JPS61247395A - Ｌ−フェニルアラニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼを用
いて、桂皮ばとアンモニアからＬ−フェニルアラニンを
製造する方法に関する。

（産業上の利用分野） Ｌ　−−７ｚニルアラニンは栄養および医学領域におい
て重要な物質であり、近年人工甘味物質の原料として産
業上有用なものである。

（従来技術） 従来、Ｌ７−フェニルアラニンの当該技術分野での公知
の製造方法は英国特許第１．４８９．４６８号（１９７
７年１０月１９日）、特開昭５６−２６１９７号公報、
特開昭５６−５１９９１号公報、特開昭５９−９１８９
０号公報等に開示さ、れている方法がある。これらの方
法は、Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（以下
ＰＡＬと略す）がＬ−フェニルアラニンから桂皮酸とア
ンモニアを生じる反応の逆反応を利用したものである。

したがって、桂皮酸からＬ−フェニルアラニ／への変換
率を高めるには、英国特許第１．４８９．４６８号公報
に見られるように過剰のアンモニアの存在下に酸素反応
を行なうことが必須であり、該特許はこのような反応条
件で実施することＫより、従来知られていなかったＰ、
ＡＬによる桂皮酸からＬ−フェニルアラニンの生成を可
能にしたものである。更に、特開昭５６−２６１９７号
公報は、英国特許が開示するアンモニア濃度では該酵素
反応を行なうには不十分である事を示し、アンモニア濃
度と桂皮酸濃度はそれぞれ独立して桂皮酸からＬ−フェ
ニルアラニンへの変換に影響するとして、アンモニア濃
度が５ｍｏνを以上であり、桂皮酸濃度が０．０５〜０
．２　ｍｏｌ／ｌで実施される反応条件を開示している
。しかし、該特許は酵素の安定性に関しては言及してい
ない。酵素の安定性に関しては、ホジンス（ＨＯＤＧＩ
ＮＳ）　等が７−カイプス・オプ・バイオケミストリ　
アンド　バイオフィジクス（ＡＲＣＨＩＶＥＳ　　ＯＦ
　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ
ｉｃｓ　）　１４９巻９１〜９６頁、（１９７２年）に
おいて、ハロゲンイオン類がＰＡＬ酵素活性を抑制する
ことを報告している。この知見から、反応液組成物質は
ハロゲンイオンを含まないことが好ましく、特開昭５９
−９１８９０号公報は該酵素反応に際して、アンモニア
供与体に非ハロゲンアンモニウム塩を使用して実施する
ことを特徴としている。該特許によれば、非ハロゲンア
ンモニウム塩として好ましいものは硫酸アンモニウムで
あり、アンモニア濃度が１〜５ｍｏｌ／ｌで実施される
条件が好ましいとしている。しかしながら、該アンモニ
ア濃度では、桂皮酸のＬ−フェニルアラニンへの転換率
は最大７０％であり、そして、同公報実施例に示されて
いるようＫＬ−フェニルアラニンの蓄積量は大規模応用
に関して十分とは言えず、問題を残している。

本発明者らは従来のＰＡＬを用いた酵素反応について梅
々検討を重ねた結果、 （１）　　酵素反応溶液に炭酸アンモニウムから成る緩
衝液を用いることにより、アンモニア高濃度の条件下で
も、ＰＡＬの活性が安定に持続されること。

（２）　　炭酸アンモニウムから成る緩衝液中では、桂
皮酸の溶解度は小さく、桂皮酸が反応液に過剰に加えら
れても、酵素反応の阻害は起り難いこと。

（３）　　反応終了後、酵素反応液から炭酸アンモニウ
ムを回収するＫは容易な方法があること。

などの酵素反応液に炭酸アンモニウム緩衝液を用いた場
合の新規な知見を得るに至った。

本発明者らは、かかる新規な知見てもとづき、更に鋭意
検討を行ないＰＡＬを用いて桂皮酸とアンモニアからＬ
−フェニルアラニンをＭ　造ｔ　ルに際して、反応溶液
として、アンモニア濃度が１０ｍｏｌ／を以上で、アン
モニア量に対して０．０５〜０．５当量の炭酸イオンか
ら成る炭酸アンモニウム緩衝液を用い、反応液中の桂皮
酸濃度を実質的に０．０５　ｍｏｌ／を以下に保つこと
により、８０％程度の高収率でＬ−フェニルアラニンを
製造することが出来ること、しかも、該酵素反応終了液
は単に加熱するだけで、炭酸アンモニウムを除去でき、
それゆえ、生成したＬ−フェニルアラニンの単離操作が
著しく改善されることを見い串した。

本発明における如く、炭酸アンモニウムから成る緩衝液
が酵素類の活性安定化効果を示すことは文献未載の新規
な知見であり、本発明では酵素反応液に該炭酸アンモニ
ウム液を用いることによって、Ｌ−フェニルアラニンの
収率が著しく向上するのみならず、酵素を反覆的に利用
可能にするものであり、従来の硫酸アンモニウムなどの
酵素安定剤の知見からは全く予想出来ない効果である。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明において使用するＬフェニルアラニンアンモニア
リアーゼ（ＰＡＬ）は、Ｌ−フェニルアラニンから桂皮
酸とアンモニアを生成する酵素で、ロドスポリジウム属
などの酵母、カビ等の微生物のほかに、ジャガイモ、パ
セリ等の植物に分布することが知られているが、通常は
酵母に由来するものが利用される。このような酵母とし
ては、例えば、ロドスボリジウム・トルロイデス（Ｒｈ
ｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｎｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ　ＡＴ
ＣＣ１０７８８）、ロドトルラ・ミヌタ（Ｒｈｏｄｏｔ
ｏｒｕｌａ　ｍ１ｎｕｔａ　ＡＴＣＣ１０６５８）、ス
トレフトマイセス・ヴアティシイラタス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓＶｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓ　ＡＴＣＣ１
３４９５）などが挙げられる。これらの酵母の細胞を公
知の方法により調製し、該酵素を含有する細胞を培養基
から遠心分離や濾過等の操作により採取し、細胞または
、細胞の処理物、例えば、洗浄細胞、乾燥細胞、細胞の
破砕物、細胞の固定化物等、更には、細胞から該酵素を
抽出して精製した標品を用いることが出来る。

本発明の実施における反応液中のアンモニア濃度は１０
ｍｏｌ／を以上が望ましい。

前記アンモニア濃度に対して、炭酸イオンが０．０５〜
０．５当量、好ましくは０．１〜０．３３当量となるよ
うにアンモニア水もしくはアンモニアガスと固体炭酸も
しくは二酸化炭素ガスとを水に吸収させることにより得
られる。更には、炭酸アンモニウムを溶解した水溶液に
アンモニア水もしくはアンモニアガスを添加もしくは吸
収させることにより調整できる。

このようにして得られる反応液はｐＨ緩衝作用を示すこ
とから、反応進行中のｐＨ調節の必要はないが、Ｌ−フ
ェニルアラニンを高濃度蓄積させる場合には反応液のｐ
ｕをＰＡＬの酵素活性の至適ｐＨにアンモニア水もしく
は炭酸ガス等で行なうのが好ましい。

桂皮酸の添加は反応溶液に一括添加もしくは分割添加の
いずれでも可能であるが、いかなる方法を用い゛ても反
応液中の炭酸アンモニウムが高濃度であることから、後
記実験例１に示される如く、反応溶液中の桂皮酸の溶解
度は小さく保たれ、酵素反応が基質阻害を受けることは
殆んどない状態にすることが出来る。

本発明の酵素反応の実施は、温度２０〜４０℃、好まし
くは２０〜３０℃で行なうのがよい。反応時間は静置、
攪拌、流下法などの反応の方法、あるいは酵素の形態や
活性によって異なるが、バッチ反応法では通常２０時間
程度であればよい。本反応において、酵素源として細胞
を用いる場合には、界面活性剤を添加することにより、
反応時間を短縮できる場合がある。

反応終了後、生成したＬ−フェニルアラニンは反応液か
ら酵素もしくは酵素源の細胞を除去した液を単に加熱す
ることで炭酸アンモニウムの除去が可能であり、以後Ｌ
−アミノ酸の分離精製の公知技術の組み合せにより容易
に行なうことが出来る。

以下、実施例および実験例を挙げて本発明方法を更に具
体的に説明する。

実施例および実験例中の桂皮酸またはＬ−フェニルアラ
ニンの定量はそれぞれ紫外吸収分光光度計または０−フ
タルアルデヒド法によるケイ光分光光度計を検出器に設
置した液体クロマトグラフィーにて行なった。

実験例１　（反応液中での桂皮酸の溶解度）アンモニア
濃度が６．８．１０ｍｏｌ／ｌで、炭酸イオンを１．１
．１゜４．１．８　ｍｏｌ／　ｌ含み、ｐＨ１０に微調
節された反応液１００−に桂皮酸７．４９を添加（溶解
すれば０．５ｍｏｌ／ｌ相当）し、数時間攪拌をしなが
ら３０℃に保ち、未溶解桂皮酸を戸別して、ｐ液中の桂
皮酸濃度の分析を行なった。比較例として、硫酸アンモ
ニウムおよび塩化アンモニウム緩衝液を用いたｐＨ１０
での溶解度の測定結果を表１に示す。炭酸アンモニウム
および硫酸アンモニウム溶液中では桂皮酸濃度は低く保
たれることが示されている。

？ −ゆ 実験例２　　（ＰＡＬ生産菌の培養） ＰＡＬ生産菌であるロドスポリジウム・トルロイデス（
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ　ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ
　Ａ　ＴＣＣ１０７８８）およびロドトルラΦミヌタ（
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｍ１ｎｕｔａＩＦＯ９２０）
をポリペプトン　１５　ｆ／ｌ、酵母エキス３　ｆ／ｌ
　、マルツエキスｓｒ／ｌ、食塩５ｙ７ｔ。

Ｌ−フェニルアラニン０．５ｆ／ｌからなる培地１ｓｔ
に接種し、初発ｐＨ７，０，２６℃にて１６時間通気攪
拌を行なった。培養終了後、遠心分離により菌体を採取
し、０．８５％食塩水にて菌体を洗浄後、再度遠心分離
により菌体を集め、得られた湿菌体をＰＡＬ酵素源とし
て、凍結保在した。凍結保在された菌体は３力月後でも
酵素活性は安定に保たれていた。さらに、ストレプトミ
セス・ヴアルティシイラタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ　Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓ　ＡＴＣＣ１３４９５
）をグルコース２０　ｆ／ｌ、酵母エキス２０２／ｌ１
食塩５２／ｌ、ＤＬ−フェニルアラニン１２／ｌから成
る培地１０ｔＫ接種し、初発ｐＨ７，０，２６℃にて１
７時間通気攪拌を行ない培養を行なった。

発泡防止のため消泡剤としてアデカノールＬＧ８０５を
０．０５％添加した。培養終了後、吸引口過により菌体
を採取し、得られた湿菌体を１０倍量の冷アセトン中に
入れ、脱水後、菌体を戸別し、アセトン臭がな（なるま
で減圧乾燥を行ないストレプトミセス・ヴアルティシイ
ラタスの乾燥菌体を得た。

得られた３種のＰＡＬ酵素比活性は２５〜４５単位／２
・ｃｅｔｌであった（酵素１単位は１分間当り１マイク
ロモルの桂皮酸を生成する力価）。

実験例３　（各種反応液中でのＰＡＬの安定性）ロトス
ホリシウム・トルロイデスＡＴＣＣ１０７８８の凍結菌
体を用いて各種組成の反応液中でのＰＡＬの安定性につ
いて実験を行なった。実験はアンモニア濃度６ｍｏ！、
／Ｌおよび８ｍｏｌ／ｌの各種の緩衝液（ｐＨ１０）を
調製し、各緩衝液１００ｍ１Ｃ解凍菌体３２を加え３０
℃にて緩やかに攪拌しなから４および２０時間後に、菌
体を採取し、ＰＡＬ活性をホジンスの方法（前記）Ｋよ
り測定した。結果を第２表に示す。炭酸アンモニウム緩
衝液では活性が保持されているのに対し、他の緩衝液で
はいずれも活性が低下し、塩化アンモニウムおよび硝酸
アンモニウムでは者しい低下を示した。

マタ、リン酸アンモニウムおよび硼酸アンモニウムの緩
衝液は目的のｐＨ溶液を作る事が出来ない。

実験例４　（酵素反応へのアンモニア濃度の影響）ロド
スポリジウム・トルロイデスＡＴＣＣ１０７８８の凍結
菌体を解凍後、炭酸アンモニウム緩衝Ｋ　ｐＨ１０，０
）のアンモニア濃度を表３に示す如く変化させた反応液
と混合し、桂皮酸を１００ｍｍｏｌ／ｌの濃度になるよ
うに添加し、３０℃で２０時間反応させた。反応終了後
生成したＬ−フェニルアラニ／を定量して桂皮酸からＬ
−フェニルアラニンへの変換率を測定した。同様の反応
条件にてロドト、ルラ・ミヌタ　ＩＦＯ９２０、および
ストレプトミセス・ヴアティシイラタス　ＡＴＣＣ１５
４９５を用いり反応を行すい、Ｌ−フェニルアラニンへ
の変換率を求めた。結果を第３表に示す。

アンモニア濃度が８ｍｏｌ／を以上であれば変換率８０
％以上の高収率を得た。

第　　３　　表 酵素反応へのアンモニア濃度の影響 Ｔ：ロドスボリジウム・トルロイデス Ｍ：ロドトルラ・ミヌタ Ｓ：ストレプトミセス・グアルティシイクタス実験例５
　（アンモニウムイオンと炭酸イオンのモル比の酵素反
応への影響） ロドスボリジウム・トルロイデスＡＴＣＣ１０７８８お
よびロドトルラφミヌタＩＦＯ９５２の凍結ＩＷ体、お
よびストレプトミセス・ヴアルティシラタスＡＴＣＣＬ
５４９５の乾燥菌体を用いて、アンモニア濃度を１０ｍ
ｏｌ／ｌとして炭酸イオンを第４表に示す如く変化させ
た反応溶液を調製し、桂皮酸を１００ｍｍｏｌ／Ｌ濃度
に添加し、３０℃にて緩やかに攪拌して２０時間反応さ
せた。反応終了液の生成Ｌ−フェニルアラニンを定量し
、桂皮酸からの変換率を求めた。結果を第４表に示す。

炭酸イオン量がアンモニアの０．１２５〜０．２５当量
の範囲で変換率８０％以上を示した。

第　　４　　表 アンモニアと炭酸イオンのモル比の変化による酵素反応
収率への影響 Ｔｅａトスポリ２ウム・トルａイデス Ｍ＝ｅ＋ドトルラ・ばヌタ Ｓ：ストレプトζセス・ヴアルティシラタス実験例６　
（酵素反応への桂皮酸濃度の影響）桂皮酸を第５表に示
す如く変化させ、その桂皮酸をそれぞれアンモニア濃度
１２Ｍで炭酸イオンを３，０Ｍ含有する反応液に溶解し
、これにロドスボリジウム・トルロイデスおよびロドト
ルラ・ミヌタの菌体を加え反応液の最終アンモニア濃度
が１０Ｍとなる。ように蒸留水を加え、６０℃でＬ−フ
ェニルアラニン生成反応を行なってその初速度を測定し
た。その結果は第５表に示す通りであり、桂皮酸の濃度
が従来から知られている阻害濃度、例えば特開昭５６−
２６１９７号公報１３頁第１表に開示されている濃度に
おいても十分な酵素活性を示すことが認められた。同様
の実験をストレプトミセス・ヴアルティシテタスの乾燥
菌体をもちいて実施し、その結果は第５表に示す通りで
、酵素活性は桂皮酸の濃度の影響を受けなかった。

第　　５　　表 初速度におよぼす桂皮酸濃度の影響 Ｔ：ロドスボエリウム中トルロイテス Ｍ：ロドトルラ・ミヌタ Ｓ：ストレプトミセス・ヴアルティ７テタス桂皮酸濃度
５０ｍＭの場合の初速度を１００とした。

実施例１ 実験例２に示した方法により調製したロドスボリジウム
・トルロイデスの凍結菌体をアンモニア濃度１４　ｍａ
ｔ／　１１炭酸イオン３．５　ｍｏｌ　／　Ｌから成る
反応液に懸濁させ、蒸留水を加えて容量が１ｏｏｒｎｔ
でアンモニア濃度を１０ｍｏｌ／ｌになるように調製し
、桂皮酸を５０ｍＭの濃度になるように加え、３０°Ｃ
で攪拌しながら反応を行なった。反応開始後４時間毎に
桂皮酸を０．７４　ｔづつ４回添加した。反応開始後１
６時間目以後は桂皮酸の添加を停止し以後３０℃での反
応を継続した。

添加桂皮酸の総量は３．７２であった。反応開始後２４
時時間和吸引口過により菌体を口別した。

口過中には桂皮酸の８３％がＬ　　７ｚニルアラニンに
変換され、３．４９のＬ−フェニルアラニンが蓄積して
いることが認められた。菌体除去後の反応液を加熱蒸留
釜とガス吸収塔とを持つ装置の加熱蒸留釜に移液し、蒸
留釜を加熱して炭酸アンモニウムを除去した。炭酸アン
モニウムを除去した反嵐 応液を減圧濃縮して、冷却後にｑＬ−フェニルアラニン
の結晶３．０２を得た。粗結晶を希塩酸水溶液に溶解し
、エーテルにて抽出を行ない、エーテル層を除去後、中
和してｐ　Ｈ６，０とし、Ｌ−フェニルアラニンの結晶
２．４２を得た。

実施例２ アンモニア濃度１４ｍｏｌ／ｌ、炭酸イオン３．５　ｍ
ｏｌ／ｌから成る溶液に実験例２に示した方法により調
製したロドトルラ・ミヌタの凍結菌体を懸濁させ、反応
液容量が１００−で、アンモニア濃度が１０ｍｏｌ／ｌ
になるように蒸留水を加えて調製した。この反応液に桂
皮酸を３．７２加え、３０’Ｃでゆるやかに攪拌しなが
ら２８時間反応を行なった。反応終了後、反応液中には
桂皮酸からの収率７４％でＬ−フェニルアラニン（３，
０５ｆ）が認められた。実施例１と同様の操作により炭
酸アンモニアを除去後、濃縮を行なった。

濃縮液に塩酸を加えてｐＨ２，０とし、生じる桂皮酸の
洗絨を遠心分離により除去後、アンモニア水にてｐＨ５
，８に調製して冷却後、生成した結晶を口別乾燥して、
Ｌ−フェニルアラニン結晶２．２ｆヲ得た。

実施例３ アンモニア濃度１４　ｍｏｌ／　ｌ、炭酸イオン濃度３
．５ｍａｔ　／　ｔかうなる反応液に実験例２に示した
方法で調製したストレプトミセス・ヴアルティシテタス
の乾燥菌体を懸濁させ、反応液容ｆｔ１００ｒｎｔで、
アンモニア濃度１０ｍｏｌ／ｌになるように水を加えて
Ｍｇした。アンモニア濃度の調製された菌体懸濁液に桂
皮酸３．７２を加えて３０℃で攪拌しながら、３００時
間反応行なった。反応終了後、反応液中には桂皮ばから
の転換率７０％でＬ−フェニルアラニン（２，８８Ｆ）
が認められた。反応終了液を実施例１と同様の方法で除
菌および除炭酸アンモニウムを行なった。炭酸アンモニ
ウム除去液に塩酸を加えてｐＨ２とし、桂皮酸を口別後
、アンモニア水を加えてｐＨ６，０として、減圧濃縮を
行ないＬ−フェニルアラニンの結晶（２，０１’）を得
た。

比較例 実験例２に示した方法により調製したロドトルラ・ミヌ
タの凍結菌体をアンモニア濃度が９　ｍｏｌ／ｌの硫酸
アンモニウム系緩衝液に懸濁させ反応液中の菌体濃度が
実施例２と同一になる様に蒸留水を加えて調製した。な
お硫酸アンモニウム系の緩衝液はアンモニア濃度を９ｍ
ｏｌ／Ｌ以上にすると硫酸アンモニウムの結晶が析出す
るので、アンモニア濃度をこれ以上にすることは出来な
かった。

硫酸アンモニウム緩衝液に菌体を懸濁させた反応液に桂
皮酸を３．７２加え、３０℃でゆるやかに攪拌しながら
２８時間反応を行なった。反応終了後、反応液中には桂
皮酸からの収率２０％でＬ−フェニルアラニン（０，８
３Ｆ）が認められた。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼの存在
   下に、アンモニアと桂皮酸とを酵素反応させてＬ−フェ
   ニルアラニンを製造するに際して、１０ｍｏｌ／ｌ濃度
   以上のアンモニアと、該アンモニア量に対し０．０５〜
   ０．５当量の炭酸イオンから成る反応溶液中で実質的に
   ０．０５ｍｏｌ／ｌ濃度以下の桂皮酸とを反応させるこ
   とを特徴とするＬ−フェニルアラニンの製造法。
2. （２）Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼがロド
   スポリジウム属、ロドトルラ属、ストレプトミセス属に
   属する微生物の生産するＬ−フェニルアラニンアンモニ
   アリアーゼを用いる方法。