JP2958361B2

JP2958361B2 - ジホモ―γ―リノレン酸の製造法および脂肪酸の△５位不飽和化反応抑制剤

Info

Publication number: JP2958361B2
Application number: JP2131357A
Authority: JP
Inventors: 寿昭中島; 敏次島内
Original assignee: Idemitsu Petrochemical Co Ltd
Current assignee: Idemitsu Petrochemical Co Ltd
Priority date: 1989-05-24
Filing date: 1990-05-23
Publication date: 1999-10-06
Anticipated expiration: 2014-10-06
Also published as: JPH0372892A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はジホモ−γ−リノレン酸（Δ8,11,14エイコ
サトリエン酸）を発酵法により安価に大量生産する方法
およびジホモ−γ−リノレン酸生産能を有する微生物の
脂肪酸に対するΔ５位不飽和化反応抑制剤に関する。

〔従来の技術および発明が解決しようとする課題〕

ジホモ−γ−リノレン酸を生産する方法として、グル
コースを主原料とする培地にゴマ油を添加してモルティ
エレラ属微生物を培養することにより、ジホモ−γ−リ
ノレン酸を含む脂質を生産する方法が知られている（H.
Yamada.et al.,J.Am Oilchem.Soc.,Vol 66,p237−241
（1989））。

また、脂肪酸のΔ５位不飽和化反応抑制剤としては、
ゴマ油中のセサミン，エピセサミンが知られている（H.
Yamada.et al.,日本農芸化学会誌63巻,p676（198
9））。しかしながら、セサミンやエピセサミンを大量
に採ることはコスト的に高く、実用性に劣るという欠点
があった。

〔課題を解決するための手段〕

そこで、本発明者らはジホモ−γ−リノレン酸の発酵
法による大量生産について鋭意研究した結果、特定の化
合物を培地に添加することにより目的を達成できるこ
と、並びに該化合物が脂肪酸のΔ５位不飽和化反応を抑
制する作用を有することを見出し、本発明を完成するに
至った。

すなわち、本発明はジホモ−γ−リノレン酸生産能を
有する微生物を、一般式（式中、R¹は低級アルキル基を示し、R²は水酸基，アル
キル基，アルコキシ基，アルケニル基，オキシアルキル
基を示す。R²が複数ある場合には、複数のR²は同一であ
っても異なっていてもよい。ｎは０〜５の整数を示
す。）で表わされる化合物を添加した培地で培養し、培
養物からジホモ−γ−リノレン酸を採取することを特徴
とするジホモ−γ−リノレン酸の製造法および上記一般
式（Ｉ）で表わされる化合物を主成分とする、ジホモ−
γ−リノレン酸生産能を有する微生物の脂肪酸に対する
Δ５位不飽和化反応抑制剤を提供するものである。

本発明で使用する微生物は、ジホモ−γ−リノレン酸
生産能を有するものであればよく、例えばコニディオボ
ラス属やモルティエレラ属に属するジホモ−γ−リノレ
ン酸生産能を有する微生物を挙げることができる。具体
的には、コニディオボラス・ナノデス（Conidiobolus
nanodes）CBS 183/62,コニディオボラス・ランプラウジ
ェス（Conidiobolus lamprauges）ATCC 12585,モルテ
ィエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）IFO 8568
等が挙げられる。

本発明では、上記微生物を培養してジホモ−γ−リノ
レン酸を製造するための培地に、一般式（式中、R¹,R²およびｎは前記と同じである。）で表わされる化合物を含むことが必須である。上記一般
式中のR¹は低級アルキル基を示す。低級アルキル基とし
ては炭素数１〜６の低級アルキル基、例えばメチル基，
エチル基，プロピル基などが挙げられる。R²は水素基，
アルキル基，アルコキシ基，アルケニル基，オキシアル
キル基を示す。アルキル基としては例えばメチル基，エ
チル基，プロピル基，ブチル基，ヘプチル基，オクチル
基，ノニル基（直鎖状また枝状のいずれでもよい）など
を、アルコキシ基としては例えばメトキシ基，エトキシ
基などを、アルケニル基として例えばアリル基,3−ブテ
ニル基などを、オキシアルキル基としては例えばオキシ
メチル基,2−オキシエチル基,3−オキシプロピル基,4−
オキシブチル基などを挙げることができる。また、R²が
１分子内に複数ある場合には、複数のR²は同一であって
も異なっていてもよい。ｎは０〜５の整数を示す。上記
一般式で表わされる化合物の具体例としては、アニソー
ル，メトキシフェノール，ジメトキシベンゼン，ジエキ
トシベンゼン，トリメトキシベンゼン，メトキシトルエ
ン,tert−ブチルヒドロキシアニソール（BHA），オイゲ
ノール等が挙げられる。これらは油脂などの抗酸化剤や
香料として工業的に多く生産されているものが多いた
め、容易に手に入れることが可能である。上記一般式で
表わされる化合物の添加量としては、培地１あたり0.
01〜10g、好ましくは0.1〜2gであるが、微生物の生育阻
害が起きなければ多い程よい。添加方法は、エタノール
やジクロロメタンなどの適当な溶媒に溶解して添加する
こともできるが、培地の炭素源として用いる油脂に混合
して添加するのが好ましい。また、添加する時期は培養
を始める前が好ましいが、培養途中から加えてもよい。

上記微生物を培養するための培地としては、炭素源，
窒素源，無機塩類などを含むものが用いられる。炭素源
としては、ブドウ糖，オリーブ油，サフラワー油，γ−
リノレン酸含有油などの炭水化物や油脂等が用いられ
る。ここでγ−リノレン酸含有油としては、月見草油；
モルティエレラ（Mortierella）属，ムコール（Mucor）
属，カニンガメラ（Cunninghamella）属等に属する糸状
菌から抽出される微生物油があげられる。また、窒素源
としては酵母エキス，ペプトン，大豆粕などの有機窒素
源が好ましく、無機塩類としてはリン酸カリウム（KH₂P
O₄），鉄塩（FeSO₄・7H₂O），マグネシウム塩（MgCO₄・
7H₂O），亜鉛塩（ZnSO₄）などが用いられる。その他、
必要に応じて微量元素や栄養源を添加することもでき
る。

上記微生物の培養は通常、液体培地にて振とう培養や
通気撹拌培養などにより行なわれる。培養条件は培養温
度10〜40℃、好ましくは20〜30℃、培養日数は１〜20日
であり、コニディオボラス属に属する微生物を用いる場
合は３〜７日が好ましいが、これらの条件は用いる微生
物の性質等を考慮してジホモ−γ−リノレン酸の生産量
が高くなるように設定すればよい。

このようにして培養物中にジホモ−γ−リノレン酸が
生産されるので、培養物からジホモ−γ−リノレン酸を
採取する。ジホモ−γ−リノレン酸は培養物よりそのま
ま採取してもよいが、培養物には炭素源として加えた油
脂等が含まれるため、培養物より菌体を分離し、この菌
体からジホモ−γ−リノレン酸を採取するのが好まし
い。ジホモ−γ−リノレン酸の採取は、溶媒抽出やクロ
マトグラフィーなどの常法により行なわれる。

次に、本発明のジホモ−γ−リノレン酸生産能を有す
る微生物の脂肪酸に対するΔ５位不飽和化反応抑制剤に
ついて説明する。本発明でいうΔ５位不飽和化反応と
は、例えばジホモ−γ−リノレン酸からアラキドン酸へ
の変換反応を指す。

本発明のジホモ−γ−リノレン酸生産能を有する微生
物の脂肪酸に対するΔ５位不飽和化反応抑制剤は、前記
一般式で表わされる化合物を主成分とするものである。
その使用にあたっては、ジホモ−γ−リノレン酸生産能
を有する微生物に脂肪酸を加えたものに前記一般式で表
わされる化合物を0.1〜100mg/g乾燥菌体、好ましくは５
〜70mg/g乾燥菌体添加すればよく、これによりジホモ−
γ−リノレン酸生産能を有する微生物の脂肪酸に対する
Δ５位不飽和化反応を抑制することができる。

〔実施例〕

次に、本発明を実施例により説明するが、本発明はこ
れらによって制限されるものではない。

比較例１第１表に示した組成の培地に炭素源として16％γ−リ
ノレン酸含有油（オレイン酸40％，リノール酸10％，γ
−リノレン酸16％）を30g/加えた培地を作製した。こ
の培地100mlを500mlの三角フラスコに入れ、121℃で15
分間滅菌処理した。このフラスコにコニディオボラス・
ナノデスCBS 183/62を接種し、30℃で４日間振とう培養
した。

培養終了後、遠心分離により菌体を集菌し、リン酸緩
衝液（pH7.0）を用いて洗浄した後、吸引ろ過により菌
体を採取した。この菌体をアルミ製のカップに入れ、ガ
ラスビーズ，メタノール，クロロホルムを加えてホモジ
ナイザーで菌体を破砕し、菌体内の脂質を抽出した。抽
出した脂質をBF₃−メタノールを用いてメチルエステル
化して、ガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成を調
べた結果を第２表に示す。

なお、ジホモ−γ−リノレン酸の同定は以下の方法に
より行なった。ジホモ−γ−リノレン酸の標品と本サン
プルを混合してキャピラリーガスクロマトグラフィー
（カラム:PEG20M）で分析したところ。ジホモ−ｒ−リ
ノレン酸画分のピークが大きくなった。また、本サンプ
ルを硝酸銀含浸薄層クロマトグラフィーによりトリエン
画分を分取した。この画分にはγ−リノレン酸とジホモ
−γ−リノレン酸が含まれていた。分取したトリエン画
分から液体クロマトグラフィー（カラム:ODS）によりジ
ホモ−γ−リノレン酸を分取した。このジホモ−γ−リ
ノレン酸をピコリニル誘導体化し、キャピラリーガスマ
ススペクトラムにより同定した。その結果、Δ8,11,14
エイコサトリエン酸、すなわちジホモ−γ−リノレン酸
であることが確認された。

実施例１比較例１と同様の培地を作成し、これに第２表に示し
た所定量のtert−ブチルヒドロキシアニソール（BHA）
を添加した。添加方法は、所定量のBHAをエターノール
に溶解したものを500mlフラスコに入れ、さらに16％γ
−リノレン酸含有油3gを加え、窒素気流下でエタノール
をとばしてBHAを油に混合した後、ここに第１表に示し
た培地を100ml加えて培地を作成した。この培地を滅菌
後、コニディオボラス・ナノデスCBS183/62を接種し、3
0℃で４日間振とう培養した。培養終了後、比較例１と
同様の方法で菌体内脂質の脂肪酸組成を分析した。この
結果を第２表に示す。

第２表より明らかなように、BHAの添加によってジホ
モ−γ−リノレン酸の含有率が顕著に上昇し、アラキド
ン酸の含有率が相対的に低下しており、Δ５位不飽和化
反応が特異的に阻害されていることがわかった。

実施例２実施例１において、第３表に示した所定量の化合部を
用いたことおよび所定の培養日数にしたこと以外は実施
例１と同様の操作を行なった。この結果を第３表に示
す。

実施例３第１表に示した培地の３倍濃度の培地に16％γ−リノ
レン酸含有油を90g/加え、さらにBHAを実施例１と同
様の方法により2.1g/加えた培地を作成した。この培
地６を10ジャーファメンターに入れ、121℃で15分
間滅菌した。次いで、コニディオボラス・ナノデスCBS1
83/62を第１表に示した培地に16％γ−リノレン酸含有
油30g/を加えた培地600mlで前培養したものを、上記
ジャーファメンターに全量接種し、30℃で７日間通気撹
拌培養した。培養終了後、比較例１と同様の方法で菌体
内脂質の脂肪酸組成を分析した。その結果、アラキドン
酸含有率は10％，ジホモ−γ−リノレン酸含有率は15
％，ジホモ−γ−リノレン酸収量は培地１あたり3.3g
であった。

実施例４実施例２において、添加したBHA量を1g/としたこと
培養日数を４日としたことおよび接種した微生物をコニ
ディオボラス・ランプラウジェスATCC 12585としたこと
以外は実施例２と同様の操作を行なった。その結果、菌
体収量は18.7g/，油脂収量は5.8g/，ジホモ−γ−
リノレン酸含有率は9.3％，ジホモ−γ−リノレン酸収
量は0.54g/，アラキドン酸含有率は9.0％であった。

実施例５および比較例２第１表に示した培地に16％γ−リノレン酸含有油30g/
添加した培地（比較例２），第１表に示した培地に16
％γ−リノレン酸含有油30g/およびBHA0.5g/添加し
た培地（実施例５）を作成し、これらの培地にモルティ
エレラ・アラピナIFO 8568を接種し、20℃で第４表に示
した所定日数振とう培養した。培養終了後、比較例１と
同様の方法で菌体内脂質の脂肪酸組成を分析した。この
結果を第４表に示す。

表より明らかなように、モルティエレラ属微生物を用
いた場合においてもアラキドン酸よりもジホモ−γ−リ
ノレン酸含有率の高い脂質を得ることができた。

〔発明の効果〕

本発明によれば、微生物菌体内のアラキドン酸含有率
を下げ、ジホモ−γ−リノレン酸含有率を上げることが
できるので、ジホモ−γ−リノレン酸を効率よく安価に
大量生産できる。また、本発明によればジホモ−γ−リ
ノレン酸生産能を有する微生物の脂肪酸に対するΔ５位
不飽和化反応を低コストに抑制することができる。得ら
れたジホモ−γ−リノレン酸は医薬，生化学用試薬とし
て有用である。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ジホモ−γ−リノレン酸生産能を有する微
生物を、一般式（式中、R¹は低級アルキル基を示し、R²は水酸基，アル
キル基，アルコキシ基，アルケニル基，オキシアルキル
基を示す。R²が複数ある場合には、複数のR²は同一であ
っても異なっていてもよい。ｎは０〜５の整数を示
す。）で表わされる化合物を添加した培地で培養し、培
養物からジホモ−γ−リノレン酸を採取することを特徴
とするジホモ−γ−リノレン酸の製造法。
【請求項２】請求項１記載の式（Ｉ）で表わされる化合
物を主成分とする、ジホモ−γ−リノレン酸生産能を有
する微生物の脂肪酸に対するΔ５位不飽和化反応抑制
剤。