JP3240011B2 - Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、医薬や、医薬・農薬等
の中間体として有用なことが知られているＬ−スレオ−
β−ヒドロキシアミノ酸を製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシアミ
ノ酸の合成は、以下の方法により行われていた。即ち、
必要に応じて保護基を導入したアルデヒド誘導体とグリ
シンを強アルカリ存在下で縮合させることによりラセミ
−スレオ／エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体を
得た後、スレオ／エリスロ体の相互分離処理を行う。得
られたラセミ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体
の保護基を除去し、アミノ基部分に置換基を導入した
後、キニン、ブルシン等の光学分割剤を用いて光学分割
を行い、最後にアミノ基部分の置換基を除去するという
ものである。

【０００３】

【発明が解決しようとする問題点】アルデヒド誘導体と
グリシンを縮合してβ−ヒドロキシアミノ酸を合成する
と、反応の立体選択性が低いために、スレオ／エリス
ロ，Ｄ／Ｌの組合せで４種類の異性体が不可避的に生成
する。Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸の合成に当
たっては、これらの異性体を分離するための繁雑な工程
を必要とし、工業的製造法を開発する上で大きな問題と
なっていた。特に、従来のＤ／Ｌ体の光学分割法は、使
用する光学分割剤が高価であるだけでなく、工程及びそ
の制御が複雑で収率も低いという問題があった。さら
に、これらの操作で得られる不要の異性体を再度利用す
るためには、別途ラセミ化したり、分解したりする必要
があり、工程をさらに複雑にする原因となっていた。

【０００４】

【問題点を解決するための手段】これを解決する方法と
して、Ｄ−スレオニンアルドラーゼとＬ−アロスレオニ
ンアルドラーゼを用いる酵素的分割法が知られている
（特開昭５８−１１６６９２号）。即ち、Ｄ−スレオニ
ンアルドラーゼによって特異的にＤ−スレオ／エリスロ
体を分解し、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼによって
特異的にＬ−エリスロ体を分解し、Ｌ−スレオ体のみを
得る方法である。しかし、この方法は、β−ヒドロキシ
アミノ酸の中でも唯一Ｌ−スレオニンに適用できること
が知られているにすぎない。本発明者らは、Ｌ−スレオ
−β−ヒドロキシアミノ酸の合成方法に関し鋭意検討を
行った結果、意外にも、Ｄ−スレオニンアルドラーゼが
Ｄ−スレオニンとＤ−アロスレオニンのみでなく種々の
β−ヒドロキシアミノ酸のＤ−スレオ体とＤ−エリスロ
体に特異的に作用しグリシンと対応するアルデヒド化合
物に分解することを見出すとともに、Ｌ−アロスレオニ
ンアルドラーゼが意外にもＬ−アロスレオニンのみでな
く、種々のβ−ヒドロキシアミノ酸のＬ−エリスロ体に
特異的に作用しグリシンと対応するアルデヒド化合物に
分解することを見出し、本発明を完成した。これによ
り、ラセミ−β−ヒドロキシアミノ酸からの効率的なＬ
−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸の製造が可能になる
のみならず、Ｄ−スレオ体、Ｄ−エリスロ及びＬ−エリ
スロ体の分解物は、原料として再度ラセミ体の合成に利
用することができる。さらに、遺伝子操作によってＤ−
スレオニンアルドラーゼ及びＬ−アロスレオニンアルド
ラーゼの生産性を大幅に向上せしめた組換え体を用いる
と、目的とするＬ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸を
分解する酵素が菌体中に含まれる場合でも、それらの酵
素を除去することなく反応に用いることが出来る。ま
た、このような組換え体を用いると、Ｄ−体やＬ−エリ
スロ体の分解に多量の酵素を必要とするような反応性の
低いβ−ヒドロキシアミノ酸に対しても効率よく反応を
行うことが出来るため、広範囲のＬ−スレオ−β−ヒド
ロキシアミノ酸の合成が可能である。本発明は、一般式
（Ｉ）

【０００５】

【化３】 （式中、Rは、置換又は非置換の脂肪族基、脂環式基、
芳香族基又は複素環式基を表す。）で表わされるラセミ
−β−ヒドロキシアミノ酸に、Ｄ−スレオ／エリスロ−
β−ヒドロキシアミノ酸を特異的にグリシンと対応する
アルデヒドに分解する酵素であるＤ−スレオニンアルド
ラーゼ、同酵素を産生するアルカリゲネス属、シュード
モナス属、アリスロバクター属、キサントモナス属に属
する微生物よりなる群より選ばれた少なくとも１種の微
生物菌体あるいは菌体処理物と、Ｌ−エリスロ−β−ヒ
ドロキシアミノ酸を特異的にグリシンと対応するアルデ
ヒドに分解する酵素であるＬ−アロスレオニンアルドラ
ーゼ、同酵素を産生するアルカリゲネス属、シュードモ
ナス属、アリスロバクター属、キサントモナス属、バチ
ルス属、エシェリヒア属に属する微生物よりなる群より
選ばれた少なくとも１種の微生物菌体あるいは菌体処理
物を作用させることを特徴とするＬ−スレオ−β−ヒド
ロキシアミノ酸の製造法等に関する。

【０００６】本発明で用いられる原料ラセミ−β−ヒド
ロキシアミノ酸は、上記式（Ｉ）におけるＲが、置換又
は非置換の脂肪族基、脂環式基、芳香族基又は複素環式
基を表す。具体的には、アルキル基、アルケニル基、ア
ルキニル基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基又は
複素環式炭化水素基より選ばれた置換基である化合物で
あり、置換基に含まれる水素のうち１個又は複数個が同
一又は相異なるアルキル基、アルケニル基、アルキニル
基、アルコキシル基、アルキレン基、脂環式炭化水素
基、芳香族炭化水素基、ヒドロキシル基、ニトロ基、又
はハロゲン基で置換されていてもよい。置換基の炭素数
が、直鎖脂肪族基の場合は好ましくは２０以下、特に好
ましくは１０以下であり、その他の置換基の場合は好ま
しくは３０以下、特に好ましくは２０以下である化合物
を用いると良好な結果を得ることができる。

【０００７】本発明においては、Ｌ−スレオ−β−ヒド
ロキシアミノ酸以外の異性体、すなわち、Ｄ−スレオ／
エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸並びにＬ−エリスロ
−β−ヒドロキシアミノ酸を特異的にグリシンと対応す
るアルデヒドに分解することから、こうして得られたグ
リシンと対応するアルデヒドはそれを再度合成に使用で
きる。

【０００８】本発明においては、前記したように、Ｄ−
スレオ／エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を分解する
酵素を用いることがあげられるが、このような酵素とし
ては、Ｄ−スレオ及びエリスロ−β−ヒドロキシアミノ
酸を特異的に分解するものであれば、いずれも使用でき
る。このような酵素として特に好ましいものとしては、
Ｄ−スレオ／エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を特異
的にグリシンと対応するアルデヒドに分解する能力を有
するものがあげられる。また特に好ましいものとして
は、Ｄ体とＬ体の立体構造の違いを特異的に認識する
が、スレオ体とエリスロ体の構造上の差異には影響を受
けないものがあげられる。さらにまた一般式（Ｉ）に示
すような広範囲のβ−ヒドロキシアミノ酸に作用するも
のがあげられる。

【０００９】このような酵素として特に好ましいもの
は、Ｄ−スレオニンアルドラーゼがあげられる。Ｄ−ス
レオニンアルドラーゼとしては、特公昭６４−１１２７
９号に記載されたものの他、その遺伝子を操作して得ら
れたもの（例えば、特開平３−１３９２８３号）などを
あげることができる。これらＤ−スレオニンアルドラー
ゼは、予想外にも種々のβ−ヒドロキシアミノ酸のＤ型
の立体異性体に作用し、これをグリシンと対応するアル
デヒドに分解せしめるという優れた特性を有している。
また、Ｄ−型の立体配位には非常に高い特異性を有する
にも拘らず、エリスロ／スレオといった立体配位に対し
ては、許容されうる寛容性を有するので、Ｄ−スレオ体
とＤ−エリスロ体の両方に作用してこれを分解するとい
う優れた特性を有している。

【００１０】本発明で用いられるＤ−スレオニンアルド
ラーゼは、Ｄ−スレオニンアルドラーゼ生産菌あるいは
その変異株などから得ることが出来る。Ｄ−スレオニン
アルドラーゼ生産菌としては、例えば、アルカリゲネス
・ハエカリス(Alcaligenes faecalis)ＩＦＯ１２６６
９、シュードモナス(Pseudomonas) ＤＫ−２（微工研菌
寄６２００号）、アリスロバクター(Arthrobacter)ＤＫ
−１９（微工研菌寄６２０１号）、キサントモナス・オ
リゼー(Xanthomonas oryzae)ＩＡＭ１６５７などが知ら
れている（特公昭６４−１１２７９号及び特開平１−２
７３５８６号）。これらのＤ−スレオニンアルドラーゼ
生産菌から得られたＤ−スレオニンアルドラーゼの合成
に関与する遺伝子を担うＤＮＡを、遺伝子組換えの手法
を用いて導入して作成された組換え体は、より好適に本
発明に用いることが出来る。このような遺伝子を導入し
て利用しうる微生物としては、例えばエシェリヒア(Esc
herichia) 属細菌、バチルス(Bacillus)属細菌、キサン
トモナス(Xanthomonas) 属細菌、アセトバクター(Aceto
bacter) 属細菌、シュードモナス(Pseudomonas) 属細
菌、グルコノバクター(Gluconobacter) 属細菌、アゾト
バクター(Azotobacter) 属細菌、リゾビウム(Rhizobiu
m) 属細菌、アルカリゲネス(Alcaligenes) 属細菌、ク
レブシェラ(Klebsiella)属細菌、サルモネラ(Salmonell
a)属細菌、セラチア(Serratia)属細菌などの原核微生物
や酵母などの下等真核生物などを用いることができる。

【００１１】このような組換え体のうち、特にＤ−スレ
オニンアルドラーゼを高度に生産する能力を有している
組換え体の例としては、キサントモナス属細菌に属する
ものがあげられる。微工研菌寄１０９７９号として寄託
されているキサントモナス・シトリー(Xanthomonas cit
ri) ＩＦＯ３３１１（ｐＤＴ６４８）は、Ｄ−スレオニ
ンアルドラーゼを高度に生産する能力を有しており（特
開平３−１３９２８３号）、特に好適なものである。

【００１２】本発明においては、前記したように、Ｌ−
エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を分解する酵素を用
いることがあげられるが、このような酵素としては、Ｌ
−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を特異的に分解す
るものであれば、いずれも使用できる。このような酵素
として特に好ましいものとしては、Ｌ−エリスロ−β−
ヒドロキシアミノ酸を特異的にグリシンと対応するアル
デヒドに分解する能力を有するものがあげられる。さら
にまた一般式（Ｉ）に示すような広範囲のβ−ヒドロキ
シアミノ酸に作用するものがあげられる。このような酵
素として特に好ましいものは、Ｌ−アロスレオニンアル
ドラーゼがあげられる。Ｌ−アロスレオニンアルドラー
ゼとしては、特公昭６３−５４３５９号に記載されたも
のの他、その遺伝子を操作して得られたものなどをあげ
ることができる。これらＬ−アロスレオニンアルドラー
ゼは、予想外にも種々のβ−ヒドロキシアミノ酸のＬ−
エリスロ体に特異的に作用し、これをグリシンと対応す
るアルデヒドに分解せしめるという優れた特性を有して
いる。

【００１３】本発明で用いられるＬ−アロスレオニンア
ルドラーゼは、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ生産菌
あるいはその変異株などから得ることができる。Ｌ−ア
ロスレオニンアルドラーゼ生産菌としては、例えば、バ
チルスＤＫ−３９（微工研菌寄６２０２号）、アルカリ
ゲネス・ハエカリスＩＦＯ１２６６９、シュードモナス
ＤＫ−２（微工研菌寄６２００号）、アリスロバクター
ＤＫ−１９（微工研菌寄６２０１号）、キサントモナス
・オリゼーＩＡＭ１６５７が知られている。これらのＬ
−アロスレオニンアルドラーゼ生産菌から得られたＬ−
アロスレオニンアルドラーゼの合成に関与する遺伝子を
担うＤＮＡを、遺伝子組換えの手法を用いて導入して作
成された組換え体は、より好適に本発明に用いることが
出来る。

【００１４】この様な組換え体の作成は、特願平４−２
７５９９６号記載の方法で行うことが出来る。すなわ
ち、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ生産菌から染色体
ＤＮＡを抽出し、制限酵素でＤＮＡを部分分解し、精製
後、適当なベクターＤＮＡに組み込み、得られた組換え
体ＤＮＡを宿主細胞に移入し、遺伝子ライブラリーを作
成する。そこから、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼの
合成に関与する遺伝子を保有する株を、培養細胞のＬ−
アロスレオニンアルドラーゼ活性を調べることにより選
択し、その細胞株から組換えＤＮＡを抽出し、適当な制
限酵素でベクターＤＮＡから目的のＤＮＡを切り出す。
得られたＤＮＡ断片の解析を行い、Ｌ−アロスレオニン
アルドラーゼの合成に不必要な部分を欠失させ、小型化
し、再度適当なベクターＤＮＡに組み込み、宿主細胞に
導入することにより、目的の株を得ることが出来る。

【００１５】このような遺伝子を導入して利用しうる微
生物としては、前記Ｄ−スレオニンアルドラーゼのとこ
ろであげたものがあげられる。このような組換え体のう
ち、特にＬ−アロスレオニンアルドラーゼを高度に産生
する能力を有している組換え体の例としては、キサント
モナス属細菌に属するものがあげられる。キサントモナ
ス・オリゼーＩＡＭ１６５７の染色体ＤＮＡから単離し
たＬ−アロスレオニンアルドラーゼの合成に関与する遺
伝子を担うＤＮＡとプラスミドｐＢＲ３２８を連結した
組換えプラスミドｐＬＡ５５６を、キサントモナス・シ
トリーＩＦＯ３３１１に導入して得られた形質転換体キ
サントモナス・シトリーＩＦＯ３３１１（ｐＬＡ５５
６）は、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼを高度に生産
する能力を有しており、特に好適なものである（特願平
４−２７５９９６号）。

【００１６】また、Ｄ−スレオニンアルドラーゼとＬ−
アロスレオニンアルドラーゼは、同一の菌株由来のもの
であっても、それぞれ異なる菌株由来のものであって
も、同様に用いることが出来るし、さらに前記したよう
に遺伝子操作を行って、一方のみを特異的に生産せしめ
るようにしたものから得られたものも使用できるが、そ
の両者を効率よく生産せしめるようにした組換え体を用
いれば、１種類の菌株で両酵素を効率よく生産出来る。

【００１７】本発明に用いる微生物は常法に従って培養
することができる。培養に用いられる培地は微生物の生
育に必要な炭素源、窒素源、無機物質等を含む通常の培
地である。ここで用いられる炭素源としては、グルコー
ス、ガラクトース、可溶性デンプンなどがあげられ、窒
素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝
酸アンモニウム、ペプトン、肉エキス、イーストエキ
ス、コーンスティプリカー、大豆粉、綿実カスなどがあ
げられる。また、塩化ナトリウム、カリウム塩、カルシ
ウム塩、アンモニウム塩、燐酸塩などの他、亜鉛、マグ
ネシウム、鉄、マンガンなどの無機物も使用できる。更
に、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加する
と望ましい結果が得られる場合が多い。培養は、好気的
条件下でｐＨ４から１０、温度２０から５０℃の任意の
範囲に制御して１〜１０日間培養を行えばよい。組換え
体を用いる場合、使用する菌株に応じて、アンピシリ
ン、クロラムフェニコール等の抗生物質を培養液に添加
してもよい。

【００１８】酵素反応にあたっては、菌体の培養液、培
養液から分離した菌体、凍結乾燥などによる乾燥菌体、
菌体破砕液、粗酵素抽出液、精製酵素、さらには、上記
の処理物および固定化物、その他何れも使用できるが、
使用する酵素液あるいは菌体にＬ−スレオニンアルドラ
ーゼやＬ−スレオニンデアミナーゼのような目的とする
Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸を分解するような
活性が含まれている場合には、効率的な合成を行うため
に、その活性を除去してから反応に用いるのが好まし
い。これらの分解活性を除去する方法としては、酵素液
の硫安分画・カラムクロマト分画などによる方法が好ま
しいが、それに限定されることなく、分解活性を選択的
に除去出来る方法であればいずれも用いることが出来
る。また、遺伝子操作によってＤ−スレオニンアルドラ
ーゼ及びＬ−アロスレオニンアルドラーゼの生産性を大
幅に向上せしめた組換え体であれば、これらの分解活性
を除去することなく反応に用いることができる。

【００１９】酵素反応を実施する方法は、水性媒体中に
て基質であるラセミ−スレオ／エリスロ−β−ヒドロキ
シアミノ酸を、上に記した微生物の培養液、菌体、菌体
処理物、酵素、あるいはこれらを通常の方法で固定化し
たものと接触させれば良い。かかる反応時の水性媒体と
しては、例えば、水、緩衝液、含水有機溶媒等が使用で
きる。反応における酵素、微生物菌体あるいは菌体処理
物等の濃度は、Ｄ−スレオ／エリスロ−β−ヒドロキシ
アミノ酸とＬ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を完
全に分解できるならば特に制限はないが、Ｄ−スレオニ
ンアルドラーゼ活性（１ＵはＤ−スレオニンから１分間
に１μｍｏｌｅのグリシンを生成するのに必要な酵素量
を表わす）とＬ−アロスレオニンアルドラーゼ活性（Ｉ
ＵはＬ−アロスレオニンから１分間に１μｍｏｌｅのグ
リシンを生成するのに必要な酵素量を表わす）が、とも
に０．１Ｕ／ｍｌ以上であることが望ましい。特に、と
もに１Ｕ／ｍｌ以上であれば反応を速やかに終了させる
ことが出来る。反応は、２種類の酵素を同時に作用させ
ても順次作用させても行うことが可能であり、順次作用
させる場合、その順序は問わない。

【００２０】基質であるラセミ−スレオ／エリスロ−β
−ヒドロキシアミノ酸の濃度は、反応を著しく阻害しな
い程度であればよく１ｍＭから１００ｍＭが好ましく、
基質の供給は、一括、連続、分割の何れの手段でも実施
できる。反応温度は、１０から５５℃がよく、２０から
４０℃がより好適である。反応時のｐＨは５から１０、
好ましくは６から８である。ピリドキサール−５’−リ
ン酸を反応系に１０ｎＭ〜１０ｍＭ、好ましくは１μＭ
〜１００μＭの濃度で添加することにより好ましい結果
が得られる。また、Ｍｇ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺、Ｆｅ²⁺等
の２価金属イオンを塩の形で１００μＭ〜１００ｍＭ、
好ましくは１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度で添加すると好まし
い結果が得られる。反応形式はバッチ方式、連続方式の
何れでもよいが、かくして、反応は０．５から５０時間
程度で終了する。

【００２１】反応終了後、反応液は遠心分離や限外濾過
等により除菌・除タンパクし、まず有機溶媒抽出等によ
り生成アルデヒドを分離する。抽出には、アルデヒドの
溶解性が高く、Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸及
びグリシンがほとんど不溶である溶媒であれば使用する
ことができるが、エーテルを使用すると良好な結果が得
られる。

【００２２】溶媒相からは減圧濃縮等によりアルデヒド
を回収することが出来る。水相からのＬ−スレオ−β−
ヒドロキシアミノ酸とグリシンの単離回収は、通常のイ
オン交換樹脂を用いたクロマト分離によって行うことが
出来る。すなわち、水相を陽イオン交換樹脂を充填した
カラムに通液、水洗後、希アンモニア水等により溶出を
行う。

【００２３】純度が低い場合には、さらに晶析・水再結
晶を行うことにより精製度を高めることが出来る。上記
反応生成物の単離精製法は、一つの代表的な方法を例示
したものであり、本発明においてはそれに限定されるこ
となく各種の分離精製法が適用できる。このような方法
の例としては、メタノール、エタノール等のアルコール
系溶媒、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶
媒、酢酸エチル等のエステル系溶媒、アセトン、メチル
エチルケトン等のケトン溶媒、ジメチルスルホキシド等
のスルホキシド類溶媒、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
等のアミド溶媒、アセトニトリルなどのニトリル系溶
媒、エチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン
等のエーテル系溶媒、メチレンクロライド等のハロゲン
化炭化水素溶媒及びそれらの混合溶媒あるいはそれらの
水性溶媒などを用いた溶媒抽出などの分離法、カラムク
ロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、高速液体
クロマトグラフィー、再結晶化法などの方法をあげるこ
とができる。

【００２４】本発明の方法によると、 （１）Ｄ−スレオニンアルドラーゼ及びＬ−アロスレオ
ニンアルドラーゼは、それぞれ、広い範囲のＤ−β−ヒ
ドロキシアミノ酸及びＬ−エリスロ−β−ヒドロキシア
ミノ酸に作用してこれを分解することができるので、様
々なラセミ−β−ヒドロキシアミノ酸からのＬ−β−ヒ
ドロキシアミノ酸の合成が可能である。 （２）Ｄ−スレオ／エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸
及びＬ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸は共に合成
原料であるグリシンとアルデヒドに分解されるため、そ
れらは反応液から回収して再度ラセミ−スレオ／エリス
ロ−β−ヒドロキシアミノ酸合成にリサイクル使用する
ことが出来る。 （３）従って、ラセミ化の必要はなく、目的物が高収率
で得られるので、工程が複雑で高価な光学分割剤を用い
る必要がある従来の光学分割法に比べ、大幅に工程を単
純化出来る。 （４）遺伝子組換えによりＤ−スレオニンアルドラーゼ
及びＬ−アロスレオニンアルドラーゼの生産性が大幅に
向上した菌株を用いれば、目的とするＬ−スレオ−β−
ヒドロキシアミノ酸を分解する酵素が菌体中に含まれる
場合でもそれらの酵素を除去することなく反応に用いる
ことが出来、また、Ｄ−体及びＬ−エリスロ体の分解に
多量の酵素を必要とするような反応性の低いβ−ヒドロ
キシアミノ酸に対しても効率よく反応を行うことが出来
るため、Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸類の製造
に幅広く利用することができる。

【００２５】

【実施例】次に、実施例により本発明の方法を更に詳し
く説明するが、本発明は実施例により限定されるもので
はない。例中％は重量％を示す。 実施例１ ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．５％、塩化ナト
リウム０．５％からなるｐＨ７．５の培地を調製し、５
リットルの培養槽にその３リットルを添加し、１２０℃
で１５分間加熱殺菌した。その培地にアリスロバクター
ＤＫ−１９（微工研菌寄６２０１号）を接種し、ｐＨ
７．５に保ちながら３０℃で２０時間通気及び撹拌をし
つつ培養した。培養終了後、培養液から菌体を遠心分離
で集菌、水洗後、０．０１ｍＭピリドキサ−ル−５’−
リン酸及び１．０ｍＭ塩化マグネシウムを含むｐＨ７．
５の０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ（N-2-Hydroxyethylpiperazi
ne-N-2-ethanesulfonic acid) 緩衝液５００ｍｌに懸濁
し、この菌体懸濁液を２０ｋＨｚ、３分間の超音波破砕
処理を４回行い、破砕液の懸濁物質を遠心分離で除去し
て粗酵素液を調製した。次に、この粗酵素液の分画を硫
酸アンモニウムを用いて行い、硫酸アンモニウム濃度２
５から６０％画分の析出物を分取し、上記緩衝液に溶解
し１００ｍｌの硫安分画酵素液を調製した。得られた硫
安分画酵素液のＤ−スレオニンアルドラーゼ活性（１Ｕ
はＤ−スレオニンから１分間に１μｍｏｌｅのグリシン
を生成するのに必要な酵素量を表わす）及びＬ−アロス
レオニンアルドラーゼ活性（ＩＵはＬ−アロスレオニン
から１分間に１μｍｏｌｅのグリシンを生成するのに必
要な酵素量を表わす）を測定したところ、それぞれ、
０．３４Ｕ／ｍｌ、０．２９Ｕ／ｍｌであった。得られ
た硫安分画酵素液１００ｍｌにＤ，Ｌ−スレオ／エリス
ロ−フェニルセリン（４種異性体の等量混合物）１００
ｍｇを加え、３０℃で１０時間反応させた。反応終了
後、反応液のフェニルセリン異性体及びグリシンを、ｏ
−フタルアルデヒドとＮ−アセチル−Ｌ−システィンに
より誘導体化し、ＯＤＳカラムを用いてＨＰＬＣにより
定量した。また、ベンズアルデヒドは、２，４−ジニト
ロフェニルヒドラジンと反応させ、ＯＤＳカラムを用い
てＨＰＬＣにより定量した。

【００２６】 Ｌ−スレオ−フェニルセリン ： １．３６ｍＭ（残存
率９７．８％） Ｌ−エリスロ−フェニルセリン： ０ ｍＭ（残存
率０ ％） Ｄ−スレオ−フェニルセリン ： ０ ｍＭ（残存
率０ ％） Ｄ−エリスロ−フェニルセリン： ０ ｍＭ（残存
率０ ％） グリシン ： ４．００ｍＭ ベンズアルデヒド ： ３．８９ｍＭ 反応液に１Ｎ塩酸を１０ｍｌ加えた後、遠心分離で不溶
物を除去した。この遠心上清に２００ｍｌのエチルエー
テルを加え、撹拌・静置し、エーテル相を分離、減圧乾
固を行い、４０ｍｇのベンズアルデヒドを得た。水相
を、強酸性陽イオン交換樹脂ＤＯＷＥＸ ５０Ｗ×８を
充填したカラム（１０ｍｍφ×１００ｍｍ）に通液、脱
イオン水による十分な洗浄後、０．５Ｎのアンモニア水
で吸着物質を溶出させ、フェニルセリン画分とグリシン
画分に分けて採取した。両画分を減圧乾固したところ、
それぞれ２３ｍｇ、２９ｍｇの結晶を得た。フェニルセ
リン画分より得られた結晶の異性体分析（ｏ−フタルア
ルデヒドとＮ−アセチル−Ｌ−システィンによる誘導体
化後、ＯＤＳカラムでＨＰＬＣ分析）を行ったところ、
残存フェニルセリンは全てＬ−スレオ体であった。

【００２７】実施例２ 実施例１と同様の方法で、シュードモナスＤＫ−２（微
工研菌寄６２００号）、アルカリゲネス・ハエカリスＩ
ＦＯ１２６６９及びキサントモナス・オリゼーＩＡＭ１
６５７を培養し、その硫安分画酵素液を調製した。得ら
れた硫安分画酵素液のＤ−スレオニンアルドラーゼ活性
及びＬ−アロスレオニンアルドラーゼ活性を測定した結
果を表１に示す。

【００２８】

【表１】

【００２９】得られた硫安分画酵素液を用い、実施例１
と同様に反応を行った。反応液の異性体分析により求め
た各異性体の残存率を表２に示す。

【００３０】

【表２】

【００３１】実施例３ キサントモナス・シトリーＩＦＯ３３１１（ｐＤＴ６４
８）とキサントモナス・シトリーＩＦＯ３３１１（ｐＬ
Ａ５５６）を、培地にクロラムフェニコールを５０μｇ
／ｍｌの濃度で添加してそれぞれ培養し、得られた培養
液の６０分の１量を破砕・アセトン分画せずにそのまま
洗浄・凍結乾燥して両者を混合し１００ｍｌの懸濁液
（Ｄ−スレオニンアルドラーゼ活性０．２２Ｕ／ｍｌ，
Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ活性０．２Ｕ／ｍｌ）
として反応に用いる以外は、全て実施例１と同様の方法
で行った。反応終了後、反応液中のフェニルセリン異性
体、グリシン、ベンズアルデヒドを前出の方法で定量
し、次の値を得た。 Ｌ−スレオ−フェニルセリン ： １．３４ｍＭ（残存
率９７．１％） Ｌ−エリスロ−フェニルセリン： ０ ｍＭ（残存
率０ ％） Ｄ−スレオ−フェニルセリン ： ０ ｍＭ（残存
率０ ％） Ｄ−エリスロ−フェニルセリン： ０ ｍＭ（残存
率０ ％） グリシン ： ４．０３ｍＭ ベンズアルデヒド ： ３．９８ｍＭ 各成分を反応液より分画・精製したところ、ベンズアル
デヒド４１ｍｇ、フェニルセリンの結晶２２ｍｇ、グリ
シンの結晶３０ｍｇを得た。フェニルセリン画分より得
た結晶の異性体分析を行ったところ、残存フェニルセリ
ンは全てＬ−スレオ体であった。

【００３２】実施例４ 実施例１と同様の方法で、バチルスＤＫ−３９（微工研
菌寄６２０２号）を培養し、その硫安分画酵素液を調製
した。得られた硫安分画酵素液のＤ−スレオニンアルド
ラーゼ活性及びＬ−アロスレオニンアルドラーゼ活性を
測定したところ、それぞれ０Ｕ／ｍｌ、０．２９Ｕ／ｍ
ｌであった。実施例３の方法で得たキサントモナス・シ
トリーＩＦＯ３３１１（ｐＤＴ６４８）の凍結乾燥菌体
をこの硫安分画酵素液に懸濁し、混合酵素液を得た。こ
の混合酵素液のＤ−スレオニンアルドラーゼ活性及びＬ
−アロスレオニンアルドラーゼ活性を測定したところ、
それぞれ０．２２Ｕ／ｍｌ、０．２９Ｕ／ｍｌであっ
た。得られた混合酵素液を用いて実施例１と同様に反応
を行った。反応液の異性体分析を行ったところ、Ｌ−ス
レオ体のみが残存しており、その残存率は９６．０％で
あった。

【００３３】実施例５ 一般式（１）におけるＲがそれぞれ、エチル基、オクチ
ル基、アリル基、シクロヘキシル基、５−ヒドロキシ−
２−ニトロフェニル基及びイミダゾリル基であるβ−ヒ
ドロキシアミノ酸のＤ，Ｌ−スレオ／エリスロ体（４種
異性体の等量混合物）を基質に用い、実施例１と２で得
た硫安分画酵素液及び実施例３で得た菌体懸濁液を実施
例１と同様の方法で反応させ、反応液の異性体分析によ
り求めた各異性体の残存率をそれぞれ表３、表４及び表
５に示す。

【００３４】

【表３】

【表４】

【表５】

【００３５】

【発明の効果】本発明によれば、光学分割のための置換
基の導入や除去が不要であり、高価な光学分割剤を用い
る必要もなく、生成するグリシンとアルデヒド誘導体を
原料合成にリサイクル使用することが可能で、繁雑なラ
セミ化を行う必要がないため、従来の方法に比べて極め
て有利な方法である。特に遺伝子組換えによりＤ−スレ
オニンアルドラーゼ及びＬ−アロスレオニンアルドラー
ゼの生産性が大幅に向上した菌体を用いることにより、
さらに広範囲のラセミ−β−ヒドロキシアミノ酸から、
Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸を簡単かつ経済的
に製造することが出来る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:05） Ｃ１２Ｒ 1:05） (Ｃ１２Ｐ 41/00 (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:06） Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｐ 41/00 (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 41/00 (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:38）

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式（Ｉ） 【化１】 （式中、Rは、置換又は非置換の脂肪族基、脂環式基、
   芳香族基又は複素環式基を表す。）で表わされるラセミ
   −β−ヒドロキシアミノ酸に、Ｄ−スレオ／エリスロ−
   β−ヒドロキシアミノ酸を特異的にグリシンと対応する
   アルデヒドに分解する酵素であるＤ−スレオニンアルド
   ラーゼ、同酵素を産生するアルカリゲネス属、シュード
   モナス属、アリスロバクター属、キサントモナス属に属
   する微生物よりなる群より選ばれた少なくとも１種の微
   生物菌体あるいは菌体処理物と、Ｌ−エリスロ−β−ヒ
   ドロキシアミノ酸を特異的にグリシンと対応するアルデ
   ヒドに分解する酵素であるＬ−アロスレオニンアルドラ
   ーゼ、同酵素を産生するアルカリゲネス属、シュードモ
   ナス属、アリスロバクター属、キサントモナス属、バチ
   ルス属、エシェリヒア属に属する微生物よりなる群より
   選ばれた少なくとも１種の微生物菌体あるいは菌体処理
   物を作用させることを特徴とするＬ−スレオ−β−ヒド
   ロキシアミノ酸の製造法。
2. 【請求項２】 一般式（Ｉ） 【化２】 （式中、Rは、置換又は非置換の脂肪族基、脂環式基、
   芳香族基又は複素環式基を表す。）で表わされるラセミ
   −β−ヒドロキシアミノ酸に、（１）遺伝子組換えによ
   り形質転換せしめられた微生物由来のD−スレオ／エリ
   スロ−β−ヒドロキシアミノ酸を特異的にグリシンと対
   応するアルデヒドに分解する能力を有す る酵素が、Ｄ−
   スレオニンアルドラーゼの合成に関与する遺伝子を担う
   ＤＮＡとベクターＤＮＡとを結合せしめてなる組換え体
   ＤＮＡを保有せしめた形質転換体から得られたものと、
   （２）遺伝子組換えにより形質転換せしめらた微生物由
   来のL−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を特異的に
   グリシンと対応するアルデヒドに分解する能力を有する
   酵素が、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼの合成に関与
   する遺伝子を担うＤＮＡとベクターＤＮＡとを結合せし
   めてなる組換え体ＤＮＡを保有せしめた形質転換体から
   得られたものとを作用させることを特徴とするＬ−スレ
   オ−β−ヒドロキシアミノ酸の製造法。