JP2996149B2

JP2996149B2 - Ｄ−アミノ酸の製法

Info

Publication number: JP2996149B2
Application number: JP22989995A
Authority: JP
Inventors: 正勝古井; 栄二高橋; 武爾柴谷
Original assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1995-09-07
Filing date: 1995-09-07
Publication date: 1999-12-27
Anticipated expiration: 2015-09-07
Also published as: JPH0975097A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微生物を利用した
Ｄ−アミノ酸（Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン及びＤ−イソ
ロイシン）の製法に関する。

【０００２】

【従来技術】Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン及びＤ−イソロ
イシンは、抗生物質など医薬品の原料、合成中間体又は
光学分割剤として有用な化合物である。従来、これらの
Ｄ−アミノ酸の製法としては、ラセミ体の分別晶析法、
クロマトグラフィーによる光学分割法もしくは有機化学
的な不斉合成法等の物理化学的な方法又はＮ−アセチル
−ＤＬ−アミノ酸を微生物酵素を用いて不斉加水分解す
る方法（ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．５４，９８４−９８９
（１９８８））、５−イソプロピルヒダントイン、５−
イソペンタノイルヒダントイン、５−ｓｅｃ−ブチルヒ
ダントインを微生物酵素を用いて不斉加水分解する方法
（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．５
６，４９２−４９８（１９７８））、Ｄ−Ｎ−カルバモ
イル−α−アミノ酸を加水分解する方法（特再平４−８
１０５７９）、ＤＬ−アミノニトリルを微生物酵素を用
いて不斉加水分解する方法（Ｂｕｌｌ．Ｉｎｓｔ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｒｅｓ．，ＫｙｏｔｏＵｎｉｖ．，Ｖｏｌ．６
５，１４１−１４３（１９８７））もしくはα−ケト酸
に微生物酵素を用いてアミノ基を転移する方法（Ｊ．Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．８，２４３−２４８
（１９８８））等の生化学的方法が知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記物理化学的方法は
操作が煩雑であり、生成物の収率、光学純度が低い等の
難点を有しており、また生化学的方法は基質の５−イソ
プロピルヒダントイン、５−イソペンタノイルヒダント
イン、５−ｓｅｃ−ブチルヒダントイン、Ｄ−Ｎ−カル
バモイル−α−アミノ酸が高価であり、生成物の分離が
難しい等の難点がある。したがって、前記課題の少なく
とも１つを解決するＤ−アミノ酸を製する方法の開発が
望まれている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、これらラセミ型バリン、ラセミ型ロイシ
ン又はラセミ型イソロイシン中のＬ型光学活性体を選択
的に分解する能力を有する微生物を見出し、本発明を完
成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明はラセミ型バリン、ラセ
ミ型ロイシン及びラセミ型イソロイシンから選択される
ラセミ型アミノ酸に、当該選択されたラセミ体中のＬ型
光学活性体を不斉分解する能力を有する微生物の培養物
又はその処理物を作用させた後、残存するＤ型光学活性
体を分離・採取することを特徴とするＤ−アミノ酸の製
法である。

【０００６】本発明に使用される微生物は、ラセミ型バ
リン、ラセミ型ロイシン又はラセミ型イソロイシン中の
Ｌ型光学活性体を不斉分解する能力、即ち、Ｌ−バリ
ン、Ｌ−ロイシン及びＬ−イソロイシンから選ばれる少
なくとも１種以上のＬ−アミノ酸を不斉分解する能力を
有する微生物であればよい。かかる微生物としては、例
えば、アクロモバクター属、プロテウス属、プロビデン
シア属又はヤローウィア属に属する微生物があげられ
る。これらのうち、プロテウス属、プロビデンシア属に
属する微生物が好ましく、とりわけ、プロテウス属に属
する微生物（例えば、プロテウスブルガリス等）が好
ましい。かかる微生物の具体例としては、アクロモバク
ターリキダム（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｌｉｑ
ｕｉｄｕｍ）ＯＵＴ８０１２（ＦＥＲＭＰ−１２６８
４）、プロテウスブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｖｕ
ｌｇａｒｉｓ）ＲＩＭＤＫＳ（ＩＡＭ１２００３）、
同ＡＨＵ１４６９、同ＡＨＵ１４７２、同ＡＨＵ１４７
４、プロビデンシアアルカリファシエンス（Ｐｒｏｖ
ｉｄｅｎｃｉａａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）ＪＣＭ
１６７３、プロビデンシアリッティゲリ（Ｐｒｏｖｉ
ｄｅｎｃｉａｒｅｔｔｇｅｒｉ）ＡＴＣＣ２５９３
２、ヤローウィアリポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ
ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＩＦＯ０７１７、同ＩＦＯ０７
４６、同ＩＦＯ１１９５、同ＩＦＯ１２０９、同ＩＦＯ
１５４８等がある。

【０００７】これら微生物は、本発明に必要な能力を有
するものである限り、どのような菌株であってもよく、
紫外線照射や変異剤処理等の人為的処理により得られる
変異株であってもよい。また、これら微生物から組換え
ＤＮＡ法、細胞融合法などの遺伝子工学的もしくは、生
物工学的手法により誘導されるものであってもよい。例
えば、遺伝子工学的手法に従い、不斉分解酵素を生産す
る微生物の染色体断片から、目的酵素の遺伝子を単離
し、これを適当なプラスミドベクターに挿入した組換え
プラスミドを調製した後、この組換えプラスミドで適当
な宿主微生物を形質転換することにより、酵素の生産能
を有する微生物又は酵素生産能がさらに向上した微生物
を得ることができる。さらに、この組換えプラスミド
で、必要に応じて他の優れた性質（例えば培養が容易な
ど）を有する宿主微生物を形質転換してもよい。

【０００８】本発明における培養物としては、例えば、
前記微生物の培養液又は生菌体などがあげられ、また、
当該培養物の処理物としては、例えば培養液の処理物
（培養上清など）もしくは菌体処理物があげられる。

【０００９】上記培養物（培養液、菌体など）は、例え
ば、上記微生物を通常この分野において用いられる培地
（慣用の炭素源、窒素源及び無機塩類含有培地）中、常
温ないし加温下（好ましくは約２０〜約４０℃）、かつ
好気的条件下、ｐＨ約５〜約８で培養し、必要とあれ
ば、このように得られた培養液から常法により菌体を分
離・採取して得ることができる。また、培養に際して
は、培地にアミノ酸を約０．００１〜約１０％、とりわ
け約０．１〜約２％程度添加して酵素活性をあげること
もできる。

【００１０】微生物の菌体処理物としては、前記培養物
を種々の物理化学的方法、例えば、超音波、フレンチプ
レス、浸透圧、凍結融解、凍結乾燥、アルミナ破壊、溶
菌酵素、界面活性剤又は有機溶媒などの手段で処理した
菌体のほか、前記培養物（培養液、菌体など）又はその
処理物（培養上清、菌体処理物など）から、公知の方法
により調製された部分精製酵素あるいは精製酵素であっ
て、ラセミ型バリン、ラセミ型ロイシン又はラセミ型イ
ソロイシン中のＬ型光学活性体を不斉分解する能力を有
するものがあげられる。

【００１１】さらに、本発明の微生物菌体、菌体処理物
又は酵素は、例えば、ポリアクリルアミド法、含硫多糖
ゲル法（カラギーナンゲル法等）、アルギン酸ゲル法又
は寒天ゲル法等により固定化して使用することもでき
る。

【００１２】また、ラセミ型バリン、ラセミ型ロイシン
及びラセミ型イソロイシンから選択されるラセミ型アミ
ノ酸を含む培地中で、当該選択されたラセミ型アミノ酸
中のＬ型光学活性体を不斉分解する能力を有する微生物
を培養し、培地中に残存するＤ型光学活性体を分離・採
取することもできる。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明にかかる不斉分解反応は、
原料化合物であるラセミ型バリン、ラセミ型ロイシン又
はラセミ型イソロイシンに、当該選択されたラセミ体中
のＬ型光学活性体を不斉分解する能力を有する微生物の
培養物又はその処理物を、溶液中で接触させインキュベ
ーションすることにより実施できる。また、反応は微生
物の培養と並行して実施してもよく、微生物の培養と並
行して実施する場合は、予めラセミ型バリン、ラセミ型
ロイシン又はラセミ型イソロイシンを添加した培地を用
いて、培養と同様の条件下で反応を行えばよい。

【００１４】また、本発明の反応は水溶液中で好適に実
施でき、反応は常温ないし加温下、好ましくは約１０〜
約５０℃、とりわけ好ましくは約２５〜約４０℃で好適
に進行する。反応液は、ｐＨ約５〜約１１とりわけｐＨ
約６〜約９となるよう調整するのが好ましい。

【００１５】反応基質となる原料化合物であるラセミ型
バリン、ラセミ型ロイシン又はラセミ型イソロイシンの
仕込濃度は、通常、約０．０５〜約３０％、とりわけ約
１〜約２０％とすることが好ましい。その際、反応基質
は最初に一括して添加してもよく、あるいは反応中数回
に分割して添加してもよい。

【００１６】また、原料化合物であるラセミ型バリン、
ラセミ型ロイシン又はラセミ型イソロイシンとしては、
Ｄ型光学活性体及びＬ型光学活性体を等量含むものだけ
でなくこれら光学活性体を共に含むものであればいずれ
も用いることができる。

【００１７】本発明において生菌体を用いる場合、反応
液中に界面活性剤を添加しておけば反応時間の短縮をは
かることができる。この目的に用いられる界面活性剤の
としては、例えば、臭化セチルピリジニウム、臭化セチ
ルトリメチルアンモニウム又はｐ−イソオクチルフェニ
ルエーテル（米国、ロームアンドハース社製、商品名ト
リトンＸ−１００）等があげられ、反応液に対し約０．
０００１〜約０．１％程度使用するのが好ましい。

【００１８】反応終了後、反応液からのＤ型光学活性体
の採取・単離は、常法にしたがって容易に実施すること
ができる。例えば、反応液から遠心分離によって菌体等
の不溶性物質を除去したのち、活性炭で色素等を吸着除
去した溶液を減圧濃縮し、冷却晶析することによりＤ型
光学活性体（Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン又はＤ−イソロ
イシン）の結晶を得ることができる。

【００１９】また、微生物の培養物又はその処理物が、
ラセミ型バリン、ラセミ型ロイシン又はラセミ型イソロ
イシンの中のＬ型光学活性体を不斉分解する能力を有す
るか否かの検定は、上記の反応方法に準じて、例えば、
以下のように容易に実施できる。すなわち、ラセミ型バ
リン、ラセミ型ロイシン又はラセミ型イソロイシンを含
む培地又は水溶液中に、検定すべき微生物の培養物又は
その処理物を添加し、３０℃にて１２０時間反応させ
る。反応終了液を、光学活性カラム（例えば、住化分析
センター製、ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬＯＡ−５０００）
を用いる高速液体クロマトグラフィーで分析・定量し、
Ｄ型光学活性体及びＬ型光学活性体の各々の含量を測定
して実施できる。測定により、例えば、Ｌ型光学活性体
が減少し、Ｄ型光学活性体が残存している場合、Ｌ型光
学活性体を不斉分解する能力を有するものと判定され
る。

【００２０】つぎに、実施例をあげて本発明をさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものでは
ない。

【００２１】なお、本明細書中「％」はいずれも「重量
／容量（ｇ／ｄｌ）」を意味するものとする。また、本
実施例において、アミノ酸の光学活性体の定量は、ＳＵ
ＭＩＣＨＩＲＡＬＯＡ−５０００（住化分析センター
製）を用いる高速液体クロマトグラフィーにより行っ
た。

【００２２】

【実施例】

実施例１ＤＬ−バリン２％、硫酸アンモニウム０．５％、リン酸
二水素カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５
％、酵母エキス０．０２％からなる培地３ｍｌ（ｐＨ
７．０）を試験管にいれ、１２０℃で１０分間滅菌し
た。この培地に下記第１表に示す微生物を接種し、３０
℃で１４４時間振盪培養後、培養液に残存するＤ−バリ
ンを定量した。Ｄ−バリンの含量は下記第１表の通りで
あり、また、その対掌体であるＬ−バリンは培養液中か
ら殆ど検出されなかった。

【００２３】

【表１】

【００２４】実施例２ＤＬ−メチオニン０．５％、ポリペプトン１．０％、酵
母エキス１．０％、塩化ナトリウム０．５％からなる培
地１００ｍｌ（ｐＨ７．０）を５００ｍｌ容振盪フラス
コに入れ、１２０℃で１０分間滅菌した。この培地にプ
ロテウスブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｖｕｌｇａｒ
ｉｓ）ＲＩＭＤＫＳ（ＩＡＭ１２００３）を１白金耳
接種し、３０℃で２０時間培養した。上記培養液１６０
０ｍｌより遠心分離によって集めた菌体を生理食塩水に
懸濁後、さらに遠心分離により集菌した。該菌体にＤＬ
−バリン５％を含む５０ｍＭリン酸緩衝液８００ｍｌ
（ｐＨ７．０）を加え、３０℃で７２時間不斉分解反応
させることによりＬ−バリンが完全に分解した。反応
後、遠心分離により除菌し、上清を得た。該上清は蛋白
等を除くため限外ろ過を行い、ろ液を得た。該ろ液は減
圧濃縮し、冷却晶析してＤ−バリンの結晶４．０ｇを得
た。

【００２５】旋光度：［α］_D ²⁰＝−２７．５゜（Ｃ
＝８，６ＮＨＣｌ）光学純度：１００％実施例３ＤＬ−バリン０．５％、ポリペプトン１．０％、酵母エ
キス１．０％、塩化ナトリウム０．５％からなる培地３
ｍｌ（ｐＨ７．０）に下記第２表に示す細菌を接種し、
３０℃で２０時間培養した。上記培養液３ｍｌより遠心
分離によって集めた菌体を生理食塩水に懸濁後さらに遠
心分離により集菌した。該菌体にＤＬ−バリン５％を含
む５０ｍＭリン酸緩衝液２ｍｌ（ｐＨ７．０）を加え、
３０℃で１４４時間不斉分解反応させた。この反応液の
Ｄ−バリンの含量は下記第２表の通りであり、また、そ
の対掌体であるＬ−バリンは反応液中から殆ど検出され
なかった。

【００２６】

【表２】

【００２７】実施例４ＤＬ−ロイシン１％、酵母エキス１％、ポリペプトン１
％、塩化ナトリウム０．５％からなる培地３ｍｌ（ｐＨ
７．０）を試験管にいれ、１２０℃で１０分間滅菌し
た。この培地に下記第３表に示す微生物を接種し、３０
℃で２４時間振盪培養後、培養液に残存するＤ−ロイシ
ンを定量した。Ｄ−ロイシンの含量は下記第３表の通り
であり、また、その対掌体であるＬ−ロイシンは培養液
中から殆ど検出されなかった。

【００２８】

【表３】

【００２９】実施例５ＤＬ−メチオニン０．５％、ポリペプトン１．０％、酵
母エキス１．０％、塩化ナトリウム０．５％からなる培
地１００ｍｌ（ｐＨ７．０）を５００ｍｌ容振盪フラス
コに入れ、１２０℃で１０分間滅菌した。この培地にプ
ロテウスブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｖｕｌｇａｒ
ｉｓ）ＲＩＭＤＫＳ（ＩＡＭ１２００３）を１白金耳
接種し、３０℃で２０時間培養した。上記培養液１６０
０ｍｌより遠心分離によって集めた菌体を生理食塩水に
懸濁後、さらに遠心分離により集菌した。該菌体にＤＬ
−ロイシン５％を含む５０ｍＭリン酸緩衝液８００ｍｌ
（ｐＨ７．０）を加え、３０℃で７２時間不斉分解反応
させることによりＬ−ロイシンが完全に分解した。反応
後、遠心分離により除菌し、実施例２と同様に処理する
ことによりＤ−ロイシン５．３ｇを得た。

【００３０】旋光度：［α］_D ²⁰＝−１５．３゜（Ｃ
＝４，６ＮＨＣｌ）光学純度：１００％実施例６ＤＬ−ロイシン１％、酵母エキス１％、ポリペプトン１
％、塩化ナトリウム０．５％からなる培地３ｍｌ（ｐＨ
７．０）を試験管にいれ、１２０℃で１０分間滅菌し
た。この培地に下記第４表に示す微生物を接種し、３０
℃で２４時間振盪培養後、遠心分離によって集めた菌体
を生理食塩水に懸濁後さらに遠心分離により集菌した。
該菌体にＤＬ−ロイシン１％を含む５０ｍＭリン酸緩衝
液２ｍｌ（ｐＨ７．０）を加え、３０℃で２４時間不斉
分解反応させた。この反応液のＤ−ロイシンの含量は下
記第４表の通りであり、また、その対掌体であるＬ−ロ
イシンは反応液中から殆ど検出されなかった。

【００３１】

【表４】

【００３２】実施例７ＤＬ−イソロイシン１％、酵母エキス１％、ポリペプト
ン１％、塩化ナトリウム０．５％からなる培地３ｍｌ
（ｐＨ７．０）を試験管にいれ、１２０℃で１０分間滅
菌した。この培地に下記第５表に示す微生物を接種し、
３０℃で２４時間振盪培養後、培養液に残存するＤ−イ
ソロイシンを定量した。Ｄ−イソロイシンの含量は下記
第５表の通りであり、また、その対掌体であるＬ−イソ
ロイシンは培養液中から殆ど検出されなかった。

【００３３】

【表５】

【００３４】実施例８ＤＬ−メチオニン０．５％、ポリペプトン１．０％、酵
母エキス１．０％、塩化ナトリウム０．５％からなる培
地１００ｍｌ（ｐＨ７．０）を５００ｍｌ容振盪フラス
コに入れ、１２０℃で１０分間滅菌した。この培地にプ
ロテウスブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｖｕｌｇａｒ
ｉｓ）ＲＩＭＤＫＳ（ＩＡＭ１２００３）を１白金耳
接種し、３０℃で２０時間培養した。上記培養液１６０
０ｍｌより遠心分離によって集めた菌体を生理食塩水に
懸濁後、さらに遠心分離により集菌した。該菌体にＤＬ
−イソロイシン５％を含む５０ｍＭリン酸緩衝液８００
ｍｌ（ｐＨ７．０）を加え、３０℃で７２時間不斉分解
反応させることによりＬ−イソロイシンが完全に分解し
た。反応後、遠心分離により除菌し、実施例２と同様に
処理することによりＤ−イソロイシン８．５ｇを得た。

【００３５】旋光度：［α］_D ²⁰＝−３８．０゜（Ｃ
＝４，６ＮＨＣｌ）光学純度：１００％実施例９ＤＬ−イソロイシン１％、酵母エキス１％、ポリペプト
ン１％、塩化ナトリウム０．５％からなる培地３ｍｌ
（ｐＨ７．０）を試験管にいれ、１２０℃で１０分間滅
菌した。この培地に下記第６表に示す微生物を接種し、
３０℃で２４時間振盪培養後、遠心分離によって集めた
菌体を生理食塩水に懸濁後さらに遠心分離により集菌し
た。該菌体にＤＬ−イソロイシン２％を含む５０ｍＭリ
ン酸緩衝液２ｍｌ（ｐＨ７．０）を加え、３０℃で２４
時間不斉分解反応させた。この反応液のＤ−イソロイシ
ンの含量は下記第６表の通りであり、また、その対掌体
であるＬ−イソロイシンは反応液中から殆ど検出されな
かった。

【００３６】

【表６】

【００３７】

【発明の効果】本願発明方法は、工業的に安価なラセミ
型バリン、ラセミ型ロイシン又はラセミ型イソロイシン
からＤ型光学活性体を効率よく、高い光学純度で製する
ことができるので、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン及びＤ−
イソロイシンの工業的有利な製法である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 41/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ラセミ型バリン、ラセミ型ロイシン及び
ラセミ型イソロイシンから選択されるラセミ型アミノ酸
に、当該選択されたラセミ体中のＬ型光学活性体を不斉
分解する能力を有する微生物であって、アクロモバクタ
ー属、プロテウス属、プロビデンシア属又はヤローウィ
ア属に属する微生物の培養物又はその処理物を作用させ
た後、残存するＤ型光学活性体を分離・採取することを
特徴とするＤ−アミノ酸の製法。
【請求項２】ラセミ型バリンに、当該ラセミ体中のＬ
−バリンを不斉分解する能力を有する微生物であって、
アクロモバクター属、プロテウス属、プロビデンシア属
又はヤローウィア属に属する微生物の培養物又はその処
理物を作用させた後、残存するＤ−バリンを分離・採取
することを特徴とするＤ−アミノ酸の製法。
【請求項３】ラセミ型ロイシンに、当該ラセミ体中の
Ｌ−ロイシンを不斉分解する能力を有する微生物であっ
て、アクロモバクター属、プロテウス属、プロビデンシ
ア属又はヤローウィア属に属する微生物の培養物又はそ
の処理物を作用させた後、残存するＤ−ロイシンを分離
・採取することを特徴とするＤ−アミノ酸の製法。
【請求項４】ラセミ型イソロイシンに、当該ラセミ体
中のＬ−イソロイシンを不斉分解する能力を有する微生
物であって、アクロモバクター属、プロテウス属、プロ
ビデンシア属又はヤローウィア属に属する微生物の培養
物又はその処理物を作用させた後、残存するＤ−イソロ
イシンを分離・採取することを特徴とするＤ−アミノ酸
の製法。
【請求項５】Ｌ−バリンを不斉分解する能力を有する
微生物がプロテウスブルガリスである請求項２記載の
製法。
【請求項６】Ｌ−ロイシンを不斉分解する能力を有す
る微生物がプロテウスブルガリスである請求項３記載
の製法。
【請求項７】Ｌ−イソロイシンを不斉分解する能力を
有する微生物がプロテウスブルガリスである請求項４
記載の製法。
【請求項８】ラセミ型バリン、ラセミ型ロイシン及び
ラセミ型イソロイシンから選択されるラセミ型アミノ酸
を含む培地中で、当該選択されたラセミ型アミノ酸中の
Ｌ型光学活性体を不斉分解する能力を有する微生物であ
って、アクロモバクター属、プロテウス属、プロビデン
シア属又はヤローウィア属に属する微生物を培養し、培
地中に残存するＤ型光学活性体を分離・採取することを
特徴とするＤ−アミノ酸の製法。