JPH0220238B2 - - Google Patents
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Description
本発明は醗酵方法に関し、さらに詳しくはポリ
（β−ヒドロキシ酪酸）（以下、これをPHBと称
する。）の生産方法に関する。 PHBは多くの細菌によつてその菌体内にエネ
ルギー保蔵物質として蓄積される。PHBは熱可
塑性ポリエステルの一種であり、それはそのまま
プラスチツク材料として有用である。 PHB含有微生物を適当な基質、すなわちエネ
ルギーおよび炭素源で好気培養すると、繁殖のた
めに必須の要求物のうちの一つまたはそれ以上が
使用し尽されるまでその微生物は繁殖する。微生
物のかかる繁殖を以下において「生長」と称する
ことにする。ある必須の生長要求物が使用し尽さ
れると、微生物の生長は全くではないが非常に限
定された程度で生ずるだけであるが、基質が使用
し尽されないことを条件としてPHBは該微生物
によつて蓄積されうる。 若干の微生物については、必須な生長要求物の
一つまたはその以上についての制限のような
PHB誘導抑制の不存在下においてさえもPHBは
微生物の生長が生じているときにもまた蓄積され
うる。しかしそのようにして蓄積されるPHBの
量は、一般的に小さくそして生産される菌体の約
10重量％であるのが典型的である。従つて、バツ
チ培養によつて生長されるときに、微生物は生長
のための必須要求物の一つまたはそれ以上が制限
的になり次いで使用し尽されるまで生長するが
PHB蓄積はほとんどまたは全く無く、その次に
微生物はPHBを合成する。生長段階において、
炭素転化率は一般的に約60％以下である。その理
由は基質中のいく分かの炭素が酸化されて二酸化
炭素となり、微生物が生長するのに必要とされる
エネルギーを与えるからである。 ここに「炭素転化率」とは、「生産物中の炭素
のグラム原子数」と「その生産物を生産するのに
用いられた基質中の炭素のグラム原子数」との比
率を意味するものとする。従つて60％の炭素転化
率においては、１モル（６グラム原子の炭素）の
グルコースは生産物中に3.6グラム原子の炭素
（すなわち43.2ｇの結合炭素）を与えたことにな
る。生産物のPHB含量の如何によつて、その炭
素含量は約47〜53重量％の範囲になるであろう
し、従つて60％の炭素転化率において１モル
（180ｇ）のグルコースから生産される生産物の量
は約82〜92ｇの間になろう。 同様にPHB蓄積段階においても、炭素転化率
（基質炭素：PHB炭素）は、グルコースを基質と
して用いる場合に一般に約60％より低くなろう。
我々は、PHB蓄積段階において、菌体のPHB含
量がほぼ50重量％に上がるにつれて炭素転化率が
降下することを発見した。 原料（すなわち基質）のコストはPHB生産の
全体コストにおいて重要な要素であるから、より
高い炭素転化率を達成することが望ましいことは
明かである。 我々は若干の微生物については、生長とPHB
蓄積との両方が同時に起こるような条件下で醗酵
を実施するならば、全体的な炭素転化率を向上し
うることを発見した。 使用しうる微生物の例としては、アルカリゲネ
ス属（Alcaligenes）のPHB蓄積性微生物、例え
ばA.フアセカリス（A.facecalis）、A.ルーランデ
イイ（A.ruhlandii）、A.ラツス（A.ratus）A.ア
クアマリヌス（A.aquamarinus）、およびA.エウ
トロフス（A.eutrophus）種がある。これらの種
は、次の本献に記載されており、それらのいろい
ろな菌株は微生物寄託機関のカタログに記載され
ている。アメリカン・タイプ・カルチユア・コレ
クシヨン（ATCC、米国メリーランド20852、ロ
ツクビレ、パークロンドライブ12301）のカタロ
グに記載されている菌株の例は、 A.フアセカリス ATCC 8750 A.ルーランデイイ ATCC 15749 A.ラツス ATCC 29712 A.アクアマリヌス ATCC 14400 A.エウトロフス ATCC 17699 A.エウトロフス種（従前はヒドロゲノモナ
ス・エウトロフアHydrogenomonas eutrophaと
称されていた）は、好ましい微生物であり、例え
ば菌株H16はA.エウトロフス種の学術的研究に広
く用いられ、例えばJ.General Microbiorogy
（1979）、115、pp185〜192に記載されており、前
述のATCC菌株17699として入手可能であり、そ
して菌株H16の突然変異株、例えば11／7B、
S301／C5、S501／C29およびS501／C41は英国の
ナシヨナル・コレクシヨン・オブ・インダストリ
アル・バクテリア（NCIB、スコツトランド、ア
バーデイーン、トーリイ・リサーチ・ステーシヨ
ン）にそれぞれ、NCIB 11600、11599、11597お
よび11598として1980年８月18日寄託された、 アゾバクター・クロオコツカム（Azobacter
chroococcum）種（例えばNCIB9125菌株）、メ
チロバクテリウム・オルガノフイルム
（Methylobacterium organophilm）種（例えば
NCIB 11482〜11488菌株およびATCC 27866菌
株）、およびシユウドモナスAM1
（PseudomonasAM1）（例えばNCIB 11489菌株）
のような他のタイプのPHB蓄積性微生物につい
ては効果が示されない。 アルカリゲネス・エウトロフス種のような微生
物は基質として水素および二酸化炭素を用いる好
気培養により生長（繁殖）およびPHB蓄積が可
能である。そのような基質については、水素の価
格が主要なフアクターであるが、二酸化炭素は比
較的安価であるので、そのような基質を用いての
炭素転化率の向上はさして有意義でない。しかし
ながら、これらの微生物は水素および炭素が一般
に酸素と共に結合している他の種々の基質をも利
用できる。そのような基質の例としては、有機酸
またはその塩（例えばギ酸塩、酢酸塩、修酸塩、
ピバリン酸塩）、およびフラクトースのような炭
水化物類がある。アルカリゲネス・エウトロフス
種H16菌株（ATCC 17699）は、グルコースを利
用しないであろうが、その菌株のある種の突然変
異株（例えば前述の11／7B、S301／C5、S501／
C29およびS501／C41突然変異株）はグルコース
を利用できる。炭水化物、殊にグルコースは、価
格の面、および微生物を効果的に生長させる点に
おいて好ましい基質である。 向上した炭素転化率の利益を得るには、醗酵
は、生長およびPHB蓄積の両方が同時に起こる
ような条件下で実施する。このようなことはバツ
チ（回分）式醗酵法では何らかの有意な程度まで
可能ではないが、生長のために要求されるものの
PHB蓄積のためには要求されない必須要求物の
一つまたはそれ以上の供給量（醗酵槽への供給
量）を制限することにより連続式醗酵法で達成さ
れうる。 従つて本発明によれば、醗酵槽中でアルカリゲ
ネス属のポリ（β−ヒドロキシ酪酸）蓄積性微生
物を栄養塩類を含む水性培地で好気培養し、該微
生物によつて資化されることができまた少なくと
も炭素及び水素を含む水溶性化合物を炭素及びエ
ネルギー源として使用し、その際に水性培地中の
資化性炭素の量を該微生物がポリ（β−ヒドロキ
シ酪酸）を合成するような量に制限することから
なるポリ（β−ヒドロキシ酪酸）の生産のための
醗酵方法において： ポリ（β−ヒドロキシ酪酸）以外の物質への炭
素の転化効率を改善するために、栄養塩類を含む
水性培地と炭素及びエネルギー源とを醗酵槽へ連
続的または間欠的に供給し、そして醗酵槽中の水
性培地の量を実質的に一定に保つように微生物の
菌体を含む水性培地の同じ量を連続的または間欠
的に取り出すようにして醗酵を連続方式で実施
し、その際の醗酵槽からの菌体含有水性培地の取
り出し速度は醗酵槽から取り出される菌体が平均
で少なくとも25重量％のポリ（β−ヒドロキシ酪
酸）を含むような醗酵槽内平均滞留時間となるよ
うな取り出し速度である、ことを特徴とする上記
ポリ（β−ヒドロキシ酪酸）の生産のための醗酵
方法が提供される。 基質および酸素（これは醗酵槽中の水性培地中
へ空気を吹き込むことにより一般に供給される）
以外に、微生物を生長可能にするために種々の栄
養塩類が必要とされる。従つて、資化可能な形の
下記の元素類（通常は水溶性塩の形）が一般に必
要とされる。すなわち、窒素、リン、硫黄、カリ
ウム、ナトリウム、マグネシウム、カルシウムお
よび鉄ならびに痕跡量のマンガン、亜鉛および銅
のような諸元素である。醗酵槽への酸素の供給を
制限することによりPHB蓄積を誘起することが
可能であるけれども、栄養塩類のうちの一または
それ以上の量を制限するのが好ましい。制限する
のが最も実用的な元素は、窒素、リンあるいは余
り好ましくないがマグネシウム、硫黄またはカリ
ウムである。これらのうちで窒素（これは好適に
はアンモニア塩の形で供給される）の量を制限す
るのが最も好ましい。資化性窒素の要求される量
は、PHBを欠く菌体の所望重量の約８〜15重量
％である。 向上した炭素転化率の利益を享受するには、醗
酵槽から取り出される菌体は少なくとも25重量％
のPHB含量を有すべきであり、この値より低い
と炭素転化率の向上は余り著しくなくなる。 菌体中に蓄積されるPHBの割合は、就中、懸
濁微生物を含む培地の醗酵槽での平均滞留時間に
よつて左右される。充分な基質が供給されている
ことを条件として、滞留時間が長くなれば長くな
るほど、PHBの含量は大きくなる。任意のPHB
含量において最適炭素転化率を得るには、基質の
使用量は、経済的操業に調和して最小量に維持さ
れるべきである。一般に基質をやや過剰に（好ま
しくは少なくとも１ｇ／、殊に２〜５ｇ／）
用いて、醗酵槽から取り出される水性培地中に小
濃度の残留基質があるようにするのが好ましい。 微生物は菌体の全重量を基準にして比較的高割
合のPHB（例えば75wt％まで、あるいは80wt％
まで）を蓄積することができるが、そのような高
割合のPHB含量を達成するための滞留時間は長
すぎて不経済である。従つて滞留時間は、PHB
含量が70wt％以下、殊に35〜65wt％となるよう
な時間であるのが好ましい。 醗酵槽は、PHB含有菌体の乾燥重量が、水性
培地１当り少なくとも５ｇとなるように操作す
るのが好ましい。従つて、例えば40wt％のPHB
含量のPHB含有菌体を１当り10ｇ生産しよう
とする場合には、菌体生長の量を制限するために
用いられる必須栄養の醗酵槽への供給量は、１
当りPHBを含まない菌体６ｇの生長を支持する
に必要とされる量であるべきであり、従つて窒素
を生長制限栄養として使用する場合には、PHB
を含まない菌体の窒素含量は約８〜15wt％であ
るから、要求される資化性窒素の量は１当りア
ンモニウムイオン約0.5〜0.9ｇ（例えば約0.6〜
1.2ｇ）となろう。 醗酵は、当該微生物について慣用的に用いられ
る条件、例えばPH、温度および通気度（ただし酸
素が制限栄養として使用されない場合）、の下で
行われる。同様に栄養塩類（ただし、既に概説し
た考慮によつてその量が決定される生長制限栄養
以外のもの）の使用量は、当該微生物の生長（繁
殖）のために通常用いられる量である。 菌体を含む水性培地は連続的または間欠的に、
醗酵槽に新しい培地が添加される速度に対応する
速度で、醗酵槽から取り出される。醗酵槽から取
り出された菌体を懸濁して含む水性培地は、菌体
からPHBを抽出するための適当な処理に付され
る（あるいはPHB含有菌体を成形用材料として
使用する場合には菌体は水性培地から単に分離さ
れるだけでよい）。 別法として、そのようなPHB抽出および／ま
たは水分離工程の前に、菌体を含む水性培地をさ
らに別の一またはそれ以上の醗酵槽（バツチ式ま
たは連続式）に供給し、そこでさらにPHB蓄積
が生ずるようにすることもできる。この追加の醗
酵工程においては追加量の基質および栄養塩類を
添加してもよいが、一般に菌体をさらに生長させ
ることは望まれないので、第１の醗酵段階で生長
を制限するために用いられた栄養の添加量は、ほ
とんどまたは全く添加されるべきでない。しかし
ながら、第１の醗酵槽から該追加の醗酵槽の供給
される水性培地は若干の残留量の制限栄養を含む
ことがあること、および／または制限栄養の少量
の追加添加は効率的操作のために望ましい場合が
あることは、了解されよう。上記追加の醗酵工程
において、菌体のPHB含量は50〜80wt％にまで
増加されるのが好ましい。そのような追加の醗酵
において用いられる基質は、第１の醗酵において
用いられるものと同一であつても、相異なるもの
であつてもよい。若干の場合には本発明方法の全
体的効率は、第１の醗酵においては菌体物質およ
びPHBの両方に可成り効率的に転化される基質
を用い、他方第２の追加の醗酵工程においては
PHBに効率的に転化されるが微生物を余り効率
的に生長させない有機酸またはその塩（例えば酢
酸塩）のようなものを用いることによつて向上じ
うることがある。 PHBは微生物菌体の内側に顆粒体の形で生産
される。PHBを含む菌体自体を成形用材料とし
て用いること（例えば米国特許第3107172号明細
書参照）ができるが、菌体からPHBを分離する
のが一般に好ましい。このような分離は、菌体を
菌体破壊工程に付し、次いで適当な溶剤でPHB
を抽出することにより行うことができる。適当な
抽出法の例は、我々の欧州特許出願第15123号明
細書に記載されている。 本発明を以下の例によつて説明する（すべての
％は重量％である）。 例 １（比較） 水性培地Ａ（3.5）およびフラクトース（35
ｇ）を公称容積５の撹拌式醗酵槽に仕込み、30
℃に維持した。 培地Ａは脱イオン水１当り下記の組成であつ
た。 （NH4）2SO4 8.65ｇ H3PO4（1.1M） 18ml MgSO4・7H2O 0.6ｇ K2SO4 1.5ｇ Fe2SO4・7H2O １ｇ 微量元素溶液 48ml 上記の微量元素溶液は下記の組成であつた。 カルシウム 720mg／ 銅 ５mg／ マンガン 24mg／ 亜鉛 22mg／ （これらの元素はいずれも可溶性塩の形で用い
た）。 培地にアルカリゲネス・エウトロフスH16
（ATCC 17699）のスターター培養物を接種し、
空気飽和の約60％に相当する溶存酸素張力におい
て醗酵を好気的に実施した。醗酵中、4Mの
NaOH溶液の添加によりPHを自動的に6.8に維持
した。周期的に追加量のフラクトースを添加して
基質の過剰を維持した。合計70時間の醗酵後に、
約70％のPHBを含んだ菌の濃度は、約45ｇ／
であつた。菌体の収量はフラクトース１ｇ当り約
0.45ｇであり、これは約57％の炭素転化率に相当
するものであつた。 例 ２（比較） アルカリゲネス・エウトロフス種のグルコース
利用突然変異株（突然変異株S301／C5）を用い
またフラクトースの代りにグルコースを用いて、
例１の操作を繰返えした。この醗酵では温度を34
℃に維持した。70時間の醗酵後に、この場合にも
菌体の濃度は約45ｇ／であり、また菌体の
PHB含量は約70％であつた。菌体の収量はグル
コース１ｇ当り0.42ｇで、これは約54％の炭素転
化率に相当するものであつた。 例 ３ 培地Ａの代りに、培地Ｂを用いて実施例１を繰
返した。培地Ｂは脱イオン水１当り下記の組成
であつた。 （NH4）2SO4 ２ｇ H3PO4（1.1M） 12ml MgSO4・7H2O 0.8ｇ K2SO4 0.45ｇ FeSO4・7H2O 7.5mg 微量元素溶液 24ml （例１と同） ある期間にわたる回分（バツチ）醗酵の後に、
醗酵槽から菌体含有培地を連続的に取り出すと共
に新しい培地Ｂ（約16ｇ／のフラクトースを添
加したもの）を連続的に供給することにより連続
式醗酵を設定した。ある時間後に定常状態に達
し、これを２時間維持した。定常状態において、
培地の取り出し量は350ml／時であり、これは稀
釈速度（滞留時間の逆数）0.1／時に相当した。
結果は次表に示す。 例 ４ アルカリゲネス・エウトロフス種のグルコース
利用突然変異株（突然変異株S301／C5）を用い
そしてフラクトースの代りにグルコースを用いて
例３の操作を繰返した。この醗酵においては温度
を34℃に維持した。醗酵槽に連続的に供給される
培地Ｂに添加されたグルコースの量は約15ｇ／
であつた。例３〜４の結果を下表に示す。
（β−ヒドロキシ酪酸）（以下、これをPHBと称
する。）の生産方法に関する。 PHBは多くの細菌によつてその菌体内にエネ
ルギー保蔵物質として蓄積される。PHBは熱可
塑性ポリエステルの一種であり、それはそのまま
プラスチツク材料として有用である。 PHB含有微生物を適当な基質、すなわちエネ
ルギーおよび炭素源で好気培養すると、繁殖のた
めに必須の要求物のうちの一つまたはそれ以上が
使用し尽されるまでその微生物は繁殖する。微生
物のかかる繁殖を以下において「生長」と称する
ことにする。ある必須の生長要求物が使用し尽さ
れると、微生物の生長は全くではないが非常に限
定された程度で生ずるだけであるが、基質が使用
し尽されないことを条件としてPHBは該微生物
によつて蓄積されうる。 若干の微生物については、必須な生長要求物の
一つまたはその以上についての制限のような
PHB誘導抑制の不存在下においてさえもPHBは
微生物の生長が生じているときにもまた蓄積され
うる。しかしそのようにして蓄積されるPHBの
量は、一般的に小さくそして生産される菌体の約
10重量％であるのが典型的である。従つて、バツ
チ培養によつて生長されるときに、微生物は生長
のための必須要求物の一つまたはそれ以上が制限
的になり次いで使用し尽されるまで生長するが
PHB蓄積はほとんどまたは全く無く、その次に
微生物はPHBを合成する。生長段階において、
炭素転化率は一般的に約60％以下である。その理
由は基質中のいく分かの炭素が酸化されて二酸化
炭素となり、微生物が生長するのに必要とされる
エネルギーを与えるからである。 ここに「炭素転化率」とは、「生産物中の炭素
のグラム原子数」と「その生産物を生産するのに
用いられた基質中の炭素のグラム原子数」との比
率を意味するものとする。従つて60％の炭素転化
率においては、１モル（６グラム原子の炭素）の
グルコースは生産物中に3.6グラム原子の炭素
（すなわち43.2ｇの結合炭素）を与えたことにな
る。生産物のPHB含量の如何によつて、その炭
素含量は約47〜53重量％の範囲になるであろう
し、従つて60％の炭素転化率において１モル
（180ｇ）のグルコースから生産される生産物の量
は約82〜92ｇの間になろう。 同様にPHB蓄積段階においても、炭素転化率
（基質炭素：PHB炭素）は、グルコースを基質と
して用いる場合に一般に約60％より低くなろう。
我々は、PHB蓄積段階において、菌体のPHB含
量がほぼ50重量％に上がるにつれて炭素転化率が
降下することを発見した。 原料（すなわち基質）のコストはPHB生産の
全体コストにおいて重要な要素であるから、より
高い炭素転化率を達成することが望ましいことは
明かである。 我々は若干の微生物については、生長とPHB
蓄積との両方が同時に起こるような条件下で醗酵
を実施するならば、全体的な炭素転化率を向上し
うることを発見した。 使用しうる微生物の例としては、アルカリゲネ
ス属（Alcaligenes）のPHB蓄積性微生物、例え
ばA.フアセカリス（A.facecalis）、A.ルーランデ
イイ（A.ruhlandii）、A.ラツス（A.ratus）A.ア
クアマリヌス（A.aquamarinus）、およびA.エウ
トロフス（A.eutrophus）種がある。これらの種
は、次の本献に記載されており、それらのいろい
ろな菌株は微生物寄託機関のカタログに記載され
ている。アメリカン・タイプ・カルチユア・コレ
クシヨン（ATCC、米国メリーランド20852、ロ
ツクビレ、パークロンドライブ12301）のカタロ
グに記載されている菌株の例は、 A.フアセカリス ATCC 8750 A.ルーランデイイ ATCC 15749 A.ラツス ATCC 29712 A.アクアマリヌス ATCC 14400 A.エウトロフス ATCC 17699 A.エウトロフス種（従前はヒドロゲノモナ
ス・エウトロフアHydrogenomonas eutrophaと
称されていた）は、好ましい微生物であり、例え
ば菌株H16はA.エウトロフス種の学術的研究に広
く用いられ、例えばJ.General Microbiorogy
（1979）、115、pp185〜192に記載されており、前
述のATCC菌株17699として入手可能であり、そ
して菌株H16の突然変異株、例えば11／7B、
S301／C5、S501／C29およびS501／C41は英国の
ナシヨナル・コレクシヨン・オブ・インダストリ
アル・バクテリア（NCIB、スコツトランド、ア
バーデイーン、トーリイ・リサーチ・ステーシヨ
ン）にそれぞれ、NCIB 11600、11599、11597お
よび11598として1980年８月18日寄託された、 アゾバクター・クロオコツカム（Azobacter
chroococcum）種（例えばNCIB9125菌株）、メ
チロバクテリウム・オルガノフイルム
（Methylobacterium organophilm）種（例えば
NCIB 11482〜11488菌株およびATCC 27866菌
株）、およびシユウドモナスAM1
（PseudomonasAM1）（例えばNCIB 11489菌株）
のような他のタイプのPHB蓄積性微生物につい
ては効果が示されない。 アルカリゲネス・エウトロフス種のような微生
物は基質として水素および二酸化炭素を用いる好
気培養により生長（繁殖）およびPHB蓄積が可
能である。そのような基質については、水素の価
格が主要なフアクターであるが、二酸化炭素は比
較的安価であるので、そのような基質を用いての
炭素転化率の向上はさして有意義でない。しかし
ながら、これらの微生物は水素および炭素が一般
に酸素と共に結合している他の種々の基質をも利
用できる。そのような基質の例としては、有機酸
またはその塩（例えばギ酸塩、酢酸塩、修酸塩、
ピバリン酸塩）、およびフラクトースのような炭
水化物類がある。アルカリゲネス・エウトロフス
種H16菌株（ATCC 17699）は、グルコースを利
用しないであろうが、その菌株のある種の突然変
異株（例えば前述の11／7B、S301／C5、S501／
C29およびS501／C41突然変異株）はグルコース
を利用できる。炭水化物、殊にグルコースは、価
格の面、および微生物を効果的に生長させる点に
おいて好ましい基質である。 向上した炭素転化率の利益を得るには、醗酵
は、生長およびPHB蓄積の両方が同時に起こる
ような条件下で実施する。このようなことはバツ
チ（回分）式醗酵法では何らかの有意な程度まで
可能ではないが、生長のために要求されるものの
PHB蓄積のためには要求されない必須要求物の
一つまたはそれ以上の供給量（醗酵槽への供給
量）を制限することにより連続式醗酵法で達成さ
れうる。 従つて本発明によれば、醗酵槽中でアルカリゲ
ネス属のポリ（β−ヒドロキシ酪酸）蓄積性微生
物を栄養塩類を含む水性培地で好気培養し、該微
生物によつて資化されることができまた少なくと
も炭素及び水素を含む水溶性化合物を炭素及びエ
ネルギー源として使用し、その際に水性培地中の
資化性炭素の量を該微生物がポリ（β−ヒドロキ
シ酪酸）を合成するような量に制限することから
なるポリ（β−ヒドロキシ酪酸）の生産のための
醗酵方法において： ポリ（β−ヒドロキシ酪酸）以外の物質への炭
素の転化効率を改善するために、栄養塩類を含む
水性培地と炭素及びエネルギー源とを醗酵槽へ連
続的または間欠的に供給し、そして醗酵槽中の水
性培地の量を実質的に一定に保つように微生物の
菌体を含む水性培地の同じ量を連続的または間欠
的に取り出すようにして醗酵を連続方式で実施
し、その際の醗酵槽からの菌体含有水性培地の取
り出し速度は醗酵槽から取り出される菌体が平均
で少なくとも25重量％のポリ（β−ヒドロキシ酪
酸）を含むような醗酵槽内平均滞留時間となるよ
うな取り出し速度である、ことを特徴とする上記
ポリ（β−ヒドロキシ酪酸）の生産のための醗酵
方法が提供される。 基質および酸素（これは醗酵槽中の水性培地中
へ空気を吹き込むことにより一般に供給される）
以外に、微生物を生長可能にするために種々の栄
養塩類が必要とされる。従つて、資化可能な形の
下記の元素類（通常は水溶性塩の形）が一般に必
要とされる。すなわち、窒素、リン、硫黄、カリ
ウム、ナトリウム、マグネシウム、カルシウムお
よび鉄ならびに痕跡量のマンガン、亜鉛および銅
のような諸元素である。醗酵槽への酸素の供給を
制限することによりPHB蓄積を誘起することが
可能であるけれども、栄養塩類のうちの一または
それ以上の量を制限するのが好ましい。制限する
のが最も実用的な元素は、窒素、リンあるいは余
り好ましくないがマグネシウム、硫黄またはカリ
ウムである。これらのうちで窒素（これは好適に
はアンモニア塩の形で供給される）の量を制限す
るのが最も好ましい。資化性窒素の要求される量
は、PHBを欠く菌体の所望重量の約８〜15重量
％である。 向上した炭素転化率の利益を享受するには、醗
酵槽から取り出される菌体は少なくとも25重量％
のPHB含量を有すべきであり、この値より低い
と炭素転化率の向上は余り著しくなくなる。 菌体中に蓄積されるPHBの割合は、就中、懸
濁微生物を含む培地の醗酵槽での平均滞留時間に
よつて左右される。充分な基質が供給されている
ことを条件として、滞留時間が長くなれば長くな
るほど、PHBの含量は大きくなる。任意のPHB
含量において最適炭素転化率を得るには、基質の
使用量は、経済的操業に調和して最小量に維持さ
れるべきである。一般に基質をやや過剰に（好ま
しくは少なくとも１ｇ／、殊に２〜５ｇ／）
用いて、醗酵槽から取り出される水性培地中に小
濃度の残留基質があるようにするのが好ましい。 微生物は菌体の全重量を基準にして比較的高割
合のPHB（例えば75wt％まで、あるいは80wt％
まで）を蓄積することができるが、そのような高
割合のPHB含量を達成するための滞留時間は長
すぎて不経済である。従つて滞留時間は、PHB
含量が70wt％以下、殊に35〜65wt％となるよう
な時間であるのが好ましい。 醗酵槽は、PHB含有菌体の乾燥重量が、水性
培地１当り少なくとも５ｇとなるように操作す
るのが好ましい。従つて、例えば40wt％のPHB
含量のPHB含有菌体を１当り10ｇ生産しよう
とする場合には、菌体生長の量を制限するために
用いられる必須栄養の醗酵槽への供給量は、１
当りPHBを含まない菌体６ｇの生長を支持する
に必要とされる量であるべきであり、従つて窒素
を生長制限栄養として使用する場合には、PHB
を含まない菌体の窒素含量は約８〜15wt％であ
るから、要求される資化性窒素の量は１当りア
ンモニウムイオン約0.5〜0.9ｇ（例えば約0.6〜
1.2ｇ）となろう。 醗酵は、当該微生物について慣用的に用いられ
る条件、例えばPH、温度および通気度（ただし酸
素が制限栄養として使用されない場合）、の下で
行われる。同様に栄養塩類（ただし、既に概説し
た考慮によつてその量が決定される生長制限栄養
以外のもの）の使用量は、当該微生物の生長（繁
殖）のために通常用いられる量である。 菌体を含む水性培地は連続的または間欠的に、
醗酵槽に新しい培地が添加される速度に対応する
速度で、醗酵槽から取り出される。醗酵槽から取
り出された菌体を懸濁して含む水性培地は、菌体
からPHBを抽出するための適当な処理に付され
る（あるいはPHB含有菌体を成形用材料として
使用する場合には菌体は水性培地から単に分離さ
れるだけでよい）。 別法として、そのようなPHB抽出および／ま
たは水分離工程の前に、菌体を含む水性培地をさ
らに別の一またはそれ以上の醗酵槽（バツチ式ま
たは連続式）に供給し、そこでさらにPHB蓄積
が生ずるようにすることもできる。この追加の醗
酵工程においては追加量の基質および栄養塩類を
添加してもよいが、一般に菌体をさらに生長させ
ることは望まれないので、第１の醗酵段階で生長
を制限するために用いられた栄養の添加量は、ほ
とんどまたは全く添加されるべきでない。しかし
ながら、第１の醗酵槽から該追加の醗酵槽の供給
される水性培地は若干の残留量の制限栄養を含む
ことがあること、および／または制限栄養の少量
の追加添加は効率的操作のために望ましい場合が
あることは、了解されよう。上記追加の醗酵工程
において、菌体のPHB含量は50〜80wt％にまで
増加されるのが好ましい。そのような追加の醗酵
において用いられる基質は、第１の醗酵において
用いられるものと同一であつても、相異なるもの
であつてもよい。若干の場合には本発明方法の全
体的効率は、第１の醗酵においては菌体物質およ
びPHBの両方に可成り効率的に転化される基質
を用い、他方第２の追加の醗酵工程においては
PHBに効率的に転化されるが微生物を余り効率
的に生長させない有機酸またはその塩（例えば酢
酸塩）のようなものを用いることによつて向上じ
うることがある。 PHBは微生物菌体の内側に顆粒体の形で生産
される。PHBを含む菌体自体を成形用材料とし
て用いること（例えば米国特許第3107172号明細
書参照）ができるが、菌体からPHBを分離する
のが一般に好ましい。このような分離は、菌体を
菌体破壊工程に付し、次いで適当な溶剤でPHB
を抽出することにより行うことができる。適当な
抽出法の例は、我々の欧州特許出願第15123号明
細書に記載されている。 本発明を以下の例によつて説明する（すべての
％は重量％である）。 例 １（比較） 水性培地Ａ（3.5）およびフラクトース（35
ｇ）を公称容積５の撹拌式醗酵槽に仕込み、30
℃に維持した。 培地Ａは脱イオン水１当り下記の組成であつ
た。 （NH4）2SO4 8.65ｇ H3PO4（1.1M） 18ml MgSO4・7H2O 0.6ｇ K2SO4 1.5ｇ Fe2SO4・7H2O １ｇ 微量元素溶液 48ml 上記の微量元素溶液は下記の組成であつた。 カルシウム 720mg／ 銅 ５mg／ マンガン 24mg／ 亜鉛 22mg／ （これらの元素はいずれも可溶性塩の形で用い
た）。 培地にアルカリゲネス・エウトロフスH16
（ATCC 17699）のスターター培養物を接種し、
空気飽和の約60％に相当する溶存酸素張力におい
て醗酵を好気的に実施した。醗酵中、4Mの
NaOH溶液の添加によりPHを自動的に6.8に維持
した。周期的に追加量のフラクトースを添加して
基質の過剰を維持した。合計70時間の醗酵後に、
約70％のPHBを含んだ菌の濃度は、約45ｇ／
であつた。菌体の収量はフラクトース１ｇ当り約
0.45ｇであり、これは約57％の炭素転化率に相当
するものであつた。 例 ２（比較） アルカリゲネス・エウトロフス種のグルコース
利用突然変異株（突然変異株S301／C5）を用い
またフラクトースの代りにグルコースを用いて、
例１の操作を繰返えした。この醗酵では温度を34
℃に維持した。70時間の醗酵後に、この場合にも
菌体の濃度は約45ｇ／であり、また菌体の
PHB含量は約70％であつた。菌体の収量はグル
コース１ｇ当り0.42ｇで、これは約54％の炭素転
化率に相当するものであつた。 例 ３ 培地Ａの代りに、培地Ｂを用いて実施例１を繰
返した。培地Ｂは脱イオン水１当り下記の組成
であつた。 （NH4）2SO4 ２ｇ H3PO4（1.1M） 12ml MgSO4・7H2O 0.8ｇ K2SO4 0.45ｇ FeSO4・7H2O 7.5mg 微量元素溶液 24ml （例１と同） ある期間にわたる回分（バツチ）醗酵の後に、
醗酵槽から菌体含有培地を連続的に取り出すと共
に新しい培地Ｂ（約16ｇ／のフラクトースを添
加したもの）を連続的に供給することにより連続
式醗酵を設定した。ある時間後に定常状態に達
し、これを２時間維持した。定常状態において、
培地の取り出し量は350ml／時であり、これは稀
釈速度（滞留時間の逆数）0.1／時に相当した。
結果は次表に示す。 例 ４ アルカリゲネス・エウトロフス種のグルコース
利用突然変異株（突然変異株S301／C5）を用い
そしてフラクトースの代りにグルコースを用いて
例３の操作を繰返した。この醗酵においては温度
を34℃に維持した。醗酵槽に連続的に供給される
培地Ｂに添加されたグルコースの量は約15ｇ／
であつた。例３〜４の結果を下表に示す。
【表】
される培地中の濃度である。
炭素転化率はバツチ式醗酵（例１および２）で
達成されたものよりも著しく大きいことが判る。
比較のために窒素制限下にメタノール基質でメチ
ロバクテリウム・オルガノフイルム菌株
（NCIB11483）を一段階連続培養した実験では、
0.08／時の稀釈速度で菌体への炭素転化率（最高
値）は53％であり、このような条件で達成された
最高のPHB含量で約11％であつた。 同様に、上記微生物をメタノール基質でバツチ
培養した実験では60時間の培養後に45％のPHB
含量（最高値）が得られ、メタノール１ｇ当り
0.16ｇの菌体収量（菌体への炭素転化率21％に相
当）であつた。 窒素制限下でのグルコース基質でのアゾトバク
ター・クロオコツカム（NCIB 9125）を用いて
の一段階連続培養実験では、0.09／時の稀釈速度
において22〜25％のオーダーの菌体への炭素転化
率（最高値）が達成され、このような条件下では
PHB含量はわずか１〜６％の間で変化した。培
地中で十分な窒素（アンモニウムイオンの形で）
を用いたが毎分醗酵槽中の培地１容当り0.1容の
通気速度を用いることにより、0.1／時の稀釈速
度において溶存酸素張力がゼロになるような酸素
制限下で実施したときには、菌体への初期炭素転
化率60％が達成されたが、８日間にわたる操作後
にその炭素転化率は50％に降下し、また同じ期間
内にPHB含量は51％から31％へ降下した。 同様に酸素制限下でのアゾトバクター・クロオ
コツカム（NCIB 9125）のバツチ培養では、60
〜65時間の醗酵後に、約35％の炭素転化率（最
高）において約65％のPHB含量（最高）を有す
る菌体が得られた。 例 ５ 例４における醗酵槽から連続的に取り出した培
地を、15ｇ／のグルコース（添加）と共に、公
称容積10の第２醗酵槽に連続的供給し、第２の
醗酵槽を再び34℃、PH6.8および空気飽和の約60
％の溶存酸素張力において、実施した。 第２の醗酵槽への培地供給合計量が７に達し
たとき、第１醗酵槽からの添加速度に相当する速
度で培地を第２の醗酵槽から取り出し、第２段階
の稀釈速度を0.05／時とした。 ある期間後に定常状態が達成され、これを２週
間維持した。第２醗酵槽（定常状態時）から取り
出された培地の平均菌体含量は10.91ｇ／であ
り、PHB含量は約70〜75％であつた。この第２
段階における炭素転化率は約45％であつた。 第１および第２両段階の細菌体への総合炭素転
化率は57.9％（すなわち全菌体炭素となつた全グ
ルコース炭素％）であり、PHBへの総合炭素転
化率は43.8％（すなわちPHB炭素となつた全グ
ルコース炭素％）であつた。 例 ６ 窒素制限下で実施される醗酵（すなわち本発明
方法）と、炭素制限下で実施される醗酵（すなわ
ち本発明によらない醗酵、なんとなれば炭素は生
長およびPHB蓄積の両者についての必須要求物
である）との比較を行うために、操作容積２の
同じ実験室用醗酵槽２個を準備した（34℃に維
持）。 用いた水性培地は、脱イオン水１当り下記の
組成であつた。 ５％NH4OH溶液 6.4ml（＝750mgＮ） H3PO4（1.1M） 12ml MgSO4・7H2O 0.8ｇ FeSO4・7H2O 4.17mg 微量元素溶液 36ml （例１と同） カリウムとナトリウムは、4M・KOH（９容）
と4M・NaOH（１容）との混合物を用いてのPH
調整操作によつて供給した。 培地にアルカリゲネス・エウトロフスのグルコ
ース利用突然変株S301／C5のスターター培養物
を接種し、空気飽和の50〜80％に相当する溶存酸
素張力において、基質としてグルコースを用いて
好気醗酵させた。前記KOH／NaOH混液の添加
により、PHを自動的に6.8に維持した。 ある時間のバツチ醗酵の後に醗酵槽から菌体含
有培地を連続的に取り出すと共にそれと等量の新
しい培地およびグルコースを連続的に供給するこ
とにより連続醗酵を設定した。定常状態（これを
数週間維持）において、両醗酵実験の稀釈速度は
0.085プラス・マイナス0.005／時であつた。 一方の醗酵槽は、残留窒素濃度が１mg／以下
となりそして残留グルコース濃度が２〜３ｇ／
となるようにグルコースを供給することにより窒
素制限下に維持した。他方の醗酵槽は残留グルコ
ース濃度が0.5ｇ／以下となりそして残留窒素
濃度が100mg／以上となるようにグルコースを
供給することにより炭素制限下に維持した。 定常状態における結果を下表に示す（これらの
結果は数週間にわたるデータの平均である）。
炭素転化率はバツチ式醗酵（例１および２）で
達成されたものよりも著しく大きいことが判る。
比較のために窒素制限下にメタノール基質でメチ
ロバクテリウム・オルガノフイルム菌株
（NCIB11483）を一段階連続培養した実験では、
0.08／時の稀釈速度で菌体への炭素転化率（最高
値）は53％であり、このような条件で達成された
最高のPHB含量で約11％であつた。 同様に、上記微生物をメタノール基質でバツチ
培養した実験では60時間の培養後に45％のPHB
含量（最高値）が得られ、メタノール１ｇ当り
0.16ｇの菌体収量（菌体への炭素転化率21％に相
当）であつた。 窒素制限下でのグルコース基質でのアゾトバク
ター・クロオコツカム（NCIB 9125）を用いて
の一段階連続培養実験では、0.09／時の稀釈速度
において22〜25％のオーダーの菌体への炭素転化
率（最高値）が達成され、このような条件下では
PHB含量はわずか１〜６％の間で変化した。培
地中で十分な窒素（アンモニウムイオンの形で）
を用いたが毎分醗酵槽中の培地１容当り0.1容の
通気速度を用いることにより、0.1／時の稀釈速
度において溶存酸素張力がゼロになるような酸素
制限下で実施したときには、菌体への初期炭素転
化率60％が達成されたが、８日間にわたる操作後
にその炭素転化率は50％に降下し、また同じ期間
内にPHB含量は51％から31％へ降下した。 同様に酸素制限下でのアゾトバクター・クロオ
コツカム（NCIB 9125）のバツチ培養では、60
〜65時間の醗酵後に、約35％の炭素転化率（最
高）において約65％のPHB含量（最高）を有す
る菌体が得られた。 例 ５ 例４における醗酵槽から連続的に取り出した培
地を、15ｇ／のグルコース（添加）と共に、公
称容積10の第２醗酵槽に連続的供給し、第２の
醗酵槽を再び34℃、PH6.8および空気飽和の約60
％の溶存酸素張力において、実施した。 第２の醗酵槽への培地供給合計量が７に達し
たとき、第１醗酵槽からの添加速度に相当する速
度で培地を第２の醗酵槽から取り出し、第２段階
の稀釈速度を0.05／時とした。 ある期間後に定常状態が達成され、これを２週
間維持した。第２醗酵槽（定常状態時）から取り
出された培地の平均菌体含量は10.91ｇ／であ
り、PHB含量は約70〜75％であつた。この第２
段階における炭素転化率は約45％であつた。 第１および第２両段階の細菌体への総合炭素転
化率は57.9％（すなわち全菌体炭素となつた全グ
ルコース炭素％）であり、PHBへの総合炭素転
化率は43.8％（すなわちPHB炭素となつた全グ
ルコース炭素％）であつた。 例 ６ 窒素制限下で実施される醗酵（すなわち本発明
方法）と、炭素制限下で実施される醗酵（すなわ
ち本発明によらない醗酵、なんとなれば炭素は生
長およびPHB蓄積の両者についての必須要求物
である）との比較を行うために、操作容積２の
同じ実験室用醗酵槽２個を準備した（34℃に維
持）。 用いた水性培地は、脱イオン水１当り下記の
組成であつた。 ５％NH4OH溶液 6.4ml（＝750mgＮ） H3PO4（1.1M） 12ml MgSO4・7H2O 0.8ｇ FeSO4・7H2O 4.17mg 微量元素溶液 36ml （例１と同） カリウムとナトリウムは、4M・KOH（９容）
と4M・NaOH（１容）との混合物を用いてのPH
調整操作によつて供給した。 培地にアルカリゲネス・エウトロフスのグルコ
ース利用突然変株S301／C5のスターター培養物
を接種し、空気飽和の50〜80％に相当する溶存酸
素張力において、基質としてグルコースを用いて
好気醗酵させた。前記KOH／NaOH混液の添加
により、PHを自動的に6.8に維持した。 ある時間のバツチ醗酵の後に醗酵槽から菌体含
有培地を連続的に取り出すと共にそれと等量の新
しい培地およびグルコースを連続的に供給するこ
とにより連続醗酵を設定した。定常状態（これを
数週間維持）において、両醗酵実験の稀釈速度は
0.085プラス・マイナス0.005／時であつた。 一方の醗酵槽は、残留窒素濃度が１mg／以下
となりそして残留グルコース濃度が２〜３ｇ／
となるようにグルコースを供給することにより窒
素制限下に維持した。他方の醗酵槽は残留グルコ
ース濃度が0.5ｇ／以下となりそして残留窒素
濃度が100mg／以上となるようにグルコースを
供給することにより炭素制限下に維持した。 定常状態における結果を下表に示す（これらの
結果は数週間にわたるデータの平均である）。
【表】
アルカリゲネス・エウトロフス種の下記の四つ
の突然変異株は、下記の微工研受託番号で微工研
に寄託されている： 突然変異株S501／C29 微工研菌寄第6106号 突然変異株S501／C41 微工研菌寄第6107号 突然変異株S301／C5 微工研菌寄第6108号 突然変異株11／7B 微工研菌寄第6109号。
の突然変異株は、下記の微工研受託番号で微工研
に寄託されている： 突然変異株S501／C29 微工研菌寄第6106号 突然変異株S501／C41 微工研菌寄第6107号 突然変異株S301／C5 微工研菌寄第6108号 突然変異株11／7B 微工研菌寄第6109号。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 醗酵槽中でアルカリゲネス属のポリ（β−ヒ
ドロキシ酪酸）蓄積性微生物を栄養塩類を含む水
性培地で好気培養し、該微生物によつて資化され
ることができまた少なくとも炭素及び水素を含む
水溶性化合物を炭素及びエネルギー源として使用
し、その際に水性培地中の資化性窒素の量を該微
生物がポリ（β−ヒドロキシ酪酸）を合成するよ
うな量に制限することからなるポリ（β−ヒドロ
キシ酪酸）の生産のための醗酵方法において： ポリ（β−ヒドロキシ酪酸）以外の物質への炭
素の転化効率を改善するために、栄養塩類を含む
水性培地と炭素及びエネルギー源とを醗酵槽へ連
続的または間欠的に供給し、そして醗酵槽中の水
性培地の量を実質的に一定に保つように微生物の
菌体を含む水性培地の同じ量を連続的または間欠
的に取り出すようにして醗酵を連続方式で実施
し、その際の醗酵槽からの菌体含有水性培地の取
り出し速度は醗酵槽から取り出される菌体が平均
で少なくとも25重量％のポリ（β−ヒドロキシ酪
酸）を含むような醗酵槽内平均滞留時間となるよ
うな取り出し速度である、ことを特徴とする上記
ポリ（β−ヒドロキシ酪酸）の生産のための醗酵
方法。 ２ 醗酵槽へ供給される資化性窒素の量は、醗酵
槽から取り出される細菌の菌体の量と該取出菌体
中に蓄積されたポリ（β−ヒドロキシ酪酸）の量
との差の８〜15重量％である特許請求の範囲第１
項に記載の方法。 ３ 醗酵槽から取り出される菌体は35〜65重量％
のポリ（β−ヒドロキシ酪酸）を含む特許請求の
範囲第１または２項に記載の方法。 ４ 醗酵槽から取り出される水性培地は１当り
少なくとも５ｇの菌体を含む特許請求の範囲第１
〜３項のいずれかに記載の方法。 ５ 醗酵槽から取り出される水性培地は１当り
炭素およびエネルギー源をなす該水溶性化合物の
少なくとも１ｇの残留量を含む特許請求の範囲第
１〜４項のいずれかに記載の方法。 ６ 醗酵槽から取り出される菌体含有水性培地
を、該微生物によつて資化されることができまた
少なくとも炭素および水素を含む、炭素およびエ
ネルギー源としての、水溶性化合物と共にさらに
別の醗酵槽に供給し、そしてその別の醗酵槽中で
菌体のポリ（β−ヒドロキシ酪酸）含量を増加さ
せるように該微生物を好気培養する特許請求の範
囲第１〜５項のいずれかに記載の方法。 ７ 第１の醗酵槽への供給が制限されている資化
性窒素の追加量を第１の醗酵槽から取り出される
水性培地中の残留量に全く加えることなく、該別
の醗酵へ該水性培地を供給する特許請求の範囲第
６項に記載の方法。 ８ 該別の醗酵槽中における微生物の培養は連続
式である特許請求の範囲第６または７項に記載の
方法。 ９ 該別の醗酵槽中における微生物の培養は菌体
が50〜80重量％のポリ（β−ヒドロキシ酪酸）含
量を有するようになるまで継続する特許請求の範
囲第６〜８項のいずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8027004 | 1980-08-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5774084A JPS5774084A (en) | 1982-05-10 |
| JPH0220238B2 true JPH0220238B2 (ja) | 1990-05-08 |
Family
ID=10515549
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56130046A Granted JPS5774084A (en) | 1980-08-19 | 1981-08-19 | Preparation of bacterial strain containing roly(beta-hydroxybutyric acid) by fermentation |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4433053A (ja) |
| EP (1) | EP0046344B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5774084A (ja) |
| AU (1) | AU542807B2 (ja) |
| DE (1) | DE3171017D1 (ja) |
| SU (1) | SU1303035A3 (ja) |
| UA (1) | UA8335A1 (ja) |
Families Citing this family (34)
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|---|---|---|---|---|
| DE3374698D1 (en) | 1982-08-27 | 1988-01-07 | Ici Plc | 3-hydroxybutyrate polymers |
| GB8301344D0 (en) * | 1983-01-18 | 1983-02-16 | Ici Plc | Poly(beta-hydroxybutyric acid) |
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| DE3343551A1 (de) * | 1983-12-01 | 1985-06-13 | Lentia GmbH Chem. u. pharm. Erzeugnisse - Industriebedarf, 8000 München | Verfahren zur biotechnologischen herstellung von poly-d(-)-3-hydroxybuttersaeure |
| DE3343576A1 (de) * | 1983-12-01 | 1985-06-13 | Lentia GmbH Chem. u. pharm. Erzeugnisse - Industriebedarf, 8000 München | Verfahren zur biotechnologischen herstellung von poly-d(-)-3-hydroxybuttersaeure |
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| US5266470A (en) * | 1985-05-28 | 1993-11-30 | Imperial Chemical Industries Plc | Copolymer production |
| US4876331A (en) * | 1987-08-18 | 1989-10-24 | Mitsubishi Kasei Corporation | Copolyester and process for producing the same |
| US5334520A (en) * | 1990-05-25 | 1994-08-02 | Center For Innovative Technology | Production of poly-beta-hydroxybutyrate in transformed escherichia coli |
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| DE69432240T2 (de) * | 1993-09-10 | 2004-02-05 | Mitsubishi Gas Chemical Co., Inc. | Verfahren zur Herstellung von bakterien Zellen, welche poly-3-hydroxy Buttersäure enthalten |
| US6100224A (en) * | 1997-10-01 | 2000-08-08 | Exxon Chemical Patents Inc | Copolymers of ethylene α-olefin macromers and dicarboxylic monomers and derivatives thereof, useful as additives in lubricating oils and in fuels |
| NL1011431C2 (nl) * | 1999-03-03 | 2000-09-05 | Univ Delft Tech | Werkwijze voor het produceren van polyhydroxyalkanoaat. |
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| US7223822B2 (en) | 2002-10-15 | 2007-05-29 | Exxonmobil Chemical Patents Inc. | Multiple catalyst and reactor system for olefin polymerization and polymers produced therefrom |
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| CN101724110B (zh) | 2002-10-15 | 2013-03-27 | 埃克森美孚化学专利公司 | 用于烯烃聚合的多催化剂体系和由其生产的聚合物 |
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