JPS6332438B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は細菌菌体中でPHBの高い収益率及び
改良された蓄積によりポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロ
キシ酪酸（PHD）をバイオテクノロジーにより
製造する方法に関するものである。 従来から原核性質の微生物の多数はPHBをエ
ネルギー及び炭素に関する貯蔵物質として細胞内
部に蓄積することができることは公知である。微
生物の細胞から単離されたPHBは有効な物理的
性質を有する熱可塑性ポリエステルである。この
性質は今日たとえばポリエチレン又はポリスチロ
ールが使用される目的と同一の目的にポリエステ
ルを使用するのに期待されるものである。しかし
この今日慣用のポリマーに比してPHBはバイオ
テクノロジー法で入手でき、更に生物学的方法で
再び分解することもできるという利点を有する。 PHB−貯蔵微生物の通気培養が栄養媒体の特
異的組成によつて、好ましくは細胞分裂及び増殖
の方向に又は細胞内のPHB−貯蔵の方向に進む
こともすでに公知である。微生物の細胞中での
PHBの蓄積は公知方法に於て栄養媒体中で炭素
源の濃度がその他の、増殖に必要な栄養素、たと
えば窒素及びリンの供給量に比して大きく、微生
物の培養がたとえばアンモニウムを制限した増殖
条件下で行われる時に得られる。 この認識に基づくPHBの二段階製造法はたと
えばヨーロツパ特許第15669号明細書中に記載さ
れている。この方法でMethylobacterium
organophilium属の微生物を先ず窒素及びリンの
完全かつ十分な供給も含めて栄養素の無制限な供
給に於て微生物母集団が培養液体１あたり好ま
しくは菌体20〜25ｇの濃度に達するまで培養す
る。その際この増殖層中に細胞内PHB−蓄積が
生じない。次いで第二発酵段階で培養媒体の窒素
−及び（又は）リン−供給の完全な中止は再生産
及び菌増殖の停止を生ぜしめる。この場合この層
中に初めて細胞内PHB−蓄積が生じる。ヨーロ
ツパ特許第15669号明細書中の記載によればこの
方法で細胞乾燥重量精々25〜47重量％のPHB−
含有量を有する菌体が得られる。 ヨーロツパ特許第46344号明細書中にこれに対
する改良されたPHBの製造に関する発酵法が記
載されている。これはAlcaligenes eutrophus種
の微生物の連続通気培養に基づいている。 その記載によればこの方法で微生物母集団の調
節された増殖及び同時に細胞内PHB−蓄積が次
のことによつて得ることができる。すなわちヨー
ロツパ特許第15669号明細書の方法と反対に増殖
に主要な栄養素及び微量物質の供給、特に窒素の
供給を培養の開始から制限することによる。この
方法で栄養媒体中で炭素源の改良された利用及び
PHBの改良された貯蔵は達成されるが、増殖に
必要な栄養素の供給によつて特異的な増殖速度及
びPHB−生成物形成速度は明らかに減少すると
いう欠点がこの方法に付随する。 この方法に於けるその他の欠点はAlcaligenes
eutrophus種の場合、発酵に対する最適温度範囲
が比較的に低く存在することにある。したがつて
微生物を強い冷却下30〜34℃で培養しなければな
らない。この温度範囲で増殖及びPHB−貯蔵は
高められた温度で培養することができる微生物−
これは比較的大きい温度公差を有する−に於て培
養されるよりもゆつくり進行する。 したがつて前記理由から公知方法の場合PHB
−製造の経済性は満足なPHB−貯蔵量を有する
菌体の培養に不可欠である発酵槽中での長い滞留
時間によつて妨害される。 炭化水素のうちの炭素源としてヨーロツパ特許
第46344号明細書による方法の場合第一にフルク
トースが使用され、特異的にAlcaligenes
eutrophus H16 株から由来する変異株を使用す
る場合のみ栄養素源としてグルコースに変えるこ
とができる。親株からの変異株の培養および淘汰
は操作的に経費がかかるという事情の他に、この
変異株の使用によつてPHBを経済的に製造する
ことができる使用可能な栄養素源の供給は著しく
増加しない。というのは多量に使用される二糖類
−これはグルコースに対する主供給物として使用
する−、たとえば糖蜜中に又は工業的製造された
砂糖溶液中に含有されるシヨ糖がAlcaligenes
eutrophus Ｈ 16 から由来する変異株に対し
ても使用することができないからである。 Alcaligenes eutrophusの他にヨーロツパ特許
第46344号明細書中に更にAlcaligenes属のその他
の種、たとえばAlc.faecalis、Alc.ruhlandii、
Alc.latus、Alc.aquamarinus もPHB−貯蔵に
対して使用できるものとして述べられているが、
この種に対して培養−及び蓄積条件に関する詳細
な記載は全くなく、発明の実施法は発明の詳細な
説明及び実施例中にAlcaligenes cutrophus の
株を用いてしか開示されていない。 これに対して本発明の課題は少ない炭素源の利
用下微生物の菌体中でPHBの高収益率及び改良
された蓄積でもつてPHBのバイオテクノロジー
による経済的製造方法を提供することにある。こ
の方法に於ては公知方法に付随する欠点は回避さ
れる。 今や、この課題を解消するにあたり、
Alcaligenes latus種の菌株及びその変異株を36
〜42℃の温度範囲で培養し、従来PHBの発酵製
造に於て知られていない条件下で発酵処理を実施
した場合、微生物母集団の極めて急速な増殖が同
時の有効なPHB−貯蔵と共に発酵槽中での比較
的短い滞留時間で得られ、使用されうる炭素源の
性質に依存する微生物を著しく除去することがで
きることは驚くべきことである。 従来技術に反して最適な、無制限の栄養素供給
−これは窒素及びリンの完全かつ十分な供給を含
めて−によつて微生物母集団の再製造及び急速な
増殖を促進し、その際驚くべきことに培養を制限
された増殖条件下で行うことなく同時に有効な細
胞内PHB−貯蔵を生じることはPHBに対するこ
の新しい製造方法の著しく顕著な特色である。 この方法で発酵槽中で比較的短い滞留時間内で
従来技術によるPHB−蓄積に比して著しく改良
された蓄積を有する菌体を生じる。それによつて
PHBの製造及び単離は従来可能である方法に比
してより経済的方法でうまくゆく。 それ故に本発明の対象は同化しうる炭素、窒素
及びリンの源並びに微生物の増殖に必要な有機又
は無機の微量栄養素の供給物を含有する水性栄養
媒体中でAlcaligenes 属の微生物を通気培養し
てポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸をバイオテ
クノロジーにより製造する方法である。この方法
はAlcaligenes latus の菌株又はこの微生物か
ら由来するPHB−貯蔵変異株を完全なかつ微生
物の増殖に最適な栄養素の制限されていない供給
下36ないし42℃の温度内で空気に対する飽和値25
〜50％の溶存酸素含有量及び6.5〜7.5PH−値で無
菌条件下で培養し、その際得られた菌体から
PHBを常法で抽出して得ることを特徴とするも
のである。 この方法を実施するためにAlcaligenes latus
のすべて公知の菌株、たとえば菌株DSM
（Deutsche Sammlung von MiKroorganismen）
No. 1122、DSMNo.1123又はDSM No. 1124 が
適する。 この菌株の形態学的性質はPalleroni等による
文献、Int.Journ.of Systematic Bacteriology
28、第416−428頁、（1978）中に記載され、培養
コレクシヨンのカクログ、たとえばAmerican
Type Culture Collection（ATCC）に収録され
ている。DSM−ナンバーによつて同定される微
生物の培養試料は微生物に対するドイツコレクシ
ヨンによつて当業者に自由に入手できる（バイオ
テクノロジー研究協会、ゲツチンゲン、MBH、
ステークハイム、西ドイツ）。 本発明による方法の実施に関して常法で親株か
ら得られる菌体Alcaligenes latusのPHB−貯蔵
変異株も適する。 菌株Alcaligenes latusは経済的PHB−製造に
有利な性質を有するので、一般に増殖及びPHB
−貯蔵のために炭素源の広い範囲を使用すること
ができる。炭素源としてたとえば炭化水素、たと
えばＤーグルコース、Ｄ−フルクトース、ラクト
ース、マルトース、シヨ糖、でんぷん、糖蜜、ベ
タイン、グリーンシロツプ、ヒドロール、、繊維
素加水分解物；有機酸又はそのエステル及び塩、
たとえばグルコン酸、２−ケト−グルコン酸、、
ギ酸、酢酸、酪酸、イソ酪酸、Ｌ−マロン酸、Ｄ
−（−）−酒石酸、アコニツト酸、イタコン酸、ｍ
−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香
酸、ゲンチジン酸、プロトカテキユ酸及びマンデ
ル酸；アルコール、たとえばｎ−プロパノール、
イソプロパノール、２，３−ブチレングリコー
ル、プロピレングリコール、グリセリン；アミノ
酸、たとえばβ−アラニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−
セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−シ
トルリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アミノプチラー
ト、Ｌ−アスパルタート、Ｌ−アスパラギン、Ｌ
−グルタマート、Ｌ−プロリン、ヒプラート、サ
ルコシン及びクレアチン；あるいは更にアミン、
たえばブチルアミンが挙げられる。 しかし通性無機自己栄養微生物としてのその性
質に従つて菌株Alcaligenes latusは、水素と酸
素との混合物の形で二酸化炭素を唯一の炭素源と
して供給する場合、一般に従来算え上げられてい
る炭素源と共に二酸化炭素を使用することもでき
る。 PHBのバイオテクノロジーによる製造法の経
済性は栄養物質中の炭素源の価格に極めて著しく
依存するので、本発明による発酵法に於て大多数
の化合物の利用可能性は大きい利点である。とい
うのは夫々最も安価な炭素源にかえることができ
るからである。 容易に入手できる二糖類の優れた利用可能性は
栄養物質の使用可能性及びPHB−製造の経済性
を顧慮して本発明による方法の驚くべきかつ有利
な特色である。好ましい実施形態で微生物に産業
用砂糖溶液、たとえばグリーンシロツプ又は砂糖
収得の廃棄物、たとえばテンサイ糖蜜中に含有さ
れるシヨ糖を炭素源として供給する。この際再び
菌株Alcaligenes latus DSM No. 1123をシヨ
糖で培養することは高いPHB−生成物形成速度
のゆえに特に有利である。 微生物に分子中に同時に窒素を有する様な同化
しうる炭素化合物の群から供給した場合、炭素−
及び窒素要求は同一の源からおぎなうことができ
る。窒素源としてAlcaligenes latus−菌株のう
ち更にアンモニア、アンモニウム塩、たとえば塩
化アンモニウム又は硫酸アンモニウム及び硝酸塩
を利用する。更に不可欠な窒素要求は産業用及び
生物学的廃水の窒素含有量によつて著しくおぎな
うこともできる。 その他のその鉱物性成分に関する栄養溶液の組
成はリンを、たとえばリン酸水素ナトリウム又は
リン酸水素カリウムの形で、マグネシウムを、た
とえば硫酸マグネシウムとして、カルシウムを、
たとえば塩化カルシウム及び鉄をたとえば塩化鉄
（）、硫酸鉄又はクエン酸アンモニウム鉄（）
の形で包含する。増殖に必要なその他の微量鉱物
を栄養媒体に好ましくは微量要素溶液の形で加え
ることができる。これはたとえば次の組成を有す
る： ZnSO₄・7H₂O 100mg／ MnCl₂・4H₂O 30mg／ H₃BO₃ 300mg／ CoCl₂・6H₂O 200mg／ CuSO₄・5H₂O 10mg／ NiCl₂・6H₂O 20mg／ NaMoO₄・2H₂O 30mg／ 本発明による方法の実施にあたり、先ず１又は
数種の前培養をたとえば液状栄養媒体中で製造
し、次いで製造発酵槽中で予め調製された前記組
成の栄養溶液に十分に増殖した前培養を約１：５
〜１：15の割合で植菌する様にして行うのが好ま
しい。 培養の全期間の間消費される栄養物質の補充に
よつて炭素、窒素及びリンに対する源並びにすべ
ての微量栄養素に対する源を細菌増殖に最適な濃
度に保つことが考慮される。本発明に於ける最適
な栄養素供給とは発酵の全期間にわたつて完全な
栄養素供給のすべての成分を培養状態に於て増殖
条件は制限されず、微生物は増殖に必要な栄養
素、たとえば窒素又はリンの供給に於て不足もな
くかつ制限もうけない様な濃度で含有する培養媒
体中での微生物培養のことである。 細菌増殖に対する窒素の最適供給は“モノメリ
ツク テクニツク”（Manometric
Techniques”）、ウムブライト・ダブリユ・ダブ
リユ（Umbreit W.W.）、バーリス・アール・エ
ツチ（Burris R.H.）、スタンフアー・ジエイ・
エス（Stanffer J.S.）、バーゲス（Burges）出版
社、ミネアポリス、アメリカ（1964）に記載され
たバーブルグ（Warburg）の方法についてバー
ブルグ（Warburg）呼吸マスクで測定する。ア
ルカリゲネス・ラチス（Alcaligenes latus）菌
株に対して最適な窒素供給は増殖に対して制限さ
れた条件を調えることなく一般に培養媒体中で全
発酵期間の間に培養液体１あたり窒素濃度少な
くとも45mg／に対して少なくとも200mgの硫酸
アンモニウム濃度が存在する時に行われる。この
際約50〜700mg／の窒素濃度が好ましく、更に
80〜320mg／の濃度が特に好ましい。 最適なリン供給に関して少なくとも500mg／
のリン濃度が好ましい。この場合更に600mg／
〜1.2ｇ／の濃度の維持が特に好ましい。炭素
源として最適な栄養溶液はたとえば培養媒体１
あたりシヨ糖10−40ｇを含有する。 本発明による条件下でAlcaligenes latus菌株
の培養にあたり驚くべきことに栄養素の制限に依
存して、たとえば窒素の供給によつて著しい
PHB貯蔵が生じるのではなく、増殖に付随する
極めて効果的なPHB−貯蔵が微生物に有効な増
殖条件下完全な栄養素供給に於て観察される。こ
の増殖に付随するPHB−貯蔵は特に細胞内PHB
の百分率含有量が増殖につれて細胞乾燥重量の60
重量％以下に決してならないことを示す。 無制限の栄養素供給に於ける増殖に付随する
PHB−貯蔵は特異的な増殖速度も、PHB−生成
物形成速度も栄養素不足によつて減少せず、した
がつて改良されたPHB−蓄積を有する菌体の比
較的大きい濃度は制限された栄養素供給下に操作
する公知方法に比して著しく短い発酵時間内に得
ることができるという利点を有する。 本発明による培養条件の維持下たとえば34時間
発酵槽中に滞留後、培養液体１あたり乾燥菌体
52.2ｇ（細胞乾燥重量74％のPHB−含有量を有
する）を得ることができる。 培養を発酵槽中前記条件下で形成された菌体が
少なくとも60重量％のPHB−含有量、好ましく
は細胞乾燥重量70〜80重量％に達するまで続ける
のが有利である。その際PHB−含有量が少なく
とも60重量％、好ましくは細胞乾燥重量70−80重
量％である時に初めて完全な栄養素供給に不可欠
な栄養媒体が窒素濃度の限界値以下、すなわちほ
ぼ培養液体１あたり窒素45mgの濃度に達する又
は達しない様に栄養媒体に窒素源の連続供給を調
製するのが有利である。 栄養媒体のPH−値を緩衝溶液、たとえばリン酸
塩緩衝溶液又は水性塩基、たとえば水酸化−カリ
ウム又は−ナトリウム溶液の連続的添加によつて
有利に6.5〜7.5の値に、好ましくは6.8〜7.2の値
に調整する。 培養は通気条件下、たとえば酸素−又は空気供
給下で行われる。この際溶存酸素含有量を時間単
位あたり導入される空気−又は酸素量の変化によ
つて空気に関して25〜50％飽和値の範囲に維持す
る。妨害されない増殖及びPHB−蓄積の促進の
ために無菌の空気を撹拌された培養媒体中に加え
る。撹拌回転数の変化によつて溶存酸素含有量を
所望の範囲に維持することもできる。 Alcaligenes latus菌株はAlcaligenes
eutrophus種に反して驚くべきことに熱公差体で
ある。この高められた熱公差は発酵に対する最適
温度範囲が36〜42℃であることを示す。この際37
〜39℃の温度が好ましい。この温度範囲での培養
は増殖及びPHB−貯蔵の促進作用の他に発酵中
の冷却コストを著しく減少することができるとい
う利点を有する。比較的短い滞留時間と共に高め
られた温度で培養することによる冷却コストの節
約は特に重要である。というのは冷却コストは一
般に発酵反応器の作業に於て生じるエネルギーコ
ストの半分であるからである。 前記条件下で培養をバツチ法で、たとえば栄養
溶液の一回又は数回の添加によつて実施すること
ができる。しかし発酵槽を供給法で処理すること
もできる。供給法は培養の間間けつ的に又は連続
的に個々の、数個の又はすべての栄養溶液成分を
微生物の増殖する培養液に無菌の形で発酵槽の処
理容量に達するまで供給することにある。 供給法はバツチ法に比して栄養素の濃度が所望
の範囲内で発酵槽利用容量に達するまでほぼ一定
に保つことができるという利点を有する。 しかし培養液に一方では一定の流れで新らたな
栄養溶液を供給し、他方では発酵槽から供給量と
等量の菌体を含有する培養媒体を取り除く連続処
理方法で発酵を行うのが特に有利である。高い速
度で進行する、増殖に付随するPHB−形成によ
つて連続作業で細胞乾燥重量70〜80重量％の
PHB−蓄積に於て１時間あたり約0.4〜0.35のま
だ高い希釈割合(D)が達成される。希釈割合(D)は平
均滞留時間の相関値である。すべての場合栄養物
質の補充は無菌条件下に行うことを考慮する。 炭素源として炭化水素を使用する場合、本発明
による方法で収益率Y_X/S＝0.42〜0.46が得られる。
すなわち使用される炭化水素１ｇあたりPHB−
含有菌体の形で0.42〜0.46ｇ細胞乾燥重量が得ら
れる。糖蜜又はグリーンスロツプを炭素源として
栄養溶液中に使用した場合、シヨ糖量あたり収益
率Y_X/S＝0.6〜0.75を得ることができる。 PHBの単離のために菌体をデカンテーシヨン、
過又は遠心分離によつて栄養溶液から分離し、
それからPHBを常法でたとえば米国特許第
4101533号明細書による方法に従つて抽出して得
る。 菌体を除いた栄養溶液を残存する栄養素の利用
のために、循環により発酵槽中に回収し、最適な
栄養素濃度を得るために新らたな栄養溶液を加え
る。次いでこの栄養溶液を次の培養に使用するこ
とができる。 次の例によつて本発明を説明する。 例 １ 水性媒体（）４を撹拌される発酵槽中に滅
源された形で導入する。次いでシヨ糖125ｇ／
を含有する水性溶液１を無菌条件下で過し、
発酵内容物を36℃に加熱する。媒体（）は脱イ
オン化された水１あたり次の組成を有する： Na₂HPO₄2H₂O： 4.5ｇ／ KH₂PO₄： 1.5ｇ／ MgSO₄・7H₂O： 0.2ｇ／ （NH₄）₂SO₄： 0.8ｇ／ CaCl₂・2H₂O： 0.02ｇ／ 微量溶液： ２ml／ Fe−NH₄−クエン酸塩（17％Fe）： 0.05ｇ／ 微量溶液は次の組成を有する： ZnSO₄・7H₂O： 100mg／ MnCl₂・4H₂O： 30mg／ H₃BO₃： 300mg／ CoCl₂・6H₂O： 200mg／ CuSO₄・5H₂O： 10mg／ NiCl₂・6H₂O： 20mg／ NaMoO₄・2H₂O： 30mg／ この媒体にAlcaligenes latus菌株DSM 1124
の前培養を植菌し、微生物の培養を通気条件下で
空気に対する飽和値25〜35％の溶存酸素分圧で続
ける。発酵の間、栄養溶液のPH−値を自動滴定機
によつて10％無菌水性NaOH−溶液を用いて7.0
で一定に保つ。更に発酵するにつれてシヨ糖及び
硫酸アンモニウムの数回の添加によつてこの物質
の濃度が開始値の10％以下に減少しないことを考
慮する。39時間の発酵槽中での滞留後、PHB含
有量69重量％を有する乾燥菌体47.6ｇ／が生じ
る。収益率Y_X/S（ｇ細胞乾燥重量／ｇ使用された
シヨ糖）＝0.45 例 ２ 菌株Alcaligenes latus DSM 1123の微生物を
例１に記載した処理条件下38℃の温度で培養す
る。34時間の発酸器中での滞留後、PHB含有量
73.8重量％を有する乾燥菌体51.3ｇ／が生じ
る。収益率Y_X/S＝0.46 例 ３ 菌株Alcaligenes latus DSM 1120の微生物を
例１に記載した処理条件下36℃の温度で培養す
る。37時間の発酸器中での滞留後、PHB含有量
70.2重量％を有する乾燥菌体48.1ｇ／が生じ
る。収益率Y_X/S＝0.45 例 ４ （NH₄）₂SO₄ 2.2ｇ／及び炭素源としてシヨ
糖22ｇ／の開始濃度を有し、その他は例１に記
載した媒体（）と同一の組成を有する培養媒体
20を100の処理容量を有する無菌発酵槽中で
減菌し、予め存在させる。次いで発酵槽に菌株
DSM 1123 のAlcaligenes latusの十分に増殖
された前培養2.5で植菌する。撹拌回転数及び
通気割合の変化によつて溶存酸素含有量を空気に
対する飽和値25〜35％の濃度に調製し、発酵の間
37℃の温度に保つ。栄養溶液のPH−値を自動滴定
機によつて無菌の10％水性NaOH−溶液を用い
て7.0に保つ。 更に発酵するにつれて夫々約0.3ｇ／に
（NH₄）₂SO₄の濃度が減少した時点で媒体（）、
約500ｇ／の濃度を有するシヨ糖溶液及び200
ｇ／の濃度を有する（NH₄）₂SO₄溶液を夫々発
酵槽中に存在する培養液容量に依存して個々の栄
養素成分の濃度が常に制限された濃度以上に保た
れる量で無菌条件下断続的に加える。 全体として発酵槽利用容量に達するまでの培養
の間窒素量281.5ｇに相当する（NH₄）₂SO₄1327
ｇを加える。34時間後、100培養液体の容量で
発酵槽の利用容量は使い尽されPHB−含有量74
重量％を有する乾燥菌体52.2ｇ／が得られる。
これはPHB3863ｇを含有する乾燥菌体5220ｇの
全量である。収益率Y_X/S＝0.46。 発酵内容物の90％を微生物の後処理及びPHB
の抽出のために発酵槽から除去する。発酵槽の残
りの内容物は新らたな処理循環工程に対する前培
養として使用する。27時間後、発酵槽の利用内容
が再び得られ、PHB−含有量74.4重量％を有す
る乾燥菌体52.3ｇ／が得られる。収益率は初め
の発酵に比して変らず高い。 次の５回の処理循環工程のうち発酵に於ける結
果は得られる菌体濃度及び菌体の百分率PHB−
割合に関して及び収益率に関して変化しない。 例 ５ 唯一の炭素源としてシヨ糖15ｇ／の開始濃度
を有し、その他は媒体（）と同一の組成を有す
る培養媒体20を例４に於て記載した条件下で植
菌する。 更に発酵するにつれて栄養物質の濃度を消費速
度及び希釈に合わせて、新らたな栄養溶液を添加
することによつて一定に保つ供給法で連続的に実
施する。新らたな栄養溶液は300ｇ／の濃度を
有するシヨ糖溶液、200ｇ／の濃度を有する
（NH₄）SO₄溶液及び新らたな媒体（）から成
る。 28時間後、この連続的添加条件下で発酵槽100
の最大処理容量が使い尽される。培養液容量は
この時点でPHB−含有量74重量％を有する乾燥
菌体46ｇ／を含有する。収益率Y_X/S＝0.46。 例４に於けると同様に発酵内容物の90％を菌体
の後処理のために発酵槽から除去し、発酵槽の残
りの内容物を前記連続的添加法に従つて新らたな
育成に対する種つけとして使用する。５回の次の
処理循環工程で菌体、PHB−含有量及び収益率
に関して最初の循環工程と同一の結果が得られ
る。 例 ６ 窒素源として（NH₄）₂SO₄1.2ｇ／の開始濃
度及び炭素源としてグルコール８ｇを含有し、そ
の他は例１に記載した媒体（）と同一の濃度を
有する培養媒体20を100の利用容量を有する
無菌の、撹拌される発酵槽中に予め存在させる。
次いで発酵槽にAlcaligenes latus DSM 1122
の十分に増殖した前培養２を植菌する。溶存酸
素含有量を撹拌回転数及び通気割合の変化によつ
て空気に対する飽和値38〜42％の濃度範囲に調製
する。発酵の間39℃の温度を保ち、栄養溶液のPH
−値を自動滴定機によつて無菌の10％水性
NaOH−溶液を用いて7.0に保つ。 更に培養するにつれて、（NH₄）₂SO₄及びグル
コースの濃度を新らたな栄養媒体（）及び
（NH₄）₂SO₄及びグルコースの無菌溶液の連続的
添加によつて保つ。 23時間の処理の後、前記条件下で反応容器の最
大処理容量が得られる。栄養溶液はこの時点で
PHB−含有量74重量％を有する乾燥菌体39ｇ／
を含有する。収益率Y_X/S＝0.42。 培養の流出液を例４及び５と同様に同一の結果
を有する数回の処理循環によつてくり返し使用す
ることができる。 例 ７ 培養を例４に記載した非連続添加方法によつて
実施する。この場合炭素源としてシヨ糖含有量59
重量％のグリーンシロツプを使用する。31時間
後、細胞乾燥重量71％のPHB−含有量を有する
菌体濃度47ｇ／が得られる。収益率Y_X/S＝0.62
（グリーンシロツプ中に含まれるシヨ糖量に対し
て）。 例 ８ 培養を例５に記載した連続添加法によつて実施
する。この場合炭素源としてシヨ糖含有量59重量
％を有するグリーンシロツプを使用する。30分
後、発酵槽中に細胞乾燥重量72％のPHB−含有
量を有する菌体濃度49ｇ／が得られる。収益率
Y_X/S＝0.62（グリーンシロツプ中に含まれるシヨ
糖に対して）。 例 ９ 培養を例４に記載した非連続添加法によつて実
施する。この場合炭素源としてシヨ糖含有量44重
量％を有するテンサイ糖蜜を使用する。33時間
後、前記条件下発酵槽の最大処理容量が得られ
る。培養液容量はこの時点でPHB含有量74重量
％を有する乾燥菌体44ｇ／を含有する。収益率
Y_X/S＝0.72（テンサイ糖蜜中に含まれるシヨ糖量
に対して）。 例 10 培養を例５に記載した連続添加法によつて実施
する。この場合炭素源としてシヨ糖含有量44重量
％を有するテンサイ糖蜜を使用する。前記連続添
加条件下で32時間後、PHB含有量71重量％を有
する乾燥菌体47ｇ／が得られる。収益率Y_X/S＝
0.72（テンサイ糖蜜中に含まれるシヨ糖量に対し
て）。 例 11 15の処理容量を有する無菌の発酵槽中に
（NH₄）₂SO₄ 1.5ｇ／及び炭素源としてシヨ糖
15ｇ／の開始濃度を有し、その他は例１に記載
した媒体（）と同一の組成を有する培養媒体10
を予め存在させ、Alcaligenes latus菌株DSM
1123 の十分に増殖した前培養１で植菌する。
溶存酸素含有量を撹拌回転数及び通気割合によつ
て空気に対する飽和値30％の範囲に保つ。発酵の
間37℃の温度を保ち、PH−値を自動滴定によつて
無菌の10％水性NaOH−溶液によつて7.0に保つ。 更に発酵するにつれて例５と同様に
（NH₄）₂SO₄、シヨ糖及び媒体（）の不断の添
加によつて消費された栄養物質を補充する。 最大処理容量15の達成と同時に連続処理法を
行う。この場合培養液に一方では一定の流れで新
らたな栄養溶液を供給し、他方では発酵槽から供
給量と等量の菌体量を含有する栄養溶液を取り除
く。その菌体は遠心分離によつて得られる。新ら
たに供給された栄養溶液はシヨ糖40ｇ／、
（NH₄）₂SO₄ 4.6ｇ／を含有し、その残りの組
成に於ては媒体（）に相当する。 しばらく後に無菌の同一重量状態が得られる。
この際発酵槽中の培養液容量は細胞乾燥重量71重
量％のPHB−含有量で16.5ｇ／の濃度を有す
る。発酵槽からの流出液は（NH₄）₂SO₄0.45ｇ／
及びシヨ糖4.1ｇ／の残存濃度を有し、菌体
の分離及び栄養溶液として新らたな栄養物質の補
充後再び発酵槽中に回収することができる。 同一重量状態で発酵槽に新らたな栄養媒体６
／ｈを供給する。これはＤ＝0.4h^-1の希釈割合
に相当する。収益率Y_X/S＝0.46。連続処理法を収
益率又は菌体の組成について変化せずに数週間以
上維持することができる。次表に於て
Alcaligenes latus菌株 DSM 1123 を用いて
PHBの連続的製造の作業条件及び結果をまとめ
て示す。 表 ：菌株DSM 1123を用いてPHBを連続的
に製造するための作業条件及び結果 処理容量 15 撹 拌 横板撹拌器 温 度 37℃ PH−値 7.0 O²−濃度（％空気飽和） 30％ 希釈割合Ｄ 0.4 炭素源 シヨ糖 シヨ糖濃度（補給して） 40ｇ／ 窒素源 （NH₄）₂SO₄ 濃 度（NH₄）₂SO₄（補給して） 4.6ｇ／ 残渣濃度 シヨ糖 4.1ｇ／ 残渣濃度 （NH₄）₂SO₄ 0.45ｇ／ シヨ糖消費量 35.9ｇ／ （NH₄）₂SO₄−消費量 4.15ｇ／ 菌体濃度 16.5ｇ／ 微生物のPHB−含有量 71％ 生産性菌体 99.1ｇ／ｈ 生産性PHB 70.4ｇ／ｈ Y_X/シヨ糖 0.46 Y_X/(NH4)2SO4 3.98

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 同化しうる炭素、窒素及びリンの源並びに微
   生物の増殖に必要な有機又は無機の微量栄養素の
   供給物を含有する水性栄養媒体中でAlcaligenes
   属の微生物を通気培養してポリ−Ｄ（−）−３−ヒ
   ドロキシ酪酸（PHB）を製造するにあたり、
   Alcaligenes latusの菌株又はこの微生物から由
   来するPHB−貯蔵変異株を完全なかつ微生物の
   増殖に最適な栄養素の制限されていない供給下36
   ないし42℃の温度範囲で空気に対する飽和値25〜
   50％の溶存酸素含有量及び6.5〜7.5のPH−値で無
   菌条件下で培養し、その際得られた菌体から
   PHBを常法で抽出して得ることを特徴とする前
   記PHBのバイオテクノロジーによる製造方法。 ２ Alcaligenes latus DSM No. 1122、DSM
   No. 1123又はDSM No. 1124の菌株を使用す
   ることよりなる特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ３ 炭素源としてシヨ糖を使用することよりなる
   特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 ４ 菌株Alcaligenes latus DSM No. 1123を
   唯一の炭素源としてシヨ糖を用いて培養すること
   よりなる特許請求の範囲第１項ないし第３項のい
   ずれかに記載した方法。 ５ 培養液体１あたり炭素源としてシヨ糖10〜
   40ｇを含有する栄養媒体中で培養を実施すること
   よりなる特許請求の範囲第１項ないし第４項のい
   ずれかに記載した方法。 ６ 発酵の全時間、培養液体１あたり少なくと
   も45mgの窒素を含有する栄養媒体中で培養を実施
   することよりなる特許請求の範囲第１項ないし第
   ５項のいずれかに記載した方法。 ７ 培養液体１あたり窒素80ないし320mgを含
   有する栄養媒体中で培養を実施施することよりな
   る特許請求の範囲第１項ないし第６項のいずれか
   に記載した方法。 ８ 培養液体１あたり少なくとも500mgのリン
   を含有する栄養媒体中で培養を実施することより
   なる特許請求の範囲第１項ないし第７項のいずれ
   かに記載した方法。 ９ 培養液体１あたりリン600mgないし1.2ｇを
   含有する栄養媒体中で培養を実施することよりな
   る特許請求の範囲第１項ないし第８項のいずれか
   に記載した方法。 １０ 形成された菌体が細胞乾燥重量70〜80重量
   ％のPHB−濃度になるまで培養を継続すること
   よりなる特許請求の範囲第１項ないし第９項のい
   ずれかに記載した方法。 １１ 6.8〜7.2のPH−値で培養を実施することよ
   りなる特許請求の範囲第１項ないし第１０項のい
   ずれかに記載した方法。 １２ 培養を37〜39℃の温度で実施することより
   なる特許請求の範囲第１項ないし第１１項のいず
   れかに記載した方法。 １３ 培養を供給法で実施することよりなる特許
   請求の範囲第１項ないし第１２項のいずれかに記
   載した方法。 １４ 培養を連続的に実施することよりなる特許
   請求の範囲第１項ないし第１２項のいずれかに記
   載した方法。 １５ 栄養溶液を菌体の分離後、循環により発酵
   槽中に回収し、次の培養のために新らたな栄養溶
   液を補充することよりなる特許請求の範囲第１項
   ないし第１４項のいずれかに記載した方法。