JPH0468917B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はＬ−フエニルアラニンアンモニアリア
ーゼを用いて、桂皮酸とアンモニアからＬ−フエ
ニルアラニンを製造する方法に関する。 （産業上の利用分野） Ｌ−フエニルアラニンは栄養および医学領域に
おいて重要な物質であり、近年人工甘味物質の原
料として産業上有用なものである。 （従来技術） 従来、Ｌ−フエニルアラニンの当該技術分野で
の公知の製造方法は英国特許第1489468号（1977
年10月19日）、特開昭56−26197号公報、特開昭56
−51991号公報、特開昭59−91890号公報等に開示
されている方法がある。これらの方法は、Ｌ−フ
エニルアラニンアンモニアリアーゼ（以下PAL
と略す）がＬ−フエニルアラニンから桂皮酸とア
ンモニアを生じる反応の逆反応を利用したもので
ある。したがつて、桂皮酸からＬ−フエニルアラ
ニンへの変換率を高めるには、英国特許第
1489468号公報に見られるように過剰のアンモニ
アの存在下に酸素反応を行なうことが必須であ
り、該特許はこのような反応条件で実施すること
により、従来知られていなかつたPALによる桂
皮酸からＬ−フエニルアラニンの生成を可能にし
たものである。更に、特開昭56−26197号公報は、
英国特許が開示するアンモニア濃度では該酸素反
応を行なうには不十分である事を示し、アンモニ
ア濃度と桂皮酸濃度はそれぞれ独立して桂皮酸か
らＬ−フエニルアラニンへの変換に影響するとし
て、アンモニア濃度が3mol／以上であり、桂
皮酸濃度が0.05〜0.2mol／で実施される反応条
件を開示している。しかし、該特許は酵素の安定
性に関しては言及していない。酵素の安定性に関
しては、ホジンス（HODGINS）等がアーカイ
ブス・オブ・バイオケミストリ アンド バイオ
フイジクス（Archives of Biochemistr and
Biophysics）149巻91〜96頁、（1972年）におい
て、ハロゲンイオン類がPAL酵素活性を抑制す
ることを報告している。この知見から、反応液組
成物質はハロゲンイオンを含まないことが好まし
く、特開昭59−91890号公報は該酵素反応に際し
て、アンモニア供与体に非ハロゲンアンモニウム
塩を使用して実施することを特徴としている。該
特許によれば、非ハロゲンアンモニウム塩として
好ましいものは硫酸アンモニウムであり、アンモ
ニア濃度が１〜5mol／で実施される条件が好
ましいとしている。しかしながら、該アンモニア
濃度では、桂皮酸のＬ−フエニルアラニンへの転
換率は最大55％であり、そして、同公報実施例に
示されているようにＬ−フエニルアラニンの蓄積
量は大規模応用に関して十分とは言えず、問題を
残している。 本発明者らは従来のPALを用いた酵素反応に
ついて種々検討を重ねた結果、 (1) 酵素反応溶液に炭酸アンモニウムから成る緩
衝液を用いることにより、アンモニア高濃度の
条件下でも、PALの活性が安定に持続される
こと。 (2) 炭酸アンモニウムから成る緩衝液中では、桂
皮酸の溶解度は小さく、桂皮酸が反応液に過剰
に加えられても、酵素反応の阻害は起り難いこ
と。 (3) 反応終了後、酵素反応液から炭酸アンモニウ
ムを回収するには容易な方法があること。 などの酵素反応液に炭酸アンモニウム緩衝液を用
いて場合の新規な知見を得るに至つた。 本発明者らは、かかる新規な知見にもとづき、
更に鋭意検討を行ないPALを用いて桂皮酸とア
ンモニアからＬ−フエニルアラニンを製造するに
際して、反応溶液として、アンモニア濃度が
10mol／以上で、アンモニア量に対して0.05〜
0.5当量の炭酸イオンから成る炭酸アンモニウム
緩衝液を用い、反応液中の桂皮酸濃度を実質的に
0.05mol／以下に保つことにより、80％程度の
高収率でＬ−フエニルアラニンを製造することが
出来ること、しかも、該酵素反応終了液は単に加
熱するだけで、炭酸アンモニウムを除去でき、そ
れゆえ、生成したＬ−フエニルアラニンの単離操
作が著しく改善されることを見い出した。 本発明における如く、炭酸アンモニウムから成
る緩衝液が酵素類の活性安定化効果を示すことは
文献未載の新規な知見であり、本発明では酵素反
応液に該炭酸アンモニウム液を用いることによつ
て、Ｌ−フエニルアラニンの収率が著しく向上す
るのみならず、酵素を反覆的に利用可能にするも
のであり、従来の硫酸アンモニウムなどの酵素安
定剤の知見からは全く予想出来ない効果である。 以下に本発明を詳細に説明する。 本発明において使用するＬ−フエニルアラニン
アンモニアリアーゼ（PAL）は、Ｌ−フエニル
アラニンから桂皮酸とアンモニアを生成する酵素
で、ロドスポリジウム属などの酵母、カビ等の微
生物のほかに、ジヤガイモ、パセリ等の植物に分
布することが知られているが、通常は酵母に由来
するものが利用される。このような酵母として
は、例えば、ロドスポリジウム・トルロイデス
（Rhodosporidium toruloides ATCC 10788），
ロドトルラ・ミヌタ（Rhodotorula minuta
ATCC 10658）、ストレプトマイセス・ヴアテイ
シラタス（Streptomyces verticillatus ATCC
13495）などが挙げられる。これらの酵母の細胞
を公知の方法により調製し、該酵素を含有する細
胞を培養基から遠心分離や過当の操作により採
取し、細胞または、細胞の処理物、例えば、洗浄
細胞、乾燥細胞、細胞の破砕物、細胞の固定化物
等、更には、細胞から該酵素を抽出して精製した
標品を用いることが出来る。 本発明の実施における反応液中のアンモニア濃
度は10mol／以上が望ましい。 前記アンモニア濃度に対して、炭酸イオンが
0.05〜0.5当量、好ましくは0.1〜0.33当量となる
ようにアンモニア水もしくはアンモニアガスと固
体炭酸もしくは二酸化炭素ガスとを水に吸収させ
ることにより得られる。更には、炭酸アンモニウ
ムを溶解した水溶液にアンモニア水もしくはアン
モニアガスを添加もしくは吸収させることにより
調整できる。 このようにして得られる反応液はPH緩衝作用を
示すことから、反応進行中のPH調節の必要はない
が、Ｌ−フエニルアラニンを高濃度蓄積させる場
合には反応液のPHをPALの酵素活性の至適PHに
アンモニア水もしくは炭酸ガス等で行なうのが好
ましい。 桂皮酸の添加は反応溶液に一括添加もしくは分
割添加のいずれでも可能であるが、いかなる方法
を用いても反応液中の炭酸アンモニウムが高濃度
であることから、後記実験例１に示される如く、
反応溶液中の桂皮酸の溶解度は小さく保たれ、酵
素反応が基質阻害を受けることは殆んどない状態
にすることが出来る。 本発明の酵素反応の実施は、温度20〜40℃、好
ましくは20〜30℃で行なうのがよい。反応時間は
静置、攪拌、流下法などの反応の方法、あるいは
酵素の形態や活性によつて異なるが、バツチ反応
法では通常20時間程度であればよい。本反応にお
いて、酵素源として細胞を用いる場合には、界面
活性剤を添加することにより、反応時間を短縮で
きる場合がある。 反応終了後、生成したＬ−フエニルアラニンは
反応液から酵素もしくは酵素源の細胞を除去した
液を単に加熱することで炭酸アンモニウムの除去
が可能であり、以後Ｌ−アミノ酸の分離精製の公
知技術の組み合せにより容易に行なうことが出来
る。 以下、実施例および実施例を挙げて本発明方法
を更に具体的に説明する。 実施例および実験例中の桂皮酸またはＬ−フエ
ニルアラニンの定量はそれぞれ紫外吸収分光光度
計またはｏ−フタルアルデヒド法によるケイ光分
光光度計を検出器に設置した液体クロマトグラフ
イーにて行なつた。 実施例 １（反応液中での桂皮酸の溶解度） アンモニア濃度が６，８，10mol／で、炭酸
イオンを1.1，1.4，1.8mol／含み、PH10に微調
節された反応液100mlに桂皮酸7.4ｇを添加（溶解
すれば0.5mol／相当）し、数時間攪拌をしな
がら30℃に保ち、未溶解桂皮酸を別して、液
中の桂皮酸濃度の分析を行なつた。比較例とし
て、硫酸アンモニウムおよび塩化アンモニウム緩
衝液を用いたPH10での溶解度の測定結果を表１に
示す。炭酸アンモニウムおよび硫酸アンモニウム
溶液中では桂皮酸濃度は低く保たれることが示さ
れている。

【表】 実施例 ２（PAL生産菌の培養） PAL生産菌であるロドスポリジウム・トルロ
イデス（Rhodosporidium toruloides Ａ TCC
10788）およびロドトルラ・ミヌタ
（Rhodotorula minuta ATCC 10658）をポリペ
プトン 15ｇ／、酵母エキス３ｇ／、マルツ
エキス３ｇ／、食塩５ｇ／、Ｌ−フエニルア
ラニン0.5ｇ／からなる培地15に接種し、初
発PH7.0、26℃にて16時間通気攪拌を行なつた。
培養終了後、遠心分離により菌体を採取し、0.85
％食塩水にて菌体を洗浄後、再度遠心分離により
菌体を集め、得られた湿菌体をPAL酵素源とし
て、凍結保在した。凍結保在された菌体は３ケ月
後でも酵素活性は安定に保たれていた。さらに、
ストレプトミセス・ヴアルテイシイラタス
（Streptomyses Verticillatus ATCC13495）を
グルコース20ｇ／、酵母エキス20ｇ／、食塩
５ｇ／、DL−フエニルアラニン１ｇ／から
成る培地10に接種し、初発PH7.0、26℃にて17
時間通気攪拌を行ない培養を行なつた。発泡防止
のため消泡剤としてアデカノールLG805を0.05％
添加した。培養終了後、吸引ロ過により菌体を採
取し、得られた湿菌体を10倍量の冷アセトン中に
入れ、脱水後、菌体を別し、アセトン臭がなく
なるまで減圧乾燥を行ないストレプトミセス・ヴ
アルテイシイラタスの乾燥菌体を得た。得られた
３種のPAL酵素比活性は25〜45単位／ｇ・cellで
あつた（酵素１単位は１分間当り１マイクロモル
の桂皮酸を生成する力価）。 実施例 ３（各種反応液中でのPALの安定性） ロドスポリジウム・トルロイデス ATCC
10788の凍結菌体を用いて各種組成の反応液中で
のPALの安定性について実験を行なつた。実験
はアンモニア濃度6mol／および8mol／の各
種の緩衝液（PH10）を調製し、各緩衝液100mlに
解凍菌体３ｇを加え30℃にて緩やかに攪拌しなが
ら４および20時間後に、菌体を採取し、PAL活
性をホジンスの方法（前記）により測定した。結
果を第２表に示す。炭酸アンモニウム緩衝液では
活性が保持されているのに対し、他の緩衝液では
いずれも活性が低下し、塩化アンモニウムおよび
硝酸アンモニウムでは著しい低下を示した。 また、リン酸アンモニウムおよび硼酸アンモニ
ウムの緩衝液は目的のPH溶液を作る事が出来な
い。

【表】 実施例 ４（酵素反応へのアンモニア濃度の影響） ロドスポリジウム・トルロイデスATCC 10788
の凍結菌体を解凍後、炭酸アンモニウム緩衝液
（PH10.0）のアンモニア濃度を表３に示す如く変
化させた反応液と混合し、桂皮酸を100mmol／
の濃度になるように添加し、30℃で20時間反応
させた。反応終了後生成したＬ−フエニルアラニ
ンを定量して桂皮酸からＬ−フエニルアラニンへ
の変換率を測定した。同様の反応条件にてロドト
ルラ・ミヌタATCC10658、およびストレプトミ
セス・ヴアルテイシイラタス ATCC 13495 を
用いた反応を行ない、Ｌ−フエニルアラニンへの
変換率を求めた。結果を第３表に示す。 アンモニア濃度が8mol／以上であれば変換
率80％以上の高収率を得た。

【表】 実施例 ５（アンモニウムイオンと炭酸イオンの
モル比の酵素反応への影響） ロドスポリジウム・トルロイデス ATCC
10788およびロドトルラ・ミヌタ ATCC 10658
の凍結菌体、およびストレプトミセス・ヴアルテ
イシイラタス ATCC 13495の乾燥菌体を用い
て、アンモニア濃度を10mol／として炭酸イオ
ンを第４表に示す如く変化させた反応溶液を調製
し、桂皮酸を100mmol／濃度に添加し、30℃
にて緩やかに攪拌して20時間反応させた。反応終
了液の生成Ｌ−フエニルアラニンを定量し、桂皮
酸からの変換率を求めた。結果を第４表に示す。
炭酸イオン量がアンモニアの0.125〜0.25当量の
範囲で変換率80％以上を示した。

【表】 実施例 ６ （酵素反応への桂皮酸濃度の影響） 桂皮酸を第５表に示す如く変化させ、その桂皮
酸をそれぞれアンモニア濃度12Mで炭酸イオンを
3.0M含有する反応液に溶解し、これにロドスポ
リジウム・トルロイデスおよびロドトルラ・ミヌ
タの菌体を加え反応液の最終アンモニア濃度が
10Mとなるように蒸留水を加え、30℃でＬ−フエ
ニルアラニン生成反応を行なつてその初速度を測
定した。その結果は第５表に示す通りであり、桂
皮酸の濃度が従来から知られている阻害濃度、例
えば特開昭56−26197号公報13頁第１表に開示さ
れている濃度においても十分な酵素活性を示すこ
とが認められた。同様の実験をストレプトミセ
ス・ヴアルテイシイラタスの乾燥菌体をもちいて
実施し、その結果は第５表に示す通りで、酵素活
性は桂皮酸の濃度の影響を受けなかつた。

【表】 桂皮酸濃度50mMの場合の初速度を100とした。 実施例 １ 実験例２に示した方法により調製したロドスポ
リジウム・トルロイデスの凍結菌体をアンモニア
濃度14mol／、炭酸イオン3.5mol／から成る
反応液に懸濁させ、蒸留水を加えて容量が100ml
でアンモニア濃度を10mol／になるように調製
し、桂皮酸を50mMの濃度になるように加え、30
℃で攪拌しながら反応を行なつた。反応開始後４
時間毎に桂皮酸を0.74ｇづつ４回添加した。反応
開始後16時間目以後は桂皮酸の添加を停止し、以
後30℃での反応を継続した。 添加桂皮酸の総量は3.7ｇであつた。反応開始
後24時間目に吸引ロ過により菌体をロ別した。ロ
過中には桂皮酸の83％がＬ−フエニルアラニンに
変換され、3.4ｇのＬ−フエニルアラニンが蓄積
していることが認められた。菌体除去後の反応液
を加熱蒸留釜とガス吸収塔とを持つ装置の加熱蒸
留釜に移液し、蒸留釜を加熱して炭酸アンモニウ
ムを除去した。炭酸アンモニウムを除去した反応
液を減圧濃縮して、冷却後に粗Ｌ−フエニルアラ
ニンの結晶3.0ｇを得た。粗結晶を希塩酸水溶液
に溶解し、エーテルにて抽出を行ない、エーテル
層を除去後、中和してPH6.0とし、Ｌ−フエニル
アラニンの結晶2.4ｇを得た。 実施例 ２ アンモニア濃度14mol／、炭酸イオン
3.5mol／から成る溶液に実験例２に示した方
法により調製したロドトルラ・ミヌタの凍結菌体
を懸濁させ、反応液容量が100mlで、アンモニア
濃度が10mol／になるように蒸留水を加えて調
製した。この反応液に桂皮酸を3.7ｇ加え、30℃
でゆるやかに攪拌しながら28時間反応を行なつ
た。反応終了後、反応液中には桂皮酸からの収率
74％でＬ−フエニルアラニン（3.05ｇ）が認めら
れた。実施例１と同様の操作により炭酸アンモニ
アを除去後、濃縮を行なつた。 濃縮後に塩酸を加えてPH2.0とし、生じる桂皮
酸の沈澱を遠心分離により除去後、アンモニア水
にてPH5.8に調製して冷却後、生成した結晶をロ
別乾燥して、Ｌ−フエニルアラニン結晶2.2ｇを
得た。 実施例 ３ アンモニア濃度14mol／、炭酸イオン濃度
3.5mol／からなる反応液に実験例２に示した
方法で調製したストレプトミセス・ヴアルテイシ
イラタスの乾燥菌体を懸濁させ、反応液容量100
mlで、アンモニア濃度10mol／になるように水
を加えて調製した。アンモニア濃度の調製された
菌体懸濁液に桂皮酸3.7ｇを加えて30℃で攪拌し
ながら、30時間反応を行なつた。反応終了後、反
応液中には桂皮酸からの転換率70％でＬ−フエニ
ルアラニン（2.88ｇ）が認められた。反応終了後
を実施例１と同様の方法で除菌および除炭酸アン
モニウムを行なつた。炭酸アンモニウム除去液に
塩酸を加えてPH２とし、桂皮酸をロ別後、アンモ
ニア水を加えてPH6.0として、減圧濃縮を行ない
Ｌ−フエニルアラニンの結晶（2.04ｇ）を得た。 比較例 実験例２に示した方法により調製したロドトル
ラ・ミヌタの凍結菌体をアンモニア濃度が
9mol／の硫酸アンモニウム系緩衝液に懸濁さ
せ反応液中の菌体濃度が実施例２と同一になる様
に蒸留水を加えて調製した。なお硫酸アンモニウ
ム系の緩衝液はアンモニア濃度を9mol／以上
にすると硫酸アンモニウムの結晶を折出するの
で、アンモニア濃度をこれ以上にすることは出来
なかつた。硫酸アンモニウム緩衝液に菌体を懸濁
させた反応液に桂皮酸を3.7ｇ加え、30℃でゆる
やかに攪拌しながら28時間反応を行なつた。反応
終了後、反応液中には桂皮酸からの収率20％でＬ
−フエニルアラニン（0.83ｇ）が認められた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ Ｌ−フエニルアラニンアンモニアリアーゼの
   存在下に、アンモニアと桂皮酸とを酵素反応させ
   てＬ−フエニルアラニンを製造するに際して、
   10mol／濃度以上のアンモニアと、該アンモニ
   ア量に対し0.15〜0.33当量の炭酸イオンから成る
   反応溶液中で実質的に0.05mol／濃度以下の桂
   皮酸とを反応させることを特徴とするＬ−フエニ
   ルアラニンの製造法。 ２ Ｌ−フエニルアラニンアンモニアリアーゼが
   ロドスポリジウム属、ロドトルラ属、ストレプト
   ミセス属に属する微生物の生産するＬ−フエニル
   アラニンアンモニアリアーゼである特許請求の範
   囲第１項の製造法。