DE102004002053A1 - Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylserin und dessen Reinigung durch Extraktion - Google Patents
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Abstract
Beansprucht wird ein Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylserin aus einem Phospholipid(-Gemisch) und Serin in einem wässrigen System durch Transphosphatidylierung in Gegenwart eines Proteins mit Phospholipase D-Aktivität und in Anwesenheit zweiwertiger Metallionen. Dieses Verfahren wird in einem Lösemittelsystem durchgeführt, das aus a) 100 bis 60 Gew.-% Wasser oder eines wässrigen Puffers mit pH 5,0 bis 6,5 und b) 0 bis 40 Gew.-% eines wassermischbaren organischen Lösemittels mit PLD-aktivierender Wirkung besteht, wobei das erhaltene Phosphatidylserin durch eine fraktionierende Reinigung abgetrennt wird. Dieses Verfahren, das insbesondere in reinem Wasser durchgeführt werden kann, besitzt seinen Hauptvorteil in den abschließenden Abtrennungsschritten der eventuell verbliebenen Ausgangsmaterialien bzw. des Produktes Phosphatidylserin, wodurch dieses in Reinheiten > 95 Gew.-% und in guten Ausbeuten erhalten wird.
Description
- Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylserin.
- Enzymatische Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylserin (PS) sind aus dem Stand der Technik hinlänglich bekannt. Dabei werden vornehmlich Enzyme mit Phospholipase D (PLD)-Aktivität eingesetzt.
- So ist bspw. mit dem europäischen Patent
EP 776 976 - Gemäß japanischem Patent Nr. 1 696 687 (veröffentlicht als JP 3-67676) werden Phospholipide und auch Phosphatidylserin mit einem enzymatischen Verfahren in der Art hergestellt, indem das Ausgangsphospholipid mit einem Akzeptor, der eine Hydroxyl-Gruppe trägt, mit einer an einem Träger-adsorbierten Phospholipase D in einem organischen Lösemittel umgesetzt wird, wobei der Gesamtwassergehalt des Reaktionssystems nicht mehr als 1 Gew.-% aufweist.
- Das japanische Patent 2 130 088 (veröffentlicht als JP 5-42917) schützt ein Verfahren, bei dem Phosphatidylcholin als Substrat im Rahmen einer Basenaustauschreaktion mit einem Alkohol, wie bspw. Serin, in Gegenwart von PLD aus Streptomyces umgesetzt wird.
- Das japanische Patent Nr. 1 997 470 umfasst ein Verfahren zur Herstellung eines Phospholipids, indem dessen basische Variante mit einer wässrigen PLD-Zubereitung in Gegenwart eines Rezeptors mit einer Hydroxyl-Gruppe in einem organischen Lösemittel so umgesetzt wird, dass die wässrige Phase in einer reversen Mizelle eingeschlossen ist. Das Phospholipid selbst soll dabei als oberflächenaktives Mittel dienen.
- Hinsichtlich der jeweils eingesetzten Phospholipase D ist bekannt, dass sie ihre spezifische Aktivität in Abhängigkeit vom jeweiligen Lösemittelsystem entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit zweiwertiger Metallionen entwickelt.
- So sind zahlreiche Verfahrensvarianten vorbeschrieben, die bspw. empfehlen, Phospholipase D z.B. zum Zwecke der Herstellung von Phosphatidsäure in Gegenwart von Wasser aber in Abwesenheit divalenter Metallionen einzusetzen. Diesbezüglich wird auf die europäische Anmeldung
EP 285 421 - Weitere Beispiele aus dem Stand der Technik, die spezielle Lösemittelsysteme bzw. den Einfluss von zweiwertigen Metallionen auf die PLD-Aktivität zum Gegenstand haben, sind JP 61-8888, gemäß der Alkohole, wie z.B. Ethanol oder Methanol, als Akzeptoren für den Kopfgruppenaustausch verwendet werden. Das beschriebene Verfahren wird in Gegenwart zweiwertiger Metallionen durchgeführt und als Lösemittel werden Wasser, Puffersysteme oder organische Lösemittel verwendet.
- Gemäß JP 63-091090 werden ebenfalls Alkohole als Akzeptoren eingesetzt. Geeignete Lösemittel sind in diesem Fall Ether, Benzol, Chloroform und Wasser, wobei das Verfahren wieder in Gegenwart eines zweiwertigen Metallions durchgeführt wird. Als besonders geeignete Metallionen beschreibt JP 63-091089 Calciumionen, wobei die PLD mit einem Alkohol wie Ethanol, Hexanol oder Sorbitol als Akzeptor eingesetzt wird.
- Eine spezielle Verfahrensvariante, bei der Alkohol nicht als Lösemittel sondern als Reaktand eingesetzt wird, beschreibt JP 01-144986; dieses Verfahren bedient sich einer PLD, die in Gegenwart von zweiwertigen Metallionen ihre spezifische Aktivität entfaltet.
- Spezielle Ester werden gemäß JP 03-004795 als Lösemittelsysteme im Gemisch mit einem Halogen-haltigen organischen Lösemittel eingesetzt. Die Reaktion der PLD wird hierbei in Gegenwart von Calcium- und Magnesiumsalzen durchgeführt.
- Gemäß JP 03-098590 wird vom Einsatz von Alkoholen als Lösemittel abgeraten, weil dadurch die PLD-Aktivität generell gestört und damit das Umsatzergebnis bei der Herstellung von Phospholipiden signifikant verschlechtert wird.
- In einem rein organischen Lösemittelsystem wird gemäß JP 07-184673 gearbeitet, wobei als wasserfreie Monophase Chloroform, Toluol oder Essigsäureethylester als Reaktionsmedium für die PLD verwendet werden. Ohne Alkohol als Lösemittel, jedoch mit Methanol als Akzeptor für den Kopfgruppentransfer, wird entsprechend JP 08-000276 gearbeitet. Gänzlich ohne zweiwertige Metallionen, jedoch in einem Reaktionsgemisch bestehend aus Alkohol und Wasser sowie einem unpolaren Lösemittel, arbeitet ein Verfahren gemäß JP 08-009896. Ein wässriges System bestehend aus Wasser oder einem Puffer, jedoch vollkommen ohne organische Lösemittel, sondern lediglich unter Verwendung von oberflächenaktiven Estern, benutzt das Verfahren gemäß JP 2002-218991. Ein Zweiphasensystem bestehend aus gesättigten Kohlenwasserstoffen, Aromaten, Ketonen, Estern, Alkoholen und Wasser, jedoch ohne die Gegenwart zweiwertiger Metallionen, ist gemäß JP 2-113891 als Reaktionsmedium für die Herstellung von Phospholipiden unter Zuhilfenahme von PLD geeignet.
- Schließlich wird auch noch empfohlen, die PLD zu immobilisieren, bspw. in Form einer Adsorption auf Aktivkohle und einer anschließenden Aktivierung durch die Ethylether; dies ist aus JP 63-36791 bekannt.
- Der bekannte und vielfältig vorbeschriebene Stand der Technik gibt dem Durchschnittsfachmann zahlreiche Verfahrensvarianten an die Hand, wie er bspw. in Abhängigkeit des gewählten Reaktionsmediums und unter Zuhilfenahme gewisser Modulatoren für die PLD-Aktivität, wie bspw. Metallionen, organische Lösemittel oder Trägermaterialien, spezifische Phospholipide herstellen kann.
- Nachteilig bei all den vorbeschriebenen Verfahren ist die Tatsache, dass die PLD entweder in besonders reiner Form eingesetzt werden muss, oder aber dass sie erst aufwändig an Trägermaterialien adsorbiert, also immobilisiert, und nach erfolgter Reaktion zum Zwecke der Rückgewinnung wieder abgetrennt werden muss, wobei auch in Kauf genommen wird, dass das Enzym zu einem großen Teil verbraucht wird.
- Auch die Auswahl komplex zusammengesetzter Reaktionsmedien, die entweder ausschließlich aus organischen Lösemitteln bestehen, oder aber aus mehrphasigen, wasserhaltigen Systemen, sind deshalb als nachteilig anzusehen, da die als Ausgangsmaterialien eingesetzten Phospholipide bekanntlich überwiegen lipophile Eigenschaften besitzen und dadurch zur Mizellbildung neigen, was deren Umsetzung bzw. Zugänglichkeit durch die PLD deutlich verschlechtern kann.
- Aus den geschilderten Nachteilen des Standes der Technik hat sich für die vorliegende Erfindung die Aufgabe gestellt, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem Phosphatidylserin aus einem Phospholipid(-Gemisch) und Serin in einem wässrigen System durch Transphosphatidylierung in Gegenwart eines Proteins mit Phospholipade D (PLD)-Aktivität und in Anwesenheit zweiwertiger Metallionen auf einfache und wirtschaftliche Weise in guten Ausbeuten gewonnen werden kann. Dabei sollte insbesondere vermieden werden, dass komplizierte mehrphasige Systeme eingesetzt werden, wobei insbesondere die eingesetzten organischen Lösemittel keinen negativen Einfluss auf die Enzymaktivität ausüben sollten. Zudem war zu vermeiden, dass das Enzym aufwändig erst auf ein Trägermaterial aufgebracht und abschließend von diesem wieder zurückgewonnen werden muss.
- Schließlich stand auch das Ziel im Vordergrund, das Phosphatidylserin in hohen Ausbeuten und in reinen Produktqualitäten zu erhalten.
- Gelöst wurde diese Aufgabe mit einem entsprechenden Verfahren, welches in einem Lösemittelsystem durchgeführt wird, das aus
- a) 100 bis 60 Gew.-% Wasser oder eines wässrigen Puffers mit pH 5,0 bis 6,5 und
- b) 0 bis 40 Gew.-% eines wassermischbaren organischen Lösemittels mit PLD-aktivierender Wirkung besteht,
- Überraschend hat sich beim Einsatz dieses Verfahrens herausgestellt, dass dieses nicht nur gemäß Aufgabenstellung in völlig unkomplizierter Weise wirtschaftlich durchzuführen ist, sondern dass insbesondere die Gesamtreaktion ohne größere Komplikationen auch in einem rein wässrigen System, also in Wasser, ablaufen kann. Insbesondere der abschließende Verfahrensschritt der fraktionierenden Reinigung trägt der beanspruchten Verfahrensbreite in sofern Rechnung, als damit in Abhängigkeit vom eingesetzten Lösemittelsystem das jeweils erhaltene Phosphatidylserin in zufriedenstellenden Ausbeuten bei gleichzeitig großer Reinheit erhalten wird. Die Vorteile dieses Verfahrens waren in dieser Ausprägung nicht vorherzusehen.
- Bzgl. des Ausgangsmaterials in Form eines Phospholipids oder eines Gemisches unterschiedlicher Phospholipide ist das vorliegende Verfahren keinerlei Einschränkung unterworfen. Als bevorzugte Phospholipid-Komponente sieht die Erfindung allerdings Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol und Phosphatidsäure vor, die auch in beliebigen Mischungen eingesetzt werden können.
- Die Breite des beanspruchten Verfahrens wird auch aus der eingesetzten Enzym-Komponente ersichtlich. So ist das vorliegende Verfahren nicht auf eine spezielle Phospholipase D beschränkt, wie sie bspw. aus spezifischen Mikroorganismen isoliert wird, oder auch in rohen Fermentationsbrühen vorhanden ist, sondern es kann sich gemäß beanspruchtem Verfahren dabei um jegliche Proteine handeln, die eine Phospholipase D-Aktivität aufweisen. Diesbezüglich sieht die vorliegende Erfindung allerdings vorzugsweise vor, als Protein mit PLD-Aktivität eine Phospholipase D zu verwenden.
- Erfindungswesentlich für das Gelingen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist u.a. die Anwesenheit zweiwertiger Metallionen, wobei Calcium-, Magnesium- und/oder Zinkionen als bevorzugt anzusehen sind. Selbstverständlich können aber auch alle anderen geeigneten zweiwertigen Metallionen in Abhängigkeit vom erfindungsgemäß verwendeten Reaktionsmedium eingesetzt werden.
- Hinsichtlich der Metallionen sieht die vorliegende Erfindung Konzentrationen von max. 100 mM vor, wobei Konzentrationen zwischen 0,1 und 20 mM als besonders bevorzugt angesehen werden, weil dadurch die Bildung von in Wasser oder gepufferten wässrigen Systemen schwer- bzw. unlöslichen Calciumsalzen zurückgedrängt werden kann.
- Auch das Lösemittelsystem kann in breiten Bereichen variiert werden. Als bevorzugte Variante berücksichtigt die vorliegende Erfindung jedoch ein System, welches 60 bis 95 Gew.-% der wasserhaltigen Komponente a) enthält, wobei Anteile zwischen 75 und 90 Gew.-% als besonders bevorzugt gelten. Besonders geeignet für das erfindungsgemäße Verfahren ist ein Lösemittelsystem, welches als Komponente a) ausschließlich Wasser enthält, wobei selbstverständlich auch eine Verfahrensvariante angewendet werden kann, bei der die Reaktion nur in Wasser durchgeführt wird, also ohne Zuhilfenahme einer Puffer-Komponente oder gewisser Mengen eines organischen Lösemittels.
- Von der vorliegenden Erfindung wird auch ein Lösemittelsystem umfasst, welches als wässrige Komponente a) einen Acetat-, Citrat- oder Phosphat-Puffer und besonders bevorzugt einen Natriumacetat-Puffer enthält, wobei die erwähnten Puffer in Mengen zwischen 50 und 100 mM vorliegen sollten. Als besonders geeignet hat sich ein Lösemittelsystem erwiesen, das als wässrige Komponente a) einen Puffer mit einem pH-Wert von 5,6 aufweist.
- Hinsichtlich der Komponente b) sollte ein Lösemittelsystem eingesetzt werden, welches diese organische Komponente in Anteilen zwischen 5 und 40 Gew.-% und besonders bevorzugt zwischen 12 und 17 Gew.-% enthält. In diesem Zusammenhang werden sekundäre oder tertiäre Alkohole und insbesondere Isopropanol als besonders bevorzugte Komponente b) angesehen.
- Entgegen dem Stand der Technik ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht auf eine spezifische PLD beschränkt, jedoch hat es sich für spezielle Verfahrensvarianten als durchaus empfehlenswert erwiesen, wenn das eingesetzte Protein mit PLD-Aktivität immobilisiert eingesetzt wird.
- Auch hinsichtlich der Reaktionstemperaturen beschränkt sich das erfindungsgemäße Verfahren nicht auf spezielle Bereiche. Allerdings werden Reaktionstemperaturen empfohlen, die zwischen 25 ° und 50 °C, wobei ein Bereich zwischen 40 ° und 45 °C als besonders bevorzugt gilt.
- Falls das Verfahren gemäß Erfindung in einem ungepufferten Lösemittelsystem mit definiertem pH-Wert durchgeführt werden soll, empfiehlt es sich, dass der pH-Wert der Reaktionslösung durch Titration mit Natronlauge während der Reaktion konstant gehalten wird.
- Um die Produktausbeute, also die Menge an Phosphatidylserin, möglichst optimal zu gestalten, sieht die vorliegende Erfindung vor, den pH-Wert nach Reaktionsende auf 3,0 zu erniedrigen, wobei der nach dieser pH-Erniedrigung erhaltene Feststoff anschließend vorzugsweise von der Lösung abgetrennt wird. Dies kann üblicherweise durch bekannte Dekantationsverfahren erfolgen, da der Feststoff nach der pH-Wert-Erniedrigung meist auf dem Reaktionsmedium flotiert, was selbstverständlich insbesondere bei höheren Temperaturen in Bereichen zwischen 35 bis 40 °C in vorteilhafter Weise ausgeprägt der Fall ist.
- Als zwingenden abschließenden Verfahrensschritt beansprucht die vorliegende Erfindung die fraktionierende Reinigung des erhaltenen Phosphatidylserins. Diesbezüglich empfiehlt es sich, die Reaktionslösung auf 5 bis 15 % ihres ursprünglichen Volumens einzuengen und zusätzlich oder aber alternativ dazu die Reaktionslösung in das 8- bis 12-fache Volumen eines C1-3-Alkohols, wie z.B. Ethanol, zu geben.
- Der mit Hilfe des bevorzugten Einengungsschrittes erhaltene Niederschlag kann in einer Form gewonnen werden, die Salze von Serin und Phosphatidylserin, also des Ausgangsmaterials und des Produkts, enthält.
- Möglich ist es aber auch, die ohne Einengungsschritt erhaltene alkoholische Lösung mit Anteilen an Phospholipiden zu gewinnen, wobei es besonders günstig ist, wenn diese Phospholipide in gelöster Form vorliegen.
- Falls die Reaktion bei insgesamt erhöhten Temperaturen, wie sie bspw. Bereiche zwischen 30 und 50 °C darstellen, durchgeführt wurde, kann überschüssiges Serin aus der Reaktionslösung in einfacher Art und Weise mit Hilfe einer Temperaturerniedrigung als Niederschlag abgetrennt werden, wobei als Temperaturuntergrenze 0 °C anzustreben sind.
- Von der vorliegenden Erfindung wird im Hinblick auf die Abtrennung der Ausgangsmaterialien bzw. der Aufreinigung des Produktes eine Variante berücksichtigt, bei der die Fraktionierung der Phospholipide durch Extraktion mit Ethanol mit einem Wasseranteil zwischen 5 und 15 Gew.-% und besonders bevorzugt zwischen 8 und 12 Gew.-% durchgeführt wird. Dabei kann es insbesondere von Vorteil sein, wenn diesem Fraktionierungsschritt mind. ein Waschschritt mit Wasser vorgeschaltet wird, wodurch Serin, welches noch im Phospholipid-Produkt enthalten sein kann, entfernt wird. Als vorteilhaft haben sich zwei bis drei Waschschritte erwiesen.
- Einen besonderen Vorteil besitzt diese Fraktionierungsvariante deshalb, da damit ein Phosphatidylserin mit besonders großer Reinheit gewonnen werden kann. Der verbleibende Rückstand gemäß vorliegender Erfindung enthält nämlich in der Regel Phosphatidylserin mit einer Reinheit > 80 Gew.-% und insbesondere mit einer Reinheit > 95 Gew.-%.
- Insgesamt ist es mit diesem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, Phosphatidylserin ausgehend von den bekannten Ausgangsmaterialien und in Anwesenheit üblicher Aktivatoren mit Hilfe von PLD-Aktivität aufweisenden Proteinen in einem äußerst einfachen Reaktionsmedium in wirtschaftlicher Weise und großer Reinheit zu gewinnen. Als besonders wesentlich ist dabei die abschließende fraktionierende Reinigung anzusehen, mit der es möglich ist, den jeweils eingesetzten Reaktionsmedien Rechnung zu tragen und das Phosphatidylserin aus den daraus erhaltenen Niederschlägen in sehr guten Ausbeuten und Qualitäten zu erhalten.
- Das nachfolgende Beispiel verdeutlicht die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens.
- Die Ausgangsstoffe Serin, CaCl2 und Epikuron 145V (Phospholipid-Gemisch der Degussa Food Ingredients GmbH) wurden in 100 ml Wasser bei 45°C gelöst bzw. dispergiert. Es wurde eine Reaktionsmischung 3 Gew.-% Lecithin, 12 mM CaCl2 und 1,9 M Serin enthalten. Nach Einstellung des pH-Wertes auf 5,6 wurden 500 Units einer Phospholipase D zugegeben und die Reaktion gestartet. Der pH-Wert wurde während der Reaktionsdauer von 6 Stunden durch Titration mit 100 mM Natronlauge konstant gehalten. Nach Beendigung der Reaktion wurde der pH-Wert durch Zugabe von konzentrierter Säure (HCL) auf 3,0 eingestellt, wodurch die Lipidphase aggregiert wurde und sich von der wässrigen Phase getrennt hat. Nach vollendeter Trennung wurde die wässrige Phase entfernt und die Lipidphase 2 bis 3 mal mit dem gleichen Volumen entionisierten Wassers in einer Anmaischwäsche gewaschen. Zur Extraktion von Nebenprodukten wurde der noch feuchte Filterkuchen mit Ethanol versetzt, so dass ein Wassergehalt von 10 Gew.-% in der resultierenden Lösung erreicht wurde. Diese Mischung wurde für 8 Stunden bei 45 °C gut durchgemischt und anschließend der Niederschlag abfiltriert. Der erhaltenen Ethanol-feuchte Filterkuchen wurde vornehmlich im Vakuum getrocknet. Das so erhaltene Phosphatidylserin besaß eine Reinheit von größer 90 Gew.-% und war frei von Enzymaktivität.
Claims (23)
- Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylserin aus einem Phospholipid(-Gemisch) und Serin in einem wässrigen System durch Transphosphatidylierung in Gegenwart eines Proteins mit Phospholipase D (PLD)-Aktivität und in Anwesenheit zweiwertiger Metallionen, dadurch gekennzeichnet, dass es in einem Lösemittelsystem durchgeführt wird, das aus a) 100 bis 60 Gew.-% Wasser oder eines wässrigen Puffers mit pH 5,0 bis 6,5 und b) 0 bis 40 Gew.-% eines wassermischbaren organischen Lösemittels mit PLD-aktivierender Wirkung besteht, und dass das erhaltene Phosphatidylserin durch eine fraktionierende Reinigung abgetrennt wird.
- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Phospholipid-Komponente Phosphatidylcholin, Phospatidylethanolamin, Phosphatidylinositol, Phosphatidsäure oder Mischungen daraus eingesetzt werden.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Protein mit PLD-Aktivität Phospholipase D verwendet wird.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es in Anwesenheit von Calcium-, Magnesium- und/oder Zinkionen durchgeführt wird.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die zweiwertigen Metallionen in Konzentrationen von max. 100 mM und besonders bevorzugt in Konzentrationen zwischen 0,1 und 20 mM eingesetzt werden.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein Lösemittelsystem eingesetzt wird, welches 60 bis 95 Gew.-% und besonders bevorzugt 75 bis 90 Gew.-% der wasserhaltigen Komponente a) enthält.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein Lösemittelsystem verwendet wird, welches als Komponente a) ausschließlich Wasser enthält.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein Lösemittelsystem verwendet wird, welches als wässrige Komponente a) einen Acetat-, Citrat- oder Phosphat-Puffer und besonders bevorzugt einen Natriumacetat-Puffer zwischen 50 und 100 mM enthält.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösemittelsystem als wässrige Komponente a) einen Puffer mit einem pH-Wert von 5,6 aufweist.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Lösemittelsystem eingesetzt wird, das 5 bis 40 Gew.-% und besonders bevorzugt 12 bis 17 Gew.-% der Komponente b) enthält.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Komponente b) ein sekundärer oder tertiärer Alkohol und insbesondere Isopropanol eingesetzt wird.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein mit PLD-Aktivität immobilisiert eingesetzt wird.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionstemperatur zwischen 25°C und 50°C und bevorzugt zwischen 40°C und 45°C liegt.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der ungepufferten Reaktionslösung durch Titration mit Natronlauge während der Reaktion konstant gehalten wird.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass nach Reaktionsende der pH-Wert auf 3,0 erniedrigt wird.
- Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der nach der pH-Erniedrigung erhaltene Feststoff von der Lösung abgetrennt wird.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionslösung im Rahmen der fraktionierenden Reinigung auf 5 bis 15 % ihres ursprünglichen Volumens eingeengt und/oder in das 8 bis 12fache Volumen eines C1-3-Alkohols wie z.B. Ethanol gegeben wird.
- Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der mit Hilfe eines Einengungsschritts erhaltene Niederschlag in Form von Salzen des Serins und Phosphatidylserin erhalten wird.
- Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die ohne Einengungsschritt erhaltene alkoholische Lösung mit Anteilen an Phospholipiden, vorzugsweise in gelöster Form, gewonnen wird.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass überschüssiges Serin aus der Reaktionslösung durch Temperaturerniedrigung, vorzugsweise auf 0 °C, als Niederschlag abgetrennt wird.
- Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine Fraktionierung der Phospholipide durch Extraktion mit Ethanol mit einem Wasseranteil zwischen 5 und 15 Gew.-% und bevorzugt zwischen 8 und 12 Gew.-% durchgeführt wird.
- Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Fraktionierung mindestens ein Waschschritt mit Wasser zur Entfernung von Serin aus dem Phospholipid-Produkt vorgeschaltet wird.
- Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass ein verbleibender Rückstand erhalten wird, der Phosphatidylserin mit einer Reinheit größer als 80 Gew.-% und insbesondere > 95 Gew.-% enthält.
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