JPH047677B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、ぺニシリン系やセフアロスポリ系抗
生物質又はエフエドリン等の交感神経作用薬等の
医薬品の原料もしくは合成中間体として有用なマ
ンデル酸の左旋性光学活性体〔（Ｒ−左旋性マン
デル酸〕（以下、単に左旋性マンデル酸という）
を酵素を利用して工学的に有利に製造する方法に
関するものである。

〔従来技術〕

左旋性のマンデル酸の製造法としては、ラセミ
体の分別結晶による光学分割法、クロマトグラフ
イーによる光学分割法、有機化学的な不斉合成法
等が知られているが、これらの方法は、操作が煩
雑であるとか、収率が低い、生成物の高光純度が
低い等の欠点を有している。

一方、左旋性のマンデル酸を得るために、ベン
ゾイルギ酸を微生物菌体を用いて不斉還元する方
法（特開昭57−198096号公報）も知られている。
この方法によれば、前記の公知方法の欠点は除去
されるものの、微生物のプロテアーゼによる自己
消化のための活性低下が避けられず、また菌体内
成分や培地成分による製品の汚染・純度低下の問
題等が残る。

〔目的〕

そこで、本発明者らは、微生物菌体を用いず
に、微生物から取出した酵素を用いてベンゾイル
ギ酸を還元して左旋性マンデル酸を製造すべく鋭
意研究を重ねた結果、ストレプトコツクス属に属
する微生物から取出した酵素がその目的に適合す
ることを見出し、本発明を完成するに到つた。

〔構成〕

即ち、本発明によれば、ストレプトコツクス属
細菌の菌体から抽出したベンゾイルギ酸還元酵素
の存在下、還元型のニコチンアミド・アデニン・
ジヌクレオチドを用いてベンゾイルギ酸を還元す
ることを特徴とするマンデル酸の左旋性光学活性
体の製造方法が提供される。

本発明は、ストレプトコツクス属に属し、ベン
ゾイルギ酸還元酵素生産能を有する細菌に含まれ
ているベンゾイルギ酸還元酵素（以下、単に酵素
Ａという）を抽出し、この酵素Ａの存在下、還元
型のニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド
（NADH）を還元剤として用いて次式の反応を触
媒させて左旋性マンデル酸を合成することを骨子
とするものである。

本発明の特徴は次の通りである。即ち、本発明
によれば純化した酵素を使用ているため、他の酵
素の作用による（＋）−異性体の副生がなく生成
する左旋性マンデル酸は、完全に100％の光学純
度を有する。また副反応や代謝による基質や生成
物の消費がないから、反応収率は極めて高く、反
応混合物のガスクロマトグラフイーによる分析で
は反応条件によればほぼ100％の変換収率が達成
されていることが明らかにされているほか、結晶
化の収率も通例85％以上であり、95％近い値に達
する場合もある。本発明における生成物は反応に
無関係な菌体成分や培地成分によつて汚染される
ことがなく、有機溶媒による抽出物を濃縮後ただ
再結晶するのみで容易に純品とすることができ
る。さらに、反応液として適当な緩衝液を使用す
れば、NAD⁺のNADHへの再生系を共存させる
という実際の使用条件下においては、反応液のPH
変動はほとんどなく、PHの維持・調節のためのめ
んどうな操作を必要としない。

本発明を実施するにあたつては次の３点につい
て考慮しなければならない。(1)ベンゾイルギ酸還
元酵素、(2)NADH再システム、及び(3)反応の実
施条件の３つである。まず(1)のベンゾイルギ酸還
元酵素はストレプトコツクス属の細菌の菌体を破
壊し抽出することによつて調製する。このために
用いる菌株として、例えばストレプトコツクス
フアエカリス（Streotococcus faecales）が挙げ
られる。培地及び培養条件としては菌体の増殖が
良く、目的の酵素活性が高いのであればどのよう
なものでもよく、例えば、トマトジユース培地を
用いて30℃で15〜25時間振とう培養するなどの方
法が挙げられる。集菌した菌体の破壊には超音波
処理など通常の方法を用いればよく、このように
して可溶化された目的酵素を精製するためには、
アフイニテイークロマトグラフイーやイオン交換
クロマトグラフイーなど通常の方法を用いればよ
い。この精製は、必らずしも目的酵素を単一の蛋
白質として単離するほどに行うことを必要としな
い。普通には、菌体に由来する低分子成分、多糖
類、核酸及びプロテアーゼやNADHオキシダー
ゼなどの妨害作用をなす酵素を除いて、比活性を
100U／mg程度に上昇させたものでも十分である。
このためには例えば色素結合樹脂によるアフイニ
テイクロマトグラフイーが効果的である。しかし
本発明は、これらの記述によつて何ら限定される
ものではない。次に(2)のNADH再生システムは、
ベンゾイルギ酸に対するNADHの使用量が等モ
ル又はそれ以上である場合には必要ない。しか
し、NADHのコストの点からそのような使用法
は実際にはありず、反応産物の酸化型NAD
（NAD⁺）をその場で還元してNADHに再生する
ようにして使用しなければならない。このために
NADH再生システムが必要である。このような
システムとしては、亜ニチオン酸ナトリウムによ
る化学的に還元システム、電解還元を利用するシ
ステム、アルコール脱水素酵素、グルコース脱水
素酵素又はギ酸脱水素酵素などの脱水素酵素を利
用するシステムなどがあり、場合の応じて適当な
システムを使用すればよい。最後に、(3)の実施条
件について説明する。まず緩衝液を選定するが、
中性付近で通常用いられるものならどのようなも
のでもよく、例えばリン酸緩衝液やトリス・塩酸
緩衝液などが挙げられる。緩衝液の濃度は数mM
から２〜300mMの範囲で適当に選べばよい。こ
れよりも高濃度であつてもさしつかえない。PHは
４から８の間の適当な値とする。どの値にするか
は、実施にあたつて要求される反応速度と酵素の
安定性及びNADH再生システムのそのPHに対す
る適合性を考慮して決定する。本発明に用いるベ
ンゾイルギ酸還元酵素の至適PHは4.5付近であり、
また加熱に対して最も安定となるPHは5.8〜6.0で
ある。しかしNADHが酸性において不安定であ
ることを考えると、あまりPHを低くすることは好
ましくない。この緩衝液にベンゾイルギ酸をナト
リウム塩やカリウム塩など適当な塩の形として溶
解させる。その濃度は、ミカエリス定数（30℃、
PH7.5で3.3mM）の10倍程度（約30mMないしは
0.5％）から100倍程度（約300mMないし５％）
とすることが実際的である。もちろんこの範囲以
上でも以下でもさしつかえない。NADH（又は
NAD⁺）の濃度は使用するNADH再生システム
の活性強度や安定性及び全反応速度として要求さ
れる反応速度等を考慮して適当に決定すればよい
が、普通には、ベンゾイルギ酸還元酵素における
ミカエリス定数（30℃、PH7.5で35μM）の10〜
100倍程度の濃度とすれば十分である。もちろん
これよりもはるかに低い値にして、回転数（ター
ンオーバーナンバー）を向上させることもさしつ
かえない。次にNADH再生システムに必要な試
薬又は基質を反応液に添加する。例えばアルコー
ル脱水素酵素を再生システムに使用する場合に
は、その酵素の基質であるエタノールを添加す
る。濃度としては、原料のベンゾイルギ酸の濃度
以上であつて、かつ再生反応が円滑に進行するよ
うな濃度とする。なお、ベンゾイルギ酸と再生反
応用基質を反応液に添加するにあたつては、反応
開始前に一度に全量を添加してもよく、また反応
の進行に伴つて逐次回分添加するようにしてもよ
い。このようにして原料のベンゾイルギ酸、
NADH（又はNAD⁺）及び再生反応用の試薬又は
基質を溶解させた反応液の準備ができたら、酵素
を添加して反応を開始する。その前に安定化剤と
して0.1〜2mM程度のメルカプトエタノール及
び／又は0.05％程度の牛血清やアルブミンを添加
しておくことが望ましい場合がある。またメルカ
プトエタノールの代りにジチオスレイトールを用
いてもよい。ベンゾイルギ酸還元酵素及び再生反
応を酵素法で行う場合のその酵素のそれぞれの使
用量は、要求される反応速度に応じて適当に決め
ればよい。なお、基質、酵素の混合順序は上の通
りである必要はなく、場合に応じて適当に行えば
よい。反応温度の上限は40℃付近とする。これよ
り高温だとベンゾイルギ酸還元酵素の失活がすみ
やかである。通常は30℃前後で反応を行うとよ
い。反応が完結するまでに要する時間は用いた酵
素量によつて違つてくることは当然である。反応
終了後生成物の左旋性マンデル酸を単離するのに
は、有機溶媒抽出など通常の方法を応用すればよ
い。例えば、反応液を希塩酸や希硫酸などでPH２
〜１の酸性とし、次で食塩などの塩を飽和濃度に
まで溶かしこんだ酢酸エチルやエーテルなどで抽
出を行うと、反応液中のマンデル酸はほぼ定量的
に回収される。有機層を分け取り、溶媒を留出し
た残渣を熱したベンゼンなどに溶解させ、必要が
あれば活性炭処理を施した上で熱濾過を行い、濾
液を冷却すれば左旋性マンデル酸の美麗な板状晶
を得る。

〔実施例〕

次に実施例について本発明をさらに詳細に説明
する。

実施例 １ ストレプトコツクス フアエカリス
（Streptococcus faecalis IFO 12964）をトマト
ジュース・麦芽エキス・CoSO₄の培地で通気攪拌
培養した。30℃で24時間培養後、集菌し、菌体を
超音波処理してベンゾイルギ酸還元酵素を抽出し
た。これをMatrex RedA樹脂を充填したカラム
によるアフイニテイクロマトグラフイーと、
DEAE−セフアローズカラムによるイオン交換ク
ロマトグラフイーを順次行つて比活性911U／mg
の標品を得た。このものの一部（67U）をとり、
0.5％の牛血清アルブミンと2mMのメルカプトエ
タノールを含む15mMリン酸緩衝液（PH6.3）の
15mlに溶解させておいた。一方、１ｇのベンゾイ
ルギ酸と0.26ｇNaOH、及び3.9mlのエタノール
を0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）の20mlと混和し
て、1NNaOHにてPHを7.5にＩ調節した。上記PH
7.5のリン酸緩衝液で約100mlに希釈後、250mgの
NADH、15mlの上記酵素液、0.333mlの酵母アル
コール脱水素酵素懸濁液（350U、ベーリンガー
社製）及び1Mのメルカプトエタノール水溶液
0.26mlを加え、最後に上記リン酸緩衝液（PH7.5、
0.1M）で全量を133mlとした。トルエン0.6mlを
加え密栓して30℃に２日放置した。6NHClの５
mlを加えてPHを２以下とし、次で塩化ナトリウム
を飽和になるまで溶解させた。これを200ml、200
ml及び100mlの酢酸エチルで３回抽出した。抽出
時に析出した不溶分はセライトを濾過助剤として
用いて濾去した。有機層を合せ、硫酸ナトリウム
上で一夜乾燥した。硫酸ナトリウムを濾別し、溶
媒を減圧留去して得られた結晶製残渣を沸とうベ
ンゼンの約50mlにとかした。少量の活性炭を加え
て熱時に濾過し、濾液を室温に放置しておくと
790mgの板状晶を与えた。母液を濃縮してさらに
64mgの結晶を得た。総収率84％。mp（134〜135
℃）とIRスペクトルはアルドリツチ社から購入
した（Ｒ）−（−）−マンデル酸の標準品のそれに
一致した。また比旋光度はD²⁵ _D＝−149°（Ｃ＝1.0、
水）であり、標準品の比旋光度に一致した。さら
に光学純度を精密に決定するために、サンプルの
少量をジアゾメタンでメチル化し、次で（Ｒ）−
（＋）−メトキシトリフルオロフエニルアセチルク
ロライドでジアステレオメリツクなMTPAエス
テルとしてガスクロマトグラフイーで分析した
（カラム：化学結合型OV−１キヤピラリーカラ
ム、0.25mm×25ｍ；キヤリヤ−ガス：ヘリウム、
入口圧：1.4Kg／cm²、入口流速：80ml／min、カ
ラム温度：175℃；保存時間：Ｒ−エナンチオマ
ーについて14.70分、Ｓ−エナンチオマーについ
て、15.45分）。その結果、本例において合成され
たマンデル酸は100％Ｒ−エナンチオマーから成
ることを確認した。

実施例 ２ １ｇのベンゾイルギ酸と1.5ｇのギ酸を0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH7.5）の20mlと混和し、等量の
NaOHを加えて中和した。上記緩衝液で約100ml
に希釈後、250mgのNADH、67Uのベンゾイルギ
酸還元酵素を含む15mMリン酸緩衝液の15ml８PH
6.3；酵素の他に0.5％の牛血清アルブミンと2mM
のメルカプトエタノールを含む）、140mgのギ酸脱
水素酵素凍結乾燥物（80U、ベーリンガー社製）
及び1Mのメルカプトエタノール水溶液の0.26ml
を加え、最後に上記0.1Mリン酸緩衝液で全量を
133mlとした。トルエン0.6mlを加えて密栓し、30
℃に２日間保つた。生成したマンデル酸を実施例
１と同様にして抽出して結晶化を行い（活性炭処
理ははぶいた）、総計940mgの板状晶を得た（収率
93％）。mp133〜134℃。IRスペクトルと比旋光
度｛〔α〕D²⁵ _D＝−150°（Ｃ＝1.1、水）｝は標準品
のデータに一致した。また実施例１と同様にして
100％Ｒ−エナンチオマーから成ることを確認し
た。

実施例 ３ １ｇのベンゾイルギ酸を約５mlの水にとかし、
2NNaOHで中和した。0.2Mのグルコース、0.2M
のNaCl、2mMのメルトカプトエタノール、及び
0.05％の牛血清アルブミンを含む0.1Mリン酸緩
衝液（PH7.5）の160mlを加えた。これにNADH
の250mgを添加し、次で88Uのグルコース脱水素
酵素（天野製薬製）及び64Uのベンゾイルギ酸脱
水素酵素を少量の緩衝液溶液として添加した。よ
く攪拌して均一溶液とした後、トルエン0.8mlを
加えて密栓し、30℃に24時間放置した。生成した
マンデル酸を実施例１と同様にして抽出して結晶
化を行い、総計902mgの板状晶を得た（収率89
％）、mp132〜134℃、〔α〕D²⁵ _D＝−149°（Ｃ＝1.0、
水）。

実施例 ４ ベンゾイルギ酸の2.5ｇとギ酸の2.3ｇを2mMの
メルトカルトエタノールを含む15mMのリン酸緩
衝液（PH6.3）の約20mlと混和し、次でNaOHの
約2.7ｇを加えて中和した。ベンゾイルギ酸還元
酵素56U、0.5％牛血清アルブミン及び2mMメル
カプトエタノールを含む上記リン酸緩衝液の21ml
を加えた。1NNaOHでPH7.5に調整し、
NADH250mgとギ酸脱水素酵素の凍結乾燥粉末70
mg（80U，ベーリンガー社製）を加え均一溶液と
した。全液量は45mlとなつた。トルエン１mlを添
加し、栓をして30℃に42時間保つた。6NHCl約
2.5mlを加えて、PH＜２とし、NaClを飽和になる
ように溶かし、酢酸エチルの150ml、150ml及び
100ml３回抽出した。有機層を合し、実施例１と
同様に処理、結晶化させて、左旋性マンデル酸の
板状晶2.30ｇを得た。収率91％、mp133℃、〔α〕
D²⁷ _D＝−150.5°（Ｃ＝1.04、水）。

〔効果〕

以上のように、本発明によれば、ベンゾイルギ
酸を原料とし左旋性マンデル酸を光学純度100％
でかつ高収率で製造することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ストレプトコツクス属細菌の菌体から抽出し
   たベンゾイルギ酸還元酵素の存在下、還元型のニ
   コチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドを用い
   てベンゾイルギ酸を還元することを特徴とするマ
   ンデル酸の左旋性光学活性体の製造方法。