JPS6332492A - 酵素法によるマンデル酸の左旋性光学活性体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、ペニシリン系やセファロスポリ系抗生物質又
はエフェドリン等の交感神経作用薬等の医薬品の原料も
しくは合成中部体として有用なマンデル酸の左旋性光学
活性体〔惟）−左旋性マンデル酸〕（以下、単に左旋性
マンデル酸という）を酵素を利用して工業的に有利に製
造する方法に関するものである。

〔従来技術〕

左旋性のマンデル酸の製造法としては、ラセミ体の分別
結晶による光学分割法、クロマトグラフィーによる光′
学分割法、有機化学的な不斉合成法等が知られているが
、これらの方法は、操作が煩雑であるとか、収率が低い
、生成物の高光純度が低い等の欠点を有している。

一方、左旋性のマンデル酸を得るために、ベンゾイルギ
酸を微生物菌体を用いて不斉還元する方法（特開昭５７
−１９８０９６号公報）も知られている。二分や培地成
分による製品の汚染・純度低下の問題等が残る。

〔目　　　的〕

そこで１本発明者らは、微生物菌体を用いずしこ、微生
物から取出した酵素を用いてベンゾイルギ酸を還元して
左旋性マンデル酸を製造すべく鋭意研究を重ねた結果、
ストレプトコックス属に属する微生物から取出した酵素
がその目的に適合することを見出し、本発明を完成する
に到った。

、〔構　　成〕 即ち１本発明によれば、ストレプトコックス属細菌の菌
体から抽出したベンゾイルギ酸還元酵素の存在下、還元
型のニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドを用い
てベンゾイルギ酸を還元することを特徴とするマンデル
酸の左旋性光学活性体の製造方法が提供される。

本発明は、ストレプトコックス属に属し、ベンゾイルギ
酸還元酵素生産能を有する細菌に含まれているベンゾイ
ルギ酸還元酵素（以下、単に酵素Ａという）を抽出し、
この酵素Ａの存在下、還元型のニコチンアミド・アデニ
ン・ジムクレオチド（ＮＡＤＨ）を還元剤として用いて
次式の反応を触媒させて左旋性マンデル酸を合成するこ
とを骨子とするものである。

ベンゾイルギ酸　　　　　　　　　　　左旋性マンデル
酸本発明の特徴は次の通りである。即ち、本発明によれ
ば純化した酵素を使用しているため一他の酵素の作用に
よる（＋）−異性体の副生がなく生成−する左旋性マン
デル酸は、完全に１００％の光学純度ｍ− ゛−混合物のガスクロマトグラフィーによる分析では反
応条件によればほぼ１００％の変換収率が達成されてい
ることが明らかにされているほか、結晶化の収率も通例
８５％以上であり、９５％近い値に達する場合もある。

本発明における生成物は反応に無関係な菌体成分や培地
成分によって汚染されることがなく、有機溶媒による抽
出物を濃縮後ただ再結晶するのみで容易に純品とするこ
とができる。さらに、反応液として適当な緩衝液を使用
すれば、ＮＡＤ＋のＮＡＤＨへの再生系を共存させると
いう実際の使用条件下においては、反応液のＰＨ変動は
ほとんどなく、ｐＨの維持・調節のためのめんどうな操
作を必要としない。

本発明を実施するにあたっては次の３点につぃて考慮し
なければならない、（１）ベンゾイルギ酸還元酵素、（
２）　ＮＡＤ）Ｉ再生システム、及び（３）−反応の実
施条件の３つである。まず（１）の゛ベンゾイルギ酸還
元酵素はストレプトコックス属の細菌の菌体を破壊し抽
出することによって調製する。このために用いる菌株と
して、例えばストレプトコックス　ファエカリス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｅｓ）が挙げら
れる。培地及び培養条件としては菌体の増殖が良く、目
的の酵素活性が高いのであればどのようなものでもよく
、例えば、トマトジュース培地を用いて３０℃で１５〜
２５時間振どう培養するなどの方法が挙げられる。集菌
した菌体の破壊には超音波処理など通常の方法を用いれ
ばよく、このようにして可溶化された目的酵素を精製す
るためには、アフィニティークロマトグラフィーやイオ
ン交換クロマトグラフィーなど通常の方法を用いればよ
い。この精製は、必らずしも目的酵素を単一の蛋白質と
して単離するほどに行うことを必要としない、普通には
、菌体に由来する低分子成分、多糖類、核酸及びプロテ
アーゼやＮＡＤＨオキシダーゼなどの妨害作用をなす酵
素を除いて、比活性を１０００／ｍｇ程度に上昇させた
ものでも十分である。−二のためには例えば色素結合樹
脂によるアフィニティクロマトグラフィーが効果的であ
る。しがし不発れ以上である場合には必要ない。しかし
、ＮＡＤＨのコストの点からそのような使用法は実際に
はありえず１反応産物の酸化型ＮＡＤ（ＮＡＤ”″）を
その場で還元してＮＡＤＨに再生するようにして使用し
なければならない。このためにＮ　Ａ　Ｄ　Ｈ再生シス
テムが必要である。このようなシステムとしては、亜ニ
チオン酸ナトリウムによる化学的な還元システム、電解
還元を利用するシステム、アルコール脱水素酵素、グル
コース脱水素酵素又はギ酸脱水素酵素などの脱水素酵素
を利用するシステムなどがあり、場合に応じて適当なシ
ステムを使用すればよい。最後に、（３）の実施条件に
ついて説明する。まず緩衝液を選定するが、中性付近で
通常用いられるものならどのようなものでもよく、例え
ばリン酸緩衝液や１リス・塩酸緩衝液などが挙げられる
。舜衝　、液の濃度は数１から２〜３００ｍＭの範囲で
適当に選べばよい。これよりも高濃度であってもさしつ
かえない。ｐＨは４から８の間の適当な値とする。どの
値にするかは、実施にあたって要求される反応速度と酵
素の安定性及びＮＡＤＨ再生システムのそのｐＨに対す
る適合性を考慮して決定する。本発明に用いるベンゾイ
ルギ酸還元酵素の至適ｐＨは４．５付近であり、また加
熱に対して最も安定となるＰＨは５．８〜６．０である
。しかしＮＡＤＨが酸性において不安定であることを考
えると、あまりｐＨを低くすることは好ましくない＝こ
の緩衝液にベンゾイルギ酸をナトリウム塩やカリウム塩
など適当な塩の形として溶解させる。その濃度は、ミカ
エリス定数（３０℃、　ｐＨ７，５で３．３ｍＭ）の１
０倍程度（約３０ｍＭないしは０．５％）から１００倍
程度（約３００ｍＭないし５％）とすることが実際的で
ある。もちろんこの範囲以上でも以下でもさしつかえな
い。ＮＡＤＨ（又はＮＡＤ”）の濃度は使用するＮＡＤ
Ｈ再生システムの活性強度や安定性及び全反応速度とし
て要求される反応速度等を考慮して適当に決定すればよ
いが、普通には、−クンゾイルギ酸還元酵素におけるミ
カエリス定数（３０’Ｃ，ｐＨ７，５で３５μＭ）の１
０〜１００倍程度の濃程度すれば十分である。もちろん
これよりもはるかに低い値にして１回転数（ターンオー
バーナンバー）を向至さ妊−二ともさしつかえない０次
にＮＡＤＨ再生システムに必要な試薬又は基質を反応液
に添加する。

例えばアルコール説水素酵素を再生システムに使用する
場合には、その酵素の基質であるエタノールを添加する
。濃度としては、原料のベンゾイルギ酸の濃度以上であ
って、かつ再生反応が円滑に進行するような濃度とする
。なお、ベンゾイルギ酸と再生反応用基質を反応液に添
加するにあたっては１反応開始前に一度に全量を添加し
てもよく、また反応の進行に伴って逐次回分添加するよ
うにしてもよい、このようにして原料のベンゾイルギ酸
、ＮＡＤＨ（又はＮＡＤ”）及び再生反応用の試薬又は
基質を溶解させた反応液の準備ができたら、酵素を添加
して反応を開始する。その前に安定化剤として０．１〜
２ｍＭ程度のメルカプトエタノール及び／又ｃ＊ｏ、ｏ
ｓ％程度の牛血溝やアルブミンを添加し又おくことが望
ましい場合がある。またメルカプトエタノールの代りに
ジチオスレイトールを用いてもよい、ベンゾイルギ酸還
元酵素及び再生反応を酵素法で行う場合のその酵素のそ
れぞれの使用量は、要求される反応速度に応じて適当に
決めればよい。

なお、基質、酵素の混合順序は上の通りである必要はな
く、場合に応じて適当に行えばよい。反応温度の上限は
４０℃付近とする。これより高温だとベンゾイルギ酸還
元酵素の失活がすみやかである。

通常は３０℃前後で反応を行うとよい。反応が完結する
までに要する時間は用いた酵素量によって違ってくるこ
とは当然である。反応終了後生成物の左旋性マンデル酸
を単離するのには、有機溶媒抽出など通常の方法を応用
すればよい。例えば、反応液を希塩酸や希硫酸などでＰ
）１２〜１の酸性とし、次で食塩などの塩を飽和濃度に
まで溶がしこんだ酢酸エチルやエーテルなどで抽出を行
うと、反応液中のマンデル酸はほぼ定量的に回収される
。有機層を分は取り、溶媒を留出した残渣を熱したベン
ゼンなどに溶解させ、必要があれば活性基処理を施した
上で熱濾過を行い、濾液を冷却すれば左旋性マンデル酸
の美麗な板状晶を得る。

〔実施例〕

茨に実施例について本発明をさらに詳細に説明する。。

実施例１ ストレプトコックスファエカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ　ＩＦＯ１２９６４）をトマ
トジュース・麦芽エキス・ＣｏＳＯ４の培地で通気撹拌
培養した。３０℃で２４時間培養後、集菌し、菌体を超
音波処理してベンゾイルギ酸還元酵素を抽出した。これ
をＭａｔｒｅｘ　ＲｅｄＡ樹脂を充填したカラムによる
アフィニティクロマトグラフィーと、ＤＥＡＥ−セファ
ローズカラムによるイオン交換クロマトグラフィーを順
次行って比活性９１１Ｕ／ｍｇの標品を得た。このもの
の一部（６７Ｕ）をとり、０．５１の牛血清アルブミン
と２ｍＭのメルカプトエタノールを含む１５ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ６，３）の１５ｍｆｌに溶解させておいた
。一方、　Ｉｇのペンゾイルギ酸と０，２６ｇＮａＯＨ
１及び３．１ｍＱのエタノールを０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，５）の２０ｍ　Ｑと混和して、ｌＮＮａＯＨ
にてｐＨを７．５に調節した。上記ｐ）１７．５のリン
酸緩衝液で約１００ｍ　Ｑに希釈後、２５０ｍｇのＮＡ
ＤＨ１１５ｍＱの上記酵素液、０．３３３ｍΩの酵母ア
ルコール脱水素酵素懸濁液（３５０Ｕ、ベーリンガー社
製）及びＩＭのメルカプトエタノール水溶液０．２６ｍ
Ωを加え、最後に上記リン酸緩衝液（ｐＨ７，５，０，
１Ｍ）で全量を１３３ｍｇとした。トルエン０．６ｍＱ
を加え密栓して３０℃に２日放置した。６ＮＨＣＱの５
ｍＱを加えてｐＨを２以下とし、次で塩化ナトリウムを
飽和になるまで溶解させた。これを２００ｍ　９　、２
００＋ａ　Ｑ及び１００ｍ　ｆｌの酢酸エチルで３回抽
出した。抽出時に析出した不溶分はセライトを濾過助剤
として用いて濾去した。有機層を合せ、硫酸ナトリウム
上で一夜乾燥した。

硫酸ナトリウムを濾別し、溶媒を減圧留去して得られた
結晶性残渣を沸とうベンゼンの約５０ｍ　Ｑにとかした
。少量の活性炭を加えて熱時に濾過し。

濾液を室温に放置しておくと７９０１１Ｉｇの板状晶を
与えた。母液を濃縮してさらに６４ｍｇの結晶を得た。

総数率８４％、　ｍｐ（１３４〜１３５℃）とＩＲスペ
クトルはアルドリッチ社から購入した（幻−（−）−マ
ンデル酸の標準品のそれに一致した。また比旋光度はＣ
ａ）：”＝−１４９°（Ｃ＝１．０、水）’ｔ−ア４Ｊ
、標準品＋７）　比旋光度に一致した。さらに光学純度
を精密に決定するために、サンプルの少量をジアゾメタ
ンでメチル化し、次で（Ｒ）−（＋）−メトキシドリフ
ルオロフェニルアセチルクロライドでジアステレオメリ
ックなＭＴＰＡエステルとしてガスクロマトグラフィー
で分析した（カラム：化学結合型０ｖ−１キヤピラリー
カラム、０，２５ｍｍＸ２５ｍ：キャリャーガス：ヘリ
ウム、入口圧：１．４ｋｇ／ａａ、入口流速：３０ｍ　
Ｑ　／ｍｉｎ。

カラム温度＝１７５℃；保存時間：尺−エナンチオマー
について１４．７０分、ジ−エナンチオマーについて、
１５．４５分）。その結果、本例において合成されたマ
ンデル酸は１００％旦−エナンチオマーから成ることを
確認した。

実施例２ １ｇのベンゾイルギ酸と１．５ｇのギ酸を０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐ！（７，５）の２Ｏｒａ　ｍと混和し、等
量のＮａＯＨを加えて中和した。上記緩衝液で約Ｌｏｏ
ｍΩに希釈後、２５（ｈａｇ＋７）ＮＡＩ）Ｈ１６７０
のベンゾイルギ酸還元酵素ヲ含む１５＋ａＭリン酸緩衝
液の１５＋＋＋Ω（ｐＨ６，３；酵素の他に０．５％の
牛血清アルブミンと２＋ａＭのメルカプトエタノールを
含む）、１４０ｍｇのギ酸脱水素酵素凍結乾燥物（８０
Ｕ、ベーリンガー社製）及びＩＭのメルカプトエタノー
ル水溶液の０．２６＋＋＋Ｑを加え、最後に上記０．１
Ｍリン酸緩衝液で全量を１３３ｍ１２とした。トルエン
０．６ｗＱを加えて密栓し、３０℃に２日間保った。

生成したマンデル酸を実施例１と同様にして抽出して結
晶化を行い（活性炭処理ははぶいた）、総計９４０ｍｇ
の板状晶を得た（収率９３％）、　ｍｐ１３３〜１３４
℃。

ＩＲスペクトルと比旋光度（〔α〕も’　＝−１５０°
（Ｃ＝１．１゜水））は標準品のデータに一致した。ま
た実施例１と同様にして１００％尺−エナンチオマーか
ら成ることを確認した。

実施例３ １ｇのベンゾイルギ酸を約５ｍＱの水にとかし、２ＮＮ
ａＯＨで中和した。　０．２Ｍのグルコース、　０．２
ＭのＮａＣ０，２ｍＭのメルカプトエタノール、及び０
．０５％の牛血清アルブミンを含む０．１Ｍリン酸緩衝
液（ＰＨ７，５）の１６０ｍｇを加えた。これにＮＡ［
ｌＨの２５０ＩＩＩＫを添加し、−次で８８０のグルコ
ース説水素酵素（天野製薬製）及び６４υのベンゾイル
ギ酸脱水素酵素を少量の緩衝液溶液として添加した。よ
く撹拌して均一溶液とした後。

トルエン０．８ｍＱを加えて密栓し、３０℃に２４時間
放置した。生成したマンデル酸を実施例１と同様にして
抽出して結晶化を行い、総計９０２ｍｇの板状晶　、を
得た（収率８９％）、　ｍｐ１３２〜１３４℃、　（α
）：’＝−１４９”（Ｃ＝１．０、水）。

実施例４ ベンゾイルギ酸の２．５ｇとギ酸の２．３ｇを２ｍＭの
メルカプトエタノールを含む１５ｍＭのリン酸緩衝液（
Ｐ）１６．３）の約２０ｍ　Ｑと混和し１次でＮａＯＨ
の約２．７ｇを加えて中和した。ベンゾイルギ酸還元酵
素５６０．０．５％牛血清アルブミン及び２１メルカプ
トエタノールを含む上記リン酸緩衝液の２１ｍ　Ｑを加
えた。

ｌＮＮａＯＨでＰＨ７，５に調整し、　ＮＡＤＨ２５０
ｍｇとギ酸脱水素酵素の凍結乾燥粉末７０ｍｇ　（８０
０、ベーリンガー社製）を加え均一溶液とした。全液量
は４５ｍ　Ｑとなった。

トルエン１ｍＡを添加し、栓をして３０℃に４２時間保
った。６ＮＨＣＱ約２．５＋＋＋ｆｌを加えて、ｐ）ｌ
＜２とし、−ＮａＣＱを飽和になるように溶かし、酢酸
エチルの１５０ｍ１２．１５０ｍ！及び１００ｍ　Ｑで
３回抽出した。有機層を合し、実施例１と同様に処理、
結晶化させて、左旋性マンデル酸の板状晶２．３０ｇを
得た。収率９１％。

ａｐ１３３℃、　〔ａ　１７＝１５０−５°（Ｃ＝１．
０４、水）。

〔効　　果〕

以上のように、本発明によれば、ベンゾイルギ酸を原料
とし左旋性マンデル酸を光学純度１０吋でかつ高収率で
製造することができる。

特許出願人　工業技術院長　　　飯　塚　幸　三指定代
理人　工業技術院微生物工業技術研究所長佐藤昭雄

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ストレプトコックス属細菌の菌体から抽出したベ
   ンゾイルギ酸還元酵素の存在下、還元型のニコチンアミ
   ド・アデニン・ジヌクレオチドを用いてベンゾイルギ酸
   を還元することを特徴とするマンデル酸の左旋性光学活
   性体の製造方法。