種子から常法により採取したアシル
グリセロリン脂質を用いることができる。合成品でもさ
しつかえない。目的とするホスファチジルセリンの構成
脂肪酸としてドコサヘキサエン酸を必要とする場合は、
例えばドコサヘキサエン酸強化鶏卵黄、イカやマグロ等
の海産物から得られるドコサヘキサエン酸を高濃度に含
む構成脂肪酸の残基を有するアシルグリセロリン脂質を
用いるのが好ましい。

【００１６】ホスホリパーゼＤは、キャベツ、米糠、放
線菌等から採取されるものを使用でき、とりわけストレ
プトマイセス属に属する微生物由来のホスホリパーゼＤ
が好適であり、一般に市販されているものでよいが、ホ
スホリパーゼＤを含む前記微生物の培養液をそのまま使
用してもよい。前記反応におけるホスホリパーゼＤの使
用量は、反応基質をジパルミトイルホスファチジルコリ
ンとし、この１μモルを１分間にジパルミトイルホスフ
ァチジン酸に加水分解するのに必要なホスホリパーゼＤ
の量を１単位と定義するとき、原料とするアシルグリセ
ロリン脂質１ｇに対し０．５〜１８００単位である。
０．５単位未満ではホスファチジル基転移反応率が低
く、１８００単位を超えて添加してもホスファチジル基
転移効率はさらに高くはならない。

【００１７】水はイオン交換水、精製水または蒸留水を
用いるのが好ましく、さらには、これに２価のカチオン
および酢酸等を含有せしめてｐＨを弱酸性に調整したも
のを使用するのがより好ましい。例えば、塩化カルシウ
ムを５〜１００ｍＭ含むｐＨ４〜６の酢酸緩衝液あるい
は同様のリン酸緩衝液とするのがよい。緩衝液の使用量
は任意であるが、望ましくは前記混液の０．１〜２重量
倍である。原料として用いるセリンの起源は問わず、Ｄ
−セリンおよびＬ−セリンを使用できるが、ホスファチ
ジル基転移反応効率および生体内活性の点からＬ−セリ
ンが好適である。

【００１８】ホスファチジル基転移反応の温度は５〜５
０℃で行うのがよく、より好ましくは２０〜５０℃であ
る。当該反応の所要時間は酵素量や反応温度により変動
するが、おおむね０．５〜４８時間である。本発明で使
用する水相と有機溶媒相とを十分に接触させるために適
宜に攪拌、振とう等の処理を施すことは好ましい。反応
後、例えば加熱やアルコール変性等の処理で酵素を失活
させ、水相を除去し、さらにヘキサンおよびアセトンを
減圧下に除去することによって本発明の目的物である多
価不飽和脂肪酸残基をもつホスファチジルセリンを得る
ことができる。なお、これを溶剤分別、シリカゲル分
画、高速液体クロマトグラフィー等の処理に供して高純
度に精製することも可能である。

【００１９】

【実施例】以下に、実施例および比較例を示して本発明
をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定さ
れるものではない。以下の記載において、％はとくに断
らない限り面積％である。なお、リン脂質の組成分析は
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）とデンシトメーター
の組み合わせで行った。ＴＬＣはＫｉｅｓｅｌｇｅｌ
６０（ＭＥＲＣＫ社製）を用い、デンシトメーターは型
式：ＣＳ−９３００（ＳＨＩＭＡＺＵ社製）を使用し
た。有機溶媒をＴＬＣにスポットしてクロロホルム：メ
タノール：酢酸＝６５：２５：１０で展開し、５０ｗｔ
％硫酸エタノールを噴霧、加熱後デンシトメーターでリ
ン脂質組成を分析した。また、ガスクロマトグラフィー
（ＧＬＣ）を用いて常法により脂肪酸組成を分析した。

【００２０】

【実施例１】イカの細断片をヘキサンで抽出し、該抽出
物をアセトン分別して得たイカ由来のアシルグリセロリ
ン脂質（ホスファチジルコリン：８５％、構成脂肪酸中
のドコサヘキサエン酸：７９％）２ｋｇをヘキサン：ア
セトン＝８０：２０（容量比。以下同じ。）の混液２５
０Ｌに溶解した。これに、塩化カルシウムを４０ｍＭ含
む０．２Ｍ酢酸緩衝液にＬ−セリンを３．２Ｍ濃度にな
るように溶解し、この１００Ｌを加えた。さらに、スト
レプトマイセス属に属する微生物由来のホスホリパーゼ
Ｄ（特願平１１−８６１８９号に記載のもの）を３２４
０００単位（１単位：前述の定義のとおり）添加し、４
５℃、１時間、ゆるやかに攪拌しながらホスファチジル
基転移反応を行わせた。反応後の有機溶媒相をＴＬＣで
展開し、デンシトメーターで分析した。ドコサヘキサエ
ン酸を構成脂肪酸として有するホスファチジルセリン
（以下、ＰＳと略す）：８０％およびホスファチジン酸
（以下、ＰＡと略す）：２０％であった。

【００２１】

【実施例２】実施例１に記載のイカ由来のアシルグリセ
ロリン脂質２ｋｇをヘキサン：アセトン＝５５：４５の
混液２８０Ｌに溶解したことを除いて実施例１と同様に
処理したところ、ドコサヘキサエン酸を構成脂肪酸とし
て有するＰＳ：７５％、同ＰＡ：２５％のアシルグリセ
ロリン脂質を得た。

【００２２】

【実施例３】ドコサヘキサエン酸強化鶏卵黄由来のアシ
ルグリセロリン脂質（ホスファチジルコリン：４８％、
ホスファチジルエタノールアミン：４３％、ホスファチ
ジン酸：５％、構成脂肪酸中のドコサヘキサエン酸：２
３％）２ｋｇを原料として実施例１に記載の方法に従っ
て処理したところ、ドコサヘキサエン酸を構成脂肪酸と
して有するＰＳ：８２％、同ＰＡ：１８％のアシルグリ
セロリン脂質を得た。

【００２３】

【実施例４】実施例１に記載のイカ由来のアシルグリセ
ロリン脂質２ｋｇをヘキサン：アセトン＝９０：１０の
混液１００Ｌに溶解したことを除いて実施例１と同様に
処理したところ、ドコサヘキサエン酸を構成脂肪酸とし
て有するＰＳ：７３％、同ＰＡ：２７％のアシルグリセ
ロリン脂質を得た。

【００２４】

【実施例５】イカ由来のアシルグリセロリン脂質に代え
て市販の粉末状大豆レシチン（ホスファチジルコリン：
５０％、ホスファチジルエタノールアミン：１５％、ホ
スファチジルイノシトール：１０％、構成脂肪酸組成中
リノール酸：６５％、α−リノレン酸：１１％、オレイ
ン酸：１４％、ステアリン酸：６％）２ｋｇを原料とし
て実施例１に記載の方法に従って処理したところ、構成
脂肪酸としてα−リノレン酸を有するＰＳ：６２％、同
ＰＡ：９％、同ホスファチジルイノシトール：５％のア
シルグリセロリン脂質を得た。

【００２５】

【実施例６】実施例１に記載のイカ由来のリン脂質２ｋ
ｇヘキサン：アセトン＝８０：２０の混合溶媒４５０Ｌ
に溶解し実施例１に従って処理したところ、ドコサヘキ
サエン酸を構成脂肪酸として有するＰＳ：５０％、同Ｐ
Ａ：３５％、原料リン脂質：１５％であるグリセロリン
脂質を得た。

【００２６】

【比較例１】ヘキサンおよびアセトンの混液に代えてヘ
キサンのみを用いた以外は実施例１と同様に処理した。
この結果、ＰＳ：０％、ＰＡ：０％であり、ヘキサンの
みによる反応では原料のアシルグリセロリン脂質の塩基
部は全く変換されなかった。

【００２７】

【比較例２】混液のヘキサンとアセトンの比をヘキサ
ン：アセトン＝４５：５５にした以外は実施例１と同様
に処理した。この結果、ＰＳ：４０％、ＰＡ：３０％、
原料リン脂質：３０％であり、混液の組成が本発明の範
囲外であるとＰＳの変換率が低下することが明らかにな
った。

【００２８】

【発明の効果】本発明によれば、ホスホリパーゼＤを用
いるホスファチジル基転移反応において、水と有機溶媒
との二相反応系における有機溶媒としてヘキサンと従来
リン脂質が溶解しないとされているアセトンとの混液を
使用することにより、安全性の点で懸念がなく、食品分
野をはじめ各種産業分野で利用可能な、塩基部の構造が
変換された生体機能性の高い多価不飽和脂肪酸残基を有
するホスファチジルセリンを工業的に効率よく製造する
ことができる。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アシルグリセロリン脂質とセリンとをホ
   スホリパーゼＤを用いてホスファチジル基転移反応せし
   めるにあたり、該反応溶媒として（Ａ）ヘキサンおよび
   アセトンの混液と（Ｂ）水との混合溶媒を用いることを
   特徴とする多価不飽和脂肪酸残基をもつホスファチジル
   セリンの製造法。
2. 【請求項２】 ヘキサンおよびアセトンの混液がヘキサ
   ン／アセトン＝９９／１〜１／１（容量比率）である請
   求項１に記載のホスファチジルセリンの製造法。
3. 【請求項３】 アシルグリセロリン脂質がアシル基を有
   するホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノール
   アミン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルイ
   ノシトールからなる群から選ばれる１種または２種以上
   である請求項１に記載のホスファチジルセリンの製造
   法。
4. 【請求項４】 アシルグリセロリン脂質のアシル基がｎ
   −３系多価不飽和脂肪酸残基を含むものである請求項１
   または３に記載のホスファチジルセリンの製造法。
5. 【請求項５】 アシルグリセロリン脂質のｎ−３系多価
   不飽和脂肪酸残基がα−リノレン酸、エイコサペンタエ
   ン酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選ばれる
   １種または２種以上の脂肪酸残基を含むものである請求
   項４に記載のホスファチジルセリンの製造法。
6. 【請求項６】 アシルグリセロリン脂質がイカ由来のも
   のである請求項１、３、４または５に記載のホスファチ
   ジルセリンの製造法。