JPS5945895A - 発酵法によるl−アスパラギン酸の製造法 - Google Patents
発酵法によるl−アスパラギン酸の製造法Info
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- JPS5945895A JPS5945895A JP57156400A JP15640082A JPS5945895A JP S5945895 A JPS5945895 A JP S5945895A JP 57156400 A JP57156400 A JP 57156400A JP 15640082 A JP15640082 A JP 15640082A JP S5945895 A JPS5945895 A JP S5945895A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、発酵法によるし一アスパラギン酸の製造法に
関する。
関する。
従来、微生物を用いてL−アスパラギン酸を製造する方
法としては、フマール酸やマレイン酸の如き前駆物質を
培地中に添加して培養することにより、或は微生物の培
養物、生菌体、更にはそれらの処理物を酵素剤とする酵
素反応によりL−アスパラギン酸を生成せしめる方法が
種々研究され、公知となっている。一方、糖類等を炭素
源として微生物を培養し、直接L−アスパラギン酸を製
造する直接発酵法につし・では、ブレビバクテリウム属
に属する微生物から誘導されたし一グルタミン酸要求性
変異株による方法(特公昭51−24592号公報)、
トジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株による方
法(特公昭53−20593号公報)などが知られてい
る。
法としては、フマール酸やマレイン酸の如き前駆物質を
培地中に添加して培養することにより、或は微生物の培
養物、生菌体、更にはそれらの処理物を酵素剤とする酵
素反応によりL−アスパラギン酸を生成せしめる方法が
種々研究され、公知となっている。一方、糖類等を炭素
源として微生物を培養し、直接L−アスパラギン酸を製
造する直接発酵法につし・では、ブレビバクテリウム属
に属する微生物から誘導されたし一グルタミン酸要求性
変異株による方法(特公昭51−24592号公報)、
トジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株による方
法(特公昭53−20593号公報)などが知られてい
る。
しかしながら、これら従来の直接発酵法によるL−アス
パラギン酸の製造法では、L−アスパラギン酸の生産性
が低く工業生産することができない。本出願人に於ては
、L−アスパラギン酸生産能の高い微生物を育種するこ
とを目的として種々研究を重ねた結果、ブレビバクテリ
ウム属に属し、L−アスパラギン酸による阻害の弱いホ
スホエノールピルビン酸キナーゼと低いクエン酸合成酵
素活性を有する変異株が著量のL−アスパラギン酸を蓄
積することを既に発見した。本発明者等は更しこL−ア
スパラギン酸生産能の高い変異株について研究したとこ
ろピルビン酸キナーゼ活性が低下した変異株がその親株
よりも多量のL−アスパラギン酸を培地中に生成蓄積す
る事実を見いだし、本発明を完成した。
パラギン酸の製造法では、L−アスパラギン酸の生産性
が低く工業生産することができない。本出願人に於ては
、L−アスパラギン酸生産能の高い微生物を育種するこ
とを目的として種々研究を重ねた結果、ブレビバクテリ
ウム属に属し、L−アスパラギン酸による阻害の弱いホ
スホエノールピルビン酸キナーゼと低いクエン酸合成酵
素活性を有する変異株が著量のL−アスパラギン酸を蓄
積することを既に発見した。本発明者等は更しこL−ア
スパラギン酸生産能の高い変異株について研究したとこ
ろピルビン酸キナーゼ活性が低下した変異株がその親株
よりも多量のL−アスパラギン酸を培地中に生成蓄積す
る事実を見いだし、本発明を完成した。
一般に、グルタミン酸生産菌においては、グルコースよ
り解糖系を経て生成したホスホエノールピルビン酸は、
一方ではピルビン酸キナーゼ反応によってピルビン酸に
変換され、更にアセチル−CoAを経てトリカルボン酸
サイクルに入り完全酸化されて炭酸ガスと水に分解され
る。他方、ホスホエノールピルビン酸からホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼ反応によって生成したオ
キザロ酢酸はアスパラギン酸に変換され、またはアセチ
ル−CoAと縮合してグルタミン酸に変換される。従っ
て、ピルビン酸キナーゼ活性レベルを低下させることは
、ホスホエノールピルビン酸の完全酸化を少なくするこ
とによってL−アスパラギン酸の前駆体であるオキザロ
酢酸の供給を高めるこ七に役立ち、その結果L−アスパ
ラギン酸生産能が増大したと考えられる。
り解糖系を経て生成したホスホエノールピルビン酸は、
一方ではピルビン酸キナーゼ反応によってピルビン酸に
変換され、更にアセチル−CoAを経てトリカルボン酸
サイクルに入り完全酸化されて炭酸ガスと水に分解され
る。他方、ホスホエノールピルビン酸からホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼ反応によって生成したオ
キザロ酢酸はアスパラギン酸に変換され、またはアセチ
ル−CoAと縮合してグルタミン酸に変換される。従っ
て、ピルビン酸キナーゼ活性レベルを低下させることは
、ホスホエノールピルビン酸の完全酸化を少なくするこ
とによってL−アスパラギン酸の前駆体であるオキザロ
酢酸の供給を高めるこ七に役立ち、その結果L−アスパ
ラギン酸生産能が増大したと考えられる。
本発明で使用する微生物はブレビバクテリウム属に属し
、ピルビン酸キナーゼ活性が低下しがっL−アスパラギ
ン酸生産能を有する変異株であり、イ列えば、ブレビバ
クテリウム俳フラバム(Brevibac−teriu
m flavum) AJ 11955 (FERM−
P 6665)がその代表例として挙げられる。
、ピルビン酸キナーゼ活性が低下しがっL−アスパラギ
ン酸生産能を有する変異株であり、イ列えば、ブレビバ
クテリウム俳フラバム(Brevibac−teriu
m flavum) AJ 11955 (FERM−
P 6665)がその代表例として挙げられる。
本発明で使用するピルビン酸キナーゼ活性の低下したL
−アスパラギン酸生産菌は、ブレビバクテリウム属に属
しL−アスパラギン酸生産能を有する微生物を親株とし
、これに通常の変異誘導操作を施し、変異処理した菌体
な培養しそのピルビン酸キナーゼ活性を測定し、ピルビ
ン酸キナーゼ活性が低下し、かつL−アスパラギン酸生
産能の高い菌株を選択することによって採取される。
−アスパラギン酸生産菌は、ブレビバクテリウム属に属
しL−アスパラギン酸生産能を有する微生物を親株とし
、これに通常の変異誘導操作を施し、変異処理した菌体
な培養しそのピルビン酸キナーゼ活性を測定し、ピルビ
ン酸キナーゼ活性が低下し、かつL−アスパラギン酸生
産能の高い菌株を選択することによって採取される。
上記親株の例としては、L−グルタミン酸要求性+7)
L−アスパラギン酸生産菌であるブレビバクテリウム・
フラバム AJ 11839 FERM−P 646]
、或はこのAJl、1839から誘導された復帰変異株
AJ 1.1840 FERM−P 6462等が挙げ
られる。
L−アスパラギン酸生産菌であるブレビバクテリウム・
フラバム AJ 11839 FERM−P 646]
、或はこのAJl、1839から誘導された復帰変異株
AJ 1.1840 FERM−P 6462等が挙げ
られる。
」―記AJ 11840はクエン酸合成酵素活性が原野
生株(ブレビバクテリウム・フラバム ATCC140
67)の1158に低下しかつホスホエ/−ルビルピン
酸カルボキシラーゼのL−アスパラギン酸ンこよる阻害
が親株の1741こまで弱くなったし一アスパラギン酸
生産菌である。本発明の変異株の親株としては上記し−
77・パラギン酸生産菌の他に、従来から、いわゆるコ
リネフォームのし一グルタミン酸生産菌として知られて
いる微生物、例えば、ブレビバクテリウム・デバリカタ
ム ATCC14020ブレビバクテリウ
ム・フラバム ATCC14067プ
レビバクテリウム・ラクトフェルメンタム ATC
o 13869等を使用することもできる。
生株(ブレビバクテリウム・フラバム ATCC140
67)の1158に低下しかつホスホエ/−ルビルピン
酸カルボキシラーゼのL−アスパラギン酸ンこよる阻害
が親株の1741こまで弱くなったし一アスパラギン酸
生産菌である。本発明の変異株の親株としては上記し−
77・パラギン酸生産菌の他に、従来から、いわゆるコ
リネフォームのし一グルタミン酸生産菌として知られて
いる微生物、例えば、ブレビバクテリウム・デバリカタ
ム ATCC14020ブレビバクテリウ
ム・フラバム ATCC14067プ
レビバクテリウム・ラクトフェルメンタム ATC
o 13869等を使用することもできる。
以下、実験例1及び2にて本発明の変異株の具体的誘導
方法とピルビン酸キナーゼの活性を示す。
方法とピルビン酸キナーゼの活性を示す。
実験例1
クエン酸合成酵素活性が低くかつL−アスパラギン酸に
よる阻害の弱いホスホエノールピルビン酸を有するL−
アスパラギン酸生産菌であるプレ 5− ビバクテリウム・フラバム AJ 11840から常法
により5−(2−アミノエチル)−L−システィン耐性
のし一リジン生産菌 AJ 11841 FERM−P
6463を誘導した。このAJll、841株はピルビ
ン。
よる阻害の弱いホスホエノールピルビン酸を有するL−
アスパラギン酸生産菌であるプレ 5− ビバクテリウム・フラバム AJ 11840から常法
により5−(2−アミノエチル)−L−システィン耐性
のし一リジン生産菌 AJ 11841 FERM−P
6463を誘導した。このAJll、841株はピルビ
ン。
酸キナーゼ活性が親株AJ 11840に比べて1/1
oに低下しかつし一メチオニン感受性菌である。このA
J 11841を下表の斜面寒天培地で培養し、生育し
た菌体な集めて1710 M ’)ン酸緩衝液(p H
7,0)に懸濁した。
oに低下しかつし一メチオニン感受性菌である。このA
J 11841を下表の斜面寒天培地で培養し、生育し
た菌体な集めて1710 M ’)ン酸緩衝液(p H
7,0)に懸濁した。
ペプトン 1゜
酵母エキス 10
塩化ナトリウム 5
この懸濁液にN−メチル−N1−ニトロ−N−二トロン
グアニジンを最終濃度が750μf/meになるように
加え30℃に15分間保持して変異を行った。
グアニジンを最終濃度が750μf/meになるように
加え30℃に15分間保持して変異を行った。
6−
この変異処理した菌体を同緩衝液で洗滌した後、L−メ
チオニンを含む第1表に示す最少寒天培地に接種し、3
0℃にて6日間培養し生育してきたコロニーを分離した
。
チオニンを含む第1表に示す最少寒天培地に接種し、3
0℃にて6日間培養し生育してきたコロニーを分離した
。
第1表 最少培地の組成(pH7,0%成 分
含 量 (10を当り)グルコース
202硫酸アンモニウム 10
〃KH2PO21Q 77 MgSO4・7 H2O0,4n FeSO4・7H2010m7 MnSO464n、o a、1
//ビオチン 30 μ7サイ
アミン塩酸塩 100〃L−メチオ=7
5001np(※NaOHで調整) このようにして得られたメチオニン非感受性復帰変異株
の中にはピルビン酸キナーゼ活性が著しく低下しかつL
−アスパラギン酸生産能の高いものが多く見い出された
。その代表株として、AJ11955株を選択した。
含 量 (10を当り)グルコース
202硫酸アンモニウム 10
〃KH2PO21Q 77 MgSO4・7 H2O0,4n FeSO4・7H2010m7 MnSO464n、o a、1
//ビオチン 30 μ7サイ
アミン塩酸塩 100〃L−メチオ=7
5001np(※NaOHで調整) このようにして得られたメチオニン非感受性復帰変異株
の中にはピルビン酸キナーゼ活性が著しく低下しかつL
−アスパラギン酸生産能の高いものが多く見い出された
。その代表株として、AJ11955株を選択した。
実験例2
第2表に示す組成の培地を500 ml容振盪フラスコ
に20m1宛分注し、加熱滅菌した。これに別途加熱滅
菌した炭酸カルシウム粉末を2.02を夫々補添して培
地を調整した。
に20m1宛分注し、加熱滅菌した。これに別途加熱滅
菌した炭酸カルシウム粉末を2.02を夫々補添して培
地を調整した。
第2表 培地組成(pH7,0)
成 分 含 量(1,0を当り)グ
ルコース 1002硫酸アンモニウ
ム 40 〃KH1lPO41tt MgSO4・7 H,200,4tt FeSO4’ 7 H2O10,OW MnSO4” 4 H2O8,1” ビオチン 300/lFサイアミン
塩酸塩 200〃犬豆蛋白酸水解液ゞ
20□eカザミノ酸 1
,02この培地に0.5%グルコース含有ブイヨン斜面
培地で培養した(30℃、24時間)AJ11955を
1白金耳接種し30℃にて振盪培養した。40時間振盪
培養後、集菌し、0.2%塩化カリウム水溶液で洗滌後
、菌体を5nMの塩化マグネシウムおよび30%グリセ
ロールを含むp H7,5のTES−NaOH緩衝液中
で20分間超音波破砕した。遠心公刊により不溶性残渣
を除去し、上清を同緩衝液で平衡化したセファデックス
G−50カラムでゲル濾過し酵素液を得た。
ルコース 1002硫酸アンモニウ
ム 40 〃KH1lPO41tt MgSO4・7 H,200,4tt FeSO4’ 7 H2O10,OW MnSO4” 4 H2O8,1” ビオチン 300/lFサイアミン
塩酸塩 200〃犬豆蛋白酸水解液ゞ
20□eカザミノ酸 1
,02この培地に0.5%グルコース含有ブイヨン斜面
培地で培養した(30℃、24時間)AJ11955を
1白金耳接種し30℃にて振盪培養した。40時間振盪
培養後、集菌し、0.2%塩化カリウム水溶液で洗滌後
、菌体を5nMの塩化マグネシウムおよび30%グリセ
ロールを含むp H7,5のTES−NaOH緩衝液中
で20分間超音波破砕した。遠心公刊により不溶性残渣
を除去し、上清を同緩衝液で平衡化したセファデックス
G−50カラムでゲル濾過し酵素液を得た。
次いで、第3表に示す組成の基質溶液1.0meに対し
て酵素液を酵素蛋白として100〜200μ2添加し、
これを22〜24℃に保持して酵素反応を行い、酵素反
応液の340nmにおける吸光度の減少の初速度を測定
してピルビン酸キナーゼ活性を求めた。その結果を第4
表に示す。
て酵素液を酵素蛋白として100〜200μ2添加し、
これを22〜24℃に保持して酵素反応を行い、酵素反
応液の340nmにおける吸光度の減少の初速度を測定
してピルビン酸キナーゼ活性を求めた。その結果を第4
表に示す。
9−
第3表 酵素基質溶液の組成
トリス−HCI(pH7,4) 0.1
MMnSO4@7 H2O3,3rnM NADHO,15// アデノンンー51−二リン酸 1.0〃ホスホエ
ノールピルビン酸2.O〃 乳酸脱水素酵素標品 10 μ?/me(
牛心臓) 尚、ホスホエノールピルビン酸を除いて同様の反応を行
い、これを対照とした。
MMnSO4@7 H2O3,3rnM NADHO,15// アデノンンー51−二リン酸 1.0〃ホスホエ
ノールピルビン酸2.O〃 乳酸脱水素酵素標品 10 μ?/me(
牛心臓) 尚、ホスホエノールピルビン酸を除いて同様の反応を行
い、これを対照とした。
AJ 11840 17
80AJ 11841
67.0AJ 11955
23.5第4表に示すようにAJ 1195
5のピルビン酸キナーゼ活性は親株AJ 11841に
比べて約1/3 に又原株AJ 1]840に比べて1
776に低下している。
80AJ 11841
67.0AJ 11955
23.5第4表に示すようにAJ 1195
5のピルビン酸キナーゼ活性は親株AJ 11841に
比べて約1/3 に又原株AJ 1]840に比べて1
776に低下している。
10−
他方、ピルビン酸キナーゼ低下株AJ 11955 テ
は、クエン酸合成酵素活性、ホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼのアスパラギン酸阻害は原株AJ1.
1840と同様に、原野性株2247(ATCC140
67)より低下しており、ホモセリンデヒドロゲナーゼ
活性は親株AJ11.841よりも増加し、原株AJ1
1,840、原野性株2247(ATCC14067)
と同等であった。
は、クエン酸合成酵素活性、ホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼのアスパラギン酸阻害は原株AJ1.
1840と同様に、原野性株2247(ATCC140
67)より低下しており、ホモセリンデヒドロゲナーゼ
活性は親株AJ11.841よりも増加し、原株AJ1
1,840、原野性株2247(ATCC14067)
と同等であった。
上述のような性質を有する微生物を用いてL−アスパラ
ギン酸を生産せしめるには特に困難はなく、炭素源、窒
素源、無機塩類、生育促進物質、要求栄養物質を含む通
常の栄養培地を用いて常法により行う。用いる炭素源と
しては、グルコース、糖蜜、デンプン加水分解物などの
糖類の他、酢酸、コハク酸等の有機酸、エチルアルコー
ル等のアルコール類、ノルマルパラフィン等の炭化水素
なども使用できる。窒素源としては硫安、硝安、尿素、
アンモニア等が用いられる。更にビオチン量の調節やペ
ニシリン等の抗生物質、脂肪酸エステル系界面活性剤等
の添加は良好な結果をもたらす。
ギン酸を生産せしめるには特に困難はなく、炭素源、窒
素源、無機塩類、生育促進物質、要求栄養物質を含む通
常の栄養培地を用いて常法により行う。用いる炭素源と
しては、グルコース、糖蜜、デンプン加水分解物などの
糖類の他、酢酸、コハク酸等の有機酸、エチルアルコー
ル等のアルコール類、ノルマルパラフィン等の炭化水素
なども使用できる。窒素源としては硫安、硝安、尿素、
アンモニア等が用いられる。更にビオチン量の調節やペ
ニシリン等の抗生物質、脂肪酸エステル系界面活性剤等
の添加は良好な結果をもたらす。
本発酵の条件は通気培養が好適である。温度は20〜4
0℃、発酵日数は1〜7日、培養中のpHは5〜・9が
よく、必要しこ応じて常法により調節する。炭素源又は
窒素源を分割添加したり連続的に添加することもできる
。発酵液からのL−アスパラギン酸の採取は通常イオン
交換樹脂法、直接晶析法等、常法によって行われる。
0℃、発酵日数は1〜7日、培養中のpHは5〜・9が
よく、必要しこ応じて常法により調節する。炭素源又は
窒素源を分割添加したり連続的に添加することもできる
。発酵液からのL−アスパラギン酸の採取は通常イオン
交換樹脂法、直接晶析法等、常法によって行われる。
生成したアスパラギン酸の定量は微生物を用いた生物検
定法、特異的酵素定量法によった。
定法、特異的酵素定量法によった。
以下、実施例により本発明を説明する。
実施例1
第2表に示した培地、但し、ビオチン量は2.0μり/
lを500ml容振盪フラスコに20m1宛分注し、1
10℃にて10分間殺菌した。この培地に、予め0,5
%グルフース含有ブイヨン斜面培地で培養した(30℃
、24時間)試験菌を接種し、30℃にて3日間振盪培
養した。培養液中に蓄積したL−アスパラギン酸を定量
した。その結果を第5表に示す。
lを500ml容振盪フラスコに20m1宛分注し、1
10℃にて10分間殺菌した。この培地に、予め0,5
%グルフース含有ブイヨン斜面培地で培養した(30℃
、24時間)試験菌を接種し、30℃にて3日間振盪培
養した。培養液中に蓄積したL−アスパラギン酸を定量
した。その結果を第5表に示す。
第5表 L−アスパラギン酸の蓄積量AJ 11
840 11..6AJ 118
41. 0.6AJ 1.1
955 22.0AJ 11955の
培養終了液から菌体な除いた濾液1tを強酸性陽イオン
交換樹脂(アンバーライト■R−120)に加えて、L
−アスパラギン酸を吸着せしめ、樹脂塔を水洗した後、
0.IN塩酸で溶出した。L−アスパラギン酸を含む画
分な集め減圧下で濃縮し、低温に一夜放置し、L−アス
パラギン酸の結晶を析出せしめた。次いでこれを濾別後
水洗し、8.79のL−アスパラギン酸の結晶を採取し
た。
840 11..6AJ 118
41. 0.6AJ 1.1
955 22.0AJ 11955の
培養終了液から菌体な除いた濾液1tを強酸性陽イオン
交換樹脂(アンバーライト■R−120)に加えて、L
−アスパラギン酸を吸着せしめ、樹脂塔を水洗した後、
0.IN塩酸で溶出した。L−アスパラギン酸を含む画
分な集め減圧下で濃縮し、低温に一夜放置し、L−アス
パラギン酸の結晶を析出せしめた。次いでこれを濾別後
水洗し、8.79のL−アスパラギン酸の結晶を採取し
た。
特許出願人 味の素株式会社
13−
Claims (1)
- ブレビバクテリウム属に属し、ピルビン酸キナーゼ活性
が低下し、かつL−アスパラギン酸生産能を有する変異
株を培養し、培養液中にL−アスパラギン酸を生成蓄積
せしめ、これを採取することを特徴とする発酵法による
L−アスパラギン酸の製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP57156400A JPS5945895A (ja) | 1982-09-08 | 1982-09-08 | 発酵法によるl−アスパラギン酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP57156400A JPS5945895A (ja) | 1982-09-08 | 1982-09-08 | 発酵法によるl−アスパラギン酸の製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5945895A true JPS5945895A (ja) | 1984-03-14 |
JPH0378114B2 JPH0378114B2 (ja) | 1991-12-12 |
Family
ID=15626905
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP57156400A Granted JPS5945895A (ja) | 1982-09-08 | 1982-09-08 | 発酵法によるl−アスパラギン酸の製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5945895A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63233210A (ja) * | 1987-03-20 | 1988-09-28 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | ガスバ−ナ |
US5077207A (en) * | 1988-01-21 | 1991-12-31 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for the production of L-threonine by fermentation |
WO2023276980A1 (ja) * | 2021-06-29 | 2023-01-05 | Green Earth Institute株式会社 | アスパラギン酸を製造する方法 |
-
1982
- 1982-09-08 JP JP57156400A patent/JPS5945895A/ja active Granted
Cited By (3)
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JPS63233210A (ja) * | 1987-03-20 | 1988-09-28 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | ガスバ−ナ |
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JPH0378114B2 (ja) | 1991-12-12 |
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