JPS6142559B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は微生物によるＤ−β−ヒドロキシイソ
酪酸の製法に関する。さらに詳しくは、キヤンデ
イダ属に属し、メタクリル酸またはイソ酪酸をＤ
−β−ヒドロキシイソ酪酸に変換する能力を有
し、かつβ−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素活性
の低下した変異株をメタクリル酸またはイソ酪酸
あるいは該微生物がイソ酪酸またはＤ−β−ヒド
ロキシイソ酪酸に変換しうる基質と接触反応さ
せ、生成するＤ−β−ヒドロキシイソ酪酸を採取
することを特徴とするＤ−β−ヒドロキシイソ酪
酸の製造方法に関するものである。 光学活性を有するＤ−β−ヒドロキシイソ酪酸
は香料あるいは医薬等の重要な原料である。工業
的なＤ−β−ヒドロキシイソ酪酸の製造法に関し
て、本発明者等はキヤンデイダ属を始めとする
種々の微生物を用いメタクリル酸あるいはイソ酪
酸から〔特開昭54−144252、同54−144253、同55
−103805、同55−17599〕、またさらにイソブチル
アルコール等の容易に該微生物によつてイソ酪酸
に変換される原料から〔特願昭56−178726〕Ｄ−
β−ヒドロキシイソ酪酸の安価な製造法について
提案して来た。これらの方法は安価な原料よりＤ
−β−ヒドロキシイソ酪酸を作る方法において優
れているが、生成されたＤ−β−ヒドロキシイソ
酪酸が一部代謝されるために収率が50％程度にし
かならないことと、更に代謝産物としてβ−ヒド
ロキシプロピオン酸の副生が認められるという欠
点を有していた。そこで本発明者等は、収率向上
と副生物の少ないＤ−β−ヒドロキシイソ酪酸の
製造方法の研究を行なつた結果、Ｄ−β−ヒドロ
キシイソ酪酸の分解酵素であるβ−ヒドロキシイ
ソ酪酸脱水素酵素活性の低下した変異株を分離
し、それを培養することによりイソ酪酸等の上記
種々の原料より飛躍的に収率が向上し、かつβ−
ヒドロキシプロピオン酸等の不純物の少ないＤ−
β−ヒドロキシイソ酪酸を製造しうることを見い
出した。変異株を使用する利点としてはＤ−β−
ヒドロキシイソ酪酸の収率が高く、かつ基質欠乏
時の分解がないこと、あるいは副生β−ヒドロキ
シプロピオン酸等の不純分が極めて少ない点等が
挙げられる。該酵素の活性の低下の度合は、親株
の活性の1/5以下が好ましい。 本発明に用いるキヤンデイダ属の酵母の親株と
してはイソ酪酸、あるいはメタクリル酸等からＤ
−β−ヒドロキシイソ酪酸を生成する能力のある
菌株、例えばキヤンデイダ・ルゴーザ（Candida
rugosa）IFO 0750、同IFO 0591などのほかに、
キヤンデイダ・パラプシロシス（Candida
parapsilosis）IFO 0708および天然から分離した
キヤンデイダ属に属するＤ−β−ヒドロキシイソ
酪酸生産株もこれに含まれる。 β−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素活性の低下
した菌株をうるために変異を利用する。変異には
人工変異と自然変異とがあり、いづれも利用しう
るが、通常は変異効率の良い人工変異が利用され
る。人工変異の方法として、Ｘ線照射、紫外線照
射、γ線処理およびＮ−メチル−N′−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）などの変異誘
起剤による処理が用いられるが、例えば具体的な
例として、本発明者等がβ−ヒドロキシイソ酪酸
脱水素酵素活性の低い株を得る為に行なつた
NTGによる変異の方法の一例を示すと次のとお
りである。ただし、目的とする性質の変異株が得
られれば良いのであつて、この方法に限定される
ものではない。 保存用スラント（キヤンデイダ・ルゴーザIFO
0750）より１白金耳をグルコース40ｇ、
（NH₄）₂HPO₄13ｇ、KH₂PO₄7ｇ、MgSO₄・
7H₂O0.8ｇ、ZnSO₄・7H₂O60mg、FeSO₄・
7H₂O90mg、CuSO₄・5H₂O5mg、MnSO₄・4H₂O10
mg、NaCl 0.1ｇ、ビオチン１mg、チアミン２
mg、水１、PH7.2の組成からなるＳ培地30mlを
500ml容フラスコに入れ接種し、30℃20時間振と
う培養した。その後、培養液1.5mlを0.5Mリン酸
緩衝液（PH7.0）で洗浄後、0.5mg/mlNTG溶液３
mlに懸濁し、４℃60分放置した。その後、同じ緩
衝液で３回洗浄し、次の組成から成る固型平板Ｃ
培地（グルコース20ｇ、イーストエキス５ｇ、肉
エキス10ｇ、ペプトン10ｇ、寒天20ｇ、水１、
PH7.0）に塗布し、コロニーを出現させた。この
コロニーをＳ培地のグルコースの代りにプロピオ
ン酸10ｇ、寒天20ｇを加えたPH7.0のＰ培地にレ
プリカした。このＰ培地上で生育不良な菌株（プ
ロピオン酸非資化性菌）を選んだ。ここでプロピ
オン酸非資化性菌を選んだ理由は次の通りであ
る。 本目的のためには、Ｄ−β−ヒドロキシイソ酪
酸を唯一の炭素源とする合成培地において、親株
より生育の劣つている変異株を選ぶのがよい。し
かし同培地においては親株も生育が弱く、目的に
かなつた変異核との生育の強弱を判定することが
困難であつた。ところがプロピオン酸を唯一の炭
素源とするプレート上では、Ｄ−β−ヒドロキシ
イソ酪酸の場合と異なり、変異により生育の弱く
なつた株を探索するのは比較的容易であつた。 本菌の代謝経路では、Ｄ−β−ヒドロキシイソ
酪酸はプロピオン酸を経由してβ−ヒドロキシプ
ロピオン酸になるとされている。そこでプロピオ
ン酸非資化性変異株の中にはβ−ヒドロキシプロ
ピオン酸脱水素酵素欠損株が見つかるはずであ
り、その中にβ−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素
活性の低い株も見つかる可能性が高いのではない
かと推定したからである。 上記の如き実験計画の下にプロピオン酸非資化
性菌を誘導し、それらの中から実施例１に示す条
件で、これらの変異株を培養し、中からＤ−β−
ヒドロキシイソ酪酸生成収率が高く、かつβ−ヒ
ドロキシプロピオン酸副生量の低い菌株を選ん
だ。この様にして選んだ変異株は、いづれも親株
に比べβ−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素活性が
著しく低下しており、すべて本発明に利用でき
る。上記酵素活性は本発明者の１人である長谷川
がアグリカルチヤル・バイオロジカル・ケミスト
リー誌（Agricultural Biological Chemistry）45
巻2899頁（1981）に報告している方法により容易
に測定することができる。 本発明を実施するため、上記の方法で得た変異
株の例としてキヤンデイダ・ルゴーザKT 8201
株がある。 この変異株の菌学的性質としては表１に示すご
とく親株と殆んど差が認められないが、β−ヒド
ロキシイソ酪酸脱水素酵素活性、プロピオン酸資
化性、およびβ−ヒドロキシプロピオン酸脱水素
酵素活性に著しい差が認められる。但し、本発明
での変異株としての条件でプロピオン酸非資化性
およびβ−ヒドロキシプロピオン酸脱水素酵素活
性の欠損は必須条件ではない。

【表】 キヤンデイダ・ルゴーザ（Candida rugosa））
KT 8201株は工業技術院微生物工業研究所へ微
生物保管委託申請書受理番号第110号として寄託
してある。 本発明におけるＤ−β−ヒドロキシイソ酪酸の
製造は、具体的にはイソ酪酸、メタクリル酸、イ
ソブチルアルコール、イソブチルアルデヒド、無
水イソ酪酸、イソブチルアミン、イソブチルアミ
ド等の中から選ばれた基質と炭素源、窒素源、無
機塩および適当な栄養源を含む培地で上記の微生
物を好気的に培養する方法、または予め適当な培
地で微生物を培養し得た培養液そのまま、あるい
は菌体のみを集め適当な無機塩等を含む液に懸濁
したものに上記イソ酪酸等の基質を添加し、好気
的に接触反応させ、Ｄ−β−ヒドロキシイソ酪酸
を蓄積させる方法等がある。また多重にＤ−β−
ヒドロキシイソ酪酸を蓄積させる為には培養後半
あるいは菌体との接触反応時に該微生物が利用し
うるエネルギー源を補給する意味から、グルコー
スまたはグリセロールまたはエタノールまたは酢
酸等の適当な利用しうる炭素源を添加するのが好
ましい。 本発明に使用する培地はグルコース、グリセリ
ン等の炭素源、アンモニア、尿素、硫安、ペプト
ン、カザミノ酸等の無機、有機の含窒素化合物の
窒素源、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の
生育に必要な無機塩類、更にビオチン、チアミン
等のビタミン類その他必要に応じて通常微生物の
培養に用いられる種々の栄養源を適宜配合して用
いることができる。 培養は殺菌した培地に菌を接種し、20〜45℃の
温度でPHを６〜９に保ちつつ１〜10日間、通気撹
拌培養、振とう培養などで好気的に行なう。培養
の初期は菌体の生育が行なわれ、その後Ｄ−β−
ヒドロキシイソ酪酸の生産が行なわれる。Ｄ−β
−ヒドロキシイソ酪酸生産時に、更にイソ酪酸等
の基質とグルコース等前記のエネルギー源を補給
すれば効率よく、多量にＤ−β−ヒドロキイソ酪
酸を蓄積させることができる。また目的によつて
は上記微生物の静止菌体、あるいは各種ポリマー
等を用い固定化した菌体を使用することも出来
る。 培養物または静止菌体反応液よりＤ−β−ヒド
ロキシイソ酪酸を回収するには通常のヒドロキシ
カルボン酸の回収に用いられる手段を用いること
ができる。例えば菌体除去後のＤ−β−ヒドロキ
シイソ酪酸含有液を濃縮し、硫酸等でPH２に調整
し、エーテル、酢酸エチル等で抽出し、溶剤を除
去することによりＤ−β−ヒドロキシイソ酪酸を
得ることができる。 以下実施例により本発明を具体的に説明する
が、本発明は実施例のみに限定されるものではな
い。 実施例 １ グルコース40ｇ、（NH₄）₂HPO₄13ｇ、KH₂PO₄7
ｇ、MgSO₄・7H₂O0.8ｇ、ZnSO₄・7H₂O60mg、
FeSO₄・7H₂O90mg、CuSO₄・5H₂O5mg、
MnSO₄・4H₂O10mg、NaCl 0.1ｇ、イーストエキ
ス５ｇ、イソ酪酸30ｇ（１当り）からなる培地
をPH7.0にNaOHで合わせ50mlを500ml容フラスコ
に入れ殺菌後、キヤンデイダ・ルゴーザIFO
0750、およびその変異株KT 8201株を接種し、
30℃で振とう培養を４日間行なつた。なお変異株
については培養開始30時間後にグルコース３ｇを
添加し、各々培養中NaOHで毎日7.0に合わせ
た。培養終了後、イソ酪酸とＤ−β−ヒドロキシ
イソ酪酸イをガスクロマトグラフイー〔長谷川
等、ジヤーナル・オブ・フアーメンテイシヨン・
テクノロジー（Journal of Fermentation
Technology）、59巻、203頁、（1981）〕で定量
し、β−ヒドロキシプロピオン酸はシリカゲルプ
レートで展開し（展開剤、酢酸エチル：イソプロ
ピルアルコール：水、５：１：１）、0.1％ジニト
ロフエノールインドフエノール−アルコール液を
噴霧し、発色後検出した（Ｄ−β−ヒドロキシイ
ソ酪酸 Ｒ_f＝0.70、β−ヒドロキシプロピオン
酸Ｒ_f＝0.41）。結果は表２の如くであつた。

【表】 実施例 ２ 実施例１に示した培地よりイソ酪酸を除いた培
地50mlを500ml容フラスコに入れ殺菌後、キヤン
デイダ・ルゴーザIFO 0750および変異株KT
8201を植菌し、30℃で１日間振とう培養した。こ
の各々の培養液に別々にメタクリル酸、イソブチ
ルアルコール、イソブチルアルデヒド、無水イソ
酪酸、イソブチルアミン、イソブチルアミドを
各々10ｇづつ添加し、PHを7.0に調整した。変異
株については更にグルコース２ｇを添加した。２
日間好気的に反応を行ない表３に示す結果を得
た。

【表】 シリカゲルクロマトグラフイーによりβ−ヒド
ロキシプロピオン酸の蓄積を調べたところ親株は
全て副生が認められたのに対し、変異株ではいづ
れも認められなかつた。 実施例 ３ 実施例１と同じ培地50mlを500ml容フラスコに
入れ殺菌後、キヤンデイダ・ルゴーザIFO
0750、および変異株KT 8201を植菌後30℃で４
日間培養した。培養開始後30時間目にエネルギー
源としてグルコース、グリセロール、各々別々に
３ｇを、またエタノールと酢酸は３ｇを６回に分
け30時間目より10時間毎に添加した。このように
して培養した結果は表４に示す如くであつた。

【表】 本培養においても変異株の生産したＤ−β−ヒ
ドロキシイソ酪酸中にはβ−ヒドロキシプロピオ
ン酸の副生は認められなかつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ キヤンデイダ属に属する微生物で、メタクリ
   ル酸またはイソ酪酸をＤ−β−ヒドロキシイソ酪
   酸に変換する能力を有し、且つβ−ヒドロキシイ
   ソ酪酸脱水素酵素活性の低下した変異株をメタク
   リル酸、またはイソ酪酸あるいは該微生物がイソ
   酪酸またはＤ−β−ヒドロキシイソ酪酸に変換し
   うる基質と接触反応させ、生成するＤ−β−ヒド
   ロキシイソ酪酸を採取することを特徴とするＤ−
   β−ヒドロキシイソ酪酸の製造法。 ２ 変異株がキヤンデイダ・ルゴーザから誘導さ
   れた微生物である特許請求の範囲第１項記載の製
   造法。 ３ 変異株の有するβ−ヒドロキシイソ酪酸脱水
   素酵素活性が親株に比べ５分の１以下である特許
   請求の範囲第１項または第２項記載の製造法。 ４ 該微生物がイソ酪酸またはＤ−β−ヒドロキ
   シイソ酪酸に変換しうる基質がイソブチルアルコ
   ール、またはイソブチルアルデヒドまたは無水イ
   ソ酪酸またはイソブチルアミンまたはイソブチル
   アミドである特許請求の範囲第１項記載の製造
   法。 ５ 微生物を栄養培地で培養し、得た培養液にイ
   ソ酪酸あるいはメタクリル酸、あるいは該微生物
   がイソ酪酸またはＤ−β−ヒドロキシイソ酪酸に
   変換しうる基質を作用させる特許請求の範囲第１
   項記載の製造法。 ６ イソ酪酸、メタクリル酸あるいは該微生物が
   イソ酪酸またはＤ−β−ヒドロキシイソ酪酸に変
   換しうる基質を添加した培地で培養することによ
   り、微生物をイソ酪酸、メタクリル酸あるいは該
   微生物がイソ酪酸またはＤ−β−ヒドロキシイソ
   酪酸に変換しうる基質に作用させる特許請求の範
   囲第１項記載の製造法。 ７ 微生物を栄養培地で培養し、得た培養液から
   微生物菌体を分離して菌体懸濁液を調製し、それ
   をイソ酪酸、アクリル酸あるいは該微生物がイソ
   酪酸またはＤ−β−ヒドロキシイソ酪酸に変換し
   うる基質に作用させる特許請求の範囲第１項記載
   の製造法。 ８ 微生物とイソ酪酸、またはメタクリル酸また
   は該微生物がイソ酪酸またはＤ−β−ヒドロキシ
   イソ酪酸に変換しうる基質との接触反応時に、該
   微生物が利用しうるエネルギー源を補給する特許
   請求の範囲第１項記載の製造法。 ９ 微生物が利用しうるエネルギー源がグルコー
   ス、グリセロール、エタノール、または酢酸であ
   る特許請求の範囲第８項記載の製造法。