JP3118331B2 - シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素の製造方法 - Google Patents
シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素の製造方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、微生物を用いてシ
クロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素
の製造方法に関する。
クロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素
の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】これまでに見い出されているシクロヘキ
サンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素は存在し
ない。しかし、フェノール性エステル加水分解酵素とし
ては、アリールエステラーゼの存在が知られており、例
えばクリニカ キミカ アクタ（Clin.Chim.Acta）,７
巻、560頁（1962年）に記載のヒト血液中アリールエス
テラーゼやバイオキミカ バイオフィジカ アクタ（Bioc
him. Biophys. Acta）,276巻、180頁（1972）に記載の
アリールエステラーゼ等が知られている。
サンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素は存在し
ない。しかし、フェノール性エステル加水分解酵素とし
ては、アリールエステラーゼの存在が知られており、例
えばクリニカ キミカ アクタ（Clin.Chim.Acta）,７
巻、560頁（1962年）に記載のヒト血液中アリールエス
テラーゼやバイオキミカ バイオフィジカ アクタ（Bioc
him. Biophys. Acta）,276巻、180頁（1972）に記載の
アリールエステラーゼ等が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ところが、これらアリ
ールエステラーゼは、動物の各組織から精製されたもの
であり、該酵素の生産性が低く、工業的に該酵素を供す
ることは困難であった。
ールエステラーゼは、動物の各組織から精製されたもの
であり、該酵素の生産性が低く、工業的に該酵素を供す
ることは困難であった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる従
来の欠点を解決すべく鋭意研究した結果、フェノール性
のエステルを強く加水分解し、かつ酵素生産性の高い微
生物由来のシクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル
加水分解酵素を見い出すことができ、本発明を完成する
に至った。
来の欠点を解決すべく鋭意研究した結果、フェノール性
のエステルを強く加水分解し、かつ酵素生産性の高い微
生物由来のシクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル
加水分解酵素を見い出すことができ、本発明を完成する
に至った。
【０００５】即ち、本発明は、エシェリヒア属に属する
シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵
素生産能を有する微生物を培養し、その培養物から下記
理化学的性質を有するシクロヘキサンカルボン酸フェニ
ルエステル加水分解酵素を採取することを特徴とするシ
クロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素
の製造方法である。
シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵
素生産能を有する微生物を培養し、その培養物から下記
理化学的性質を有するシクロヘキサンカルボン酸フェニ
ルエステル加水分解酵素を採取することを特徴とするシ
クロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素
の製造方法である。
【０００６】〔理化学的性質〕 作用： 水の存在下で、１モルのセトラキサートか
ら１モルのトラネキサム酸と１モルのヒドロキシフェニ
ルプロピオン酸を生成せしめる。 基質特異性： Ｎ−アセチルセトラキサート、トラ
ネキサム酸フェニル、セトラキサート、４−（２−カル
ボキシエチル）フェニルシクロヘキサンカルボキシレー
ト、トラネキサム酸ヘキシルに対して作用し、トラネキ
サム酸ミリスチル、トラネキサム酸メチルに対しては作
用を示さない。 至適ｐＨ： ｐＨ５．５〜６．５ ｐＨ安定性： ４℃下にて２４時間保存したとき、
ｐＨ５．０〜９．０において８０％以上の残存活性を有
する。 至適温度： ０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）において４０℃ 温度安定性： ０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）において、各温度に５分間保持した時、４０℃以下
で９５％以上の残存活性を有する。
ら１モルのトラネキサム酸と１モルのヒドロキシフェニ
ルプロピオン酸を生成せしめる。 基質特異性： Ｎ−アセチルセトラキサート、トラ
ネキサム酸フェニル、セトラキサート、４−（２−カル
ボキシエチル）フェニルシクロヘキサンカルボキシレー
ト、トラネキサム酸ヘキシルに対して作用し、トラネキ
サム酸ミリスチル、トラネキサム酸メチルに対しては作
用を示さない。 至適ｐＨ： ｐＨ５．５〜６．５ ｐＨ安定性： ４℃下にて２４時間保存したとき、
ｐＨ５．０〜９．０において８０％以上の残存活性を有
する。 至適温度： ０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）において４０℃ 温度安定性： ０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）において、各温度に５分間保持した時、４０℃以下
で９５％以上の残存活性を有する。
【０００７】本発明によって得られるシクロヘキサンカ
ルボン酸フェニルエステル加水分解酵素は、医薬品とし
て重要なセトラキサートの製造や液晶性エステル化合物
製造等の用途に使用される。
ルボン酸フェニルエステル加水分解酵素は、医薬品とし
て重要なセトラキサートの製造や液晶性エステル化合物
製造等の用途に使用される。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明においてシクロヘキサンカ
ルボン酸フェニルエステルとは、シクロヘキサンカルボ
ン酸フェニルエステル及びその誘導体を意味し、具体的
には、例えば、4−(2−カルボキシエチル)フェニルトラ
ンス−4−アミノメチルシクロヘキサンカルボキシレー
ト［一般にセトラキサートと称される］、トラネキサム
酸フェニル、Ｎ−アセチルセトラキサート、４−（２−
カルボキシエチル）フェニルシクロヘキサンカルボキシ
レートなどが挙げられる。
ルボン酸フェニルエステルとは、シクロヘキサンカルボ
ン酸フェニルエステル及びその誘導体を意味し、具体的
には、例えば、4−(2−カルボキシエチル)フェニルトラ
ンス−4−アミノメチルシクロヘキサンカルボキシレー
ト［一般にセトラキサートと称される］、トラネキサム
酸フェニル、Ｎ−アセチルセトラキサート、４−（２−
カルボキシエチル）フェニルシクロヘキサンカルボキシ
レートなどが挙げられる。
【０００９】本発明においては、微生物を用いて上記シ
クロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素
を製造するが、このとき微生物としては、エシェリヒア
・コリ IFO 12713（Escherichia coli）等のエシェリヒ
ア（Escherichia）属に属するシクロヘキサンカルボン
酸フェニルエステル加水分解酵素生産能を有する微生物
を使用する。
クロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素
を製造するが、このとき微生物としては、エシェリヒア
・コリ IFO 12713（Escherichia coli）等のエシェリヒ
ア（Escherichia）属に属するシクロヘキサンカルボン
酸フェニルエステル加水分解酵素生産能を有する微生物
を使用する。
【００１０】本発明においては、これらエシェリヒア
（Escherichia）属に属するシクロヘキサンカルボン酸
フェニルエステル加水分解酵素生産能を有する微生物を
培養し、その培養物からシクロヘキサンカルボン酸フェ
ニルエステル加水分解酵素を採取する。ここで、該微生
物を培養した培養物には、培養する菌株によっても異な
るが、シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水
分解酵素活性の存在するもの全てが含まれ、例えば培養
菌体、培養液、ふすま培養などの培養体またはその洗浄
液、あるいはこれら培養物の処理物等がある。
（Escherichia）属に属するシクロヘキサンカルボン酸
フェニルエステル加水分解酵素生産能を有する微生物を
培養し、その培養物からシクロヘキサンカルボン酸フェ
ニルエステル加水分解酵素を採取する。ここで、該微生
物を培養した培養物には、培養する菌株によっても異な
るが、シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水
分解酵素活性の存在するもの全てが含まれ、例えば培養
菌体、培養液、ふすま培養などの培養体またはその洗浄
液、あるいはこれら培養物の処理物等がある。
【００１１】前記微生物を培養する際に使用する培地と
しては特に限定されない。例えば炭素源としてグルコー
ス、糖密、可溶性でんぷん等の炭素源、窒素源として肉
エキス、酵母エキス、ポリペプトン等の窒素源、無機塩
類として例えば燐酸第一カリウム、燐酸第二カリウム、
塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム
等の無機塩類を適宣組み合わせたものであればよい。
しては特に限定されない。例えば炭素源としてグルコー
ス、糖密、可溶性でんぷん等の炭素源、窒素源として肉
エキス、酵母エキス、ポリペプトン等の窒素源、無機塩
類として例えば燐酸第一カリウム、燐酸第二カリウム、
塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム
等の無機塩類を適宣組み合わせたものであればよい。
【００１２】また、培養条件としては、通気攪はん条件
下で培養温度が１５〜４０℃の範囲、好ましくは２５〜
３５℃の範囲で培養する方法が好適である。培養時のｐ
Ｈ条件は、４．０〜９．０の範囲で、好ましくはｐＨ
５．０〜８．０の範囲が適当である。培養時間は、特に
限定されないが酵素の生産性等の経済性を考慮すると増
殖の後期に達する時間から休止状態に入ってから１０時
間以内の範囲が適当である。シクロヘキサンカルボン酸
フェニルエステル加水分解酵素は、培養物の中の菌体内
と培養液側の両者に蓄積される。培養によって得られた
培養物から培養液と菌体とを分離する方法としては、従
来から行われている遠心分離法や濾過等の方法が使用出
来るが、遠心分離の方法が好適である。
下で培養温度が１５〜４０℃の範囲、好ましくは２５〜
３５℃の範囲で培養する方法が好適である。培養時のｐ
Ｈ条件は、４．０〜９．０の範囲で、好ましくはｐＨ
５．０〜８．０の範囲が適当である。培養時間は、特に
限定されないが酵素の生産性等の経済性を考慮すると増
殖の後期に達する時間から休止状態に入ってから１０時
間以内の範囲が適当である。シクロヘキサンカルボン酸
フェニルエステル加水分解酵素は、培養物の中の菌体内
と培養液側の両者に蓄積される。培養によって得られた
培養物から培養液と菌体とを分離する方法としては、従
来から行われている遠心分離法や濾過等の方法が使用出
来るが、遠心分離の方法が好適である。
【００１３】本発明の製造方法においては、上記のよう
にして分離された菌体、又は培養液からシクロヘキサン
カルボン酸フェニルエステル加水分解酵素を採取する。
例えば、菌体からの酵素の採取は、該酵素を菌体から何
らかの方法によって抽出すればよい。抽出方法として
は、従来から行われている超音波による菌体破砕、ある
いはガラス・ビーズと共に回転させるダイノミル破砕機
による菌体破砕又は、リゾチーム等の酵素やトルエン等
の有機溶媒による細胞膜の破壊等の方法が挙げられる。
これらの中から適当な方法を選択して菌体から酵素の抽
出を行うことにより、酵素の採取が出来る。
にして分離された菌体、又は培養液からシクロヘキサン
カルボン酸フェニルエステル加水分解酵素を採取する。
例えば、菌体からの酵素の採取は、該酵素を菌体から何
らかの方法によって抽出すればよい。抽出方法として
は、従来から行われている超音波による菌体破砕、ある
いはガラス・ビーズと共に回転させるダイノミル破砕機
による菌体破砕又は、リゾチーム等の酵素やトルエン等
の有機溶媒による細胞膜の破壊等の方法が挙げられる。
これらの中から適当な方法を選択して菌体から酵素の抽
出を行うことにより、酵素の採取が出来る。
【００１４】また、分離された培養液からシクロヘキサ
ンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素を採取する
場合は、培養液を通常の酵素精製法に用いられる方法、
例えば塩析、透析等の処理によって採取することが出来
る。
ンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素を採取する
場合は、培養液を通常の酵素精製法に用いられる方法、
例えば塩析、透析等の処理によって採取することが出来
る。
【００１５】これらの方法で抽出または、分離された粗
酵素液からシクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル
加水分解酵素をさらに精製する必要性がある場合は、通
常実施されている一般的な酵素の精製手段である硫酸ア
ンモニウム沈澱法、イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー法、ゲル濾過法、ヒドロキシアパタイトカラムクロマ
トグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー
法、疎水性カラムクロマトグラフィー法、調製用電気泳
動法等の方法を適宜組み合わせるか、あるいは繰り返す
ことによって精製を行うことが出来る。
酵素液からシクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル
加水分解酵素をさらに精製する必要性がある場合は、通
常実施されている一般的な酵素の精製手段である硫酸ア
ンモニウム沈澱法、イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー法、ゲル濾過法、ヒドロキシアパタイトカラムクロマ
トグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー
法、疎水性カラムクロマトグラフィー法、調製用電気泳
動法等の方法を適宜組み合わせるか、あるいは繰り返す
ことによって精製を行うことが出来る。
【００１６】本発明によって得られるシクロヘキサンカ
ルボン酸フェニルエステル加水分解酵素は、例えばエシ
ェリヒア・コリＮ−０００２微工研菌寄第１３１９０号
（Escherichia coli N-0002 FERM P-13190）によって生
産される、下記の特徴的な理化学的性質を有するシクロ
ヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素であ
る。なお、上記菌体は、シクロヘキサンカルボン酸フェ
ニルエステル加水分解酵素生産菌として通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１３１９０
号として寄託されているものである。
ルボン酸フェニルエステル加水分解酵素は、例えばエシ
ェリヒア・コリＮ−０００２微工研菌寄第１３１９０号
（Escherichia coli N-0002 FERM P-13190）によって生
産される、下記の特徴的な理化学的性質を有するシクロ
ヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素であ
る。なお、上記菌体は、シクロヘキサンカルボン酸フェ
ニルエステル加水分解酵素生産菌として通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１３１９０
号として寄託されているものである。
【００１７】〔理化学的性質〕 作用： 水存在下で、１モルのセトラキサートから
１モルのトラネキサム酸と１モルのヒドロキシフェニル
プロピオン酸を生成せしめる。
１モルのトラネキサム酸と１モルのヒドロキシフェニル
プロピオン酸を生成せしめる。
【００１８】 基質特異性： Ｎ−アセチルセトラキ
サート、トラネキサム酸フェニル、セトラキサート、４
ー（２ーカルボキシエチル）フェニルシクロヘキサンカ
ルボキシレート、トラネキサム酸ヘキシルに対して作用
し、トラネキサム酸ミリスチル、トラネキサム酸メチル
に対しては、作用を示さない。これらのエステル類に対
する作用の強さを、セトラキサートに対する作用を１０
０とした相対活性値で表１に示す。
サート、トラネキサム酸フェニル、セトラキサート、４
ー（２ーカルボキシエチル）フェニルシクロヘキサンカ
ルボキシレート、トラネキサム酸ヘキシルに対して作用
し、トラネキサム酸ミリスチル、トラネキサム酸メチル
に対しては、作用を示さない。これらのエステル類に対
する作用の強さを、セトラキサートに対する作用を１０
０とした相対活性値で表１に示す。
【００１９】
【表１】
【００２０】 至適ｐＨ：ｐＨ５．５〜６．５（図１
に示す） ｐＨ安定性：４℃下にて２４時間保存した時、ｐＨ
５．０〜９．０において８０％以上の残存活性を有す
る。（図２に示す） 至適温度：０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
において４０℃（図３に示す） 温度安定性：０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）において、各温度に５分間保持した時、４０℃以下
で９５％以上の残存活性を有する。（図４に示す） 分子量：５３，０００±５，０００{（商品名：HPL
C用カラムTSK-gel G3000SWXL 東ソー社製）によるゲル
濾過法より}（図５に示す） Ｋｍ値：０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
の条件におけるセトラキサートに対するＫｍ値は０．６
ｍＭである。
に示す） ｐＨ安定性：４℃下にて２４時間保存した時、ｐＨ
５．０〜９．０において８０％以上の残存活性を有す
る。（図２に示す） 至適温度：０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
において４０℃（図３に示す） 温度安定性：０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）において、各温度に５分間保持した時、４０℃以下
で９５％以上の残存活性を有する。（図４に示す） 分子量：５３，０００±５，０００{（商品名：HPL
C用カラムTSK-gel G3000SWXL 東ソー社製）によるゲル
濾過法より}（図５に示す） Ｋｍ値：０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
の条件におけるセトラキサートに対するＫｍ値は０．６
ｍＭである。
【００２１】阻害剤： 種々の試薬及び金属イオンの
濃度１ｍＭまたは０．１ｍＭでの本発明の酵素に対する
影響を表２に示す。表２から本発明の酵素は水銀イオ
ン、銀イオンにより強く阻害を受けることがわかる。
濃度１ｍＭまたは０．１ｍＭでの本発明の酵素に対する
影響を表２に示す。表２から本発明の酵素は水銀イオ
ン、銀イオンにより強く阻害を受けることがわかる。
【００２２】
【表２】
【００２３】
【実施例】以下、本発明を実施例によって更に具体的に
説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものでは
ない。
説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものでは
ない。
【００２４】なお、以下の実施例におけるシクロヘキサ
ンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素の活性測定
方法、及び酵素活性値の表示方法は以下の通りである。
ンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素の活性測定
方法、及び酵素活性値の表示方法は以下の通りである。
【００２５】〔シクロヘキサンカルボン酸フェニルエス
テル加水分解活性の測定方法〕 ２．０ｍＭセトラキサート溶液{in 0.1Mクエン 酸緩衝
液(pH6.0)）0.5ml、酵素溶液0.1ml、及び蒸留水0.4mlか
らなる溶液1.0mlをよく攪はん後、３７℃、１時間イン
キュベートし、反応液とした。この反応液に直ちに５０
%トリクロロ酢酸０．１ｍｌを添加し、氷冷下１５分間
静置後遠心分離操作をし、上清０．５５ｍｌを分取し
た。この除蛋白された上清０．５５ｍｌに０．５Ｍ酢酸
ナトリウム０．５ｍｌと蒸留水０．４５ｍｌを添加し攪
はんした後HPLC分析サンプルとした。またブランクとし
て酵素溶液を蒸留水に代えてまったく同じ操作をした。
HPLC分析カラムはShim-pack CLC-ODS（6.0mmφ×150m
m）（商品名：島津製作所社製）を使用した。またトラ
ネキサム酸の検出は蛍光検出法により行った。このHPLC
分析により測定された酵素溶液系のトラネキサム酸の濃
度（Ｅμmol/l）、ブランク系のトラネキサム酸の濃度
（Ｂμmol/l）から酵素反応により生成したトラネキサ
ム酸の濃度をＴμmol/lとするとＴμmol/l＝Ｅμmol/l
−Ｂμmol/lとなる。このトラネキサム酸の濃度より下
記計算式（１）により酵素活性値を算出した。
テル加水分解活性の測定方法〕 ２．０ｍＭセトラキサート溶液{in 0.1Mクエン 酸緩衝
液(pH6.0)）0.5ml、酵素溶液0.1ml、及び蒸留水0.4mlか
らなる溶液1.0mlをよく攪はん後、３７℃、１時間イン
キュベートし、反応液とした。この反応液に直ちに５０
%トリクロロ酢酸０．１ｍｌを添加し、氷冷下１５分間
静置後遠心分離操作をし、上清０．５５ｍｌを分取し
た。この除蛋白された上清０．５５ｍｌに０．５Ｍ酢酸
ナトリウム０．５ｍｌと蒸留水０．４５ｍｌを添加し攪
はんした後HPLC分析サンプルとした。またブランクとし
て酵素溶液を蒸留水に代えてまったく同じ操作をした。
HPLC分析カラムはShim-pack CLC-ODS（6.0mmφ×150m
m）（商品名：島津製作所社製）を使用した。またトラ
ネキサム酸の検出は蛍光検出法により行った。このHPLC
分析により測定された酵素溶液系のトラネキサム酸の濃
度（Ｅμmol/l）、ブランク系のトラネキサム酸の濃度
（Ｂμmol/l）から酵素反応により生成したトラネキサ
ム酸の濃度をＴμmol/lとするとＴμmol/l＝Ｅμmol/l
−Ｂμmol/lとなる。このトラネキサム酸の濃度より下
記計算式（１）により酵素活性値を算出した。
【００２６】〔酵素活性計算式〕 生成したトラネキサム酸の濃度をＴμmol/lとすると酵
素溶液1.0ml当りの酵素活性値（ｕ／ml）は、 酵素活性値＝（3／1000）×（1／60）×（1／0.1）×Ｔ （1） となる。ただし酵素活性単位ｕ（ユニット）は１分間当
り１μmolのトラネキサム酸を生成することの出来る酵
素量と定義した。
素溶液1.0ml当りの酵素活性値（ｕ／ml）は、 酵素活性値＝（3／1000）×（1／60）×（1／0.1）×Ｔ （1） となる。ただし酵素活性単位ｕ（ユニット）は１分間当
り１μmolのトラネキサム酸を生成することの出来る酵
素量と定義した。
【００２７】尚、トラネキサム酸定量用ＨＰＬＣの分析
条件は以下のようにした。
条件は以下のようにした。
【００２８】〔ＨＰＬＣ分析条件〕 １． 装置 1) 液クロ本体・・・Waters 600E 2) カラム恒温槽（50゜Ｃ）・・・島津CTO-6A 3) 反応液送液ポンプ・・・Waters 510 4) 蛍光検出器・・・島津 RF-535 5) レコーダ及びデータ処理・・・島津 C-R4A 6) オートサンプラー・・・Waters 700 7) 反応槽（50℃）・・・島津 CRB-6A 8) ＵＶ検出器・・・Waters 484。
【００２９】２． カラム・・・島津 Shim-pack CLC
-ODS（6.0mmφ×150mm）。
-ODS（6.0mmφ×150mm）。
【００３０】３． 移動相 Ｉ液 0.1M過塩素酸ナトリウム 10mMヘキサンスルホン酸ナトリウム （ｐＨ４．０） ＩＩ液 Ｉ液 25％ メタノール 75％ （ｐＨ３．０） Ｉ液とＩＩ液による濃度勾配溶出法。
【００３１】４． 反応液 Brij-35・・・0.4g 炭酸二ナトリウム・・・40.0g ホウ酸・・・13.4g 硫酸カリウム・・・18.4g オルソフタルアルデヒド／12mlエタノール・・・0.80g β-メルカプトエタノール・・・2.0ml （ｐＨ１０．５）。
【００３２】５． 流速・・・移動相：1.1ml/min
反応液：0.4ml/min。
反応液：0.4ml/min。
【００３３】実施例１ 1.0％ポリペプトン、0.5％酵母エキス、0.5％食塩、0.0
1％消泡剤から成る培地（pH7.2）1,000mｌを5ｌの三角
フラスコに入れ、120℃で15分間オートクレーブした
後、30℃下でこの培地にエシェリヒア・コリＮ−０００
２微工研菌寄第１３１９０号を植菌する。30℃で24時間
振とう培養を行った後この培養液を、あらかじめ上記と
同様の組成を有する培地170ｌを仕込みそして蒸気滅菌
をしたジャー・ファーメンターに植菌し本培養を行っ
た。
1％消泡剤から成る培地（pH7.2）1,000mｌを5ｌの三角
フラスコに入れ、120℃で15分間オートクレーブした
後、30℃下でこの培地にエシェリヒア・コリＮ−０００
２微工研菌寄第１３１９０号を植菌する。30℃で24時間
振とう培養を行った後この培養液を、あらかじめ上記と
同様の組成を有する培地170ｌを仕込みそして蒸気滅菌
をしたジャー・ファーメンターに植菌し本培養を行っ
た。
【００３４】22時間培養の後、培養物中のシクロヘキサ
ンカルボン酸フェニルエステル加水分解活性を測定した
結果、0.05ユニット/mｌ-培養物であった。
ンカルボン酸フェニルエステル加水分解活性を測定した
結果、0.05ユニット/mｌ-培養物であった。
【００３５】培養物を遠心分離機にかけて菌体を採取し
た。得られた菌体の100ｇ（湿菌体重量）を1ｌの0.01M
リン酸緩衝液（pH7.0）に懸濁し、その懸濁液をダイノ
ミル細胞破砕機に連続的に通過させて菌体破砕を行っ
た。その破砕液を遠心分離機を使用して遠心分離し、上
清液を得た。この上清液中のシクロヘキサンカルボン酸
フェニルエステル加水分解酵素の総活性は831ユニッ
ト、比活性は0.007ユニット/mg-タンパクであった。こ
の上清液を、あらかじめ 0.01Mのリン酸緩衝液（pH7.
2）にて平衡化したDE52イオン交換樹脂（商品名：ワッ
トマン社製）を充填したカラム（9.0ラ30cm）に負荷させ
た。カラムを2ｌの 0.01Mリン酸緩衝液（pH7.2）で充分
に洗浄後、食塩濃度が 0Mから0.3Mである直線濃度勾配
（総容量：16ｌ）にて吸着されたタンパク質を溶出せし
め、シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分
解活性画分を回収した。本活性画分中のシクロヘキサン
カルボン酸フェニルエステル加水分解酵素の総活性は、
795ユニット、比活性は0.09ユニット/mg-タンパクであ
った。
た。得られた菌体の100ｇ（湿菌体重量）を1ｌの0.01M
リン酸緩衝液（pH7.0）に懸濁し、その懸濁液をダイノ
ミル細胞破砕機に連続的に通過させて菌体破砕を行っ
た。その破砕液を遠心分離機を使用して遠心分離し、上
清液を得た。この上清液中のシクロヘキサンカルボン酸
フェニルエステル加水分解酵素の総活性は831ユニッ
ト、比活性は0.007ユニット/mg-タンパクであった。こ
の上清液を、あらかじめ 0.01Mのリン酸緩衝液（pH7.
2）にて平衡化したDE52イオン交換樹脂（商品名：ワッ
トマン社製）を充填したカラム（9.0ラ30cm）に負荷させ
た。カラムを2ｌの 0.01Mリン酸緩衝液（pH7.2）で充分
に洗浄後、食塩濃度が 0Mから0.3Mである直線濃度勾配
（総容量：16ｌ）にて吸着されたタンパク質を溶出せし
め、シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分
解活性画分を回収した。本活性画分中のシクロヘキサン
カルボン酸フェニルエステル加水分解酵素の総活性は、
795ユニット、比活性は0.09ユニット/mg-タンパクであ
った。
【００３６】この溶出液を限外濾過により脱塩濃縮後、
氷冷下飽和硫酸アンモニウム溶液をゆっくり混ぜながら
55％飽和硫酸アンモニウム溶液になるまで添加した。約
１時間静置後遠心分離操作をした。この上清を同様にさ
らに75％飽和硫酸アンモニウム溶液とした。約１時間静
置後遠心分離操作をした。この沈澱物に氷冷した0.01M
リン酸緩衝液（pH7.2）100mlを加え溶解した。この溶液
を限外濾過により脱塩後シクロヘキサンカルボン酸フェ
ニルエステル加水分解活性画分とした。本活性画分中の
シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵
素の総活性は、765ユニット、比活性は0.26ユニット/mg
-タンパクであった。
氷冷下飽和硫酸アンモニウム溶液をゆっくり混ぜながら
55％飽和硫酸アンモニウム溶液になるまで添加した。約
１時間静置後遠心分離操作をした。この上清を同様にさ
らに75％飽和硫酸アンモニウム溶液とした。約１時間静
置後遠心分離操作をした。この沈澱物に氷冷した0.01M
リン酸緩衝液（pH7.2）100mlを加え溶解した。この溶液
を限外濾過により脱塩後シクロヘキサンカルボン酸フェ
ニルエステル加水分解活性画分とした。本活性画分中の
シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵
素の総活性は、765ユニット、比活性は0.26ユニット/mg
-タンパクであった。
【００３７】次いであらかじめ0.01Mのリン酸緩衝液（p
H7.2）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール（商品名：東
ソー社製）を充填したカラム（3.2ラ28cm ）に通した。1
ｌの0.05Mの食塩を含むリン酸緩衝液 （pH7.2）でカラ
ムを洗浄後、食塩濃度が0.05Mから0.15Mである直線濃度
勾配（総容量：6ｌ）にて吸着されたタンパク質を溶出
せしめ、シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加
水分解活性画分を回収した。本活性画分中のシクロヘキ
サンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素の総活性
は、627ユニット、比活性は1.77ユニット/mg-タンパク
であった。
H7.2）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール（商品名：東
ソー社製）を充填したカラム（3.2ラ28cm ）に通した。1
ｌの0.05Mの食塩を含むリン酸緩衝液 （pH7.2）でカラ
ムを洗浄後、食塩濃度が0.05Mから0.15Mである直線濃度
勾配（総容量：6ｌ）にて吸着されたタンパク質を溶出
せしめ、シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加
水分解活性画分を回収した。本活性画分中のシクロヘキ
サンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素の総活性
は、627ユニット、比活性は1.77ユニット/mg-タンパク
であった。
【００３８】この活性画分を限外濾過装置を用いて、脱
塩及び濃縮した後、あらかじめ0.1Mの硫酸ナトリウムを
含有する0.05Mリン酸緩衝液（pH7.2）で平衡化したセフ
ァクリルＳ−400（商品名：ファルマシア社製）を充填
したカラム（2.2ラ120cm）に負荷しゲル濾過を行った。
シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解活
性画分を回収した。本活性画分中のシクロヘキサンカル
ボン酸フェニルエステル加水分解酵素の総活性は、561
ユニット、比活性は32.9ユニット/mg-タンパクであっ
た。
塩及び濃縮した後、あらかじめ0.1Mの硫酸ナトリウムを
含有する0.05Mリン酸緩衝液（pH7.2）で平衡化したセフ
ァクリルＳ−400（商品名：ファルマシア社製）を充填
したカラム（2.2ラ120cm）に負荷しゲル濾過を行った。
シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解活
性画分を回収した。本活性画分中のシクロヘキサンカル
ボン酸フェニルエステル加水分解酵素の総活性は、561
ユニット、比活性は32.9ユニット/mg-タンパクであっ
た。
【００３９】次いで限外濾過装置にて脱塩後、あらかじ
め0.01Mのリン酸緩衝液（pH7.2）で平衡化したＤＥＡＥ
−トヨパール（商品名：東ソー社製）を充填したカラム
（2.0ラ20cm）に通した。300mｌの0.05Mの食塩を含むリ
ン酸緩衝液（pH7.2）でカラムを洗浄後、食塩濃度が0.0
5Mから0.15Mである直線濃度勾配（総容量：2ｌ）にて吸
着されたタンパク質を溶出せしめ、シクロヘキサンカル
ボン酸フェニルエステル加水分解活性画分を回収して精
製酵素溶液を得た。この精製酵素溶液中のシクロヘキサ
ンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素の総活性は
412ユニット、比活性は91ユニット/mg-タンパクであっ
た。
め0.01Mのリン酸緩衝液（pH7.2）で平衡化したＤＥＡＥ
−トヨパール（商品名：東ソー社製）を充填したカラム
（2.0ラ20cm）に通した。300mｌの0.05Mの食塩を含むリ
ン酸緩衝液（pH7.2）でカラムを洗浄後、食塩濃度が0.0
5Mから0.15Mである直線濃度勾配（総容量：2ｌ）にて吸
着されたタンパク質を溶出せしめ、シクロヘキサンカル
ボン酸フェニルエステル加水分解活性画分を回収して精
製酵素溶液を得た。この精製酵素溶液中のシクロヘキサ
ンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素の総活性は
412ユニット、比活性は91ユニット/mg-タンパクであっ
た。
【００４０】こうして得られた酵素の純度をポリアクリ
ルアミド・ゲル電気泳動によって調べた結果、一本のバ
ンドのみが観察され、純粋なシクロヘキサンカルボン酸
フェニルエステル加水分解酵素であることが確認され
た。得られた精製酵素を使って本酵素の基質特異性、至
適ｐＨ、ｐＨ安定性、至適温度、温度安定性、分子量を
調べた。
ルアミド・ゲル電気泳動によって調べた結果、一本のバ
ンドのみが観察され、純粋なシクロヘキサンカルボン酸
フェニルエステル加水分解酵素であることが確認され
た。得られた精製酵素を使って本酵素の基質特異性、至
適ｐＨ、ｐＨ安定性、至適温度、温度安定性、分子量を
調べた。
【００４１】〔基質特異性〕 前記表１に示す各種基質を50mMクエン酸緩衝液に２mMに
なる様溶解した。この基質溶液0.9mlに対し0.1mlの酵素
液を添加し、攪拌後37℃５分間反応させた。その後の処
理は通常の酵素活性測定法と同様にした。但し各々の反
応に対しコントロールとして酵素液の代わりに蒸留水を
添加したものを用意し同様に操作した。反応後の分析は
通常のＨＰＬＣ分析とした。分析後酵素液系のトラネキ
サム酸またはヒドロキシフェニルプロピオン酸生成量か
ら蒸留水系のトラネキサム酸またはヒドロキシフェニル
プロピオン酸生成量を差引き酵素活性を計算した。その
時の結果をセトラキサートを基質とした場合の活性を10
0として相対活性で前出の表１に示した。
なる様溶解した。この基質溶液0.9mlに対し0.1mlの酵素
液を添加し、攪拌後37℃５分間反応させた。その後の処
理は通常の酵素活性測定法と同様にした。但し各々の反
応に対しコントロールとして酵素液の代わりに蒸留水を
添加したものを用意し同様に操作した。反応後の分析は
通常のＨＰＬＣ分析とした。分析後酵素液系のトラネキ
サム酸またはヒドロキシフェニルプロピオン酸生成量か
ら蒸留水系のトラネキサム酸またはヒドロキシフェニル
プロピオン酸生成量を差引き酵素活性を計算した。その
時の結果をセトラキサートを基質とした場合の活性を10
0として相対活性で前出の表１に示した。
【００４２】〔至適ｐＨ〕 精製酵素標品を蒸留水にて0.1u／ml程度まで希釈し、サ
ンプルとした。酵素反応のpHは次に示す緩衝液を使って
調製した。酵素反応は通常の方法により行った。但し反
応時間は30分とし、各々の反応に対しコントロールとし
て酵素液の代わりに蒸留水を添加したものを用意し同様
に操作した。反応後の分析は通常のＨＰＬＣ分析とし
た。分析後酵素液系のトラネキサム酸生成量から蒸留水
系のトラネキサム酸生成量を差引き酵素活性を計算し
た。
ンプルとした。酵素反応のpHは次に示す緩衝液を使って
調製した。酵素反応は通常の方法により行った。但し反
応時間は30分とし、各々の反応に対しコントロールとし
て酵素液の代わりに蒸留水を添加したものを用意し同様
に操作した。反応後の分析は通常のＨＰＬＣ分析とし
た。分析後酵素液系のトラネキサム酸生成量から蒸留水
系のトラネキサム酸生成量を差引き酵素活性を計算し
た。
【００４３】反応系に用いた各種緩衝液（全ての緩衝液
は0.1Mとした。） クエン酸緩衝液：pH2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,
6.5 燐酸緩衝液：pH：6.1,6.6,7.1,7.5,8.0 トリス緩衝液：7.4,8.0,8.5,9.0 グリシン緩衝液：8.3,8.6,9.0,9.4,9.7,10.9,11.8 この時の結果を図１に示した。
は0.1Mとした。） クエン酸緩衝液：pH2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,
6.5 燐酸緩衝液：pH：6.1,6.6,7.1,7.5,8.0 トリス緩衝液：7.4,8.0,8.5,9.0 グリシン緩衝液：8.3,8.6,9.0,9.4,9.7,10.9,11.8 この時の結果を図１に示した。
【００４４】〔ｐＨ安定性〕 精製酵素標品を各緩衝液中に一定量取り４℃、24時間静
置保存した。その後酵素の残存活性を通常の酵素活性測
定法で測った。但し反応時間は30分とした。
置保存した。その後酵素の残存活性を通常の酵素活性測
定法で測った。但し反応時間は30分とした。
【００４５】保存に用いた各種緩衝液（全ての緩衝液は
0.1Mとした。） クエン酸緩衝液：pH2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,
6.5 燐酸緩衝液：pH：6.1,6.6,7.1,7.5,8.0 トリス緩衝液：7.4,8.0,8.5,9.0 グリシン緩衝液：8.3,8.6,9.0,9.4,9.7,10.9,11.8 この時の結果を図２で示す。
0.1Mとした。） クエン酸緩衝液：pH2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,
6.5 燐酸緩衝液：pH：6.1,6.6,7.1,7.5,8.0 トリス緩衝液：7.4,8.0,8.5,9.0 グリシン緩衝液：8.3,8.6,9.0,9.4,9.7,10.9,11.8 この時の結果を図２で示す。
【００４６】〔至適温度〕 精製酵素標品を蒸留水にて0.1u／ml程度まで希釈し、サ
ンプルとした。酵素反応は通常の方法により行った。但
し反応温度は20、30、40、50、55、60、70、80、90℃で
それぞれ行った。また反応時間は５分とし、各々の反応
に対しコントロールとして酵素液の代わりに蒸留水を添
加したものを用意し同様に操作した。反応後の分析は通
常のＨＰＬＣ分析とした。分析後酵素液系のトラネキサ
ム酸生成量から蒸留水系のトラネキサム酸生成量を差引
き酵素活性を計算した。この時の結果を図３に示す。
ンプルとした。酵素反応は通常の方法により行った。但
し反応温度は20、30、40、50、55、60、70、80、90℃で
それぞれ行った。また反応時間は５分とし、各々の反応
に対しコントロールとして酵素液の代わりに蒸留水を添
加したものを用意し同様に操作した。反応後の分析は通
常のＨＰＬＣ分析とした。分析後酵素液系のトラネキサ
ム酸生成量から蒸留水系のトラネキサム酸生成量を差引
き酵素活性を計算した。この時の結果を図３に示す。
【００４７】〔温度安定性〕 酵素精製標品を10mM燐酸緩衝液（pH7.5）中で20、30、4
0、50、55、60、80、90℃に５分間保持した。その後直
ちに氷冷した。このサンプルを10mM燐酸緩衝液（pH7.
5）で50倍希釈し、残存酵素活性測定サンプルとした。
酵素活性の測定は通常の方法により行った。但し反応時
間は30分とした。この時の結果をに図４に示した。図か
ら本発明酵素の温度安定範囲は40℃以下で95％以上の残
存活性であった。しかし本発明酵素は50℃以上でも80％
以上の残存活性が見られた。このことは至適温度の実験
と合わせて考えると本酵素は40℃以上では一旦不活性型
になるが、冷却されることにより再び活性型になること
が出来ると考えられる。さらにこの現象を確認するため
次の実験を行った。先の実験と保持温度は同じ20〜90℃
とし、保持時間を５分から１時間と延ばした。さらに酵
素を溶解している緩衝液のpHをpH7.5からpH5.5、7.0、
8.0の３種に変えた。この時も本酵素は同じ現象がみら
れることがわかった。本発明の酵素は温度安定性につい
て特徴的な性質を有していることが判明した。
0、50、55、60、80、90℃に５分間保持した。その後直
ちに氷冷した。このサンプルを10mM燐酸緩衝液（pH7.
5）で50倍希釈し、残存酵素活性測定サンプルとした。
酵素活性の測定は通常の方法により行った。但し反応時
間は30分とした。この時の結果をに図４に示した。図か
ら本発明酵素の温度安定範囲は40℃以下で95％以上の残
存活性であった。しかし本発明酵素は50℃以上でも80％
以上の残存活性が見られた。このことは至適温度の実験
と合わせて考えると本酵素は40℃以上では一旦不活性型
になるが、冷却されることにより再び活性型になること
が出来ると考えられる。さらにこの現象を確認するため
次の実験を行った。先の実験と保持温度は同じ20〜90℃
とし、保持時間を５分から１時間と延ばした。さらに酵
素を溶解している緩衝液のpHをpH7.5からpH5.5、7.0、
8.0の３種に変えた。この時も本酵素は同じ現象がみら
れることがわかった。本発明の酵素は温度安定性につい
て特徴的な性質を有していることが判明した。
【００４８】〔分子量〕 ゲル濾過法による分子量の測定を行った。カラムはHPLC
用カラムTSK-gel G3000SWXLを使用した。移動相は50mM
燐酸緩衝液（pH7.1）、0.2M硫酸ナトリウムを使用し
た。流速は0.5ml／minとした。マーカー蛋白は図５に示
したものを使用した。ＨＰＬＣの検出はＵＶ280nmで行
い、また標品の溶出位置はその酵素活性の測定も併せて
行った。その結果を図５に示した。
用カラムTSK-gel G3000SWXLを使用した。移動相は50mM
燐酸緩衝液（pH7.1）、0.2M硫酸ナトリウムを使用し
た。流速は0.5ml／minとした。マーカー蛋白は図５に示
したものを使用した。ＨＰＬＣの検出はＵＶ280nmで行
い、また標品の溶出位置はその酵素活性の測定も併せて
行った。その結果を図５に示した。
【００４９】
【発明の効果】 本発明によれば、セトラキサート等の
フェノール性エステル類の加水分解或いは合成に好適に
使用できるシクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル
加水分解酵素を工業的に生産することが可能となる。
フェノール性エステル類の加水分解或いは合成に好適に
使用できるシクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル
加水分解酵素を工業的に生産することが可能となる。
【図１】 実施例１のシクロヘキサンカルボン酸フェニ
ルエステル加水分解酵素のpH活性曲線を示す図である。
ルエステル加水分解酵素のpH活性曲線を示す図である。
【図２】 同酵素のpH安定性を示す図である。
【図３】 同酵素の温度活性曲線を示す図である。
【図４】 同酵素の温度安定性を示す図である。
【図５】 同酵素の分子量を示す図である。（●：実施
例１の酵素、○：マーカータンパク）
例１の酵素、○：マーカータンパク）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 C12N 1/00 - 1/38 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】 エシェリヒア属に属するシクロヘキサン
カルボン酸フェニルエステル加水分解酵素生産能を有す
る微生物を培養し、その培養物から下記理化学的性質を
有するシクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水
分解酵素を採取することを特徴とするシクロヘキサンカ
ルボン酸フェニルエステル加水分解酵素の製造方法。 〔理化学的性質〕 作用： 水の存在下で、１モルのセトラキサートか
ら１モルのトラネキサム酸と１モルのヒドロキシフェニ
ルプロピオン酸を生成せしめる。 基質特異性： Ｎ−アセチルセトラキサート、トラ
ネキサム酸フェニル、セトラキサート、４−（２−カル
ボキシエチル）フェニルシクロヘキサンカルボキシレー
ト、トラネキサム酸ヘキシルに対して作用し、トラネキ
サム酸ミリスチル、トラネキサム酸メチルに対しては作
用を示さない。 至適ｐＨ： ｐＨ５．５〜６．５ ｐＨ安定性： ４℃下にて２４時間保存したとき、
ｐＨ５．０〜９．０において８０％以上の残存活性を有
する。 至適温度： ０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）において４０℃ 温度安定性： ０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）において、各温度に５分間保持した時、４０℃以下
で９５％以上の残存活性を有する。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27749792A JP3118331B2 (ja) | 1992-10-15 | 1992-10-15 | シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27749792A JP3118331B2 (ja) | 1992-10-15 | 1992-10-15 | シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素の製造方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000252654A Division JP3471301B2 (ja) | 2000-08-23 | 2000-08-23 | シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06125775A JPH06125775A (ja) | 1994-05-10 |
| JP3118331B2 true JP3118331B2 (ja) | 2000-12-18 |
Family
ID=17584425
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27749792A Expired - Fee Related JP3118331B2 (ja) | 1992-10-15 | 1992-10-15 | シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3118331B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU9733698A (en) * | 1997-10-24 | 1999-05-17 | Institute Of Materia Medica Chinese Academy Of Medical Sciences | Process for making and uses of cordyceps fermentation products |
-
1992
- 1992-10-15 JP JP27749792A patent/JP3118331B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06125775A (ja) | 1994-05-10 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |