DE69735278T2

DE69735278T2 - Verfahren zur Herstellung von ungesättigte Fettsäuren enthaltendem Öl

Info

Publication number: DE69735278T2
Application number: DE69735278T
Authority: DE
Inventors: Kenichi Higashiyama; Kengo Kawasaki-shi Kanagawa Akimoto; Sakayu Shimizu
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 1996-08-30
Filing date: 1997-08-27
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2017-08-28
Also published as: EP0957173A4; CN1232507A; US9464305B2; US9493798B2; DE69730867T3; CA2264276A1; US20060252736A1; KR101475713B1; US20060189588A1; ES2255017T5; DE69735278D1; KR20100082380A; DK0957173T3; KR101475711B1; AU719123B2; EP0957173B1; EP0957173B2; WO1998008967A1; US7091244B1; US8841097B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von ungesättigte Fettsäuren enthaltenden Ölen mit einem niedrigen 24,25-Methylencholest-5-en-3β-ol Gehalt unter Verwendung von Mikroorganismen, die zur Gattung Mortierella, Untergattung Mortierella gehören.
Stand der Technik
Mikroorganismen, die zur Gattung Mortierella, Untergattung Mortierella gehören, sind als Mikroorganismen bekannt, die ungesättigte Fettsäuren, wie z.B. Arachidonsäure, Dihomo-γ-linolensäure und Eikosapentaensäure produzieren, und es wurden Verfahren für eine effiziente Produktion von Arachidonsäure, Dihomo-γ-linolensäure und Eikosapentaensäure durch Fermentation unter Verwendung dieser Mikroorganismen entwickelt (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichungen Nr. 63-44891, 63-12290, 63-14696, 5-91887, 63-14697). Außerdem ist auch ein Verfahren zur Erzeugung von 5,8,11-Eikosatriensäure, 20:3 (Omega)9, (Meadsäure) bekannt, wobei mutierte Stämme mit einer reduzierten oder defekten Δl2-Entsättigungsaktivität verwendet werden, die durch Mutation von Mikroorganismen erhalten werden, die zur Gattung Mortierella, Untergattung Mortierella gehören (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 5-91888).
Ungesättigte Fettsäuren, wie z.B. Dihomo-γ-linolensäure, Arachidonsäure, Eikosapentaensäure und Meadsäure, sind Vorläufer von Prostaglandinen, Thromboxanen, Prostacyclinen, Leukotrienen und ähnlichen, die eine starke und vielfältige physiologische Aktivität aufweisen, und Nahrungsmitteln und Tiernahrung, denen diese zugefügt wurden, wird daher viel Aufmerksamkeit gewidmet.
Es wird zum Beispiel angenommen, daß Arachidonsäure ein Vorläufer von Prostaglandinen, Thromboxanen, Prostacyclinen und Leukotrienen ist, die eine physiologische Aktivität einschließlich der Kontraktion und Entspannung des Uterusmuskels ausüben, wie auch vasodilatatorische und antihypertensive Wirkungen usw., und die Forschung der letzten Zeit hat sich schnell im Hinblick auf Docosahexaensäure entwickelt (hiernach auch abgekürzt als "DHA") als essentieller Bestandteil insbesondere für die Kleinkindentwicklung.
Spezifisch haben Lanting et al. (Lancet, Bd. 344, 1319–1322 (1994)) Kleinkinder untersucht, die mit Muttermilch ernährt wurden, und Kleinkinder, die mit Kleinkind-Pulvermilch aufgezogen wurden, und zwar für 3 Wochen oder mehr nach der Geburt, mit einer Nachfolgeuntersuchung bis zu einem Alter von 9 Jahren, wobei die Inzidenz kleinerer Schäden an den Kranialnerven aus einer Perspektive des Verhaltens untersucht wurde, und haben berichtet, daß das Auftreten von Gehirnschäden bei Kindern, die mit Kleinkind-Pulvermilch aufgezogen wurden, zweimal höher ist als bei Kindern, die mit Muttermilch aufgezogen wurden. Dieses schockierende Ergebnis legt nahe, daß höher ungesättigte Fettsäuren, wie z.B. DHA und Arachidonsäure, die in der Muttermilch vorliegen jedoch in Kleinkind-Pulvermilch im wesentlichen nicht vorliegen, eine Rolle bei der Entwicklung des Gehirns spielen. Darauffolgende Berichte haben auch Ergebnisse gezeigt, die nahelegen, daß höher ungesättigte Fettsäuren mit der Entwicklung des Gehirns und der Retina in Verbindung stehen.
Während ungesättigte Fettsäuren-haltige Öle als sehr sicher angesehen werden, hat jedoch das Problem ihrer mikrobiellen Quellen verhindert, daß sie in der Welt weitverbreitet verwendet werden; währenddessen wurde in LIPIDS, Bd. 27, Nr. 6, 481–483 (1992) berichtet, daß Mortierella alpina 1S-4 24,25-Methylencholest-5-en-3β-ol erzeugt, von dem bis zu diesem Zeitpunkt nicht bekannt war, daß es natürlich auftritt. So wurde gewünscht, ungesättigte Fettsäure enthaltende Öle zu entwickeln, die von Mikroorganismen erhalten werden, die zur Gattung Mortierella, Untergattung Mortierella gehören, die sicher für Nahrung und Tiernahrung verwendet werden können.
Offenbarung der Erfindung
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mikroorganismusöl bereitzustellen, das in Nahrungsstoffen und Tiernahrungen sicher verwendet werden kann und das ökonomisch und stabil ungesättigte Fettsäuren bereitstellen kann.
Um das oben beschriebene Problem zu lösen haben die gegenwärtigen Erfinder nach einem Verfahren für eine effiziente Produktion ungesättigter Fettsäureöle gesucht mit einem niedrigen Gehalt an 24,25-Methylencholest-5-en-3β-ol, dessen Verwendung als Nahrungsmittel noch unbekannt ist, und haben im Detail die Beziehung zwischen verschiedenen Mediumbestandteilen und Sterolzusammensetzungen untersucht; im Ergebnis haben sie die vorliegende Erfindung mit der Feststellung vervollständigt, daß es möglich ist, Öle mit einem niedrigen Zusammensetzungsverhältnis von 24,25-Methylencholest-5-en-3β-ol zu erhalten, indem eine Stickstoffquelle abstammend von der Sojabohne zur Kultivierung von Mikroorganismen, die zur Gattung Mortierella, Untergattung Mortierella gehören, verwendet wird.
Anders ausgedrückt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung ungesättigte Fettsäure enthaltender Öle, das die Kultivierung eines Mikroorganismus umfaßt, der zur Gattung Mortierella, Untergattung Mortierella gehört, in einem Medium, das eine Stickstoffquelle enthält, die von der Sojabohne abgeleitet ist, und Sammeln des ungesättigte Fettsäure enthaltenden Öls aus dem Kulturprodukt.
Ausführungsform zur Durchführung der Erfindung
Gemäß der Erfindung sind ungesättigte Fettsäuren Fettsäuren mit mindestens 16 Kohlenstoffatomen und mindestens einer Doppelbindung, unter denen die höher ungesättigten Fettsäuren allgemein Fettsäuren mit mindestens 18 Kohlenstoffatomen und mindestens zwei Doppelbindungen sind, und als Beispiele können γ-Linolensäure, Dihomo-γ-linolensäure, Arachidonsäure, Eikosapentaensäure und Meadsäure erwähnt werden.
Als Beispiele für Mikroorganismen, die zur Gattung Mortierella, Untergattung Mortierella gemäß der Erfindung gehören können, können Mortierella elongata, Mortierella exigua, Mortierella hygrophila, Mortierella alpina usw. erwähnt werden und spezifisch können Mortierella elongata IFO8570, Mortierella exigua IFO8571, Mortierella hygrophila IFO5941, Mortierella alpina IFO8568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS219.35, CBS224.37, CBS250.53, CBS343.66, CBS527.72, CBS529.72, CBS608.70, CBS754.68 und andere Zelllinien erwähnt werden.
Diese Stämme sind alle ohne Einschränkung vom Institute of Fermentation, Osaka (IFO), der American Type Culture Collection (ATCC) und dem Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) erhältlich. Mortierella elongata SAM0219 (FERM P-8703) (FERM-BP 1239), der durch die Forschergruppe der vorliegenden Erfindung aus Erde isoliert wurde, kann ebenfalls verwendet werden. Diese Typ-Zelllinien oder natürlich auftretende Zelllinien können direkt verwendet werden, es ist jedoch durch Wachstum und/oder mindestens einmal Isolation möglich, eine natürliche Mutante zu erhalten, mit von der ursprünglichen Zelllinie unterschiedlichen Eigenschaften.
Die gemäß der Erfindung verwendeten Mikroorganismen beinhalten mutierte Stämme oder rekombinante Stämme von Mikroorganismen, die zur Gattung Mortierella, Untergattung Mortierella gehören (Wildstämme), d.h. diejenigen, die so entworfen sind, daß sie entweder einen höheren ungesättig ten Fettsäuregehalt im Öl ergeben, einen höheren Gesamtölgehalt oder beider im Vergleich mit der Menge, die vom ursprünglichen Wildstamm erzeugt wurde, wenn sie unter Verwendung desselben Substrats kultiviert werden.
Es sind ebenfalls Mikroorganismen beinhaltet, die so entworfen wurden, daß sie dieselbe Menge an ungesättigter Fettsäure wie der Wildstamm erzeugen, durch effiziente Verwendung eines Substrats mit einer ausgezeichneten Kostenwirkung. Als Beispiele hierfür können Mortierella alpina SAM1861 (FERM BP-3590) als mutierter Stamm, der in seiner Δ12 entsättigenden Aktivität defekt ist, und Mortierella alpina SAM1860 (FERM BP-3589) als mutierter Stamm, der in seiner Δ5 entsättigenden Aktivität defekt ist, genannt werden.
Die oben erwähnten Mikroorganismen, die zur Gattung Mortierella, Untergattung Mortierella gehören, in Form von Sporen, Hyphen oder einer Vorkultur, erhalten durch vorheriges Kultivieren, werden in ein Flüssigmedium oder Festmedium inokuliert und kultiviert. Die verwendete Kohlenstoffquelle kann Glucose, Fructose, Xylose, Saccharose, Maltose, lösliche Stärke, Melasse, Glycerin, Mannit, Zitronensäure, Maisstärke oder irgendeine andere konventionelle sein, jedoch werden Glucose, Maltose, Fructose, Maisstärke, Glycerin und Zitronensäure besonders bevorzugt.
Gemäß der Erfindung ist es durch Verwendung einer Nährquelle, erhalten aus der Sojabohne als Stickstoffquelle, möglich, das Zusammensetzungsverhältnis von 24,25-Methylencholest-5-en-3β-ol im Öl zu erniedrigen.
Die für die Erfindung verwendete, von Sojabohnen abstammende Stickstoffquelle ist eine, die einen Stickstoffgehalt von mindestens 2 Gew.%, vorzugsweise mindestens 3 Gew.% und noch bevorzugter mindestens 5 Gew.%, im Hinblick auf die Gesamtbestandteile außer Wasser aufweist. Die von Sojabohnen abstammende Stickstoffquelle kann eine oder eine Kombination von unterschiedlichen Typen einer entfetteten Sojabohne oder einer einer Wärmebehandlung unterzogenen Sojabohne sein; einer Säurebehandlung; einer Alkalibehandlung; einer Enzymbehandlung; einer chemischen Modifikation; einer Denaturierung und/oder Renaturierung durch chemische und/oder physikalische Verarbeitung einschließlich einer Wärmebehandlung, Säurebehandlung, Alkalibehandlung, Enzymbehandlung, chemischen Modifikation usw.; einer Entfernung eines Teils der Komponenten mit Wasser und/oder organischen Lösungsmitteln; einer Entfernung eines Teils der Komponenten durch Filtration und/oder Zentrifugation; einem Einfrieren; einem Zerkleinern; einem Trocknen; einem Sieben usw., oder ein Verarbeitungsprodukt in derselben Weise wie bei einer nicht entfetteten Sojabohne; als übliche Kandidaten können Sojabohnen, ent fettete Sojabohnen, Sojabohnenflocken, eßbares Sojabohnenprotein, Okara, Sojamilch und geröstetes Sojamehl (Kinako) erwähnt werden, unter denen besonders die wärmedenaturierten entfetteten Sojabohnen und insbesondere wärmedenaturierte entfettete Sojabohnen bevorzugt werden, aus denen weiterhin die Ethanol-löslichen Komponenten entfernt wurden.
Wenn notwendig können eine oder mehr unterschiedliche zusätzliche Stickstoffquellen ebenfalls zugefügt werden, so lange die Sterolzusammensetzung nicht in deutlicher weise beeinflußt wird, und Beispiele beinhalten organische Stickstoffquellen, wie z.B. Pepton, Hefeextrakt, Malzextrakt, Fleischextrakt, Casaminsäure (casaminic acid), Maislaugeflüssigkeit (corn steep liquor) und Harnstoff, und anorganische Stickstoffquellen, wie z.B. Natriumnitrat, Ammoniumnitrat und Ammoniumsulfat.
Wenn notwendig, können außerdem Spurennährquellen verwendet werden, einschließlich anorganischen Salzen, wie z.B. Kaliumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat und andere Phosphatsalze, Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Magnesiumsulfat, Eisensulfat, Kupfersulfat, Magnesiumchlorid, Kalziumchlorid usw., und Vitamine.
Gemäß der Erfindung kann die Anhäufung der ungesättigten Fettsäure von Interesse durch Bewirkung der Kultivierung unter Zugabe eines Substrats für die ungesättigte Fettsäure in dem Medium beschleunigt werden. Das verwendete ungesättigte Fettsäuresubstrat kann z.B. ein Kohlenwasserstoff sein wie z.B. Hexadecan oder Octadecan; eine Fettsäure wie z.B. Ölsäure oder Linolsäure oder ein Salz, wie z.B. ein Natrium- oder Kaliumsalz davon, oder ein Fettsäureester wie z.B. Ethylester, Glycerolfettsäureester oder Sorbitanfettsäureester; oder ein Öl wie z.B. Olivenöl, Sojaöl, Rapsöl, Baumwollöl oder Kokosöl, und diese können allein oder in Kombinationen verwendet werden. Die Gesamtmenge des zugefügten Substrats beträgt 0,001 bis 10 Gew.% und bevorzugt 0,5 bis 10 Gew.% im Hinblick auf das Medium. Alle diese Substrate können auch als einzige Kohlenstoffquelle für die Kultivierung verwendet werden.
Die oben erwähnten Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganischen Salze, Vitamine und/oder Additive können dem Medium vor dem Beginn der Kultivierung zugefügt werden oder der Kulturbrühe während der Kultivierung. Die Mediumsbestandteile können alle gleichzeitig oder kontinuierlich oder periodisch über einige Additionen zugefügt werden. Die Mediumsbestandteile können jeweils allein oder als Mischung zugefügt werden. Es gibt keine besonderen Begrenzungen im Hinblick auf die Konzentrationen der Mediumsbestandteile, so lange das Wachstum der Zellen nicht inhibiert wird.
Im praktischen Gebrauch sollte die Kohlenstoffquelle eine Konzentration von 0,1 bis 30 Gew.%, vorzugsweise 1 bis 15 Gew.%, aufweisen und die Stickstoffquelle sollte eine Konzentration von 0,01 bis 10 Gew.%, vorzugsweise 0,1 bis 5 Gew.%, aufweisen.
Die Kultivierungstemperatur beträgt 5 bis 40°C und vorzugsweise 20 bis 30°C, und die ungesättigte Fettsäure kann auch durch Wachstum der Zellen durch Kultivierung bei 20 bis 30°C, gefolgt von einer kontinuierlichen Kultivierung bei 5 bis 20°C erzeugt werden. Diese Art und Weise einer Temperaturkontrolle kann auch verwendet werden, um den Ertrag der höher ungesättigten Fettsäuregehalte in den Fettsäuren, die erzeugt werden, zu erhöhen. Der pH des Mediums beträgt 4 bis 10 und vorzugsweise 5 bis 8, und eine Kultivierung mit Belüftung und Rühren, Schüttelkultivierung oder statische Kultivierung können verwendet werden. Die Kultivierung wird normalerweise für 2 bis 20 Tage, vorzugsweise 5 bis 20 Tage und noch bevorzugter 5 bis 15 Tage durchgeführt.
Ein Fermenter, insbesondere ein Kulturfermenter mit Belüftung und Rühren oder ein Airlift-Kulturfermenter können für Eintauchkultivierung mit Belüftung verwendet werden, um eine Produktion mit Erträgen zu ermöglichen, die für ungesättigte Fettsäure enthaltende Öle als kommerzielle Produkte geeignet sind. In solchen Fällen kann das ungesättigte Fettsäure enthaltende Öl sogar noch effizienter durch Erhalt einer Glucosekonzentration von mindestens 0,3 Gew.% und/oder einer durchschnittlichen Glucosekonzentration von mindestens 0,5 Gew.%, vorzugsweise einer Glucosekonzentration von mindestens 0,5 Gew.% und/oder einer durchschnittlichen Glucosekonzentration von mindestens 0,7 Gew.%, und noch bevorzugter einer Glucosekonzentration von 0,5–5 Gew.% und/oder einer durchschnittlichen Glucosekonzentration von 0,7–3 Gew.%, für mindestens 3 Tage nach Beginn der Kultivierung erzeugt werden. Arachidonsäure kann zum Beispiel mit 100 mg oder mehr und vorzugsweise 120 mg oder mehr zu 1 g Trockenzellen erzeugt werden.
So wird ein Öl, das im Hinblick auf die gewünschte ungesättigte Fettsäure reich ist und niedrig in seinem 24,25-Methylencholest-5-en-3β-ol-Gehalt, in großen Mengen in den Zellen angehäuft.
Das gewünschte Öl kann gemäß einem konventionellen Verfahren aus der Kulturbrühe erhalten werden, die während der Produktion des Öls durch die Zellkultivierung genommen wird oder nach der Sterilisierung, der Kulturbrühe, die am Ende der Kultivierung oder nach der Sterilisierung erhalten wird, oder den kultivierten Zellen, die von einem der beiden gesammelt wurden, alternativ in trockener Form.
Das gewünschte Öl kann aus den kultivierten Zellen beispielsweise durch das folgende Verfahren gesammelt werden.
Nach Vervollständigung der Kultivierung werden die kultivierten Zellen aus der Kulturbrühe durch ein konventionelles Festphasen/Flüssigphasen-Abtrennmittel erhalten, wie z.B. einer Zentrifugation und/oder Filtration. Die kultivierten Zellen werden vorzugsweise gewaschen, aufgebrochen und getrocknet. Das Trocknen kann durch Gefriertrocknen, Lufttrocknen oder ähnliches bewirkt werden. Die trockenen Zellen werden vorzugsweise einer Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise unter einem Stickstoffstrom, unterzogen. Das verwendete organische Lösungsmittel kann Ether, Hexan, Methanol, Ethanol, Chloroform, Dichlormethan, Petroleumether oder ähnliche sein, und zufriedenstellende Ergebnisse können auch durch alternierende Extraktion mit Methanol und Petroleumether oder durch Extraktion unter Verwendung eines Chloroform-Methanol-Wasser Monolayer-Systems erhalten werden.
Durch Entfernung des organischen Lösungsmittel aus dem Extrakt bei reduziertem Druck ist es möglich, ein ungesättigte Fettsäure enthaltendes Öl mit hoher Konzentration zu erhalten. Die Extraktion kann auch unter Verwendung von feuchten Zellen anstelle des oben beschriebenen Verfahrens bewirkt werden. In diesem Fall wird ein wasserkompatibles Lösungsmittel wie z.B. Methanol oder Ethanol oder ein wasserkompatibles Mischlösungsmittel beinhaltend eine von diesen mit Wasser und/oder einem anderen Lösungsmittel verwendet. Die anderen Verfahren sind dieselben wie oben beschrieben.
Das auf diese Weise erhaltene Öl enthält die ungesättigten Fettsäuren im Zustand von Triglyceriden und Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin oder Phosphatidylinosit, jedoch im wesentlichen in Form von Triglyceriden. Um die ungesättigte Fettsäuren enthaltenden Triglyceride aus dem ungesättigte Fettsäuren enthaltendem Öl, gesammelt aus dem kultivierten Produkt, abzutrennen und zu reinigen, kann ein konventionelles Verfahren für eine Hexanextraktion, gefolgt von einer Entsäuerung, Entfärbung, Deodorierung und einer Entgummierungsbehandlung oder eine Kühlseparation verwendet werden.
Gemäß der Erfindung wird das Zusammensetzungsverhältnis von 24,25-Methylencholest-5-en-3β-ol durch das folgende Verfahren bestimmt, basierend auf einer Sterolzusammensetzungsanalyse.
Zunächst wird die Sterolzusammensetzungsanalyse erklärt. Ein 30 bis 80 mg Anteil des Öls wird in ein Teströhrchen mit einem Stopfen ausgewogen, 4 ml Methanol und 1 ml einer 33 %igen wäßrigen Kaliumhydroxidlösung werden zugefügt und der Stopfen eingepaßt. Nach einer einstündigen Reaktion unter leichtem Rühren bei 80°C läßt man die Mischung abkühlen und die öllöslichen Komponenten werden mit Hexan extrahiert. Die resultierende Hexanlösung wird mit Wasser gewaschen, bis ein Phenolphthalein-Indikator die wäßrige Schicht nicht mehr anfärbt, und wird dann unter reduziertem Druck zum Erhalt einer Analyseprobe konzentriert. Die Analyseprobe wird in einer geringen Menge Hexan gelöst und einer Gaschromatographie unter den in der unten angegebenen Tabelle aufgeführten Bedingungen unterzogen. Durch Vergleich des Gaschromatogramms mit einem kommerziell erhältlichen Desmosterol-Standard werden die Desmosterol-Peaks identifiziert.
Die Bestandteile, die innerhalb von 0,8 bis 2,0 mal der Retentionszeit von Desmosterol nachgewiesen werden, sind die Sterolbestandteile, und die Peakbereiche der Gaschromatogramme für alle Sterolbestandteile innerhalb der Retentionszeit werden durch ein konventionelles Verfahren bestimmt. Das Verhältnis des Peakbereichs von jeder Komponente zur Summe der Gesamtpeakbereiche der Komponenten wird als Zusammensetzungsverhältnis für jede Komponente angenommen. Zum Beispiel ist das Verhältnis des Peakbereichs, nachgewiesen für Desmosterol, im Hinblick auf die Summe des Gesamtsterolbereichs das Zusammensetzungsverhältnis für Desmosterol.

24,25-Methylencholest-5-en-3β-ol wird in einer Retentionszeit von 1,07 bis 1,12 mal der Retentionszeit von Desmosterol nachgewiesen. Das Verhältnis des Peakbereichs, nachgewiesen für 24,25-Methylencholest-5-en-3β-ol im Hinblick auf die Summe aller Peakbereiche, ist das Zusammensetzungsverhältnis von 24,25-Methylencholest-5-en-3β-ol.

Verwendete Säule:	ULBON HR-1 (Innendurchmesser: 0,25 mm, Länge: 25 m)
Säulentemperatur:	280°C
Einlaß- und Detektortemperatur:	300°C
Trägergas und Eichdruck, Helium:	1,2 kg/cm²
Make-up Gas und Flußrate, Stickstoff:	70 ml/min.
Detektor:	FID
Splitverhältnis:	20

Das ungesättigte Fettsäure enthaltende Öl der Erfindung weist ein 24,25-Methylencholest-5-en-3β-ol Zusammensetzungsverhältnis von 35 % oder weniger, vorzugsweise 33 % oder weniger und noch bevorzugter 30 % oder weniger auf, und/oder der 24,25-Methylencholest-5-en-3β-ol Anteil ist 1,2 oder weniger, vorzugsweise 0,9 oder weniger und noch bevorzugter 0,6 oder weniger im Hinblick auf das im Öl vorliegende Desmosterol. Desmosterol ist eine Komponente, beinhaltet mit 24,25-Methylencholest-5-en-3β-ol in Ölen, erhalten durch Kultivierung von Mikroorganismen, die zur Gattung Mortierella, Untergattung Mortierella gehören, und es ist bekannt, daß es in der Muttermilch vorliegt.
Als Beispiel eines ungesättigte Fettsäure enthaltendes Öls gemäß der Erfindung kann ein Arachidonsäure enthaltendes Öl genannt werden, mit 20 bis 54 Gew.% und vorzugsweise 30 bis 50 Gew.% Arachidonsäure im Hinblick auf die gesamten Fettsäuren im Öl und einem 24,25-Methylencholest-5-en-3β-ol Zusammensetzungsverhältnis von 35 % oder weniger, vorzugsweise 33 % oder weniger und noch bevorzugter 30 % oder weniger und/oder einem 24,25-Methylencholest-5-en-3β-ol Anteil von 1,2 oder weniger, vorzugsweise 0,9 oder weniger und noch bevorzugter 0,6 oder weniger im Hinblick auf das im Öl vorliegende Desmosterol.
Die Öleigenschaften des Arachidonsäure enthaltenden Öls sind derartig, daß der Triglyceridgehalt 90 % oder mehr beträgt, der Feuchtigkeitsgehalt 0,1 % oder weniger, der Säurewert 0,5 oder weniger und der Peroxidwert 5 oder weniger, während die Farbe ≤ 50 gelb und ≤ 10 durch das Lovibond-Verfahren in einer 133,4 mm Zelle ist, und die Fettsäurezusammensetzung beträgt 20 bis 54 %, vorzugsweise 30 bis 50 % Arachidonsäure, 0,2 bis 0,7 % Myristinsäure, 10 bis 16 % Palmitinsäure, 4 bis 10 % Stearinsäure, 5 bis 15 % Ölsäure, 5 bis 15 % Linolsäure, 1 bis 5 % γ-Linolensäure, 0,1 bis 2 % α-Linolensäure, 1 bis 6 % Dihomo-γ-linolensäure, 0 bis 1 % Eikosapentaensäure und 2 bis 7 % Lignocerinsäure.
Das Öl ist reich an der Triglyceridform von Arachidonsäure und enthält entweder keine Eikosapentaensäure oder enthält sie nur in sehr geringen Spurenmengen und ist daher als Material für Nahrungsmittel und insbesondere Formeln für unreife Kleinkinder, Kleinkind-Formeln, Babynahrung und Schwangerschaftsnahrung wünschenswert. Das ungesättigte Fettsäure enthaltende Öl der Erfindung kann auch sicher in Nahrungsmitteln und Tierfutter verwendet werden, da es einen niedrigen Gehalt an 24,25-Methylencholest-5-en-3β-ol aufweist, dessen Eßbarkeit bis jetzt noch nicht etabliert werden konnte.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun im Detail durch die Beispiele beschrieben.
Beispiel 1
Unter Verwendung von Mortierella elongata IFO8570 als Arachidonsäure erzeugende Zelllinie wurden 1.400 1 eines Mediums, enthaltend 2 % Glucose, 1 % eßbares Sojaprotein (Marke Esusan Meat, erzeugt von Ajinomoto Co.) und 0,1 % Rapsöl in einen 2.000 1 Fermenter plaziert, ausgerüstet mit einer Rührvorrichtung und einer Belüftungsvorrichtung, und eine Kultivierung unter Belüftung und Rühren wurde unter Bedingungen von 28°C Temperatur, 1,0 vvm Belüftung, 80 Upm Rühren und 1,0 kg/cm² G Headspacedruck initiiert. Die Glucosekonzentration wurde auf 1,5 % durch Zufuhr von Glucose gehalten, und nach einem Kultivieren über 7 Tage wurden die Zellen durch Filtration wiedergewonnen und einer Ölextraktion unterzogen. Als Vergleichsbeispiel wurde eine Kultivierung und Ölextraktion auf dieselbe Weise unter Verwendung von 1 % Hefeextrakt anstatt des eßbaren Sojaproteins durchgeführt.
Bei einer Analyse der Sterolzusammensetzung des resultierenden Öls gemäß dem oben beschriebenen Verfahren wurde Desmosterol bei einer Retentionszeit von ungefähr 9,6 Minuten und 24,25-Methylencholest-5-en-3β-ol bei einer Retentionszeit von ungefähr 10,5 Minuten nachgewiesen. Im Vergleichsbeispiel wurde Desmosterol bei einer Retentionszeit von ungefähr 6,5 Minuten und 24,25-Methylencholest-5-en-3β-ol bei einer Retentionszeit von ungefähr 7,2 Minuten nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. So wurde ein Arachidonsäure enthaltendes Öl mit einem niedrigen Zusammensetzungsverhältnis von 24,25-Methylencholest-5-en-3β-ol erhalten. Tabelle 1

* Sterolgehalt im Öl
** Arachidonsäuregehalt im Hinblick auf die gesamten Fettsäuren im Öl

Beispiel 2
Mortierella alpina CBS754.68 wurde als Arachidonsäure produzierende Zelllinie verwendet und 600 l eines Mediums, enthaltend 4 % Glucose, 1,3 % geröstetes Sojamehl (Kinako), 0,2 % Hefeextrakt und 0,1 % Olivenöl wurden in einen 1.000 l Fermenter plaziert, ausgerüstet mit einer Rührvorrichtung und einer Belüftungsvorrichtung, zur Kultivierung unter Belüftung und Rühren für 5 Tage unter Bedingungen von 24°C Temperatur, 1,0 vvm Belüftung, 100 Upm Rühren und 0,5 kg/cm² G Headspacedruck, gefolgt von einer Filtration und einem Trocknen zum Gewinnen der Zellen und Hexanextraktion zum Erhalt eines Öls. Als Vergleichsbeispiel wurde eine Kultivierung auf dieselbe Weise unter Verwendung eines Mediums aus 4 % Glucose, 1,5 % Hefeextrakt und 0,1 % Olivenöl zum Erhalt eines Öls durchgeführt. Sowohl im Beispiel als auch im Vergleichsbeispiel wurde 1 % Glucose am 2. Tag der Kultivierung zugefügt.
Bei einer Analyse der Sterolzusammensetzung des gemäß dem oben beschriebenen Verfahren erhaltenen resultierenden Öls wurde Desmosterol bei einer Retentionszeit von ungefähr 10,2 Minuten und 24,25-Methylencholest-5-en-3β-ol bei einer Retentionszeit von ungefähr 11,2 Minuten nachgewiesen. Im Vergleichsbeispiel wurde Desmosterol bei einer Retentionszeit von ungefähr 6,4 Minuten und 24,25-Methylencholest-5-en-3β-ol bei einer Retentionszeit von ungefähr 7,1 Minuten nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. So wurde ein Arachidonsäure enthaltendes Öl mit einem niedrigen Zusammensetzungsverhältnis von 24,25-Methylencholest-5-en-3β-ol erhalten. Tabelle 2

Beispiel 3
Mortierella alpina ATCC32221 und Mortierella alpina ATCC42430 wurden als Arachidonsäure produzierende Zelllinien verwendet und jeweils kultiviert. Nachdem 25 l eines Mediums, enthaltend 4 % Glucose, 1,2 % entfettetes Sojapulver, 0,2 % Kaliumhydrogenphosphat und 0,1 % Sojaöl in einem 50 l Fermenter plaziert worden waren, ausgerüstet mit einer Rührvorrichtung und einer Belüftungsvorrichtung, wurde eine Kultivierung unter Belüftung und Rühren für 5 Tage durchgeführt unter Bedingungen von 28°C Temperatur, 1,0 vvm Belüftung, 300 Upm Rühren und 1,0 kg/cm² G Headspacedruck durchgeführt, gefolgt von einer Filtration und einem Trocknen, um die Zellen zu gewinnen und einer Hexanextraktion, um ein Öl aus den gewonnenen Zellen zu erhalten.
Als Vergleichsbeispiel wurde eine Kultivierung in derselben Weise unter Verwendung eines Mediums aus 4 % Glucose, 1,2 % Bierhefepulver, 0,2 % Kaliumhydrogenphosphat und 0,1 % Rapsöl zum Erhalt eines Öls durchgeführt. Sowohl im Beispiel als auch im Vergleichsbeispiel wurde 1 % Glucose am 2. Tag der Kultivierung zugefügt. Die Sterolzusammensetzung des resultierenden Öls wurde gemäß dem oben beschriebenen Verfahren analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Auf diese Weise wurde ein Arachidonsäure enthaltendes Öl mit einem niedrigen Zusammensetzungsverhältnis von 24,25-Methylencholest-5-en-3β-ol erhalten.
Tabelle 3

Beispiel 4

Unter Verwendung von Mortierella alpina CBS754.68 als Arachidonsäure produzierende Zelllinie wurden 1.400 1 eines Mediums, enthaltend 2 % Glucose, 1,5 % Sojaprotein und 0,1 % Sojaöl in einen 2.000 1 Fermenter plaziert, ausgerüstet mit einer Rühr- und Belüftungsvorrichtung, und Kultivierung unter Belüftung und Rühren wurde unter Bedingungen von 24°C Temperatur, 1 vvm Belüftung, 80 Upm Rühren und 200 kPa Headspacedruck initiiert. Die Glucosekonzentration wurde durch Zufuhr von Glucose bei 0,5 bis 1,5 % gehalten und nach einer Kultivierung für 7 Tage wurden die Zellen durch Filtration gewonnen. Nach Trocknen der Zellen wurden sie mit Hexan extrahiert, das extrahierte Öl wurde einer Entsäuerung, Entfärbung und Deodorie rung unterzogen, und 0,05 % Tocopherol wurden als Antioxidans zugefügt. Das resultierende Öl wurde analysiert und hatte die folgende Zusammensetzung. Analyseergebnisse:

Triglyceridgehalt:	95,6 %
Feuchtigkeit:	0,04 %
Säurewert:	0,08
Peroxidwert:	2,16
Farbe (Lovibond-Verfahren, 133,4 mm Zelle):	gelb: 20,1, rot: 1,4

Fettsäurezusammensetzung:

Arachidonsäure	44,4 %
Myristinsäure	0,6 %
Palmitinsäure	14,6 %
Stearinsäure	8,8 %
Ölsäure	6,3 %
Linolsäure	10,2 %
γ-Linolensäure	3,2 %
α-Linolensäure	0,8 %
Dihomo-γ-linolensäure	5,2 %
Eikosapentaensäure	0,2 %
Lignocerinsäure	4,8 %
Gesamtsterolgehalt:	1,0 %
24,25-Methylencholest-5-en-3β-ol Zusammensetzungsverhältnis:	24 %
Desmosterol-Zusammensetzungsverhältnis:	67 %

Beispiel 5
Das in Beispiel 4 erhaltene Arachidonsäure enthaltende Öl wurde auf geeignete Weise mit Fischöl und pflanzlichem Öl vermischt, um ein auf essentielle Fettsäuren eingestelltes Öl zu erhalten. Zusätzlich zu dem auf essentielle Fettsäuren eingestellten Öl wurden die unten aufgeführten Rohmaterialien und Bestandteile für eine Formulierung von 100 kg pulverförmiges Kleinkind-Formel hergestellt. Nach einem Auflösen, Vermischen und Raffinieren der Rohmaterialien gemäß konventionellen Verfahren wurden sie sterilisiert, konzentriert und homogenisiert und dann sprühgetrocknet, um eine pulverförmige Kleinkind-Formel zu erhalten. Rohmaterialien und Bestandteile:

Kasein 5,6 kg

Molkeproteinkonzentrat 24,0 kg

auf essentielle Fettsäuren eingestelltes Öl (bestehend im wesentlichen aus Linolsäure, α-Linolensäure) 25,0 kg

Arachidonsäuregehalt 80 g

Docosahexaensäuregehalt 25 g

Eikosapentaensäuregehalt 10 g

Saccharide (Lactose und Oligosaccharide) 43,4 kg

Mineralien und Vitamine 2 kg

Gesamt 100 kg

Claims

Arachidonsäure-haltiges Öl mit einem 24,25-Methylencholest-5-en-3(beta)-ol Zusammensetzungsverhältnis in einem Anteil von 1,2 oder weniger im Hinblick auf das Desmosterol-Zusammensetzungsverhältnis und einem Arachidonsäuregehalt von 20 bis 54 %.
Arachidonsäure-haltiges Öl gemäß Anspruch 1, wobei es sich um ein mikrobielles Öl handelt, erhalten von einem Mikroorganismus der Gattung Mortierella, Untergattung Mortierella.
Diätetischer Nahrungszusatz, umfassend ein Arachidonsäure-haltiges Öl gemäß Anspruch 1 oder 2.
Formel für unreife Kleinkinder, Kleinkindformel, Babynahrung oder Schwangerschaftsnahrungsprodukt, umfassend ein Arachidonsäure-haltiges Öl gemäß Anspruch 1 oder 2.
Tiernahrung, umfassend ein Arachidonsäure-haltiges Öl gemäß Anspruch 1 oder 2.