JPH02113891A

JPH02113891A - リゾホスファチジルコリンの新規な製造法

Info

Publication number: JPH02113891A
Application number: JP26699188A
Authority: JP
Inventors: Isao Myokan; 勇雄明官; Makoto Takada; 誠高田; Kaishu Momoi; 桃井　海秀
Original assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Current assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Priority date: 1988-10-22
Filing date: 1988-10-22
Publication date: 1990-04-26
Anticipated expiration: 2013-03-25
Also published as: JP2731852B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、ホスファチジルコワン含有率の高いリン脂質
をホスホリパーゼＡ２またはホスホリパーゼＡ２を含有
する複合酵素を用いて加水分解するにあたり、該リン脂
質に対して１〜４倍モルの水の存在下、飽和炭化水素類
、芳香族炭化水素類、ケトン類、エステル類、環状エー
テル類、ニトリル類、ハロゲン化炭化水素類、アルコー
ル類またはこれら二種以上の混合有機溶媒中で反応させ
ることを特徴とするリゾホスフアチジルコリンの製造法
に関する。

一般に、リゾホスファチジルコリンなどのリゾリン脂質
類は、免疫賦活作用および平滑筋の収縮に対する抑制作
用などの有用な作用を発揮することが知られ、ざらにミ
セル状で水に極めて溶解しやすいことから、優れた界面
活性能を発揮することも知られている。そのため、これ
らの優れた作用を発揮するりゾホスフ７チジルコリンは
、医薬品、農薬、食品および化粧品などの分野で使用さ
れている。

本発明の目的は、ホスファチジルコリン含有率の高いリ
ン脂質をホスホリパーゼＡ２またはホスホリバーぜＡ２
を含有する複合酵素を用いて加水分解するにあたり、該
リン脂質に対して１〜４倍モルの水の存在下、飽和炭化
水素類、芳香族炭化水素類、ケトン類、エステル類、環
状エーテル類、ニトリル類、ハロゲン化炭化水素類、ア
ルコール類またはこれら二種以上の混合有機溶媒中で反
応させることにより、高純度のリゾホスフアチジルコリ
ンを得る工業的製造法を提供することにおる。

［従来の技術］従来、ホスファチジルコリンを酵素反応に付してリゾホ
スファチジルコ１ノンを得る方法としては、たとえば、
以下に示すものが知られている。

（１）天然型ホスファチジルコリンにジエチルエーテル
またはジエチルエーテルとエタノールの混合溶媒（容量
比；　５０　：　１または２５：１）を加え、これにバ
ンクレアチンを作用させてリゾホスファチジルコリンを
得る方法。［デイ・ジエー・ハナハン（ＤＪ、Ｈａｎａ
ｈａｎ）、　シャー−ｊ−ル・オフ　・バイオロジカル
・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　＞第１９
５巻、第１９９〜２０６頁（１９５２）　］（２）リン脂質１重量部に対して水分を０．１〜１．０
重間部添加し、ホスホリパーゼＡを用いて、リン脂質を
加水分解する方法。［特開昭６３−４４８９３＠　］［
発明が解決しようとする課題］上記（１）の方法は、酵素と基質（ホスファチジルコリ
ン）との複合体をジエチルエーテルで抽出し、ジエチル
エーテルまたはジエチルエーテルとエタノールの混合溶
媒中で反応させる方法である。

しかし、この方法は、引火性の強いジエチルエーテルを
基質（ホスファチジルコリン）に対して多量に用いるの
で、工業的製造法としては好ましくない。

また、上記以外の溶媒、たとえば、９５％エタノール、
クロロホルム、石油エーテル中などで上記（１）の方法
を適用しても反応は進行しないことがこの文献に記載さ
れている。

また、上記（２）の方法を具体的に述べると、リン脂質
をホスホリパーゼＡを用いて、加水分解する際に、リン
脂質１型徂部に対して水分を０．１〜１．０重量部添加
し、分散させた後、静置下で反応させる方法である。

しかし、この公開公報に具体的に開示されている原料リ
ン脂質含有率は６５〜８６％であり、しかもこの公開公
報で「含有率」と称しているのは、ホスファチジルコリ
ン、ボスフ７チジルエタノールアミンおよびホスファチ
ジルイノシトールなどの合計の含有率を示しているので
、ボスフ７チジルコリンの含有率が６５〜８６％である
ことを意味するものではない。この公開公報で特に具体
的に開示されている市販扮末脱脂レシチン（ツルーレシ
チン工業製）もボスフ７チジルコリンの含有率が低いリ
ン脂質である。この公開公報に開示されているようなホ
スファチジルコリン含有率が低い原料リン脂質を用いて
酵素反応に付し、リゾホスフアチジルコリンを単離する
ことは容易ではない。そこで、このような方法で高純度
のりゾホスフ？チジルコリンを単離するためには、カラ
ムクロマトグラフィー、向流分配法などの煩雑な精製操
作が要求される。

さらにまた、この方法を本発明方法の原料であるホスフ
ァチジルコリン含有率の高いリン脂質、たとえば、ホス
ファチジルコリン含有率９５％以上のリン脂質に適用す
ると、水の添加量がリン脂質１＠ｍ部に対して０．１〜
１．０重量部の場合、反応開始のための分散を充分に行
うことが困難であるため、極めて反応率が低く、目的と
する高純度のりゾホスフ１チジルコリンを（ｑるには上
記したと同様煩雑な精製操作が要求される。また、分散
性を高めるために水の添加債を増大させると反応速度が
遅くなり、反応を完結させるためには酵素の増重、高温
などの過酷な条件が要求される。

さらに、この方法では、リン脂質中のホスファチジルコ
リン含有率の高低にかかわらず目的物中に酵素などのタ
ンパク質類が混入することがあるため、後処理が極めて
煩唯である。

したがって、この公開公報に開示されているリン脂質を
酵素により加水分解する方法は、工業的製造法として好
ましくない。

従来法にはこれらの欠点がおるため、医薬品、農薬、食
品および化粧品などの分野で使用するための高純度のリ
ゾホスフアチジルコリンの工業的製造法の開発が望まれ
ていた。

［課題を解決するための手段］水発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行
った結果、ホスファチジルコリン含有率の高いリン脂質
をホスホリパーゼＡ２またはホスホリパーゼＡ２を含有
する複合酵素を用いて加水分解するにあたり、該リン脂
質に対して１〜４倍モル（約０．０２〜０．０９倍重量
部に相当する）の水の存在下、飽和炭化水素類、芳香族
炭化水素類、ケトン類、エステル類、環状エーテル類、
二］・クル類、°ハロゲン化炭化水素類、アルコール類
またはこれら二種以上の混合有機溶媒中で反応させれば
、加水分解による円滑な脱アシル化が進行して反応率が
高くなり、また水の添加間が少ないため酵素を容易に？
戸去することができる。その結果、生成したリゾホスフ
？チジルコリンを反応系内から容易に分離することがで
き、かつ再結晶のような通常の精製操作によって精製で
きることを見出し、本発明を完成するに至った。

以下、本発明の詳細な説明する。

ボスフ７チジルコリン含有率の高いリン脂質としては、
たとえば、卵黄、大豆または動物組織など天然由来のリ
ン脂質で、ボスク１チジルコリン含有率が９５％以上の
リン脂質が挙げられる。

ホスホリパーゼＡ２を含有する複合＠素としては、たと
えば、ホスホリパーゼＡ２活性を有する膵臓抽出酵素パ
ンクレアチンなどの複合酵素が挙げられ、ホスホリパー
ゼＡ２またはホスホリパーゼＡ２を含有する複合＃！ｆ
素の使用量は、好ましくは、リン脂質１９に対して２０
〜５００ユニツトである。

本反応に使用される有機溶媒における飽和炭化水素類と
しては、たとえば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オ
クタン、イソオクタンおよびシクロヘキサンなどのＣの
鎖状または環状の飽和５〜８炭化水素類；芳香族炭化水素類としては、たとえば、ベ
ンゼン、トルエンおよびキシレンなどのＣアルキル基で
置換されていてもよいペン１〜５ゼン類；ケトン類としては、たとえば、アセトン、メチ
ルエチルケトン、ジエチルケトンおよびメチルイソブチ
ルケトンなどのジ−Ｃ１〜５アルキルケトン類；エステ
ル類としては、たとえば、ギ酸メチル、酢酸エチル、酢
Ｉｎ−プロピル、酢酸イソプロピル、酢Ｗｎ−ブチル、
プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、プロごオン
駿ｎ−プロピルおよびｎ−プロピオンｐｎ−ブチルなと
のＣ脂肪１〜５族カル−ボン酸のＣアルキルエステル１〜５状エーテル類としては、たとえば、テトラヒドロフラン
およびジオキサンなどの５〜６員環状エーテル類：ニト
リル類としては、たとえば、アセトニトリル、プロピオ
ニトリルおよびブチロニトリルなどのＣ　　　アルキル
ニトリル類；ハロゲン１〜５化炭化水素類としては、たとえば、塩化メチレン、クロ
ロボルム、ジクロロエタンおよびトリクロロエタンなど
のハロゲン化Ｃ　　　の鎖状の炭化水１〜５素預；アルコール項としては、たとえば、メタノール、
エタノール、プロパツール、イソプロパツール、ｎ−ブ
タノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅ
ｒｔ−ブタノールおよびアミルアルコールなどのＣ　　
　脂肪族アルコール類が挙げられ、１〜５これらは二種以上混合してもよい。

有機溶媒の使用量は、特に限定されないが、有機溶媒の
種類、操作性などにより適宜選択することができ、通常
、ホスファチジルコリン含有率の高いリン脂質に対して
０，５〜５倍量（容伍／重童）で十分である。

また、水の添加量は、ボスフ７チジルコリン含有率の高
いリン脂質に対して１〜４倍モルが好ましい。さらに、
本発明方法の最適ｐＨは５〜９であるため、ＤＨ５〜９
を維持するために緩衝液を使用することもできる。なお
、緩衝液を使用する場合、水の添加量は緩衝液の中の水
も含むものである。

さらに、酵素活性を高めるためにカルシウムイオンをホ
スファチジルコリン含有率の高いリン脂質に対してｏ、
ｏｉ〜０．２倍モル程度添加してもよい。

本発明において、緩衝液またはカルシウムイオンを添加
して酵素反応を行った場合、反応終了後、イオン交換ま
たは酸アルカリ処理などの通常の操作によって、使用し
た［１液またはカルシウムイオンをそれぞれ容易に除去
することができる。

反応温度は、２０℃〜８０℃が好ましく、また、反応時
間は、反応温度、酵素の使用量、有酸溶媒の種類などに
よっても異なるが、通常、３０分〜２０時間で十分であ
る。

［発明の効果］反応終了後、生成したりゾホスフ１チジルコワンを含有
する反応液に、たとえば、前記したと同様のアルコール
類および／またはハロゲン化炭化水素類などのリゾホス
フアチジルコリンが可溶な有機溶媒（これらは、反応溶
媒として使用されていてもよい）を添加し、濾過するこ
とによって酵素を容易に消去することができる。所望に
より酵素を枦去した清液を常圧または減圧下で適宜濃縮
した後、冷却すれば、リゾホスファチジルコリンを晶出
させることができる。

また、酵素を消去した清液またはこの清液を濃縮した濃
縮液に、リゾホスファチジルコリンが不溶な有機溶媒、
たとえば、アセトンなどを添加することによって、リゾ
ホスファチジルコリンを晶出させることもできる。

本発明方法によれば、添加する水の借が少ないので、リ
ゾホスファチジルコリンと酵素との分離が容易であり、
そのため酵素の混入が少なく、また、反応率が高いため
、未反応のホスファチジルコリン含有率の高いリン脂質
の混入が少ない。その結果、生成したりゾホスフ？チジ
ルコリンを通常の精製操作によて精製でき、高純度のリ
ゾホスフアチジルコリンを得ることができる。

本発明方法は、ケトン類もしくはエステル類中、または
少なくともケトン類および／もしくはアルコール類を含
有する混合有機溶媒中で実施するのが好ましい。

特に、本発明方法をアルコール類を含有する混合有機溶
媒中でバンクレアチンを用いて行った場合、水の添加量
が少ないため、加水分解反応によって生成する副生物で
ある脂肪酸の大部分が、混合有機溶媒中のアルコールと
のエステルに変換されるので、アルコール類を含有しな
い有機溶媒を用いて行った場合には除去しにくい脂肪酸
が、たとえば、脂肪酸エステルとして再結晶などの後処
理により除去しやすくなる利点を有する。

［実施例］つぎに、実施例を挙げて本発明をざらに詳細に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。

なお、実施例および比較例において使用されているホス
ファチジルコリンとしては、卵黄ボスク１チジルコリン
（ＩｉＩｉ度９９．５％；旭化成社製）を、また、ホス
ホリパーゼＡ２を含有する複合酵素としては、バンクレ
アチン原末（大野製薬社製）を用いた。

また、ホスホリパーゼＡ２による反応率（ホスファチジ
ルコリンがリゾホスファチジルコリンに変換した割合）
は、イアトロスキャン（薄層クロマトグラフィー−水素
炎イオン化法）による分析によって求めた。その際、ホ
スファチジルコワンおよびリゾホスファチジルコリンの
平均分子量は、文献上知られた脂肪酸構成比より算出し
、卵黄ホスファチジルコリンの平均分子量を７７４、リ
ゾホスファチジルコリンの平均分子量を５０４とした。

また、得られたリゾホスフアチジルコリンの純度は、イ
アトロスキャンによって求めた。

また、実施例中の混合液の混合比は、特に断らない限り
容量比を示す。

参考例パンクレアチン原末中のホスホリパーゼＡ２活性の測定以下の実施例および比較例で使用されているパンクレア
チン原末中のボスホリパーぜＡ２活性は、パンクレアチ
ン原末中の他の酵素活性、たとえば、リパーゼ活性、タ
ンパク分解酵素などの影響を除去するため、卵黄レシチ
ンく旭化成社製）に対して１０倍容量の水中で超音波（
１９ＫＨ７）処理した卵黄レシチンを用いて、バイオシ
ミ力・バイオフイジカ・アクタ（ＢｉＯＣｈｉｍ、Ｂ１
０１　＋ｌ／Ｓ、ＡＣｔａ）第１５９巻、第１０３〜１
１７頁（１９６８年＞１．：）；碍戎の卵黄エマルジョ
ンを用いる方法に準じて測定した。その結果、バンクレ
アチン原末（大野製薬社製）のホスホリパーゼＡ２活性
は、約０．７ユニツト／ｍｇであった。

実施例１ボスフ７チジルコリン１０．００　ｇにアセトンおよび
０−ブタノールの混合液（２：　１　　）１０ｄを加え
、５０°Ｃで撹拌して溶解させる。これにバンクレアチ
ン原末４．０９および蒸留水０．８１ｄを加え、同温度
で８時間撹拌する。ついで、この反応混合物にｎ−ブタ
ノール３０ｄを加え、得られた混合物を４０℃で１０分
間撹拌する。この反応混合物にセライトを加えて濾過し
、ざらにセライト上をｎ−７タノール１０７で洗浄する
。ン戸液を合わせ、この炉液の一部をサンプリングして
イアトロスキャンで分析したところ、反応率は９７％で
めった。

ン戸液にアセトン１２０　Ｉｎｉを５０℃で１０分間撹
拌下に滴下し、徐冷した後、氷冷し、析出した結晶をｉ
月収する。この結晶をアセトン１０ｄで洗浄し、デシケ
ータ−中で乾燥すれば、はとんど無色の結晶としてリゾ
ホスファチジルコリン４．９４９　（純度９８％）を得
る。

実施例２ホスファチジルコリンｉｏ、ｏｏ　！７にアセトンおよ
び０−ブタノールの混合！（２：１）１０ｒｄ！を加え
、５０°Ｃで撹拌して溶解させる。これにバンクレアチ
ン原末３，０９、蒸留水０．２５ｄおよび塩化カルシウ
ム０．２（ＩＪを加え、同温度で８時間撹拌する。つい
で、実施例１と同様に後処理し、炉液の一部をイアトロ
スキャンで分析したところ、反応率は９８％であった。

実施例３ボスフ７チジルコリン１０．００９にアセトンおよびｎ
−ブタノールの混合液（２：１）１（７！を加え、５０
℃で撹拌して溶解させる。これにバンクレアチン原末４
．０　ｇおよび蒸留水０．８１ｄを加え、５０°Ｃで８
時間撹拌する。この反応混合物にｎ−ブタノール５０ｄ
を加え、得られた混合物を３０℃で１０分間撹拌する。

この反応混合物にセライトを加えて濾過し、ざらにセラ
イト上をｎ−ブタノール１０ｄで洗浄する。

ン戸液を合わせ、この炉液の一部をサンプリングしてイ
アトロスキャンで分析したところ、反応率は９７％であ
った。

ン戸液に蒸留水３５ｍ１を加え、撹拌した後、上層を分
取する。一方、下層にｎ〜アクタール５ｄを加え、撹拌
した後、上層を分取する。この上層を先の上層と合わせ
、減圧下に５０ｍｌ１まで濃縮した後、ｎ−ブタノール
４０ｄを加え１．減圧下に５０ｄまで濃縮する。

濃縮液を５０℃に維持しながら、これにアセトン１００
　ｍを滴下し、徐冷した後、析出した結晶をン月収する
。この結晶をアセトン１０ばで洗浄し、デシケータ−中
で乾燥すれば、はとんど無色の結晶としてカゾホスフ１
チジルコリン５．４３ｇ（１度９９．６％）を得る。

この結晶を５倍容量のエタノールから再結晶すれば、無
色のリゾホスフアチジルコリン４．７１１Ｊ（純度９９
．９％）を得る。

実施例４アセトン−〇−ブタノール（２：１；１（７）の代わり
に、ｎ−ヘキザンー〇−１タノール（２：１：１０ｍ１
）、アセトニトリル−ｎ−ブタノール（２：１：１０ｍ
！り、アセトン−クロロホルム（２：１；１０威）、ジ
エチルケトン（１０ｄ＞、メチルエチルケトン（２０ｄ
）または酢酸イソプロピル（１５ｄ）を用いて実施例３
と同様に反応させ、２戸液の一部をイアトロスキャンで
分析したところ、反応率は９６〜９９％であった。

ついで実施例３と同様に後処理を行い、再結晶すれば、
リゾホスファチジルコ１ノン４．６０〜４．７５７（純
度９９．７〜９９．９％）を得る。

比較例１ホスファチジルコリン１０．００９にパンクレアチン原
末４．０ｇおよび蒸留水０．８１ｄを加え、５０℃で８
時間撹拌する。反応液をイアトロスキャンで分析したと
ころ、反応率は５２％であった。

比較例２ホスファチジルコリン１０．００９にパンクレアチン原
末４．０７ｉ！３よび蒸留水５．０／７１ｉ２を加え、
５０℃で８時間撹拌する。反応液をイアトロスキャンで
分析したところ、反応率は３４％であった。

比較例３ホスファチジルコリンｉｏ、ｏｏ　ｙにパンクレアチン
原末４，０３および蒸留水３０ｄを加え、５０’Ｃで８
時間撹拌する。反応液をイアトロスキャンで分析したと
ころ、反応率は７％であった。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ホスファチジルコリン含有率の高いリン脂質をホ
スホリパーゼＡ＿２またはホスホリパーゼＡ＿２を含有
する複合酵素を用いて加水分解するにあたり、該リン脂
質に対して１〜４倍モルの水の存在下、飽和炭化水素類
、芳香族炭化水素類、ケトン類、エステル類、環状エー
テル類、ニトリル類、ハロゲン化炭化水素類、アルコー
ル類またはこれら二種以上の混合有機溶媒中で反応させ
ることを特徴とするリゾホスフアチジルコリンの製造法
。
（２）ケトン類またはエステル類中で反応させることを
特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載のリゾホスフ
アチジルコリンの製造法。
（３）飽和炭化水素類、芳香族炭化水素類、ケトン類、
エステル類、環状エーテル類、ニトリル類、ハロゲン化
炭化水素類およびアルコール類から選ばれる二種以上の
混合有機溶媒中で反応させることを特徴とする特許請求
の範囲第（１）項記載のリゾホスフアチジルコリンの製
造法。
（４）混合有機溶媒が少なくともケトン類および／また
はアルコール類を含有することを特徴とする特許請求の
範囲第（３）項記載のリゾホスフアチジルコリンの製造
法。