JPS5974983A - Ｌ−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸−デヒドロゲナ−ゼ及びその取得法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の目的は、次の特性： ａ）Ｌ−２−ヒドロキン−４−メチルペ／り／酸に対す
る特異活性、 １〕）ニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド（Ｎ
ＡＤ）依存性、 Ｃ）作用至適温度・１０〜６０　”に、ｄ）安定性至適
温度＜　４　（１−＜：、ｅ）脱水素反応に関する至適
ｐ　Ｈ値８（）〜８５、ｆ）還元反応に関ずろ至後１〕
１■値７０付近、ｇ）　　１）Ｈ−安定範囲６５〜８５
、Ｉ＋）　　Ｌ　−２−ヒドロキノ−４−メチルペンタ
ン酸に対するミ・・エリス一定数（ＫＭ−値）０６２Ｘ
、Ｉ（ＩＭ 及び １）Ｌ−２ヒドロキシベンクン酸、Ｌ−２−ヒ１゛ロギ
／ヘギザン酸及びＬ−２−ヒドロキシ　４−（メチルメ
ルカプト）−酪酸に対するイー］加重安定性 を有−Ｊ”ｙ−ｒ　ｔ、　−２−ヒドロキン−４−メチ
ルペンクン酸−デヒ１″ロゲナ　ゼである。

本発明のもう４つの目的は、新規Ｌ−２−ヒＩＳロキ／
−・１〜メチルインタン酸デヒ１″ロゲナーゼの取得法
にも関し、こオｔは、ラクトノＳシルス・コンツユスス
（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏｎｆｕｓｕｓ；Ｄ
　Ｓ　Ｍ　２０１９６　）を炭素源及び窒素源兼びに無
機用、４Ｉ−長物質及びビタミンを訝櫓し、培養の開始
時に６５０）　Ｉ）ＪＴ値を有する水性栄養培地中で培
狡し、培養終了後に、遠心分離により細胞を、庫得し、
これをＩ）１１７に緩衝した懸濁液中で崩壊させ、抽出
物から酵素を取得することよりなる。

最後に、本発明の目的は、Ｌ　−２−ヒドロキン−４−
メチルくンタン酸、Ｌ　−２−ヒドロキン被ンタン酸、
Ｌ−２−ヒドロキンヘキザン酸又はＬ−２−ヒドロキン
−４−（メチルメルカゾｌ−）−酪酸を酵素的に変換し
１相尾、すイ）２−ケトカル７Ｉソン酸に変じろかもし
くは２−ケト−４−メチルにンタン酸、２−ケト被ンタ
ン酸、２−ケトヘキザノ酸又は２−ケト−４−（メチル
メルカプト）−酪酸を相ｊ＋５するＬ−２−ヒＩ−″ロ
キシカルボン酸に変じるために、この新規酵素を使用す
ることにもある。

この新規酵素は、Ｌ−２−ヒドロキシ−１−メチルペン
タン酸に対ずろ特異活性及び種々の他のＬ−２−ヒドロ
キシカル７」ざン酸殊に１．−２−ヒドロキシペンタン
酸、Ｌ−２−ヒドロキノへキザノ酸及びＬ−２−ヒドロ
キシ−４−（メチルメルカプト）−酪酸に対する付加的
活性を有する。これは補酵素依存性であり、この脱水素
灰１，１１、のために（」１、ニコチンアミド−７テ＝
　ンージヌクレンチｌ’　（ＮＡＩ）　’　）の存在及
び逆反応即ちそれぞれの２−ケトカル、Ｊｊノ酸の水素
化のためＩＩＣ＆土、水素化されたニコチンアミ１：″
−アデニ７−−　、）　ニクＬ／オチｉ″’　（ＮＡＤ
Ｈ）の存在が必９であて）。作Ｊ１１の価適を都度は、
１１０〜６０　’にの範囲にあり安定性の至１箇湿度は
市大約４０’Ｇにあり、この脱水素反応に関する至適ｐ
Ｈは約８０〜８５にあり、がっ、逆反応に対する至適ｐ
Ｈは約７０にル）ろ、。

この新規酵素は約６５〜８５の間の１１）Ｉ範囲て最も
安定であ４）。基質Ｌ　−２−ヒ１：′ロキンー４−＝
ノチルーペンクン酸に関するミバエリス定数（ＫＩＶｌ
ｌ　　値）は（１，（５２Ｘ　、１０−３Ｍ　−Ｑ　’
Ｊｒ）　ル。

この力１規酵素（佳、１゛イツチエン・ザンムルグ・７
オン・ミクロ刊ルガニスメン（１）ｅｕｔｓｃｈｅｎＳ
　ａｎ１削＋＋ｎｇ　ｖＯｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇ；ｎ＋
ｉｓ＋ｎｃｎ　　ｉｎ　ＧｉｉＬｔｉｎｇｅｎ）カ［口
火ゴージ）イ）微生物即ちラクト・Ｓシルク・コア　７
　ユｙ、　ス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏｎｆ
ｕｓｕｓ　；　ＤＳＭカタログ番シ号２０１９６）がら
得ることができる。この微生物の培養は、ドイッチェン
・す８ンムルング・フォノ・ミクロオルガニスメンのカ
タログに記載の又は後に記載の栄養培地中で行ナウのが
有利である。次に、ラクトパノルス・コンツユスス（Ｉ
）８Ｍ２（１４９６）からのこσ）新規酵素の取ｍ法を
記載する： Ｉ　微生物の培養 このｌ＠佇のために、ラクトパシルス・コンツユスス（
ＤＳＩＶＴ２　（＋　１９６　）を次の培地中で培養−
するニ ゲルコース　　　　　　２０ｇ 酵素エキス　　　　　　　１０．９ 肉エキス　　　　　　　　０５ｇ 耐酸ナトリウム　　　　　５ｇ Ｋ２ＨＰＯ４２，９ Ｍｇ５０４０．２．１７ Ｍｎ５ｏ４ｏ、　０５　ｇ 脱イオン水　　　　　　令Ｆｉｔ１に の溶液のｐＨ値を６５に調節１−７、次℃・て、］　２
１　’Ｃ（２パール）て１５分間滅菌する。

培養のために、試験管中の培地５　ｍｅに、穿刺恋人、
、−管か１う）のラクトハ／ルス・コンツユスス自制■
」、−・杯を抜挿し２．３０　’（：で１６〜２０時間
培養する。次いで、生長ｔ７た培養物４　ｍｅを、培地
２　（ｌ　Ｏｍｅ　（５００Ｔｎｅ−エーレンマイヤー
フラスコ中）に対−１−る接（Φ培養物として使用・す
る。

２０〜２４時間の後に、このｚｏｏｍ／！を１０１−−
醗酵製餡に対する予備培養物として使用し、次いて゛、
２０　（ｌ　ｉに、かつ引続き、５０００１に接、［中
４ることかできる。。

生長の過程゛二低下するｐＨ値は、醗酵装部中への・卓
続的アンモニア導入により５０に保持ずイ）。対数的生
長用の終り頃に、培養物を冷却し、遠心により旧１１胞
を収得する。このビオマスは−２０’（で大きな活性損
失なしに数週間〜数ケ月［貯蔵することかて゛きる。

２　酵素の取１＠及び精製 ２１）オ且授油出物 ラクト只シルス・コンツユスス−細＆Ｉ　（湿〆〕だビ
オマス）　２　ｓ　ｋｇを、２−メルフｌシトエタノ−
＃　０．１．　（Ｖ／Ｖ）　％を宵有する］００ｍモル
燐酸塩緩衝＊　（ｐＨ７，０）中に懸濁させる。６（１
１の〕！終用、は約４０係の細胞層濁液に相当する。細
胞を連続的に作動する工業用−ガラスノミ−ルー、１ミ
ールミル（ＮＥＴＺＳＣＩＩ　Ｉ、Ｍｇ　２０）中て崩
購さぜる。内容量２２７１の水平に配置された粉砕容器
に０．５５〜０８５關ガラスパールを充填すると、１９
．３　／　（ｓ　ｓ　％　）の振動容置が生じる。この
崩壊は、Ｊ　２００　ＵＭＰの］・Ｕ拌輔回転数及び１
０１）　ｌ／　ｈの貫流速度で実施する。粉砕容器の冷
却外套を、この経過の間に、生成物の加温を充分にさけ
るために、−Ｉ　Ｏ”Ｃ（１，、）エチレングリコール
溶液で冷却する。２回貫流の後に、約９０係の分解率が
達成されろ。）旨？蜀液のｐＩ−１は、ホモゲナイジン
グの間に６３まで低下する。

ｂ）液−液一分配 第１の分配工程を用いて、細胞断片をこの精製抽出物か
ら分離する。このために、ポリエチレングリコール　Ｊ
　５０　（１１８（ｗ／ｗ）％、燐酸塩緩衝液（ｐＨ７
，０）　７　（ｗ／ｗ）％及び粗製抽出物６（）ｌを１
２０ｋｇ−系中に含有する水（１：　２相系を製潰する
。良好な分配を達成するためＣ（、この２相系を２時間
１・Ｕ拌し、引続き、盤形分＋ｒｉｔｔ装置（α−Ｌａ
ｖ；ＩｌのＧｙｒｏｔｅｓｔｃｒ　Ｂ型）を月］いて分
離する。相の分離の間の貫流速度は６０　、（３／　Ｉ
＋てあり、Ｉ　３．５　ｒｎｍの調整ネジ用個ヲ用’、
、□　Ｚ）。十和（８６（１）　＆ｔ、実際［Ｌ　−２
−ヒｌゝロキンー４−メチルペンタン酸−デヒドロゲナ
ーゼの全活性（収率９８４φ）を有すく）。を相は、細
胞断片を含有し、これを捨てろ。

先の工程の酵素含有上相に最終量１７２１に対し、て両
脚し１−ポリエチレングリコール］、　（１０（１（］
　　２　（ｗ／ｖ）％、ｐＨ６，０の燐酸塩緩衝液１０
（＼Ｖ／Ｖ、）係及Ｏ−塩化ナトリウム０．２　Ｍを加
え、２時間［１゛Ｌ拌する。生じるポリエチレングリコ
ール／塩−系をガラス容器中で沈殿させろと、その鋒）
■１−１ぞ９１時間後に完全である。この分配］二程で
゛ば、非常に多量の蛋白質が！げに過剰に存在するＤ−
ラクテートーデヒｌ゛ロゲナーゼの大部分が下相に抽出
されるが、Ｉ、２−ヒドロキシ−４−メチルにンクン酸
−デヒドロゲナーゼ（７］、　ＩＪ　）は、充分に上相
に残る。相の分肉１１は下相の流出により行なつ、。

先の工程の下相に、ｐＨ６，（，１の燐酸塩緩衝液１ｏ
　（Ｗ／ｖ）係及び塩化すｌ・リウノ、０．２　Ｍを添
／Ｊｌ＋し、次いで、］　４２（Ｉｔて充」１１する。

２時間σ）１・Ｉ’＃　４１’時間の後に、沈（般槽中
で相を分１力１１さ１す４）。

Ｌ−２−ヒドロキノ−４−メチル被ンクノ酸−デヒｌ：
″ロゲナーゼー活性か下相（８２／り中に存在する。

Ｃ）透析０・と過 一ト相付ロミコン・中空縁ｔ（ｆパトロ　ネ（Ｒｏｍｉ
ｃｏｎ　　ｌ１ｅｔ＋Ｉ　ｆｓｃｒｐａｔ＋ｏｎｅ　；
　　ｎＦ　ｌ（０−２ｎ−にへＬ−８ｆ１型）中′（゛
濃縮ｌ−１ｐＨ６５の燐酸塩緩衝液の添Ｉ）（１により
、最終濃度２Ｆ１　（ｌ　ｍ　Ｍにｌ瑳るまで透析〈ｌ
を過する。引１妾き、アミコン−中空ｆ＃、イイ［・♀
トローネ（Ａ＋ｎ１ｃｏｎｉ（ｏｈｌｆａｓｅｒｐｑｔ
ｒｏ＋＋ｅ　；　ＩＨ９３０）　ｉａｌ用いて、こσ）
酵素溶液を５００　ｍｅまで濃縮すイ）６、ｄ　）　　
Ｉ）　Ｆ；　Ａ　Ｉ’、−セルロース−クロマトグラフ
ィこの濃縮され透枡絢過された酵素を、５Ｘ４０ＣＭカ
ラノｚ　（Ｗｈ；＋ｔ＋ｎａｎ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　
ＤＥ　５２が充填されて℃・る）にポンプ装入する。こ
のＩ）　Ｅ　Ａ　Ｅ−セルロースを、ｐＨＧ、　５の燐
酸塩緩衝液２（ｉｆ）ｍＭ及７）：２−メルカプトエタ
ノールＯ，］、　（〜ｖ／ｖ）係を陰イＪ−Ｊ−る緩衝
ｉｌｌに対してイ衡化する。このカラムを差当り開始緩
衝液２．５１１で洗浄［７、この酵素を引続き、開始緩
衝液中の０〜１Ｍ塩１ヒナ１．　ＩＪウノ・の直線勾配
／Ｉ’ｆ−（２Ｘ　２　ｌ　）で溶加、さぜる。

Ｌ　−２−−−ヒ）ゞロキシー４−メヂルペンタノ酸−
デヒドロゲナーゼを０３Ｍ哩化ナトリウムで清白（１さ
Ｖ、Ｄ−ラクテート−デヒドロゲナーゼの残分を完全に
分離さげる。活性フラクションを限外婚内により濃縮し
、４°（：で保持する。こσ）不肖製＋［を第１表にま
とめる。

Ｉ、−２−ヒドロキシ−４−メチル深ンクン酸−デヒ）
＋ロゲナーぜの分子量を七フアクリルＳ：’ｌ　ｆｌ　
ｆ）スーパーフーアイン（５ｃｐｈ３ｃｒｙｌ　Ｓ　３
０（１ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ　）を用いるゲル濾過により
約１２５０００１　　　ｌ　５０ｆｌＯ’ｉ’　　）ｌ
ｉ　　ｌ・：／　　ｙｐ−（イｌ用定　１＝　　７＝　
　。　　こ　”：’　Ｐｉ？　９０）％道↓ｌ占性に１
−ゲル濾ｉ、ｆｉ　Ｋより］、　００　Ｕ・ｍ９−１を
越えろ　（ｊ白　；Ｉ：　　で己（良　き　Ａし　プこ
　３゜ン欠θ）１列１で、（層線されプこ］、　−２−
ヒドロキン−４−メチル被ノクン酸−デヒトゝロゲナー
ゼ−調製′吻のイΦ々の２−ヒドロキンカルボン酸を相
応−ｉ−′７．）２−り−トカルボン酸に変じろことに
閏する活性を試１検する。それぞれ最大当初反応速度Ｖ
ｌｌｌａｘ及び■くヤーイ的を乙用定する。

例　　Ｉ Ｌ　−２−ヒ１３０キシー４−メチル（ンクン酸の脱／
Ｊ（素に関する反応速度を次の試１験・Ｓソチで試験し
７た：　ｐＨ８，（ｌの燐酸塩緩衝液０．０９９Ｍ、Ｎ
ＡりＩＯ，３ｍ　Ｍ及び制限−用、の酵素。Ｌ−２−ヒ
１ゝロキンー４−メチルペンクン酸の濃度を０２〜１　
（ｌ　Ｉｌｌ　Ｍの範囲−〇変えた。生じろＮ　Ａ　１
）ｌ−１による吸光度の増加を３４０　ｎ　ｍで測定し
７た。試験を１７−２−ヒドロキシ−４−メチルペンク
ン酸すＬ−に進１イする際に得られる空値な引いた。酵
素活性を国際単位Ｕ　（−ｉｔ’位）で示し２、ここで
ＩＵはＮＡＩ）ＩＩ　ｌμモル／　ｍｉｎ及びｍｅの生
成な７でａ叱ずイ〕。

相応する方法で、他の２−ヒドロキ７カノ１月トン酸に
対Ｊ−る酵素活性を測定した。試験時における相応する
２−ヒドロキンカルボン酸の濃度は、０２〜最大１００
ｍＭの間で変動１．た。基り」濃度の増加により、最大
当初反応速度ＶＩＩＬＲＸを測定１〜だ９ミバエリス一
定数（ＫＭ−値）は、反応速度Ｖか最大当初反応速度の
半分になる際の基質０度（壬ル／　１４　）　Ｋ相当す
る。この反応速度論的定数”　ＩＩＩａＸ及びＫＭをミ
バエリス−メンテ７一式の非線形回帰により４１１ｊ定
し、第２表（Ｃまとめる。

最大当初反応速度Ｖ　　（μモル×ｍＩｎＸｍｇ１１ａ
Ｘ の次元を有する）は、基質飽和（一般にＩ（ＩＸＫ、、
、、さもなければｌＩ″１″に規定される）時に測定し
たＭ活性（Ｕ　／　ｍｅ　）を使用酵素溶液の蛋白！６
含分（ｍ９／　ｒ、ηｔ）で割く〕ことにより得られろ
。

この表は、一連の２−ヒドロキシカルボン酸が酸化さね
、て２−ケトノノル＋１ｆｆン酸Ｖｌなることを示し７
ている。純粋ｏ）Ｌ−エナンチオマー及びり。

１７−混合物に門１．て認められた定数を比較する際に
、Ｄ−成分は、測定した定数の範囲で、反応速度論的定
数に対して何の影響をも有しな℃・ことかわかる。これ
に反して基質濃度１００ｍＭにおいては、既に、明白な
基質過剰−阻害が顕著でＡ））イ）（第３表）。

第３表に記載の相対的活性（Ｕ／ｍＣ）は、基質最終濃
度１　ｍＭ　、ｌ０ｍＭ及び１００ｍＭで測定１〜た。

すべての場合に、同じ酵素性液をＵｌ用しプこ。

反応速度のＮＡＤ″”　Ｍ１４度による依存性をｐ　Ｈ
８，０の燐酸塩緩衝液Ｑ、ＩＭ、Ｌ−２−ヒドロギシ−
４−ノチルーξノタン酸６．３　＋ｎ　Ｍ及び制限量の
酵素を陰有する試験パッチで測定した。ＮＡＤ−濃度は
０．　（１５〜７．０　ｍ　Ｍの間で変動した。

ＮＡＩ）’に閏するＫＭ−値は、ミノ・エリスーシンデ
７式の非線形回帰により測定し、３．３ＸＩ（ｌ　Ｍて
あつ火皿。

次の例２で、種々の２−ケトカルボン酸を相１、シスる
２−ヒ１″′ロキシカルボン酸に変えるための濃縮され
たＬ　−２−ヒドロキン−４−メチルくノクン酸−デヒ
ドロゲナーゼ調製品の活性を試験し、た、それぞれ、最
大当初反応速度ＶＩ１１ａＸ及びＫえ、−値を測定した
。

例　　２ ２−ケト−１−メチルペンタン酸をＬ−２−ヒドロキン
　４−メチル波ンタン酸に変える反応に］９−１する反
応速度を次の試験パッチで測定する：ｐ８７．０のｉ；
メ′ｆ酸塩緩衝’ｌ（ｌ　ＮＡＩ）Ｉ　Ｏ，２３５ｍＭ
及び制限量の酵素。２−り゛トー４−メチルー被ンタン
酸の濃度を００１〜１０ｍＭ（７）範ｌ用で変じたつ反
応を光学試験により追跡し、こσ９試験で、′う４　（
ｌ　ｎ　ｍにおけるＮＡＤＨの吸）’Ｃ，，ＩＩの減少
をカ１１定する。この試験を２−ケト−４−メチル−く
ンタン酸なしに実行する際に得ら、ｌする空（１１を弓
１℃・た。

この酵素活性を国際単位（Ｕ）て゛示し、ここｆｌＵむ
」、ＮＡＤＩ口ｔｔＭ　７’ｍｉｎ及びｍｅσ−）消”
を７Ｇ、唱【−４−る。＋１４１．ｉ、、する方法で、
他の２−ケトプＪ／しＨミン酸に交」−４ろ酵素活性を
測定した。ケト酸−儂１隻をそＡしぞＡし０、　（ｌ　
］〜最大ＩＱＩｎＭの間で変えた。ミノ・工１ノス・一
定数（ＫＭ−値）は１反）１ち速度Ｖカ″−最太当＋）
Ｊ反応速度の半分に達する基質濃度（モル／ｅ）に相当
する。反１．と、速度論的定数■ｌ１ｌａＸ及びＫＭ　
、二ミバエリスーメンテン式σ）：ＪＦ線ツノ１ネ１司
帝に」こ奢）　１ｌｔｌｌ定し、次の第４表（／ｌＣま
とめる。

１Ｎ開昭５９−７４９８３　（７） この表は、一連の２−ケトカル＋ＩＦン酸をし−２−￥
ドロキシー４−メチルくンタン酸を本発明によりＬ　−
２−ヒドロキシ−・１−メチルペノタン酸〜デヒＦロゲ
ナーゼで還元して相応するＬ−２−ヒドロキシ−カル７
ｊクツ酸にすることがテキることを示している。

第５表に記載の相対的活性（Ｕ／ｍ／；）を基質最終濃
度０．１　ｍＭ、　　Ｊ、　ｍＭ及びｌ０ｍＭ’″Ｃ′
測定したつすべての場合に、同じ酵素溶液を用（・た。

ｌ　（ｉｎ創でｔべての基質において、すでに、基質過
循−阻害が認めろ」した。

反応速度とＮＡＤＨ濃度と関係を、ｐＨ７，＋１の燐酸
塩緩衝液０．］］Ｍ、２−ケト−４−メチぐノタン酸０
．７９＋ｎＭ及び制限量の酵素を印有する試験パッチ中
で測定した。Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ濃度をｏ（）１〜０．３３
ｍＭの範囲で変えた。ＮＡＤＴ（に関ずろＫＭ−値をミ
バエリス−ノンテン式の非線形回帰により測定すると３
．３Ｘ］ＯＭである。

第　　５　　表 引続き、次の例３に、米国％許第４３２６０３４号明、
ｌ′１ｌｌ−１に記載の方法による２−ケト−３〜メチ
ルくンクン酸を連続的な酵素的変換により■。

＝２−ヒドロキン−４−メチル被ンタン酸に変じる実験
を記載する。

例　　３ ２５°（７の）ｈ７＋度に保持した容量１１．３ｍ６０
平膜反Ｌｐ；？５　［ＦＩａｃｌ＋ｍｃｍｂｒａｎｒｃ
ａｋｔｏｒ　；磁気攪拌機及び名目上の排除限界５００
０を有する直径６２ｍｍの限外ｉｉ、％過膜；　（Ａｍ
１ｃｏｎ、Ｗｉｔｔｅｎ社製ＹＭ５）を備えた〕を、滅
菌のために＋　１．３　ｍｅ　／　ｌ＋の搬送速度に調
節された配量ポンゾを用（・て、ホルムアルデヒド水溶
液で約５時間洗浄した。引続き、更に約１０時間の間に
蒸溜水によりホルムアルデヒドを押１．出した。その際
、同様に、１　］、　３　ｍｅ　／　ｌ＋の搬送速度で
、約１（）時間滅菌フィルター（０，２μ）を通Ｉ２て
濾過した基ａ溶液（これは、２−ケト−４−メチルペン
タン酸のナトリウムＢ＋　１００　ｍモル／ｅ及びギ酸
ナトリウム４０　（ｌ　ｍモル／ｌ並びに緩衝剤とし１
のり、〒酸カリウム５０ｍモル／６を含有し、苛１シト
ソーダでｐＨ７に調節した）な導入した。更に、滅菌フ
ィルターの前て゛、スプレーを用いる連続的基η配駄に
より、水溶液の形のギ酸塩−デヒ）゛ロゲナーゼの溶液
（基質としてのギ酸塩、２５１〕及びｐＩＩ　８におけ
る活性２６．３　／１モル／　ｍｅ　ｘｍｉｎ、をスプ
レー導入した１、その後、相応（−で水溶液の形のＬ−
２−ヒドロキノ−４−メチル々ンタン酸−デヒドロゲナ
ーゼ（基質としての２−ケト−４−メチルインタノエー
ト、２５　’（、’及びｐＨ７ｆｃおけるン占ｉ生２４
１．７　μモル／ｍｌｙｒｍｎ）０．５　ｍｌをスプレ
ー導入する。この反応の開始のために、更ＬＣ、平均分
子量２００　（］　０を有するボリエヂレノグリコール
に結合しているＮ　Ａ　１）Ｈ５、７３ｍモル／ｌを真
−有する補酵素溶液２　ｍｅをスプレ　嗜人した７、す
べての触媒を導入した後、基質流を１７ｍＪ／ｂＫ高め
ると、４０分の平均帯留時間が１１ＩらＪした。変換率
を濾液流中に設置されたポーラリメータ流液キュベツト
を用（・て連続的に旧跡［−２た９膜の上のＨ−力差は
、当初に０２バ　ルてあり、８作業日の経堝の間に１３
・ξ−ルに−１，荷した。１９１時間（約８８）の作業
時間内に、］、−］２−ヒドロキンー４−メチルーξン
クン酸２７６ｍモル３７！ｊに相当）か得られた。変換
率は０３９係から７６３％まで低下した（平均変換率８
５．　Ｊ　％　）。この補酵素に関して１、Ｉ　［１ｊ
’＋りの失活重心上９２０チ、ギ酸塩−デヒト８０ゲナ
ーゼに関しては］「１当り４５４チ、Ｉ７２−ヒ１″ロ
キン　４−メチルにンタン酸−デヒ１：’　Ｉ−１ゲナ
ーゼに関しては１日当り４６８係の失活率が得られた。

全作業時間にわムニる空時収率ば、平均して３０７モル
／　ｌ　ｘ　ｄａｙ　モしくは４１１　ｇ／　１Ｘｄａ
ｙであった。補酵素（消費さｉｔた）１モル当り、生成
物７１８　（ｌ　Ｏモルか生じた。これは、ＮＡＤ”（
生得）　６　ｓ、９　ｍｙ／ｚ、ｌ−酸物ｌａｙの要求
−（ｌに相当する。この１奪素要求邦Ｇ土、・１″酸塩
−デヒ１゛ロゲナーゼ４０９ｔＪ／牛成物爾もり、　＜
はＩ、−２−ヒドロキン−４−メチル崎ノタン酸−デヒ
ドロゲナー−−−ｅ　６＋　７　Ｕ／生成酸物ｇであっ
たつ全作業時間の間に測定した平均ギ酸塩−デヒ１５０
ゲナーゼー活性は、３．７４　Ｕ　／ｍｅて゛あり、２
−ヒｉ′″ロキンー４−メチルベノクン酸−テヒ１−ロ
ゲナーゼに関し７では５．４８　Ｕ　／ｍｅて゛あ−）
た。

・Ｉ’均補酵素儂濃度０．４８　ｍモル／ｌでｔ）つた
。

全作業時間にわたる乎均反＋、［−；、速度＋’；ｔ　
２．　Ｉ　３　／Ｌモ／ｌ／　／　ｍｅ　ｘ　ｗｎ−（
１゛あった。

第１頁の続き ヴ■発明者　　ヴエルナー・フンメル ドイツ連邦共和国ブラウンシュ ヴアイク・グリュツクシュトラ ーセ３ ＠発　明　者　ホルスト・シュツテ ドイツ連邦共和国ザルツギツタ 一５１ノルドリング２９アー ０出　願　人　ゲゼルシャフト・フユア・ビオテヒノロ
ギツシエ・フォルシュ ング・ミツト・ベシュレンクテ ル・ハフランク（ゲー・ベー・ エフ） ドイツ連邦共和国ブラウンシュ ヴアイクーシュテックハイム・ マシエローダー・ヴエーク１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　次θ）１１￥性： ２）Ｌ−２−ヒドロキン−４−メチルペンタン１１俊に
   渫１する特異ン占竹Ｌ １〕）ニコチンアミドゞ−アデニンージヌクレオチｌ’
   （ＮＡＤ）依存性、 Ｃ）作用至適温度１０〜６０°Ｃ１ ｄ）　　安定Ｉ／ｌ：全ｌ：度；、　４０　”Ｃ１Ｃ）
   脱水素反応に関する至適ｐＨ仙８ｏ〜８５、「）還元反
   応Ｖこ関する至適ｐＨ値７．　ｏ　イ＝Ｊ近、Ｈ）　　
   Ｉ）Ｉ（−安定範囲６５〜８５、ｈ）　　Ｌ−２−−ヒ
   ドロキシ−４−メチル被ンクン酸に対す′Ｚ、）ミバエ
   リス一定数（Ｋ、−値）０６２　Ｘ　ｌ　Ｏ”ＩＶＴ 及び ＋）Ｌ　　２−ヒドロキンペンタ／酸、Ｌ　−２−ヒド
   ロキシヘキザン酸及びＬ　２−ヒドロキシ−４−（メヂ
   ルメルカブト）−Ｍ酸に対するイ・ｊ加的安定性 を有することを特徴とずろ、Ｌ−２−ヒドロキン−７Ｉ
   −メチル橡ンタン酸−デヒ１５０ケナ−４ｌミ。 ２　次の’Ｉ￥性： ａ）Ｌ−２−−ヒドロキシ−４−メチルくンタン酸に対
   する特異活性、 １））ニコチンアミドゞ−アデニン〜ジヌクレオチｌ”
   （ＮＡＤ）依存性、 Ｃ）作用至適温度１０〜６　（１’Ｃ３（１）安定性至
   適温度く１．４　（１”に、ｅ）脱水素反応に関する至
   適ｐｌ−Ｉ　仙、　ｓ、ｆ−１〜８５、「）還元反応に
   関する至適ＩＮ＋値７．　（］　（＝Ｊ近、ｇ）ρＪｌ
   −安定範囲６５〜８５、 ｈ）　　Ｌ−２−ヒドロキン−４−メヂルベンタン酸に
   対するミバエリス一定数（Ｋや一値）０．６２ＸＩ（、
   Ｉ　　　　Ｍ 及び ｉ）　　Ｉノー２−ヒドロキシベンクン酸、Ｌ−２−ヒ
   ドロキシヘキザン酸及びＬ−２−ヒドロキシ−４−（メ
   チルメルカプト）−酪酸にχ・１するイ・ｊ加的友定性 を有ずろＬ　−２−ヒドロキシ−４−メチルペノタン酸
   −デヒ１−″ロゲナ−ゼを取得するためて、ラクトハシ
   ルス・コンツユスス（ＤＳＭ２０．１９６）を、炭素源
   及び窒素源、並びに無機塩、生長物質及びビタミンを陰
   有し、培養開始時に６５のｐＨ値を有する水性栄養培地
   ｌ−１１−（−培養し、培養終了後に、細胞を遠心分離
   により収得し、これをｐＨ７の緩衝懸濁液中で崩壊させ
   、抽出物から酵素を得ることを特徴と」ろ、Ｉ、−２−
   ヒドロキン−４−メチルペンタン酸−デヒドロゲナーー
   ーーゼの取得法。 ３、Ｌ−２−−ヒドロキン−４−メチルインタン酸、Ｌ
   　２−ヒドロキンペンタン酸、Ｌ−２−ヒドロギシヘギ
   ザン酸又はＬ　−２−ヒドロキ７−４−（メチルメルカ
   プト）−酪酸を、酵素反応で相応する２−ケトカルボン
   酸に変じるかもしくは、２−り゛トー４−メチルペンタ
   ン酸、２−ケトｏンタン酸、２−ケトヘギザン酸又は２
   −ケ）−４−（メチルメルカプト）−酪酸を相応するＬ
   　−２−ヒ１ゝロキンノノルｌ？ン酸に変じるために、
   Ｌ　−２−ヒ１＋ロキンー４−メチル被ンタン酸−デヒ
   ドロゲナーゼを使用することを特徴とする、２−ケトカ
   ルボン酸又はＩ、−２−ヒドロキシカル】１ミン酸の製
   法。