ES2224264T5 - Procedimiento para preparar grasa o aceite que contiene ácidos grasos insaturados - Google Patents

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Description

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DESCRIPCION
Procedimiento para preparar grasa o aceite que contiene acidos grasos insaturados Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un procedimiento para producir aceites que contienen acidos grasos insaturados con un bajo contenido de 24,25-metilencolest-5-en-3p-ol, usando microorganismos que pertenecen al genero Mortierella, subgenero Mortierella.
Tecnica relacionada
Los microorganismos que pertenecen al genero Mortierella, subgenero Mortierella son conocidos como microorganismos que producen acidos grasos insaturados tales como el acido araquidonico, acido dihomo-Y- linolenico y acido eicosapentanoico, y se han desarrollado procedimientos para la produccion eficaz de acido araquidonico, acido dihomo-Y-linolenico y acido eicosapentanoico por fermentacion usando estos microorganismos (publicaciones de patentes japonesas sin examinar N° 63-44891, N° 63-12290, N° 63-14696, N° 5-91887, N° 6314697). Adicionalmente tambien es conocido un procedimiento para producir acido mead (acido 5,8,11- eicosatrienoico) usando cepas mutantes que tienen reducida o defectuosa la actividad desaturante en A12, las cuales se obtienen por mutacion de microorganismos que pertenecen al genero Mortierella, subgenero Mortierella (publicacion de patente japonesa sin examinar N° 5-91888).
Los acidos grasos insaturados tales como el acido dihomo-Y-linolenico, acido araquidonico, acido eicosapentanoico y acido mead (acido 5,8,11-eicosatrienoico) son precursores de las prostaglandinas, tromboxanos, prostaciclinas y leucotrienos que tienen una actividad fisiologica potente y versatil, y por tanto se esta dirigiendo mucha atencion hacia los alimentos y piensos donde se anaden.
Por ejemplo, el acido araquidonico se dice que es un precursor de las prostaglandinas, tromboxanos, prostaciclinas y leucotrienos que presentan actividad fisiologica que incluye los efectos de contraccion y relajacion del musculo uterino, los efectos vasodilatador y antihipertensivo, etc., y las investigaciones recientes han progresado rapidamente sobre el acido docosahexanoico (de aqui en adelante abreviado tambien "DHA") como un componente esencial particularmente para el desarrollo infantil.
Especificamente, Lanting et al. (LANCET, Vol. 344, 1319-1322 (1994)) han examinado ninos desarrollados con leche materna y ninos desarrollados con leche en polvo durante 3 semanas o mas despues de su nacimiento, con un seguimiento hasta los 9 anos de edad, estudiando la incidencia de dano menor en los nervios craneales desde una perspectiva del comportamiento, y han publicado que la indicencia de dano cerebral en los ninos desarrollados con leche en polvo es dos veces que la de los ninos desarrollados con leche materna. Este asombroso resultado sugiere que los acidos grasos insaturados superiores tales como DHA y acido araquidonico que estan presentes en la leche materna pero que estan virtualmente ausentes en la leche en polvo infantil juegan un papel en el desarrollo del cerebro. Las subsiguientes publicaciones han mostrado tambien resultados que sugieren que los acidos grasos insaturados superiores estan conectados con el desarrollo del cerebro y la retina.
No obstante, aunque se considera que los aceites que contiene acidos grasos insaturados son muy seguros, la cuestion de sus fuentes microbianas ha impedido un amplio uso a lo largo del mundo; mientras tanto, en LIPIDS, Vol. 27, N° 6, 481-483 (1992), se publico que la Mortierella alpina 1S-4 produce 24,25-metilencolest-5-en-3p-ol, lo cual en aquel momento no se conocia que sucediera de forma natural. Por tanto, se han querido desarrollar aceites que contienen acidos grasos insaturados obtenidos a partir de microorganismos que pertenecen al genero Mortierella, subgenero Mortierella, que se puedan utilizar de forma mas segura para los alimentos y los piensos.
Shinmen et al., en Applied Microbiology and Biotechnology, 1989, volume 31, N° 1, pages 11-16, describen el ensayo de diferentes hongos de Mortierella en cuanto a su productividad de acido araquidonico. El documento incluye la referencia al cultivo de diferentes cepas de Mortierella que incluye cepas procedentes del subgenero Mortierella. Los medios de crecimiento que se usaron se describieron en los primeros documentos, siendo uno de ellos un medio de crecimiento YM descrito por Yamada et al, Agric. Biol. Chem. 51:785-790 (1987) que comprende glucosa-polipeptona, extracto de levadura y extracto de malta, siendo el otro un medio GY descrito por Shimizu et al., J. Am. Oil Chem. Soc. 65:1455-1459 (1987) que comprende glucosa y extracto de levadura. Ninguno de estos dos primeros documentos se refiere al cultivo en un fermentador con aireacion.
El documento WO 92/13086 describe procedimientos para la produccion de aceites que contienen acido araquidonico. El microorganismo preferido para el cultivo se considera que es pythium insidiosum pero en el Ejemplo 2 del documento se menciona un cultivo de Mortierella alpina en un frasco agitado que contiene un medio de patata- dextrosa.
Descripcion de la invencion
Es por tanto un objetivo de la presente invencion proporcionar un aceite microorganico que se pueda usar de forma segura en alimentos y piensos y que pueda proporcionar economica y establemente acidos grasos insaturados.
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Para resolver el problema descrito antes, en la presente invencion se ha investigado un procedimiento para la produccion eficaz de aceites con acidos grasos insaturados con un bajo contenido de 24,25-metilencolest-5-en-3p- ol, cuyo uso como alimento es todavia desconocido, y se ha estudiado en detalle la relacion entre los diferentes componentes del medio y composiciones de esteroles, como resultado se ha encontrado que es posible obtener aceites con una baja proporcion composicional de 24,25-metilencolest-5-en-3p-ol usando una fuente de nitrogeno derivada de la soja para el cultivo de microorganismos que pertenecen al genero Mortierella subgenero Mortierella.
La presente invencion proporciona un procedimiento para la produccion de aceite que contiene acidos grasos insaturados como se define en la reivindicacion 1, que comprende el cultivo de un microorganismo que pertenece al genero Mortierella subgenero Mortierella en un fermentador con aireacion en un medio que contiene una fuente de nitrogeno, y la recogida de dicho aceite que contiene acidos grasos insaturados del producto cultivado, usando soja desgrasada o soja desgrasada procesada como dicha fuente de nitrogeno para restringir la proporcion compositiva de 24,25-metilen-colest-5-en-3p-ol en el aceite, siendo la proporcion compositiva no mayor que 35%.
En otro aspecto, la invencion proporciona un aceite que contiene acidos grasos insaturados que tiene una proporcion compositiva de 24,25-metilen-colest-5-en-3p-ol no mayor que 35 % y obtenible por un procedimiento como el anterior, que contiene de 30 a 50 % de acido araquidonico. La invencion proporciona tambien un aceite que contiene acido araquidonico caracterizado por una proporcion compositiva de 24,25-metilencolest-5-en-3p-ol de 35 % o menor y un contenido de acido araquidonico de 30 a 50 %, y obtenible por cultivo sumergido de un microorganismo que pertenece al genero Mortierella subgenero Mortierella en un fermentador con aireacion, usando una fuente de nitrogeno derivada de soja.
La invencion se refiere tambien a procedimientos para preparar un suplemento nutritivo de la dieta, formula para ninos prematuros, formula infantil, alimentos para bebes, productos para la alimentacion de gestantes y piensos que contienen aceite como antes por incorporacion de un aceite como anteriormente.
Realizacion para llevar a cabo la invencion
Segun la invencion, los acidos grasos insaturados son acidos grasos con al menos 16 atomos de carbono y al menos un doble enlace, entre los cuales los acidos grasos insaturados superiores son acidos grasos generalmente con al menos 18 atomos de carbono y al menos dos dobles enlaces, y como ejemplos se pueden mencionar el acido Y-linolenico, acido dihomo-Y-linolenico, acido araquidonico, acido eicosapentanoico y acido mead (acido 5,8,11- eicosatrienoico).
Como ejemplos de microorganismos que pertenecen genero Mortierella, subgenero Mortierella segun la invencion se pueden mencionar Mortierella elongata, Mortierella exigua, Mortierella hygrophila, Mortierella alpina, etc., y especificamente se pueden mencionar Mortierella elongata IFO8570, Mortierella exigua IFO8571, Mortierella hygrophila IFO5941, Mortierella alpina IFO8568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS219.35, CBS224.37, CBS250.53, CBS343.66, CBS527.72, CBS529.72, CBS608.70, CBS754.68 y otras lineas celulares.
Estas cepas son todas obtenibles sin restriccion del instituto de fermentacion, Osaka (IFO), American Type Culture Collection (ATCC) y Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS). Tambien se puede usar la Mortierella elongata SAM0219 (FERM P-8703) (FERM-BP 1239) que se aislo de la suciedad por el grupo de investigacion de la presente invencion. Estos tipos de lineas celulares de cultivo o las lineas celulares aisladas de origen natural se pueden usar directamente, pero es posible obtener mediante el crecimiento y/o el aislamiento al menos una vez un mutante natural con diferentes propiedades que la linea celular original.
Los microorganismos usados segun la invencion incluyen cepas mutantes o cepas recombinantes de microorganismos que pertenecen al genero Mortierella, subgenero Mortierella (cepas salvajes), es decir, las disenadas para dar o bien un contenido de acido graso insaturado superior en el aceite, o bien un contenido de aceite total superior, o ambos, comparado con la cantidad producida por la cepa salvaje original, cuando se cultiva usando el mismo sustrato.
Tambien estan incluidos los microorganismos disenados para producir la misma cantidad de acidos grasos insaturados que la cepa salvaje por medio del uso eficiente de un sustrato con un excelente efecto sobre el coste. Como ejemplos se pueden mencionar Mortierella alpina SAM1861 (FERM BP-3590) como una cepa mutante defectuosa en la actividad desaturante de A12 y la Mortierella alpina SAM1860 (FERM BP-3589) como una cepa mutante defectuosa en la actividad desaturante de A5.
Los microorganismos mencionados antes que pertenecen al genero Mortierella, subgenero Mortierella en la forma de esporas, hifa o un precultivo obtenido mediante el cultivo previo se inoculan en un medio liquido o medio solido y se cultivan. La fuente de carbono usada puede ser glucosa, fructosa, xilosa, sacarosa, maltosa, almidon soluble, molasas, glicerol, manitol, acido citrico, almidon de maiz o cualquier otro convencional, pero son particularmente preferidos la glucosa, maltosa, fructosa, almidon de maiz, glicerol y acido citrico.
Segun la invencion, usando una fuente de nutrientes obtenida de la soja como fuente de nitrogeno es posible bajar la proporcion composicional del 24,25-metilencolest-5-en-3p-ol en el aceite.
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La fuente de nitrogeno derivada de la soja usada en la invencion tiene un contenido de nitrogeno de al menos 2 % en peso, preferiblemente al menos 3 % en peso y mas preferiblemente al menos 5 % con respecto a los componentes totales excepto el agua. La fuente de nitrogeno derivada de la soja puede ser una o una combinacion de diferentes tipos de soja desgrasada o soja sometida a tratamiento con calor; tratamiento acido; tratamiento con alcalis; tratamiento enzimatico; modificacion quimica; desnaturalizacion y/o renaturalizacion por procedimientos quimicos y/o fisicos que incluyen tratamiento con calor, tratamiento acido, tratamiento con alcalis, tratamiento enzimatico, modificacion quimica, etc; separacion de una parte de los componentes con agua y/o disolventes organicos; separacion de una parte de los componentes por filtracion y/o centrifugacion; congelacion; trituracion; secado; tamizado; etc, o un producto de procesado de la misma manera que la soja no desgrasada; como candidatos comunes se pueden mencionar soja, soja desgrasada, copos de soja, proteina de soja comestible, okara, leche de soja y harina de soja tostada (kinako), entre los cuales son particularmente preferidos la soja desgrasada desnaturalizada con calor, y especialmente la soja desgrasada desnaturalizada con calor de la que se han eliminado ademas los componentes solubles en etanol.
Cuando sea necesario se pueden anadir tambien una o mas fuentes diferentes de nitrogeno adicionales ya que la composicion de esteroles no se ve notablemente afectada, y ejemplos incluyen fuentes de nitrogeno organicas tales como peptona, extracto de levadura, extracto de malta, extracto de carne, acido casaminico, licor de maiz macerado y urea, y fuentes de nitrogeno inorganicas tales como nitrato de sodio, nitrato de amonio y sulfato de amonio.
Se pueden usar tambien, cuando sean necesarias, fuentes de nutrientes en trazas, que incluyen sales inorganicas tales como fosfato de potasio, dihidrogenofostato de potasio y otras sales de fosfato, sulfato de amonio, sulfato de sodio, sulfato de magnesio, sulfato de hierro, sulfato de cobre, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etc., y vitaminas.
Segun la invencion, la acumulacion del acido graso insaturado de interes se puede acelerar realizando el cultivo con adicion de un sustrato para el acido graso insaturado en el medio. El sustrato usado para el acido graso insaturado puede ser, por ejemplo, un hidrocarburo tal como hexadecano u octadecano, un acido graso tal como acido oleico o acido linolico o una sal, por ejemplo una de sus sales de sodio o potasio, o un ester de acido graso tal como un ester etilico, ester de acido graso y glicerol o un ester de acido graso y sorbitano; o un aceite tal como aceite de oliva, aceite de soja, aceite de colza, aceite de semilla de algodon o aceite de cacahuete, y estos se pueden usar solos o en combinaciones. La cantidad total del sustrato anadido es de 0,001 a 10 % en peso, y preferiblemente de 0,5 a 10 % en peso, con respecto al medio. Cualquiera de estos sustratos se puede usar tambien como la unica fuente de carbono para el cultivo.
Las fuentes de carbono, fuentes de nitrogeno, sales inorganicas, vitaminas y/o aditivos mencionados antes se pueden anadir al medio antes de comenzar el cultivo o al caldo de cultivo durante el mismo. Los componentes del medio se pueden anadir de una vez, o de forma continua o periodicamente con unas pocas adiciones. Los componentes del medio se pueden anadir cada uno solo o como una mezcla. No hay restricciones particulares en las concentraciones de los componentes del medio ya que el crecimiento de las celulas no se inhibe. En la practica, la fuente de carbono debe estar a una concentracion de 0,1 a 30 % en peso, preferiblemente de 1 a 15 % en peso, y la fuente de nitrogeno debe estar a una concentracion de 0,01 a 10 % en peso, y preferiblemente de 0,1 a 5 % en peso.
La temperatura del cultivo es de 5 a 40 °C, y preferiblemente de 20 a 30 °C, y el acido graso insaturado se puede producir tambien por crecimiento de celulas cultivando de 20 a 30 °C seguido por cultivo continuado de 5 a 20 °C. Esta forma de control de la temperatura se puede emplear tambien para aumentar el rendimiento del contenido en acidos grasos insaturados superiores que se producen. El pH del medio es de 4 a 10, y preferiblemente de 5 a 8, y se cultiva con aireacion y agitacion, se puede emplear cultivo con agitacion o cultivo estatico. El cultivo se lleva a cabo normalmente durante de 2 a 20 dias, preferiblemente de 5 a 20 dias, y mas preferiblemente de 5 a 15 dias.
Se usa un fermentador, especialmente un fermentador de cultivos con aireacion y agitacion o un fermentador de cultivos de inyeccion de aire para cultivo sumergido con aireacion para posibilitar la produccion con rendimientos convenientes de aceites que contienen acidos grasos insaturados como productos comerciales. En tales casos, el aceite que contiene acidos grasos insaturados puede ser incluso mas eficazmente producido manteniendo durante el cultivo una concentracion de glucosa de al menos 0,3 % en peso y/o una concentracion media de glucosa de al menos 0,5 % en peso, preferiblemente una concentracion de glucosa de al menos 0,5 % en peso y/o una concentracion media de glucosa de al menos 0,7 % en peso, y mas preferiblemente una concentracion de glucosa de al menos 0,5-5 % en peso y/o una concentracion media de glucosa de al menos 0,7-3 % en peso, durante al menos 3 dias despues del comienzo del cultivo. Por ejemplo, se pueden producir 100 mg o mas de acido araquidonico, y preferiblemente 120 mg o mas por cada gramo de celulas secas.
Por tanto, un aceite que es rico en el acido graso insaturado deseado y pobre en 24,25-metilencolest-5-en-3p-ol, se acumula en grandes cantidades en las celulas.
El aceite deseado se puede obtener segun un metodo convencional a partir del caldo de cultivo tomado durante la produccion del aceite mediante el cultivo de celulas o despues de su esterilizacion, el caldo de cultivo obtenido al final del cultivo o despues de su esterilizacion, o las celulas cultivadas de cualquiera de ellos, alternativamente en forma seca.
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El aceite deseado se puede recoger de las celulas cultivadas por el siguiente metodo, por ejemplo.
Despues de que se completa el cultivo, las celulas cultivadas se obtienen del caldo de cultivo por un medio de separacion solido/liquido convencional tal como centrifugacion y/o filtracion. Las celulas cultivadas preferiblemente se lavan, se rompen y se secan. El secado se puede lograr por secado por congelacion o secado al aire. Las celulas secas se someten preferiblemente a extraccion con un disolvente organico preferiblemente bajo una corriente de nitrogeno. El disolvente organico usado puede ser eter, hexano, metanol, etanol, cloroformo, diclorometano o eter de petroleo, y se pueden obtener tambien resultados satisfactorios por extraccion alternada con metanol y eter de petroleo o por extraccion usando un sistema monocapa de cloroformo-metanol-eter.
Por separacion del disolvente organico del extracto bajo presion reducida, es posible obtener un aceite que contiene acidos grasos insaturados en una alta concentracion. La extraccion se puede lograr tambien usando celulas humedas, en su lugar o por el metodo descrito antes. En este caso se usa un disolvente compatible con agua tal como metanol o etanol, o un disolvente mixto compatible con agua que incluye uno de estos con agua y/o otro disolvente. Los otros procedimientos son los mismos que los descritos antes.
El aceite obtenido de esta manera contiene los acidos grasos insaturados en un estado de trigliceridos y fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina o fosfatidilinositol, pero la mayoria del aceite esta en la forma de trigliceridos. Para separar y purificar los trigliceridos que contienen acidos grasos insaturados del aceite que contiene acidos grasos insaturados recogido del producto cultivado, se puede usar un metodo convencional para la extraccion con hexano seguido de tratamiento de desacidificacion, decoloracion, desodorizacion y desgomado, o separacion por enfriamiento.
Segun la invencion, la proporcion composicional del 24,25-metilencolest-5-en-3p-ol se determina por el siguiente metodo basado en el analisis de la composicion de esteroles.
Se explicara primero el analisis de la composicion de esteroles. Una porcion de 30 a 80 mg del aceite se pesa dentro de un tubo de ensayo con un tapon, se anaden 4 ml de metanol y 1 ml de hidroxido de potasio acuoso al 33 %, y se ajusta el tapon. Despues de reaccion durante una hora mientras se agita suavemente a 80 °C, la mezcla se deja enfriar y se extraen los componentes solubles en aceite con hexano. La solucion de hexano resultante se lava con agua hasta que el indicador de fenoftaleina no colorea la capa acuosa, y despues se concentra a presion reducida para obtener una muestra analitica. La muestra analitica se disuelve en una pequena cantidad de hexano y se somete a cromatografia de gases en las condiciones listadas en la tabla posterior. Comparando el cromatograma de gases con un desmosterol estandar comercialmente disponible, se identifica los picos del desmosterol.
Los componentes que se detectan de 0,8 a 2,0 veces el tiempo de retencion del desmosterol son los componentes esteroles, y las areas de los picos de los cromatogramas de gas para todos los componentes de esteroles dentro del tiempo de retencion se determinan por un metodo convencional. La proporcion del area del pico de cada componente a la suma de las areas totales de los picos de los componentes se toma como la proporcion composicional de cada componente. Por ejemplo, la proporcion del area del pico detectada para el desmosterol con respecto a la suma del area total del esterol es la proporcion composicional del desmosterol. El 24,25-metilencolest- 5-en-3p-ol se detecta en un tiempo de retencion de 1,07 a 1,12 veces el tiempo de retencion del desmosterol. La proporcion del area del pico detectada para el 24,25-metilencolest-5-en-3p-ol con respecto a la suma de todas las areas de los picos es la proporcion composicional del 24,25-metilencolest-5-en-3p-ol. Columna usada: ULBON HR-1 (diametro interno: 0,25 mm, longitud: 25 m). Temperatura de la columna: 280 °C. Temperatura de entrada y del detector: 300 °C. Vehiculo del gas y presion del indicador, helio: 1,2 kg/cm2. Composicion del gas y caudal, nitrogeno: 70 ml/minuto. Detector FID. Proporcion de separacion: 20.
El aceite que contiene acidos grasos insaturados de la invencion tiene una proporcion composicional de 24,25- metilencolest-5-en-3p-ol de 35 % o menor, preferiblemente 33 % o menor, o mas preferiblemente 30 % o menor, y/o la proporcion de 24,25-metilencolest-5-en-3p-ol es 1,2 o inferior, preferiblemente 0,9 o inferior y mas preferiblemente 0,6 o inferior con respecto al desmosterol presente en el aceite. El desmosterol es un componente incluido con el
24.25- metilencolest-5-en-3p-ol en aceites obtenidos por cultivo de microorganismos que pertenecen al genero Mortierella, subgenero Mortierella, y se sabe que esta presente en la leche materna.
Como ejemplo de un aceite que contiene acidos grasos insaturados se puede mencionar un aceite que contiene acido araquidonico con 20 a 54 % en peso y preferiblemente de 30 a 50 % en peso de acido araquidonico con respecto al total de los acidos grasos en el aceite, y una proporcion composicional de 24,25-metilencolest-5-en-3p-ol de 35 % o inferior, preferiblemente 33 % o inferior y mas preferiblemente 30 % o inferior y/o una proporcion de
24.25- metilencolest-5-en-3p-ol de 1,2 o inferior, preferiblemente 0,9 o inferior y mas preferiblemente 0,6 o inferior con respecto al desmosterol presente en el aceite.
Las propiedades del aceite que contiene acido araquidonico son tales que el contenido de triglicerido es 90 % o superior, el contenido de humedad es 0,1 % o inferior, el valor acido es 0,5 o inferior y el valor de peroxido es 5 o inferior, mientras que el color es <50 amarillo y <10 por el metodo de Lovibond en una celula de 133,4 mm, y la composicion del acido graso es de 20 a 54 %, preferiblemente con 30 a 50 % de acido araquidonico, 0,2 a 0,7 % de acido miristico, 10 a 16 % de acido palmitico, 4 a 10 % de acido estearico, 5 a 15 % de acido oleico, 5 a 15 % de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
acido linolico, 1 a 5 % de acido Y-linolenico, 0,1 a 2 % de acido a-linolenico, 1 a 6 % de acido dihomo-Y-linolenico, 0 a 1 % de acido eicosapentanoico y 2 a 7 % de acido lignocerico.
El aceite es rico en la forma de triglicerido del acido araquidonico, y o bien no contiene acido eicosapentanoico o bien lo contiene solo en una cantidad en trazas, y es por tanto deseable como material para alimentos, y especialmente para formulas para ninos prematuros, formulas infantiles, alimentos para bebes y alimentos para gestantes. El aceite que contiene acidos grasos de la invencion se puede usar tambien de forma segura en alimentos y piensos debido a su bajo contenido de 24,25-metilencolest-5-en-3p-ol, cuya uso como alimento todavia no se ha establecido.
Ejemplos
La presente invencion se explicara ahora en mas detalle por medio de ejemplos.
Ejemplo 1
Usando la Mortierella elongata IFO8570 como la linea celular para producir acido araquidonico, se colocaron 1400 l de un medio que contenia glucosa al 2 %, proteina de soja comestible al 1 % (nombre comercial: Esusan Meat, producto de Ajinomoto Co.) y aceite de colza al 0,1 % en un equipo fermentador de 2000 l equipado con un agitador y un aireador y el cultivo con aireacion y agitacion se inicio en condiciones de 28 °C de temperatura, 1,0 vvm de aireacion, 80 rpm de agitacion y 1,0 kg/cm2G de presion en el espacio de cabeza. La concentracion de glucosa se mantuvo a 1,5 % por alimentacion con glucosa, y despues de cultivo durante 7 dias se recuperaron las celulas por filtracion y se sometieron a extraccion del aceite. Como ejemplo comparativo, el cultivo y la extraccion del aceite se llevaron a cabo de la misma manera usando extracto de levadura al 1 % en vez de proteina de soja comestible.
Al analizar la composicion de esteroles del aceite resultante segun el procedimiento descrito antes, se detecto desmosterol a un tiempo de retencion de aproximadamente 9,6 minutos y el 24,25-metilencolest-5-en-3p-ol se detecto a un tiempo de retencion de aproximadamente 10,5 minutos. En el ejemplo comparativo, se detecto desmosterol a un tiempo de retencion de aproximadamente 6,5 minutos y el 24,25-metilencolest-5-en-3p-ol se detecto a un tiempo de retencion de aproximadamente 7,2 minutos. Los resultados se muestran en la tabla 1. Por tanto, se obtuvo un aceite que contiene acido araquidonico con una baja proporcion composicional de 24,25- metilencolest-5-en-3p-ol.
Tabla1
proporcion composicional de 24,25-metilencolest-5- en-3p-ol (A) proporcion composicional del desmosterol (B) A/B Contenido total de esteroles+ Contenido de acido araquidonico++
Ejemplo
30 % 65 % 0,46 1 % 8 %
Ejemplo comparativo
65 % 27 % 2,41 1 % 9 %
* contenido de esteroles en el aceite
** contenido de acido araquidonico con respecto al total de acidos grasos en el aceite Ejemplo 2
Se uso la Mortierella alpina CBS754.68 como la linea celular para producir acido araquidonico, se colocaron 600 l de un medio que contenia glucosa al 4 %, harina de soja tostada al 1,3 % (kinako), extracto de levadura al 0,2 % y aceite de oliva al 0,1 % en un equipo fermentador de 1000 l equipado con un agitador y un aireador para el cultivo con aireacion y agitacion durante 5 dias en condiciones de 24 °C de temperatura, 1,0 vvm de aireacion, 100 rpm de agitacion y 0,5 kg/cm2G de presion en el espacio de cabeza, seguido de filtracion y secado para recuperar las celulas y extraccion con hexano para obtener un aceite. Como ejemplo comparativo, el cultivo se llevo a cabo de la misma manera usando un medio de glucosa al 4 %, extracto de levadura al 1,5 % y aceite de oliva al 0,1 % para obtener un aceite. Tanto en el ejemplo como en el ejemplo comparativo se anadio glucosa al 1 % en el segundo dia de cultivo.
Al analizar la composicion de esteroles del aceite resultante segun el procedimiento descrito antes, se detecto desmosterol a un tiempo de retencion de aproximadamente 10,2 minutos y el 24,25-metilencolest-5-en-3p-ol se detecto a un tiempo de retencion de aproximadamente 11,2 minutos. En el ejemplo comparativo, se detecto desmosterol a un tiempo de retencion de aproximadamente 6,4 minutos y el 24,25-metilencolest-5-en-3p-ol se detecto a un tiempo de retencion de aproximadamente 7,1 minutos. Los resultados se muestran en la tabla 2. Por tanto, se obtuvo un aceite que contiene acido araquidonico con una baja proporcion composicional de 24,25- metilencolest-5-en-3p-ol.
Tabla2
proporcion composicional de 24,25-metilencolest-5- en-3p-ol (A) proporcion composicional del desmosterol (B) A/B Contenido total de esteroles+ Contenido de acido araquidonico++
Ejemplo
25 % 53 % 0,47 1,2 % 48 %
Ejemplo comparativo
68 % 16 % 4,25 1,1 % 46 %
* contenido de esteroles en el aceite
** contenido de acido araquidonico con respecto al total de acidos grasos en el aceite Ejemplo 3
5 Se uso la Mortierella alpina ATCC32221 y la Mortierella alpina ATCC42430 como la linea celular para producir acido araquidonico, y se cultivo cada una. Despues de colocar 25 l de un medio que contenia glucosa al 4 %, polvo de soja desgrasada al 1,2 %, hidrogenofosfato de potasio al 0,2 % y aceite de soja al 0,1 % en un equipo fermentador de 50 l equipado con un agitador y un aireador, el cultivo con aireacion y agitacion se llevo a cabo durante 5 dias en condiciones de 28 °C de temperatura, 1,0 vvm de aireacion, 300 rpm de agitacion y 1,0 kg/cm2G de presion en el 10 espacio de cabeza, seguido de filtracion y secado para recuperar las celulas y extraccion con hexano para obtener un aceite de las celulas recuperadas.
Como ejemplo comparativo, el cultivo se llevo a cabo de la misma manera usando un medio de glucosa al 4 %, polvo de levadura de cerveza al 1,2 %, hidrogenofosfato de potasio al 0,2 % y aceite de colza al 0,1 % para obtener un aceite. Tanto en el ejemplo como en el ejemplo comparativo se anadio glucosa al 1 % en el segundo dia de 15 cultivo. La composicion de esteroles del aceite resultante se analizo segun el procedimiento descrito antes. Los resultados se muestran en la tabla 3. Por tanto, se obtuvo un aceite que contiene acido araquidonico con una baja proporcion composicional de 24,25-metilencolest-5-en-3p-ol.
Tabla 3
proporcion composicional de 24,25-metilencolest-5- en-3p-ol (A) proporcion composicional del desmosterol (B) A/B Contenido total de esteroles+ Contenido de acido araquidonico++
Mortierella alpina ATCC 32221
5 % 67 % 0,07 0,9 % 25 %
Ejemplo comparativo
37 % 28 % 1,32 0,8 % 20 %
Mortierella alpina ATCC42430
5 % 35 % 0,14 0,9 % 18 %
Ejemplo comparativo
40 % 25 % 1,60 1,0 % 18 %
* contenido de esteroles en el aceite
20 ** contenido de acido araquidonico con respecto al total de acidos grasos en el aceite
Ejemplo 4
Se uso la Mortierella alpina CBS754.68 como la linea celular para producir acido araquidonico, se colocaron 1400 l de un medio que contenia glucosa al 2 %, proteina de soja al 1,5 % y aceite de soja al 0,1 % en un equipo fermentador de 2000 l equipado con agitacion y aireacion, y el cultivo con aireacion y agitacion se inicio en 25 condiciones de 24 °C de temperatura, 1 vvm de aireacion, 80 rpm de agitacion y 200 kPa de presion en el espacio de cabeza. La concentracion de glucosa se mantuvo de 0,5 a 1,5 % por alimentacion con glucosa, y despues de cultivo durante 7 dias se recuperaron las celulas por filtracion. Despues de secar las celulas, se extrajeron con hexano, el aceite extraido se sometio a desacidificacion, decoloracion y desodoracion, y se anadio tocoferol al 0,05 % como antioxidante. El aceite resultante se analizo y se encontro que tenia la siguiente composicion.
30 Resultados del analisis
10
15
Contenido de trigliceridos: 95,6 % Humedad; 0,04 % Valor acido: 0,08 Valor de peroxido: 2,16 Color (metodo de Lovibond, celulas 133,4 mm): amarillo: 20,1, rojo: 1,4 Composicion de acidos grasos: Acido araquidonico
44,4 %
Acido miristico
0,6 %
Acido palmitico
14,6 %
Acido estearico
8,8 %
Acido oleico
6,3 %
Acido linolico
10,2 %
Acido Y-linolenico
3,2 %
Acido a-linolenico
0,8 %
Acido dihomo-Y-linolenico
5,2 %
Acido eicosapentanoico
0,2 %
Acido lignocerico
4,8 %
Contenido total de esteroles: 1,0 %
Proporcion composicional del 24,25-metilencolest-5-en-3p-ol: 24 %
Proporcion composicional del desmosterol: 67 %
Ejemplo 5
El aceite que contiene acido araquidonico obtenido en el ejemplo 4 se mezclo apropiadamente con aceite de pescado y aceite vegetal para obtener un aceite esencial ajustado con acidos grasos. Adicionalmente al aceite esencial ajustado con acidos grasos, se prepararon los materiales crudos y los componentes listados a continuacion para la formulacion de 100 kg de formula infantil en polvo. Despues de disolver, mezclar y refinar los materiales crudos segun los metodos convencionales, se esterilizaron, se concentraron y se homogeneizaron, y despues se secaron por pulverizacion para obtener la formula infantil en polvo.
Materiales crudos y componentes
Caseina
5,6 kg
Concentrado de proteina del suero de la leche
24,0 kg
aceite esencial ajustado con acidos grasos (compuesto principalmente por acido linolico, acido a-linolenico)
25,0 g
Contenido de acido araquidonico
80 g
Contenido de acido docosahexanoico
25 g
Contenido de acido eicosapentanoico
10 g
Sacaridos (lactosa y oligosacaridos)
43,4 kg
Minerales y vitaminas
2 kg
TOTAL
100 kg

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para la produccion de aceite microbiano que contiene acidos grasos insaturados, que comprende el cultivo sumergido de un microorganismo que pertenece al genero Mortierella subgenero Mortierella en un fermentador con aireacion en un medio que contiene una fuente de nitrogeno, y recoger dicho aceite que contiene acidos grasos insaturados del producto cultivado, caracterizado por el uso de soja desgrasada o soja desgrasada procesada como dicha fuente de nitrogeno, para restringir la proporcion compositiva de 24,25- metilencolest-5-en-3p-ol en dicho aceite que contiene acidos grasos insaturados, siendo dicha proporcion compositiva no mayor que 35%.
  2. 2. Un procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que dicha fuente de nitrogeno derivada de soja desgrasada proporciona un contenido de nitrogeno de al menos 2 % en peso con respecto a los componentes totales excluyendo el agua.
  3. 3. Un procedimiento segun la reivindicacion 2, en el que dicha fuente de nitrogeno proporciona un contenido de dicho nitrogeno de al menos 5 % en peso.
  4. 4. Un procedimiento segun las reivindicaciones 1, 2 o 3, en el que la soja desgrasada de la fuente de nitrogeno ha sido procesada por tratamiento con calor; tratamiento acido; tratamiento con alcalis; tratamiento enzimatico; modificacion quimica; desnaturalizacion y/o renaturalizacion por un procedimiento quimico y/o fisico que incluye dicho tratamiento; separacion de una porcion de los componentes con agua y/o disolventes organicos; separacion de una porcion de los componentes por filtracion y/o centrifugacion; congelacion; trituracion; secado; y/o tamizado.
  5. 5. Un procedimiento segun las reivindicaciones 1, 2 o 3, en el que dicha fuente de nitrogeno derivada de soja procede de soja desgrasada que ha sido sometida al menos a desnaturalizacion con calor.
  6. 6. Un procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho producto cultivado es un caldo de cultivo tomado durante la produccion del aceite mediante el cultivo celular o despues de su esterilizacion, un caldo de cultivo obtenido al final del cultivo o despues de su esterilizacion, o celulas cultivadas recogidas de cualquiera de ellos, opcionalmente en forma seca.
  7. 7. Un procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho fermentador esta equipado con un agitador y un rociador de aire o es un fermentador con sistema de inyeccion de aire.
  8. 8. Un procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el cultivo se lleva a cabo mientras se mantiene una concentracion de glucosa de al menos 0,3 % en peso y/o una concentracion media de glucosa de al menos 0,5 % en peso, durante al menos 3 dias despues del comienzo del cultivo.
  9. 9. Un procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el cultivo se lleva a cabo durante un periodo de 2 a 20 dias.
  10. 10. Un aceite microbiano que contiene acidos grasos insaturados que tiene una proporcion compositiva de 24,25- metilencolest-5-en-3p-ol no mayor que 35 % y obtenible por un procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que contiene de 30 a 50 % de acido araquidonico.
  11. 11. Un aceite microbiano que contiene acido araquidonico caracterizado por una proporcion compositiva de 24,25- metilencolest-5-en-3p-ol de 35 % o inferior y por un contenido de acido araquidonico de 30 a 50 %, y obtenible por el cultivo de un microorganismo que pertenece al genero Mortierella subgenero Mortierella en un fermentador con aireacion, usando una fuente de nitrogeno derivada de la soja.
  12. 12. Un aceite que contiene acido araquidonico segun la reivindicacion 10 u 11, caracterizado ademas porque la proporcion compositiva de 24,25-metilencolest-5-en-3p-ol esta en una proporcion no mayor que 1,2 con respecto a la proporcion compositiva de desmosterol.
  13. 13. Un procedimiento para preparar un suplemento nutritivo de la dieta, una formula para ninos prematuros, una formula infantil, alimento para bebes, productos para la alimentacion de gestantes, o pienso, caracterizado por la incorporacion de un aceite microbiano que contiene acido araquidonico segun la reivindicacion 10, 11 o 12 en el suplemento, la formula, el alimento o el pienso.
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