JPH05260985A - Ｌ−アスパラギン酸の連続製造方法 - Google Patents
Ｌ−アスパラギン酸の連続製造方法Info
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- JPH05260985A JPH05260985A JP27434392A JP27434392A JPH05260985A JP H05260985 A JPH05260985 A JP H05260985A JP 27434392 A JP27434392 A JP 27434392A JP 27434392 A JP27434392 A JP 27434392A JP H05260985 A JPH05260985 A JP H05260985A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 小さい反応スケールで、高い生産性をあげる
ことのできるＬ−アスパラギン酸の製造法を提供する。 【構成】 アスパルターゼ活性を有する微生物菌体を用
いて、フマル酸アンモニウムをＬ−アスパラギン酸に変
換させる。反応は多段完全混合型連続反応槽を用い、そ
の第一反応槽の出口におけるフマル酸濃度が５０〜２０
０ｍＭに低下するまで反応を行う。
ことのできるＬ−アスパラギン酸の製造法を提供する。 【構成】 アスパルターゼ活性を有する微生物菌体を用
いて、フマル酸アンモニウムをＬ−アスパラギン酸に変
換させる。反応は多段完全混合型連続反応槽を用い、そ
の第一反応槽の出口におけるフマル酸濃度が５０〜２０
０ｍＭに低下するまで反応を行う。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酵素法によるＬ−アス
パラギン酸の連続製造方法に関するものである。Ｌ−ア
スパラギン酸は重要なアミノ酸の１つとして蛋白質中に
その存在が知られ、医薬、食品添加物として用いられて
おり、その需要が近年急激に増加しつつある。
パラギン酸の連続製造方法に関するものである。Ｌ−ア
スパラギン酸は重要なアミノ酸の１つとして蛋白質中に
その存在が知られ、医薬、食品添加物として用いられて
おり、その需要が近年急激に増加しつつある。
【０００２】
【従来の技術】従来、アスパルターゼ活性を有する微生
物を用いてフマル酸アンモニウムからＬ−アスパラギン
酸を製造する方法としては、α−アミノ酪酸に耐性を有
する微生物を好気的に培養後反応に供試する方法（特公
昭61−29718号公報）、フマル酸添加培地で培養した微
生物菌体を用いる方法（特開昭60−120983号公報）、天
然物多糖由来のポリマー等に大腸菌（Escherichia col
i）を固定化した固定化酵素充填カラムを用いる方法
（特開昭53-6483号公報）等が知られている。
物を用いてフマル酸アンモニウムからＬ−アスパラギン
酸を製造する方法としては、α−アミノ酪酸に耐性を有
する微生物を好気的に培養後反応に供試する方法（特公
昭61−29718号公報）、フマル酸添加培地で培養した微
生物菌体を用いる方法（特開昭60−120983号公報）、天
然物多糖由来のポリマー等に大腸菌（Escherichia col
i）を固定化した固定化酵素充填カラムを用いる方法
（特開昭53-6483号公報）等が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの製造
法ではＬ−アスパラギン酸の生産効率が悪く、反応設備
が大型となる、汎用性に乏しい等の問題がある為、自由
度に富む連続反応によってＬ−アスパラギン酸を効率高
く製造する方法の開発が望まれていた。本発明者らは、
Ｌ−アスパラギン酸の連続的製造法の開発について鋭意
検討を行ったところ、フマル酸アンモニウムをＬ−アス
パラギン酸に変換するに際し、多段完全混合型連続反応
槽を用い、その第１反応槽の出口におけるフマル酸濃度
が５０〜２００ｍＭに低下するまで、反応を行うことに
より、反応槽サイズが小型化し、フマル酸アンモニウム
をほぼ完全にＬ−アスパラギン酸へ変換することが可能
で、単位反応液容積当たりのＬ−アスパラギン酸収量の
高い、効率的なＬ−アスパラギン酸の製造法を開発して
本発明を完成するに到った。
法ではＬ−アスパラギン酸の生産効率が悪く、反応設備
が大型となる、汎用性に乏しい等の問題がある為、自由
度に富む連続反応によってＬ−アスパラギン酸を効率高
く製造する方法の開発が望まれていた。本発明者らは、
Ｌ−アスパラギン酸の連続的製造法の開発について鋭意
検討を行ったところ、フマル酸アンモニウムをＬ−アス
パラギン酸に変換するに際し、多段完全混合型連続反応
槽を用い、その第１反応槽の出口におけるフマル酸濃度
が５０〜２００ｍＭに低下するまで、反応を行うことに
より、反応槽サイズが小型化し、フマル酸アンモニウム
をほぼ完全にＬ−アスパラギン酸へ変換することが可能
で、単位反応液容積当たりのＬ−アスパラギン酸収量の
高い、効率的なＬ−アスパラギン酸の製造法を開発して
本発明を完成するに到った。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、アスパルター
ゼ活性を有する微生物菌体の存在下、多段完全混合型連
続反応槽を用いてフマル酸アンモニウムをＬ−アスパラ
ギン酸に変換させるに際し、第１反応槽においてその出
口におけるフマル酸濃度が５０〜２００ｍＭに低下する
まで反応を行うことを特徴とする、Ｌ−アスパラギン酸
の連続的製造方法を提供するものである。本発明によれ
ば、小型反応槽で効率良くＬ−アスパラギン酸を製造で
きる。
ゼ活性を有する微生物菌体の存在下、多段完全混合型連
続反応槽を用いてフマル酸アンモニウムをＬ−アスパラ
ギン酸に変換させるに際し、第１反応槽においてその出
口におけるフマル酸濃度が５０〜２００ｍＭに低下する
まで反応を行うことを特徴とする、Ｌ−アスパラギン酸
の連続的製造方法を提供するものである。本発明によれ
ば、小型反応槽で効率良くＬ−アスパラギン酸を製造で
きる。
【０００５】本発明に使用する微生物としては、アスパ
ルターゼ活性を有する微生物であれば特に限定されない
が、エッシェリヒア（Escherichia）属に属する微生
物、例えばエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)Ｋ
-１２系菌株 ATCC27325、同Ｂ系菌株ATCC11303、同Ｗ系
菌株ATCC9637；ブレビバクテリウム（Brevibacterium）
属に属する微生物、例えばブレビバクテリウム・フラバ
ム（Brevibacterium flavum）ＭＪ-２３３(FERM BP-149
7)、同ＭＪ-２３３-ＡＢ-４１(FERM BP-1498)等が好適
に用いられる。本発明に用いられる上記微生物は、菌体
のまま用いることもできるし、超音波、摩砕、凍結融
解、酵素処理等により物理的または生物的に処理して破
砕した菌体破砕物、および菌体もしくは菌体破砕物をポ
リアクリルアミド、アルギン酸、κ-カラギーナン等の
適当な固定化剤に固定化して使用することもできる。
ルターゼ活性を有する微生物であれば特に限定されない
が、エッシェリヒア（Escherichia）属に属する微生
物、例えばエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)Ｋ
-１２系菌株 ATCC27325、同Ｂ系菌株ATCC11303、同Ｗ系
菌株ATCC9637；ブレビバクテリウム（Brevibacterium）
属に属する微生物、例えばブレビバクテリウム・フラバ
ム（Brevibacterium flavum）ＭＪ-２３３(FERM BP-149
7)、同ＭＪ-２３３-ＡＢ-４１(FERM BP-1498)等が好適
に用いられる。本発明に用いられる上記微生物は、菌体
のまま用いることもできるし、超音波、摩砕、凍結融
解、酵素処理等により物理的または生物的に処理して破
砕した菌体破砕物、および菌体もしくは菌体破砕物をポ
リアクリルアミド、アルギン酸、κ-カラギーナン等の
適当な固定化剤に固定化して使用することもできる。
【０００６】本発明の方法に使用される上記微生物菌体
の調製に使用する培地は特に限定されるものではなく一
般の微生物に使用される培地でよい。培地の炭素源とし
ては、例えば、グルコース、フラクトース、ショ糖等の
糖類；酢酸、フマル酸、リンゴ酸等の有機酸；およびエ
タノール等のアルコールが使用できる。培地の窒素源と
しては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、硝酸アンモニウム、尿素等の無機塩類を用いるこ
とができる。さらに、ペプトン、酵母エキス、肉エキ
ス、コーンスチープリカー、カザミノ酸等の有機栄養素
源も使用することができる。無機塩としては、リン酸一
水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウ
ム、硫酸第一鉄等が用いられる。また、必要に応じて、
チアミン、ビオチン等のビタミン類も適宜添加すること
ができるが、前記天然有機栄養源をもってそれに代替さ
せることも可能である。
の調製に使用する培地は特に限定されるものではなく一
般の微生物に使用される培地でよい。培地の炭素源とし
ては、例えば、グルコース、フラクトース、ショ糖等の
糖類；酢酸、フマル酸、リンゴ酸等の有機酸；およびエ
タノール等のアルコールが使用できる。培地の窒素源と
しては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、硝酸アンモニウム、尿素等の無機塩類を用いるこ
とができる。さらに、ペプトン、酵母エキス、肉エキ
ス、コーンスチープリカー、カザミノ酸等の有機栄養素
源も使用することができる。無機塩としては、リン酸一
水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウ
ム、硫酸第一鉄等が用いられる。また、必要に応じて、
チアミン、ビオチン等のビタミン類も適宜添加すること
ができるが、前記天然有機栄養源をもってそれに代替さ
せることも可能である。
【０００７】培養は通気撹拌、振盪等の好気的条件下で
行い、培養温度は２０℃〜４０℃、好ましくは２８℃〜
３７℃である。培養途中のｐＨは５〜１０、好ましくは
７〜８付近であり、培養中のｐＨの調整は、酸又はアル
カリの添加により行う。培養開始時の培地中の炭素源の
濃度は０.０５〜１０重量％であり、例えばグルコース
を使用する場合、グルコース濃度は、好ましくは０.０
５〜１.０重量％、さらに好ましくは０.１〜０.３重量
％が適する。培養期間は１０時間〜４日間、最適期間は
１５時間〜３日間である。
行い、培養温度は２０℃〜４０℃、好ましくは２８℃〜
３７℃である。培養途中のｐＨは５〜１０、好ましくは
７〜８付近であり、培養中のｐＨの調整は、酸又はアル
カリの添加により行う。培養開始時の培地中の炭素源の
濃度は０.０５〜１０重量％であり、例えばグルコース
を使用する場合、グルコース濃度は、好ましくは０.０
５〜１.０重量％、さらに好ましくは０.１〜０.３重量
％が適する。培養期間は１０時間〜４日間、最適期間は
１５時間〜３日間である。
【０００８】このようにして得られた培養物から菌体を
遠心あるいは濾過により集めて、水または適当な緩衝液
で洗浄し、本発明の酵素反応に使用する。好ましくは、
該菌体もしくはその破砕物または固定化物をあらかじめ
Ｌ−アスパラギン酸及びアンモニウムイオンの存在下、
且つｐＨのアルカリ域にて４０℃〜６０℃に加熱処理し
た後に用いることもできる。
遠心あるいは濾過により集めて、水または適当な緩衝液
で洗浄し、本発明の酵素反応に使用する。好ましくは、
該菌体もしくはその破砕物または固定化物をあらかじめ
Ｌ−アスパラギン酸及びアンモニウムイオンの存在下、
且つｐＨのアルカリ域にて４０℃〜６０℃に加熱処理し
た後に用いることもできる。
【０００９】本発明の方法に用いられる完全混合型連続
反応槽（ＣＳＴＲ；ContinuousStirred Tank-type Reac
tor）とは、撹拌機を備えたいわゆる撹拌槽で、液中の
あらゆる化合物濃度が完全に一様となる様に完全混合し
て連続反応を行う装置を指す。「多段完全混合型連続反
応槽」とは、複数の上記反応槽を直列に連結したものを
指し、通常は２個使用されるが、必要に応じて３個以上
連結することもできる。必要に応じ、反応槽の連結部に
貯溜槽を設けることもできる。
反応槽（ＣＳＴＲ；ContinuousStirred Tank-type Reac
tor）とは、撹拌機を備えたいわゆる撹拌槽で、液中の
あらゆる化合物濃度が完全に一様となる様に完全混合し
て連続反応を行う装置を指す。「多段完全混合型連続反
応槽」とは、複数の上記反応槽を直列に連結したものを
指し、通常は２個使用されるが、必要に応じて３個以上
連結することもできる。必要に応じ、反応槽の連結部に
貯溜槽を設けることもできる。
【００１０】反応槽より得られる反応液から微生物菌体
またはその処理物を分離するには、通常、濾過膜が用い
られる。本反応の反応液のｐＨ等を考慮すると、本発明
に用いる濾過膜としては、ポリスルフォンを基材とする
中空糸型の濾過膜が好ましい。濾過膜に求められる排除
限界分子量は反応に用いる処理物により異なり、菌体も
しくは菌体破砕物の固定化物を用いる場合には精密濾過
膜もしくは排除限界分子量が100,000以下の限外濾過膜
を、菌体自体を用いる場合には排除限界分子量が50,000
以下の限外濾過膜を、菌体破砕物を用いる場合には排除
限界分子量が10,000以下の限外濾過膜をそれぞれ用いる
ことができる。本発明の方法に用いられる反応装置の概
略を図１に示す。Ｌ−アスパラギン酸を生成させる反応
液の組成は、フマル酸０.５〜２Ｍ、好ましくは１〜１.
５Ｍ、アンモニア１〜１０Ｍ、好ましくは２〜６Ｍであ
る。本反応液には、さらに塩化カルシウム、炭酸カルシ
ウム等のカルシウム塩、または塩化マグネシウム、硫酸
マグネシウム等のマグネシウム塩を１〜５０ｍＭ、好ま
しくは５〜３０ｍＭの濃度で添加することが望ましい。
またはその処理物を分離するには、通常、濾過膜が用い
られる。本反応の反応液のｐＨ等を考慮すると、本発明
に用いる濾過膜としては、ポリスルフォンを基材とする
中空糸型の濾過膜が好ましい。濾過膜に求められる排除
限界分子量は反応に用いる処理物により異なり、菌体も
しくは菌体破砕物の固定化物を用いる場合には精密濾過
膜もしくは排除限界分子量が100,000以下の限外濾過膜
を、菌体自体を用いる場合には排除限界分子量が50,000
以下の限外濾過膜を、菌体破砕物を用いる場合には排除
限界分子量が10,000以下の限外濾過膜をそれぞれ用いる
ことができる。本発明の方法に用いられる反応装置の概
略を図１に示す。Ｌ−アスパラギン酸を生成させる反応
液の組成は、フマル酸０.５〜２Ｍ、好ましくは１〜１.
５Ｍ、アンモニア１〜１０Ｍ、好ましくは２〜６Ｍであ
る。本反応液には、さらに塩化カルシウム、炭酸カルシ
ウム等のカルシウム塩、または塩化マグネシウム、硫酸
マグネシウム等のマグネシウム塩を１〜５０ｍＭ、好ま
しくは５〜３０ｍＭの濃度で添加することが望ましい。
【００１１】本発明の方法では、第１反応槽において、
その出口におけるフマル酸の濃度が５０〜２００ｍＭに
低下するまで充分に反応を行わせることが重要である。
フマル酸濃度が上記範囲外であると、目的とするＬ−ア
スパラギン酸の生産効率が低下する。
その出口におけるフマル酸の濃度が５０〜２００ｍＭに
低下するまで充分に反応を行わせることが重要である。
フマル酸濃度が上記範囲外であると、目的とするＬ−ア
スパラギン酸の生産効率が低下する。
【００１２】酵素反応は０〜６０℃の温度範囲で実施す
ることができるが、アスパルターゼの安定性を考慮して
２０〜５０℃で実施するのが好ましい。反応終了液中の
Ｌ−アスパラギン酸は常法通り等電点沈殿法等により容
易に回収できる。例えば等電点沈殿法を用いる場合に
は、反応液のｐＨを硫酸等の酸を用いて３前後に調整し
て放置することにより生じる結晶を濾別、遠心分離等に
より回収することができる。
ることができるが、アスパルターゼの安定性を考慮して
２０〜５０℃で実施するのが好ましい。反応終了液中の
Ｌ−アスパラギン酸は常法通り等電点沈殿法等により容
易に回収できる。例えば等電点沈殿法を用いる場合に
は、反応液のｐＨを硫酸等の酸を用いて３前後に調整し
て放置することにより生じる結晶を濾別、遠心分離等に
より回収することができる。
【００１３】
【実施例】以下実施例により本発明を具体的に説明す
る。実施例１： ブレビバクテリウム属菌体を用いたＬ−ア
スパラギン酸の生産 (1) ブレビバクテリウム属菌体の調製 Ａ） ブレビバクテリウム属菌体の培養 尿素４ｇ、硫酸アンモニウム１４ｇ、リン酸一カリウム
０.５ｇ、リン酸二カリウム０.５ｇ、硫酸マグネシウム
・７水塩０.５ｇ、硫酸第１鉄・７水塩６ｍｇ、硫酸マ
ンガン・４〜６水塩６ｍｇ、ビオチン２００μｇ、チア
ミン塩酸１００μｇ、カザミノ酸１ｇ、酵母エキス１
ｇ、脱イオン水１ｌからなる培地１００ｍｌを５００ｍ
ｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で２０分間の滅菌
を行った。この培地にブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ-２３３を一白金耳植菌し、さらに別途滅菌した５０
％(W/V)グルコース水溶液を１ｍｌ添加した後、３３℃
で２０時間振盪前培養を行った。
る。実施例１： ブレビバクテリウム属菌体を用いたＬ−ア
スパラギン酸の生産 (1) ブレビバクテリウム属菌体の調製 Ａ） ブレビバクテリウム属菌体の培養 尿素４ｇ、硫酸アンモニウム１４ｇ、リン酸一カリウム
０.５ｇ、リン酸二カリウム０.５ｇ、硫酸マグネシウム
・７水塩０.５ｇ、硫酸第１鉄・７水塩６ｍｇ、硫酸マ
ンガン・４〜６水塩６ｍｇ、ビオチン２００μｇ、チア
ミン塩酸１００μｇ、カザミノ酸１ｇ、酵母エキス１
ｇ、脱イオン水１ｌからなる培地１００ｍｌを５００ｍ
ｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で２０分間の滅菌
を行った。この培地にブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ-２３３を一白金耳植菌し、さらに別途滅菌した５０
％(W/V)グルコース水溶液を１ｍｌ添加した後、３３℃
で２０時間振盪前培養を行った。
【００１４】次に、硫酸アンモニウム２３ｇ、リン酸一
カリウム０.５ｇ、リン酸二カリウム０.５ｇ、硫酸マグ
ネシウム・７水塩０.５ｇ、硫酸第１鉄・７水塩２０ｍ
ｇ、硫酸マンガン・４〜６水塩２０ｍｇ、ビオチン２０
０μｇ、チアミン塩酸１００μｇ、カザミノ酸３ｇ、酵
母エキス３ｇ、脱イオン水１ｌからなる本培養培地１.
５ｌを３ｌ容通気撹拌槽に仕込み１２０℃で２０分間の
滅菌を行った後、５０％グルコース溶液を３０ｍｌ添加
し、さらに上記前培養菌液を３０ｍｌ植菌して培養を行
った。培養は、培養温度３３℃、通気量１vvm、回転速
度1,000rpmにて行った。また、アンモニアの添加によ
り、培地のｐＨを７.６に維持した。さらに、培養途中
で、グルコースの不足または枯渇に伴う溶存酸素濃度の
急激な上昇が観察された際には５０％グルコース溶液を
３０ｍｌ添加した。培養開始２０時間後に培養を終了し
て、遠心分離により菌体を回収した。
カリウム０.５ｇ、リン酸二カリウム０.５ｇ、硫酸マグ
ネシウム・７水塩０.５ｇ、硫酸第１鉄・７水塩２０ｍ
ｇ、硫酸マンガン・４〜６水塩２０ｍｇ、ビオチン２０
０μｇ、チアミン塩酸１００μｇ、カザミノ酸３ｇ、酵
母エキス３ｇ、脱イオン水１ｌからなる本培養培地１.
５ｌを３ｌ容通気撹拌槽に仕込み１２０℃で２０分間の
滅菌を行った後、５０％グルコース溶液を３０ｍｌ添加
し、さらに上記前培養菌液を３０ｍｌ植菌して培養を行
った。培養は、培養温度３３℃、通気量１vvm、回転速
度1,000rpmにて行った。また、アンモニアの添加によ
り、培地のｐＨを７.６に維持した。さらに、培養途中
で、グルコースの不足または枯渇に伴う溶存酸素濃度の
急激な上昇が観察された際には５０％グルコース溶液を
３０ｍｌ添加した。培養開始２０時間後に培養を終了し
て、遠心分離により菌体を回収した。
【００１５】Ｂ） フマラーゼ活性の除去処理 上記Ａ）項にて調製した微生物菌体内にはアスパルター
ゼの他に副反応酵素フマラーゼが共存するため、原料の
フマル酸が一部リンゴ酸に変換される問題が生じるの
で、あらかじめフマラーゼ活性の除去処理を行った。上
記Ａ）項にて調製したブレビバクテリウム属菌体を〔Ｌ
−アスパラギン酸１００ｇ、アンモニア（２８％アンモ
ニア含有水溶液）１４０ｍｌ、塩化カルシウム・２水塩
１ｇ、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウ
レート０．８ｇを脱イオン水に溶解させ、最終容積を１
ｌとした〕処理液に５％(w/v)濃度となるように懸濁し
た後、４５℃にて５時間加熱処理を行った。処理物を遠
心分離して菌体を回収し、これをアスパルターゼ含有菌
体としてＬ−アスパラギン酸生成連続反応に供した。
ゼの他に副反応酵素フマラーゼが共存するため、原料の
フマル酸が一部リンゴ酸に変換される問題が生じるの
で、あらかじめフマラーゼ活性の除去処理を行った。上
記Ａ）項にて調製したブレビバクテリウム属菌体を〔Ｌ
−アスパラギン酸１００ｇ、アンモニア（２８％アンモ
ニア含有水溶液）１４０ｍｌ、塩化カルシウム・２水塩
１ｇ、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウ
レート０．８ｇを脱イオン水に溶解させ、最終容積を１
ｌとした〕処理液に５％(w/v)濃度となるように懸濁し
た後、４５℃にて５時間加熱処理を行った。処理物を遠
心分離して菌体を回収し、これをアスパルターゼ含有菌
体としてＬ−アスパラギン酸生成連続反応に供した。
【００１６】（２） Ｌ−アスパラギン酸生成連続反応 Ｌ−アスパラギン酸生成連続反応に供する反応液とし
て、フマル酸１.３Ｍ、アンモニア３.２Ｍ、塩化カルシ
ウム１５ｍＭを含有する反応液を調製した。各反応槽に
おけるブレビバクテリウム属菌体の菌体濃度を９％(W/
V)、反応温度を４５℃とし、上記反応液を用いて以下の
ような構成の２槽ＣＳＴＲ装置を設定した。すなわち、
上記反応液を１００mｌ/hrの速度で第１反応槽に添加
し、同時に限外濾過膜から反応液だけを等量抜き出し
た。このとき、第１槽ＣＳＴＲ内の反応液量を変化させ
て滞留時間を調節し、第１槽ＣＳＴＲ出口液のフマル酸
濃度を２０〜５００ｍＭとした。次に、第１槽ＣＳＴＲ
から出たフマル酸含有溶液を、１００mｌ/hrの速度で第
２槽ＣＳＴＲに添加し、同時に限外濾過膜から等量抜き
出した。このとき、第２ＣＳＴＲ槽内の液量を変化させ
て滞留時間を調節し、第２槽ＣＳＴＲ出口液のフマル酸
濃度を約１０ｍＭとし、Ｌ−アスパラギン酸の最終生成
量を約１２９０ｍＭとした。なお、反応液と菌体との分
離には、抜き出し速度に対して律速とならないように透
水量を設定した中空糸型限外濾過膜（排除限界分子量2
0,000、ポリスルフォン、日東電工製）を用いた。Ｌ−
アスパラギン酸およびフマル酸の定量は、高速液体クロ
マトグラフィーを用いて行った。
て、フマル酸１.３Ｍ、アンモニア３.２Ｍ、塩化カルシ
ウム１５ｍＭを含有する反応液を調製した。各反応槽に
おけるブレビバクテリウム属菌体の菌体濃度を９％(W/
V)、反応温度を４５℃とし、上記反応液を用いて以下の
ような構成の２槽ＣＳＴＲ装置を設定した。すなわち、
上記反応液を１００mｌ/hrの速度で第１反応槽に添加
し、同時に限外濾過膜から反応液だけを等量抜き出し
た。このとき、第１槽ＣＳＴＲ内の反応液量を変化させ
て滞留時間を調節し、第１槽ＣＳＴＲ出口液のフマル酸
濃度を２０〜５００ｍＭとした。次に、第１槽ＣＳＴＲ
から出たフマル酸含有溶液を、１００mｌ/hrの速度で第
２槽ＣＳＴＲに添加し、同時に限外濾過膜から等量抜き
出した。このとき、第２ＣＳＴＲ槽内の液量を変化させ
て滞留時間を調節し、第２槽ＣＳＴＲ出口液のフマル酸
濃度を約１０ｍＭとし、Ｌ−アスパラギン酸の最終生成
量を約１２９０ｍＭとした。なお、反応液と菌体との分
離には、抜き出し速度に対して律速とならないように透
水量を設定した中空糸型限外濾過膜（排除限界分子量2
0,000、ポリスルフォン、日東電工製）を用いた。Ｌ−
アスパラギン酸およびフマル酸の定量は、高速液体クロ
マトグラフィーを用いて行った。
【００１７】実施例２： エッシェリヒア属菌体を用い
たＬ−アスパラギン酸の生産 （１） エッシェリヒア属菌体の調製 Ａ） エッシェリヒア属菌体の培養 硫酸アンモニウム６ｇ、リン酸一カリウム３.２ｇ、リ
ン酸二カリウム１１ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩０.
２ｇ、ポリペプトン２ｇ、酵母エキス２ｇ、脱イオン水
１ｌからなる培地１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラス
コに分注し、１２０℃で２０分間の蒸気滅菌を行った。
この培地にエッシェリヒア・コリATCC27325株を一白金
耳植菌し、さらに別途殺菌した５０％(W/V)グルコース
水溶液を１ｍｌ添加した後、３７℃で２０時間振盪前培
養を行った。次に、１.５ｌの上記培地を３ｌ容通気撹
拌槽に仕込み１２０℃で２０分間の滅菌を行った後、こ
れに濾過除菌した硫酸第１鉄・７水塩水溶液（１００mg
/mｌ）を０.７５ｍｌ、５０％グルコース溶液を３０ｍ
ｌ、それぞれ添加した。その後、上記前培養菌液を３０
ｍｌ添加して培養を行った。培養は、培養温度３７℃、
通気量１vvm、回転速度1000rpmにて行った。また、アン
モニアの添加により培地のｐＨを７.３に維持した。さ
らに、培養途中で、グルコースの不足または枯渇に伴う
溶存酸素濃度の急激な上昇が観察された際には５０％グ
ルコース溶液を３０ｍｌ添加した。培養開始１８時間後
に培養を終了して、遠心分離により菌体を回収した。
たＬ−アスパラギン酸の生産 （１） エッシェリヒア属菌体の調製 Ａ） エッシェリヒア属菌体の培養 硫酸アンモニウム６ｇ、リン酸一カリウム３.２ｇ、リ
ン酸二カリウム１１ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩０.
２ｇ、ポリペプトン２ｇ、酵母エキス２ｇ、脱イオン水
１ｌからなる培地１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラス
コに分注し、１２０℃で２０分間の蒸気滅菌を行った。
この培地にエッシェリヒア・コリATCC27325株を一白金
耳植菌し、さらに別途殺菌した５０％(W/V)グルコース
水溶液を１ｍｌ添加した後、３７℃で２０時間振盪前培
養を行った。次に、１.５ｌの上記培地を３ｌ容通気撹
拌槽に仕込み１２０℃で２０分間の滅菌を行った後、こ
れに濾過除菌した硫酸第１鉄・７水塩水溶液（１００mg
/mｌ）を０.７５ｍｌ、５０％グルコース溶液を３０ｍ
ｌ、それぞれ添加した。その後、上記前培養菌液を３０
ｍｌ添加して培養を行った。培養は、培養温度３７℃、
通気量１vvm、回転速度1000rpmにて行った。また、アン
モニアの添加により培地のｐＨを７.３に維持した。さ
らに、培養途中で、グルコースの不足または枯渇に伴う
溶存酸素濃度の急激な上昇が観察された際には５０％グ
ルコース溶液を３０ｍｌ添加した。培養開始１８時間後
に培養を終了して、遠心分離により菌体を回収した。
【００１８】Ｂ） フマラーゼ活性の除去処理 上記(１)項にて得られた微生物菌体内にはアスパルター
ゼの他に副反応酵素フマラーゼが共存するため、原料の
フマル酸が一部リンゴ酸に変換される問題が生じるの
で、あらかじめフマラーゼ活性の除去処理を行った。上
記(１)項にて得られたエッシェリヒア属菌体を〔Ｌ−ア
スパラギン酸１００ｇ、アンモニア(２８％アンモニア
含有水溶液)１４０ｍｌ、硫酸マグネシウム・７水塩１.
２ｇ、ポリオキシエチレン(２０)ソルビタンモノラウレ
ート０.８ｇを脱イオン水に溶解させ、最終容積を１ｌ
とした〕処理液に５％(w/v)濃度となるように懸濁した
後、４５℃にて３時間加熱処理を行った。処理物を遠心
分離して菌体を回収し、これをアスパルターゼ含有菌体
としてＬ−アスパラギン酸生成連続反応に供した。
ゼの他に副反応酵素フマラーゼが共存するため、原料の
フマル酸が一部リンゴ酸に変換される問題が生じるの
で、あらかじめフマラーゼ活性の除去処理を行った。上
記(１)項にて得られたエッシェリヒア属菌体を〔Ｌ−ア
スパラギン酸１００ｇ、アンモニア(２８％アンモニア
含有水溶液)１４０ｍｌ、硫酸マグネシウム・７水塩１.
２ｇ、ポリオキシエチレン(２０)ソルビタンモノラウレ
ート０.８ｇを脱イオン水に溶解させ、最終容積を１ｌ
とした〕処理液に５％(w/v)濃度となるように懸濁した
後、４５℃にて３時間加熱処理を行った。処理物を遠心
分離して菌体を回収し、これをアスパルターゼ含有菌体
としてＬ−アスパラギン酸生成連続反応に供した。
【００１９】（２） Ｌ−アスパラギン酸生成連続反応 Ｌ−アスパラギン酸生成連続反応に供する反応液とし
て、フマル酸１.３Ｍ、アンモニア３.２Ｍ、硫酸マグネ
シウム５ｍＭを含有する反応液を調製した。各反応槽に
おけるエッシェリヒア属菌体の菌体濃度を１０％(W/
V)、反応温度を３７℃とし、上記反応液を用いて以下の
ような構成の２槽ＣＳＴＲ装置を設定した。すなわち、
上記反応液を１００mｌ/hrの速度で第１反応槽に添加
し、同時に限外濾過膜から反応液だけを等量抜き出し
た。このとき、第１槽ＣＳＴＲ内の反応液量を変化させ
て滞留時間を調節し、第１槽ＣＳＴＲ出口液のフマル酸
濃度を２０〜５００ｍＭとした。次に、第１槽ＣＳＴＲ
から出たフマル酸含有溶液を、１００mｌ/hrの速度で第
２槽ＣＳＴＲに添加し、同時に限外濾過膜から等量抜き
出した。このとき、第２ＣＳＴＲ槽内の液量を変化させ
て滞留時間を調節し、第２槽ＣＳＴＲ出口液のフマル酸
濃度を約１０ｍＭとし、Ｌ−アスパラギン酸の最終生成
量を約１２９０ｍＭとした。なお、反応液と菌体との分
離には、抜き出し速度に対して律速とならないように透
水量を設定した中空糸型限外濾過膜（排除限界分子量2
0,000、ポリスルフォン、日東電工製）を用いた。Ｌ−
アスパラギン酸およびフマル酸の定量は、高速液体クロ
マトグラフィーを用いて行った。
て、フマル酸１.３Ｍ、アンモニア３.２Ｍ、硫酸マグネ
シウム５ｍＭを含有する反応液を調製した。各反応槽に
おけるエッシェリヒア属菌体の菌体濃度を１０％(W/
V)、反応温度を３７℃とし、上記反応液を用いて以下の
ような構成の２槽ＣＳＴＲ装置を設定した。すなわち、
上記反応液を１００mｌ/hrの速度で第１反応槽に添加
し、同時に限外濾過膜から反応液だけを等量抜き出し
た。このとき、第１槽ＣＳＴＲ内の反応液量を変化させ
て滞留時間を調節し、第１槽ＣＳＴＲ出口液のフマル酸
濃度を２０〜５００ｍＭとした。次に、第１槽ＣＳＴＲ
から出たフマル酸含有溶液を、１００mｌ/hrの速度で第
２槽ＣＳＴＲに添加し、同時に限外濾過膜から等量抜き
出した。このとき、第２ＣＳＴＲ槽内の液量を変化させ
て滞留時間を調節し、第２槽ＣＳＴＲ出口液のフマル酸
濃度を約１０ｍＭとし、Ｌ−アスパラギン酸の最終生成
量を約１２９０ｍＭとした。なお、反応液と菌体との分
離には、抜き出し速度に対して律速とならないように透
水量を設定した中空糸型限外濾過膜（排除限界分子量2
0,000、ポリスルフォン、日東電工製）を用いた。Ｌ−
アスパラギン酸およびフマル酸の定量は、高速液体クロ
マトグラフィーを用いて行った。
【００２０】上記実施例１並びに実施例２における第１
および第２槽ＣＳＴＲ内反応液の体積の和に１.７を乗
したものを必要反応槽容積とみなし、これを単位時間当
たりのＬ−アスパラギン酸生産量で除した値、すなわ
ち、単位量の生産に必要な反応槽総容積を「生産性」と
した。第１槽ＣＳＴＲ出口液中のフマル酸濃度の変化に
伴う生産性の違いを下記表−１および表−２に示す。な
お、表では、第１槽ＣＳＴＲ出口液中のフマル酸濃度を
１００ｍＭとしたときの生産性を１.０とした相対値に
より生産性を表した。
および第２槽ＣＳＴＲ内反応液の体積の和に１.７を乗
したものを必要反応槽容積とみなし、これを単位時間当
たりのＬ−アスパラギン酸生産量で除した値、すなわ
ち、単位量の生産に必要な反応槽総容積を「生産性」と
した。第１槽ＣＳＴＲ出口液中のフマル酸濃度の変化に
伴う生産性の違いを下記表−１および表−２に示す。な
お、表では、第１槽ＣＳＴＲ出口液中のフマル酸濃度を
１００ｍＭとしたときの生産性を１.０とした相対値に
より生産性を表した。
【００２１】
【表１】
【００２２】
【表２】
【００２３】表−１および表−２に示したとおり、どの
菌体を用いても、第１槽ＣＳＴＲ出口液中のフマル酸濃
度が５０〜２００ｍＭの範囲内であれば良好な生産性が
認められるが、前記範囲外では大幅に生産性が低下す
る。
菌体を用いても、第１槽ＣＳＴＲ出口液中のフマル酸濃
度が５０〜２００ｍＭの範囲内であれば良好な生産性が
認められるが、前記範囲外では大幅に生産性が低下す
る。
【００２４】
【発明の効果】本発明の方法によれば、小さい反応スケ
ールで高いＬ−アスパラギン酸生産性をあげることがで
きる。
ールで高いＬ−アスパラギン酸生産性をあげることがで
きる。
【図１】本発明の方法に用いられる反応装置の概略図で
ある。
ある。
１ フマル酸アンモニウム槽 ２ 基質供給管 ３ 完全混合型反応槽（ＣＳＴＲ）第１槽 ４、９ 撹拌羽根 ５、１０ ポンプ ６、１１ 限外濾過膜 ７ 貯留槽 ８ 完全混合型反応槽（ＣＳＴＲ）第２槽 １２ 反応液排出管 １３ 晶析タンク
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 寺沢 真人 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内 (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内
Claims (1)
- 【請求項１】 アスパルターゼ活性を有する微生物菌体
の存在下、多段完全混合型連続反応槽を用いてフマル酸
アンモニウムをＬ−アスパラギン酸に変換させるに際
し、第１反応槽においてその出口におけるフマル酸濃度
が５０〜２００ｍＭに低下するまで反応を行うことを特
徴とするＬ−アスパラギン酸の連続製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26642191 | 1991-10-15 | ||
| JP3-266421 | 1991-10-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05260985A true JPH05260985A (ja) | 1993-10-12 |
| JP3004826B2 JP3004826B2 (ja) | 2000-01-31 |
Family
ID=
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0833491A (ja) * | 1994-05-20 | 1996-02-06 | Nippon Shokubai Co Ltd | Ｌ−アスパラギン酸の製造方法 |
| WO2005005649A1 (ja) * | 2003-07-09 | 2005-01-20 | Mitsubishi Chemical Corporation | 有機酸の製造方法 |
| US7563606B2 (en) | 2003-09-17 | 2009-07-21 | Mitsubishi Chemical Corporation | Method for producing non-amino organic acid |
| US7763447B2 (en) | 2003-08-28 | 2010-07-27 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing succinic acid with bacterium comprising a modified fumarate reductase gene or a modified succinate dehydrogenase gene |
| US7829316B2 (en) | 2005-10-18 | 2010-11-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for production of succinic acid |
| US7972823B2 (en) | 2004-05-20 | 2011-07-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Succinic acid-producing bacterium and process for producing succinic acid |
| US7993888B2 (en) | 2006-02-24 | 2011-08-09 | Mitsubishi Chemical Corporation | Bacterium having enhanced 2-oxoglutarate dehydrogenase activity |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0833491A (ja) * | 1994-05-20 | 1996-02-06 | Nippon Shokubai Co Ltd | Ｌ−アスパラギン酸の製造方法 |
| JP2664648B2 (ja) * | 1994-05-20 | 1997-10-15 | 株式会社日本触媒 | Ｌ−アスパラギン酸の製造方法 |
| WO2005005649A1 (ja) * | 2003-07-09 | 2005-01-20 | Mitsubishi Chemical Corporation | 有機酸の製造方法 |
| US7833763B2 (en) | 2003-07-09 | 2010-11-16 | Mitsubishi Chemical Corporation | Method for producing organic acid |
| US7763447B2 (en) | 2003-08-28 | 2010-07-27 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing succinic acid with bacterium comprising a modified fumarate reductase gene or a modified succinate dehydrogenase gene |
| US7563606B2 (en) | 2003-09-17 | 2009-07-21 | Mitsubishi Chemical Corporation | Method for producing non-amino organic acid |
| US7972823B2 (en) | 2004-05-20 | 2011-07-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Succinic acid-producing bacterium and process for producing succinic acid |
| US7829316B2 (en) | 2005-10-18 | 2010-11-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for production of succinic acid |
| US7993888B2 (en) | 2006-02-24 | 2011-08-09 | Mitsubishi Chemical Corporation | Bacterium having enhanced 2-oxoglutarate dehydrogenase activity |
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