JP3004826B2 - Ｌ−アスパラギン酸の連続製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酵素法によるＬ−アス
パラギン酸の連続製造方法に関するものである。Ｌ−ア
スパラギン酸は重要なアミノ酸の１つとして蛋白質中に
その存在が知られ、医薬、食品添加物として用いられて
おり、その需要が近年急激に増加しつつある。

【０００２】

【従来の技術】従来、アスパルターゼ活性を有する微生
物を用いてフマル酸アンモニウムからＬ−アスパラギン
酸を製造する方法としては、α−アミノ酪酸に耐性を有
する微生物を好気的に培養後反応に供試する方法（特公
昭61−29718号公報）、フマル酸添加培地で培養した微
生物菌体を用いる方法（特開昭60−120983号公報）、天
然物多糖由来のポリマー等に大腸菌（Escherichia col
i）を固定化した固定化酵素充填カラムを用いる方法
（特開昭53-6483号公報）等が知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの製造
法ではＬ−アスパラギン酸の生産効率が悪く、反応設備
が大型となる、汎用性に乏しい等の問題がある為、自由
度に富む連続反応によってＬ−アスパラギン酸を効率高
く製造する方法の開発が望まれていた。本発明者らは、
Ｌ−アスパラギン酸の連続的製造法の開発について鋭意
検討を行ったところ、フマル酸アンモニウムをＬ−アス
パラギン酸に変換するに際し、多段完全混合型連続反応
槽を用い、その第１反応槽の出口におけるフマル酸濃度
が５０〜２００ｍＭに低下するまで、反応を行うことに
より、反応槽サイズが小型化し、フマル酸アンモニウム
をほぼ完全にＬ−アスパラギン酸へ変換することが可能
で、単位反応液容積当たりのＬ−アスパラギン酸収量の
高い、効率的なＬ−アスパラギン酸の製造法を開発して
本発明を完成するに到った。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、アスパルター
ゼ活性を有する微生物菌体の存在下、多段完全混合型連
続反応槽を用いてフマル酸アンモニウムをＬ−アスパラ
ギン酸に変換させるに際し、第１反応槽においてその出
口におけるフマル酸濃度が５０〜２００ｍＭに低下する
まで反応を行うことを特徴とする、Ｌ−アスパラギン酸
の連続的製造方法を提供するものである。本発明によれ
ば、小型反応槽で効率良くＬ−アスパラギン酸を製造で
きる。

【０００５】本発明に使用する微生物としては、アスパ
ルターゼ活性を有する微生物であれば特に限定されない
が、エッシェリヒア（Escherichia）属に属する微生
物、例えばエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)Ｋ
-１２系菌株 ATCC27325、同Ｂ系菌株ATCC11303、同Ｗ系
菌株ATCC9637；ブレビバクテリウム（Brevibacterium）
属に属する微生物、例えばブレビバクテリウム・フラバ
ム（Brevibacterium flavum）ＭＪ-２３３(FERM BP-149
7)、同ＭＪ-２３３-ＡＢ-４１(FERM BP-1498)等が好適
に用いられる。本発明に用いられる上記微生物は、菌体
のまま用いることもできるし、超音波、摩砕、凍結融
解、酵素処理等により物理的または生物的に処理して破
砕した菌体破砕物、および菌体もしくは菌体破砕物をポ
リアクリルアミド、アルギン酸、κ-カラギーナン等の
適当な固定化剤に固定化して使用することもできる。

【０００６】本発明の方法に使用される上記微生物菌体
の調製に使用する培地は特に限定されるものではなく一
般の微生物に使用される培地でよい。培地の炭素源とし
ては、例えば、グルコース、フラクトース、ショ糖等の
糖類；酢酸、フマル酸、リンゴ酸等の有機酸；およびエ
タノール等のアルコールが使用できる。培地の窒素源と
しては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、硝酸アンモニウム、尿素等の無機塩類を用いるこ
とができる。さらに、ペプトン、酵母エキス、肉エキ
ス、コーンスチープリカー、カザミノ酸等の有機栄養素
源も使用することができる。無機塩としては、リン酸一
水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウ
ム、硫酸第一鉄等が用いられる。また、必要に応じて、
チアミン、ビオチン等のビタミン類も適宜添加すること
ができるが、前記天然有機栄養源をもってそれに代替さ
せることも可能である。

【０００７】培養は通気撹拌、振盪等の好気的条件下で
行い、培養温度は２０℃〜４０℃、好ましくは２８℃〜
３７℃である。培養途中のｐＨは５〜１０、好ましくは
７〜８付近であり、培養中のｐＨの調整は、酸又はアル
カリの添加により行う。培養開始時の培地中の炭素源の
濃度は０.０５〜１０重量％であり、例えばグルコース
を使用する場合、グルコース濃度は、好ましくは０.０
５〜１.０重量％、さらに好ましくは０.１〜０.３重量
％が適する。培養期間は１０時間〜４日間、最適期間は
１５時間〜３日間である。

【０００８】このようにして得られた培養物から菌体を
遠心あるいは濾過により集めて、水または適当な緩衝液
で洗浄し、本発明の酵素反応に使用する。好ましくは、
該菌体もしくはその破砕物または固定化物をあらかじめ
Ｌ−アスパラギン酸及びアンモニウムイオンの存在下、
且つｐＨのアルカリ域にて４０℃〜６０℃に加熱処理し
た後に用いることもできる。

【０００９】本発明の方法に用いられる完全混合型連続
反応槽（ＣＳＴＲ；ContinuousStirred Tank-type Reac
tor）とは、撹拌機を備えたいわゆる撹拌槽で、液中の
あらゆる化合物濃度が完全に一様となる様に完全混合し
て連続反応を行う装置を指す。「多段完全混合型連続反
応槽」とは、複数の上記反応槽を直列に連結したものを
指し、通常は２個使用されるが、必要に応じて３個以上
連結することもできる。必要に応じ、反応槽の連結部に
貯溜槽を設けることもできる。

【００１０】反応槽より得られる反応液から微生物菌体
またはその処理物を分離するには、通常、濾過膜が用い
られる。本反応の反応液のｐＨ等を考慮すると、本発明
に用いる濾過膜としては、ポリスルフォンを基材とする
中空糸型の濾過膜が好ましい。濾過膜に求められる排除
限界分子量は反応に用いる処理物により異なり、菌体も
しくは菌体破砕物の固定化物を用いる場合には精密濾過
膜もしくは排除限界分子量が100,000以下の限外濾過膜
を、菌体自体を用いる場合には排除限界分子量が50,000
以下の限外濾過膜を、菌体破砕物を用いる場合には排除
限界分子量が10,000以下の限外濾過膜をそれぞれ用いる
ことができる。本発明の方法に用いられる反応装置の概
略を図１に示す。Ｌ−アスパラギン酸を生成させる反応
液の組成は、フマル酸０.５〜２Ｍ、好ましくは１〜１.
５Ｍ、アンモニア１〜１０Ｍ、好ましくは２〜６Ｍであ
る。本反応液には、さらに塩化カルシウム、炭酸カルシ
ウム等のカルシウム塩、または塩化マグネシウム、硫酸
マグネシウム等のマグネシウム塩を１〜５０ｍＭ、好ま
しくは５〜３０ｍＭの濃度で添加することが望ましい。

【００１１】本発明の方法では、第１反応槽において、
その出口におけるフマル酸の濃度が５０〜２００ｍＭに
低下するまで充分に反応を行わせることが重要である。
フマル酸濃度が上記範囲外であると、目的とするＬ−ア
スパラギン酸の生産効率が低下する。

【００１２】酵素反応は０〜６０℃の温度範囲で実施す
ることができるが、アスパルターゼの安定性を考慮して
２０〜５０℃で実施するのが好ましい。反応終了液中の
Ｌ−アスパラギン酸は常法通り等電点沈殿法等により容
易に回収できる。例えば等電点沈殿法を用いる場合に
は、反応液のｐＨを硫酸等の酸を用いて３前後に調整し
て放置することにより生じる結晶を濾別、遠心分離等に
より回収することができる。

【００１３】

【実施例】以下実施例により本発明を具体的に説明す
る。実施例１： ブレビバクテリウム属菌体を用いたＬ−ア
スパラギン酸の生産 (1) ブレビバクテリウム属菌体の調製 Ａ） ブレビバクテリウム属菌体の培養 尿素４ｇ、硫酸アンモニウム１４ｇ、リン酸一カリウム
０.５ｇ、リン酸二カリウム０.５ｇ、硫酸マグネシウム
・７水塩０.５ｇ、硫酸第１鉄・７水塩６ｍｇ、硫酸マ
ンガン・４〜６水塩６ｍｇ、ビオチン２００μｇ、チア
ミン塩酸１００μｇ、カザミノ酸１ｇ、酵母エキス１
ｇ、脱イオン水１ｌからなる培地１００ｍｌを５００ｍ
ｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で２０分間の滅菌
を行った。この培地にブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ-２３３を一白金耳植菌し、さらに別途滅菌した５０
％(W/V)グルコース水溶液を１ｍｌ添加した後、３３℃
で２０時間振盪前培養を行った。

【００１４】次に、硫酸アンモニウム２３ｇ、リン酸一
カリウム０.５ｇ、リン酸二カリウム０.５ｇ、硫酸マグ
ネシウム・７水塩０.５ｇ、硫酸第１鉄・７水塩２０ｍ
ｇ、硫酸マンガン・４〜６水塩２０ｍｇ、ビオチン２０
０μｇ、チアミン塩酸１００μｇ、カザミノ酸３ｇ、酵
母エキス３ｇ、脱イオン水１ｌからなる本培養培地１.
５ｌを３ｌ容通気撹拌槽に仕込み１２０℃で２０分間の
滅菌を行った後、５０％グルコース溶液を３０ｍｌ添加
し、さらに上記前培養菌液を３０ｍｌ植菌して培養を行
った。培養は、培養温度３３℃、通気量１vvm、回転速
度1,000rpmにて行った。また、アンモニアの添加によ
り、培地のｐＨを７.６に維持した。さらに、培養途中
で、グルコースの不足または枯渇に伴う溶存酸素濃度の
急激な上昇が観察された際には５０％グルコース溶液を
３０ｍｌ添加した。培養開始２０時間後に培養を終了し
て、遠心分離により菌体を回収した。

【００１５】Ｂ） フマラーゼ活性の除去処理 上記Ａ）項にて調製した微生物菌体内にはアスパルター
ゼの他に副反応酵素フマラーゼが共存するため、原料の
フマル酸が一部リンゴ酸に変換される問題が生じるの
で、あらかじめフマラーゼ活性の除去処理を行った。上
記Ａ）項にて調製したブレビバクテリウム属菌体を〔Ｌ
−アスパラギン酸１００ｇ、アンモニア（２８％アンモ
ニア含有水溶液）１４０ｍｌ、塩化カルシウム・２水塩
１ｇ、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウ
レート０．８ｇを脱イオン水に溶解させ、最終容積を１
ｌとした〕処理液に５％(w/v)濃度となるように懸濁し
た後、４５℃にて５時間加熱処理を行った。処理物を遠
心分離して菌体を回収し、これをアスパルターゼ含有菌
体としてＬ−アスパラギン酸生成連続反応に供した。

【００１６】（２） Ｌ−アスパラギン酸生成連続反応 Ｌ−アスパラギン酸生成連続反応に供する反応液とし
て、フマル酸１.３Ｍ、アンモニア３.２Ｍ、塩化カルシ
ウム１５ｍＭを含有する反応液を調製した。各反応槽に
おけるブレビバクテリウム属菌体の菌体濃度を９％(W/
V)、反応温度を４５℃とし、上記反応液を用いて以下の
ような構成の２槽ＣＳＴＲ装置を設定した。すなわち、
上記反応液を１００mｌ/hrの速度で第１反応槽に添加
し、同時に限外濾過膜から反応液だけを等量抜き出し
た。このとき、第１槽ＣＳＴＲ内の反応液量を変化させ
て滞留時間を調節し、第１槽ＣＳＴＲ出口液のフマル酸
濃度を２０〜５００ｍＭとした。次に、第１槽ＣＳＴＲ
から出たフマル酸含有溶液を、１００mｌ/hrの速度で第
２槽ＣＳＴＲに添加し、同時に限外濾過膜から等量抜き
出した。このとき、第２ＣＳＴＲ槽内の液量を変化させ
て滞留時間を調節し、第２槽ＣＳＴＲ出口液のフマル酸
濃度を約１０ｍＭとし、Ｌ−アスパラギン酸の最終生成
量を約１２９０ｍＭとした。なお、反応液と菌体との分
離には、抜き出し速度に対して律速とならないように透
水量を設定した中空糸型限外濾過膜（排除限界分子量2
0,000、ポリスルフォン、日東電工製）を用いた。Ｌ−
アスパラギン酸およびフマル酸の定量は、高速液体クロ
マトグラフィーを用いて行った。

【００１７】実施例２： エッシェリヒア属菌体を用い
たＬ−アスパラギン酸の生産 （１） エッシェリヒア属菌体の調製 Ａ） エッシェリヒア属菌体の培養 硫酸アンモニウム６ｇ、リン酸一カリウム３.２ｇ、リ
ン酸二カリウム１１ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩０.
２ｇ、ポリペプトン２ｇ、酵母エキス２ｇ、脱イオン水
１ｌからなる培地１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラス
コに分注し、１２０℃で２０分間の蒸気滅菌を行った。
この培地にエッシェリヒア・コリATCC27325株を一白金
耳植菌し、さらに別途殺菌した５０％(W/V)グルコース
水溶液を１ｍｌ添加した後、３７℃で２０時間振盪前培
養を行った。次に、１.５ｌの上記培地を３ｌ容通気撹
拌槽に仕込み１２０℃で２０分間の滅菌を行った後、こ
れに濾過除菌した硫酸第１鉄・７水塩水溶液（１００mg
/mｌ）を０.７５ｍｌ、５０％グルコース溶液を３０ｍ
ｌ、それぞれ添加した。その後、上記前培養菌液を３０
ｍｌ添加して培養を行った。培養は、培養温度３７℃、
通気量１vvm、回転速度1000rpmにて行った。また、アン
モニアの添加により培地のｐＨを７.３に維持した。さ
らに、培養途中で、グルコースの不足または枯渇に伴う
溶存酸素濃度の急激な上昇が観察された際には５０％グ
ルコース溶液を３０ｍｌ添加した。培養開始１８時間後
に培養を終了して、遠心分離により菌体を回収した。

【００１８】Ｂ） フマラーゼ活性の除去処理 上記(１)項にて得られた微生物菌体内にはアスパルター
ゼの他に副反応酵素フマラーゼが共存するため、原料の
フマル酸が一部リンゴ酸に変換される問題が生じるの
で、あらかじめフマラーゼ活性の除去処理を行った。上
記(１)項にて得られたエッシェリヒア属菌体を〔Ｌ−ア
スパラギン酸１００ｇ、アンモニア(２８％アンモニア
含有水溶液)１４０ｍｌ、硫酸マグネシウム・７水塩１.
２ｇ、ポリオキシエチレン(２０)ソルビタンモノラウレ
ート０.８ｇを脱イオン水に溶解させ、最終容積を１ｌ
とした〕処理液に５％(w/v)濃度となるように懸濁した
後、４５℃にて３時間加熱処理を行った。処理物を遠心
分離して菌体を回収し、これをアスパルターゼ含有菌体
としてＬ−アスパラギン酸生成連続反応に供した。

【００１９】（２） Ｌ−アスパラギン酸生成連続反応 Ｌ−アスパラギン酸生成連続反応に供する反応液とし
て、フマル酸１.３Ｍ、アンモニア３.２Ｍ、硫酸マグネ
シウム５ｍＭを含有する反応液を調製した。各反応槽に
おけるエッシェリヒア属菌体の菌体濃度を１０％(W/
V)、反応温度を３７℃とし、上記反応液を用いて以下の
ような構成の２槽ＣＳＴＲ装置を設定した。すなわち、
上記反応液を１００mｌ/hrの速度で第１反応槽に添加
し、同時に限外濾過膜から反応液だけを等量抜き出し
た。このとき、第１槽ＣＳＴＲ内の反応液量を変化させ
て滞留時間を調節し、第１槽ＣＳＴＲ出口液のフマル酸
濃度を２０〜５００ｍＭとした。次に、第１槽ＣＳＴＲ
から出たフマル酸含有溶液を、１００mｌ/hrの速度で第
２槽ＣＳＴＲに添加し、同時に限外濾過膜から等量抜き
出した。このとき、第２ＣＳＴＲ槽内の液量を変化させ
て滞留時間を調節し、第２槽ＣＳＴＲ出口液のフマル酸
濃度を約１０ｍＭとし、Ｌ−アスパラギン酸の最終生成
量を約１２９０ｍＭとした。なお、反応液と菌体との分
離には、抜き出し速度に対して律速とならないように透
水量を設定した中空糸型限外濾過膜（排除限界分子量2
0,000、ポリスルフォン、日東電工製）を用いた。Ｌ−
アスパラギン酸およびフマル酸の定量は、高速液体クロ
マトグラフィーを用いて行った。

【００２０】上記実施例１並びに実施例２における第１
および第２槽ＣＳＴＲ内反応液の体積の和に１.７を乗
したものを必要反応槽容積とみなし、これを単位時間当
たりのＬ−アスパラギン酸生産量で除した値、すなわ
ち、単位量の生産に必要な反応槽総容積を「生産性」と
した。第１槽ＣＳＴＲ出口液中のフマル酸濃度の変化に
伴う生産性の違いを下記表−１および表−２に示す。な
お、表では、第１槽ＣＳＴＲ出口液中のフマル酸濃度を
１００ｍＭとしたときの生産性を１.０とした相対値に
より生産性を表した。

【００２１】

【表１】

【００２２】

【表２】

【００２３】表−１および表−２に示したとおり、どの
菌体を用いても、第１槽ＣＳＴＲ出口液中のフマル酸濃
度が５０〜２００ｍＭの範囲内であれば良好な生産性が
認められるが、前記範囲外では大幅に生産性が低下す
る。

【００２４】

【発明の効果】本発明の方法によれば、小さい反応スケ
ールで高いＬ−アスパラギン酸生産性をあげることがで
きる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法に用いられる反応装置の概略図で
ある。

【符号の説明】

１ フマル酸アンモニウム槽 ２ 基質供給管 ３ 完全混合型反応槽（ＣＳＴＲ）第１槽 ４、９ 撹拌羽根 ５、１０ ポンプ ６、１１ 限外濾過膜 ７ 貯留槽 ８ 完全混合型反応槽（ＣＳＴＲ）第２槽 １２ 反応液排出管 １３ 晶析タンク

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 寺沢 真人 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内 (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 13/04 - 13/24 C12M 1/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アスパルターゼ活性を有する微生物菌体
   の存在下、多段完全混合型連続反応槽を用いてフマル酸
   アンモニウムをＬ−アスパラギン酸に変換させるに際
   し、第１反応槽においてその出口におけるフマル酸濃度
   が５０〜２００ｍＭに低下するまで反応を行うことを特
   徴とするＬ−アスパラギン酸の連続製造方法。