JPH048035B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は微生物によるＬ（＋）−β−ヒドロキシ
脂肪酸の製造法に関する。更に詳しくは、サツカ
ロマイコピシス属、エンドマイセス属あるいはピ
キヤ属に属し、酪酸をＬ（＋）−β−ヒドロキシ酪
酸に変換する能力を有する微生物から誘導された
Ｌ（＋）−β−ヒドロキシ酪酸を単一炭素源とする
栄養培地に生育し得ないか、もしくは生育の弱い
変異株を、炭素数４あるいは５の飽和脂肪酸、
α，β−不飽和脂肪酸あるいはアルコールに作用
させ、生成する炭素数４あるいは５のＬ（＋）−β
−ヒドロキシ脂肪酸を採取することを特徴とする
Ｌ（＋）−β−ヒドロキシ脂肪酸の製造法に関する
ものである。 光学活性Ｌ（＋）−β−ヒドロキシ脂肪酸は２種
の異なる官能基をもち、医薬、農薬等の合成原料
として有用な物質群である。 炭素数４個のＬ（＋）−β−ヒドロキシ酪酸の製
造法に関しては、アセト酢酸エステルをパン酵母
による不斉還元法によりＬ（＋）−β−ヒドロキシ
酪酸エチルとして得る方法が知られているが（森
ら：日本化学会誌第９号、1315頁、1983年）、多
量の酵母を必要とするため経済的な方法とは考え
難い。また炭素数４個の分岐状Ｌ（＋）−β−ヒド
ロキシ脂肪酸であるＬ（＋）−β−ヒドロキシイソ
酪酸に関しては、シユードモナス・プチダ
（Pseudomonas putida）を用い、イソ酪酸より
生産する方法（C.T.Goodhue and J.R.
Schaeffer：Biotechnology and Bioengineering
第13巻、203頁、1971年）や、本発明者らによ
り、デパリオマイセス属、ピキヤ属を始めとする
多くの微生物によつてイソ酪酸より生産する方法
が知られている（特開昭57−65192）。一方炭素数
５個のＬ（＋）−β−ヒドロキシ脂肪酸のＬ（＋）−
β−ヒドロキシ吉草酸の製法に関しては、β−ケ
ト吉草酸エチルをパン酵母還元によりＤ（−）−β
−ヒドロキシ吉草酸エチルが得られる（G.
Fiater：Helvetica Chimica Acta、62巻、2829
頁、1979年）ことが知られているが、これは立体
配置が逆であるとともに、光学純度が極めて低
い。 Ｌ（＋）−β−ヒドロキシ吉草酸に関しては、先
に本発明者らがキヤンデイダ・ルゴーザIFO1542
により吉草酸からＬ（＋）−β−ヒドロキシ吉草酸
を生産しうることを見い出している（特開昭57−
65188）。これは微生物によつてＬ（＋）−β−ヒド
ロキシ吉草酸を生産しうることを見い出したもの
であるが、通常の微生物は直鎖状のＬ（＋）−β−
ヒドロキシ脂肪酸を極めて容易に代謝分解するた
めに収率が極めて低く、大量生産にはむかない。 そこで本発明者らは、安価で、かつ効率的なＬ
（＋）−β−ヒドロキシ脂肪酸の製造法を開発すべ
く研究の結果、サツカロマイコピシス属、エンド
マイセス属、あるいはピキヤ属に属し、酪酸をＬ
（＋）−β−ヒドロキシ酪酸に変換する能力を有す
る微生物を変異改良し、Ｌ（＋）−β−ヒドロキシ
酪酸を単一炭素源とする栄養培地に生育しない変
異株に誘導することにより、酪酸、クロトント酸
あるいはｎ−ブチルアルコールからＬ（＋）−β−
ヒドロキシ酪酸を、吉草酸、２−ペンテン酸ある
いはｎ−アミルアルコールからＬ（＋）−β−ヒド
ロキシ吉草酸を高収率を生産しうることを見い出
した。 本発明を実施するに当り、変異株取得のために
用いられる親株として、サツカロマイコピシス・
リポテイカ（Saccharomycopsis lipolytica）
IFO 1545、エンドマイセス・テトラスペルマ
（Endomyces tetrasperma）CBS 765.70、ある
いはピキヤ・ブルトーニ（Pichia burtonii）IFO
0844等があるが、酪酸をＬ（＋）−β−ヒドロキシ
酪酸に、吉草酸をＬ（＋）−β−ヒドロキシ吉草酸
に変換する能力を有する微生物であれば、いずれ
も用いることができる。 微生物と基質とを作用させＬ（＋）−β−ヒドロ
キシ脂肪酸に変換させる方法としては、微生物を
栄養培地で培養し、得られた培養液に、あるいは
培養液から微生物を分離して菌体懸濁液を調整
し、それに基質を反応させる方法、あるいは基質
を添加した培地で微生物を培養することにより微
生物と基質を反応させる方法等がある。また分離
菌体は菌体懸濁液あるいは水不溶性ポリマー等で
固定化した状態でも使用しうる。 微生物と基質との接触反応時に該微生物が利用
しうるエネルギー源を補給することによりＬ（＋）
−β−ヒドロキシ脂肪酸の生産性は向上する。こ
の際に好ましいエネルギー源としては、グルコー
ス、グリセロール等がある。 通常の微生物はＬ（＋）−β−ヒドロキシ脂肪酸
の代謝速度が早いため、Ｌ（＋）−β−ヒドロキシ
脂肪酸の蓄積量は極めて少なく、生産しようとす
る場合、経済的に不利である。そこで効率的に多
量蓄積させるには、Ｌ（＋）−β−ヒドロキシ脂肪
酸の代謝速度が遅いか、もしくは代謝しない変異
株、換言すればＬ（＋）−β−ヒドロキシ脂肪酸を
単一炭素源とする栄養培地に生育しないか、もし
くは生育に弱い変異株を使用することが有利であ
る。このような変異株を得るには人工変異あるい
は自然変異を利用するが、効率的に行なうには通
常人工変異が用いられる。人工変異方法として
は、Ｘ線照射、紫外線照射、γ線処理、およびＮ
−メチル−Ｎ−ニトロ−N′−ニトロソグアニジ
ン（NTG）などの変異誘起剤による処理が用い
られる。具体的な例として本発明者らがＬ（＋）−
β−ヒドロキシ脂肪酸を代謝しない変異株をうる
ために行なつた。NTGによる変異方法の１例に
ついて示すと、次のとおりである。ただし、目的
とする変異株が得られれば良いのであつてこの方
法に限定されるものではない。 保存用スラント（サツカロマイコピシス・リポ
テイカ IFO 1545）から１白金耳をグルコース
40g、（NH₄）₂HPO₄13g、KH₂PO₄7g、MgSO₄・
7H₂O0.8g、ZnSO₄・7H₂O60mg、FeSO₄・
7H₂O90mg、CuSO₄・5H₂O5mg、MnSO₄・
4H₂O10mg、NaCl0.1g、ビオチン１mg、チアミン
−HCl2mg、水１、PH7.2の組成から成るＳ培地
30mlを500ml容フラスコに入れ接種し、30℃、20
時間振とう培養した。その培養液1.5mlを0.5Mリ
ン酸緩衝液（PH7.0）で洗浄後、0.5mg／mlNTG溶
液３mlに懸濁し、４℃、60分間放置した。その
後、同じ緩衝液で３回洗浄し、次の組成から成る
固形平板培地、Ｃ培地（グルコース20g、イース
トエキス5g、肉エキス10g、ペプトン10g、寒天
20g、水１、PH7.0）に塗布し、コロニーを出現
させた。このコロニーをＳ培地のグルコースの代
りに酪酸10g、寒天20gを加えたPH7.0のＢ培地に
レプリカし、30℃で２日間培養した。このＢ培地
上で生育不良の菌（酪酸非資化性株）を選んだ。
この様にして得た酪酸非資化性株をＳ培地に酪酸
10gを添加した培地（PH7.0）に植え、30℃、48時
間培養し、Ｌ（＋）−β−ヒドロキシ酪酸の生産量
をガスクロマトグラフイー法（長谷川ら：ジヤー
ナル・オブ・フアーメンテイシヨン・テクノロジ
ー誌 59巻、257頁、1981年）で分析し、Ｌ（＋）
−β−ヒドロキシ酪酸生産株を選んだ。この様に
して選んだ変異株はＬ（＋）−β−ヒドロキシ酪酸
を単一炭素源とする栄養培地（例えばＳ培地のグ
ルコースの代りに、Ｌ（＋）−β−ヒドロキシ酪酸
を添加した培地）での生育が著しく低下してお
り、本発明に使用できる。他の属の微生物の変異
も同様な手法を用いて行なうことができ、本発明
を実施するために上記方法で得た変異株の例とし
てサツカロマイコピシス・リポリテイカ
KT84011、エンドマイセス・テトラスペルマ
KT84012、ピキヤ・ブルトーニKT84013等があ
る。この変異株の性質としては、親株と殆んど差
が認められないが、表１に示すとおりＬ（＋）−β
−ヒドロキシ脂肪酸の資化性において著しい差が
認められた。

【表】

【表】 ＋＋＋＋：生育良好、−：生育不良
なお、これらの変異株は工業技術院微生物工業
研究所に下記番号で寄託してある。

【表】 本発明に使用する培地はグルコース、グリセリ
ン等の炭素源、アンモニア、硫安、ペプトン、カ
ザミノ酸等の無機、有機の含窒素化合物の窒素
源、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等生育に
必要な無機塩類、更にビオチン等のビタミン類、
その他必要に応じて通常の微生物の培養に用いら
れる種々の栄養源を適宜配合して用いることがで
きる。培養には殺菌した培地に菌を接種し、20〜
45℃の温度でPH６〜９に保ちつつ１〜10日間通気
撹拌、振とう培養等好気的に行なう。培養初期に
菌体生産があり、その後Ｌ（＋）−β−ヒドロキシ
脂肪酸の生産が行なわれる。またＬ（＋）−β−ヒ
ドロキシ脂肪酸の生産時にエネルギー源としてグ
ルコースまたはグリセロール等を補給することに
より、より効率的にＬ（＋）−β−ヒドロキシ脂肪
酸の生産が行なわれる。基質は培養初期から培地
に加えても菌体生育後、添加してもいずれでもよ
い。 培養液、あるいは菌体反応液から生成したＬ
（＋）−β−ヒドロキシ脂肪酸を回収するには、通
常のβ−ヒドロキシ脂肪酸の回収に用いる手段に
よつて行なうことができる。例えば菌体除去後、
Ｌ（＋）−β−ヒドロキシ脂肪酸含有液を濃縮後、
硫酸等でPH2.5以下にし、これよりエーテル、酢
酸エチル等で抽出し、溶剤を除去後、減圧蒸留す
れば、容易にＬ（＋）−β−ヒドロキシ脂肪酸をう
ることができる。Ｌ（＋）−β−ヒドロキシ脂肪酸
は余り安定な物質でないので、前記の溶剤抽出等
で得たＬ（＋）−β−ヒドロキシ脂肪酸をメタルー
ルやエタノール等のアルコールに溶解し、硫酸等
の触媒存在下で加熱し、エステル化することによ
り、Ｌ（＋）−β−ヒドロキシ脂肪酸のアルキルエ
ステルに容易に変換しうる。このものを蒸留すれ
ば高収率に高純度のＬ（＋）−β−ヒドロキシ脂肪
酸エステルを得ることができ、このエステル体は
比較的安定である。 以下実施例により、本発明を具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。 実施例 １ グルコース40g、イーストエキス5g、
（NH₄）₂HPO₄13g、KH₂PO₄7g、MgSO₄・
7H₂O0.8g、ZnSO₄・7H₂O60mg、FeSO₄・
7H₂O90mg、CuSO₄・5H₂O5mg、MnSO₄・
4H₂O10mg、NaCl0.1g、酪酸10mlまたは吉草酸10
ml（１当り）の組成からなる培地をNaOHで
PH7.2となし、この３を５容ミニジヤーフア
ーメンターに入れ殺菌後、サツカロマイコピシ
ス・リポリテイカKT84011、あるいはエンドマ
イセス・テトラスペルマKT84012、あるいはピ
キヤ・ブルトーニKT84013、を植え、通気
1vvm、撹拌500rpm、30℃で４日間培養した。培
養中PHは7.0に保ち、かつ毎日グルコースを60gず
つ添加した。培養終了後、生成したＬ（＋）−β−
ヒドロキシ酪酸あるいはＬ（＋）−β−ヒドロキシ
吉草酸を測定した結果、表３の如くＬ（＋）−β−
ヒドロキシ脂肪酸の蓄積がみとめられた。

【表】 尚、基質無添加の場合、いずれの株の親株、変
異株ともにＬ（＋）−β−ヒドロキシ酪酸あるいは
Ｌ（＋）−β−ヒドロキシ吉草酸の蓄積は認められ
なかつた。

【表】 実施例 ２ 実施例１に示した培地から脂肪酸を除去した培
地３を５容ミニジヤーフアーメンターに入れ
殺菌後、サツカロマイコピシス・リポリテイカ
KT84011、エンドマイセス・テトラスペルマ
KT84012、あるいはピキヤ・ブルトーニ
KT84013を植菌し、通気1vvm、撹拌500rpm、
30℃で24時間培養した。 この培養液各々に、クロトン酸、ｎ−ブチルア
ルコール、２−ペンテン酸あるいはｎ−アミルア
ルコールを15gずつ添加し、PHを7.0に保ちつつグ
ルコースまたはグリセロールを毎日60gずつ添加
しつつ、更に３日間培養した。培養終了後、生成
したＬ（＋）−β−ヒドロキシ脂肪酸をガスクロマ
トグラフイーで測定した結果、表５の如くの各Ｌ
（＋）−β−ヒドロキシ脂肪酸の蓄積が認められ
た。

【表】 実施例 ３ 実施例１と同様にサツカロマイコピシス・リポ
リテイカKT84011、エンドマイセス・テトラス
ペルマKT84012、あるいはピキヤ・ブルトーニ
KT84013を培養し、培養開始後、24、48、72時
間目にグルコース60g、またはグリセロール60g
ずつ添加し、かつPHを7.0に保ちつつ96時間培養
した。比較のため、エネルギー源無添加でも培養
した。培養終了後の培養液中のＬ（＋）−β−ヒド
ロキシ酪酸、あるいはＬ（＋）−β−ヒドロキシ吉
草酸の生成量は表６の如くであつた。

【表】

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ サツカロマイコピシス属、エンドマイセス属
   あるいはピキア属に属し、酪酸をＬ（＋）−β−ヒ
   ドロキシ酪酸に変換する能力を有する微生物から
   誘導された、Ｌ（＋）−β−ヒドロキシ酪酸を単一
   炭素源とする栄養培地に生育しないか、もしくは
   生育の弱い変異株を炭素数４あるいは５の飽和脂
   肪酸、α，β−不飽和脂肪酸あるいはアルコール
   に作用させ、生成する炭素数４あるいは５のＬ
   （＋）−β−ヒドロキシ脂肪酸を採取することを特
   徴とするＬ（＋）−β−ヒドロキシ脂肪酸の製造
   法。 ２ 微生物が、サツカロマイコピシス・リポリテ
   カあるいはエンドマイセス・テトラスペルマある
   いはピキヤ・ブルトーニから誘導された変異株で
   ある特許請求の範囲第１項記載の製造法。 ３ 基質として用いる飽和脂肪酸が酪酸あるいは
   吉草酸、α，β−不飽和脂肪酸がクロトン酸ある
   いは２−ペンテン酸、アルコールがｎ−ブチルア
   ルコールあるいはｎ−アミルアルコールであり、
   製造目的物がそれぞれ対応するＬ（＋）−β−ヒド
   ロキシ酪酸、あるいはＬ（＋）−β−ヒドロキシ吉
   草酸である特許請求の範囲第１項あるいは第２項
   記載の製造法。 ４ 微生物を栄養培地で培養し、得た培養液に基
   質を作用させる特許請求の範囲第１項、第２項あ
   るいは第３項記載の製造法。 ５ 基質を添加した培地で培養し、基質と微生物
   を作用させる特許請求の範囲第１項、第２項ある
   いは第３項記載の製造法。 ６ 微生物を栄養培地で培養し、得られた培養液
   から微生物菌体を分離して菌体懸濁液を調製し、
   それに基質を作用させる特許請求の範囲第１項、
   第２項あるいは第３項記載の製造法。 ７ 微生物と基質を作用させる際に、該微生物が
   利用しうるエネルギー源を補給する特許請求の範
   囲第１項乃至第６項の何れかの項記載の製造法。 ８ 微生物が利用しうるエネルギー源がグルコー
   スまたはグリセロールである特許請求の範囲第７
   項記載の製造法。