JPH0378114B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、発酵法によるＬ−アスパラギン酸の
製造法に関する。 従来、微生物を用いてＬ−アスパラギン酸を製
造する方法としては、フマール酸やマレイン酸の
如き前駆物質を倍地中に添加して培養することに
より、或は微生物の培養物、生菌体、更にはそれ
らの処理物を酵素剤とする酵素反応によりＬ−ア
スパラギン酸を生成せしめる方法が種々研究さ
れ、公知となつている。一方、糖類等を炭素源と
して微生物を培養し、直接Ｌ−アスパラギン酸を
製造する直接発酵法については、ブレビバクテリ
ウム属に属する微生物から誘導されたＬ−グルタ
ミン酸要求性変異株による方法（特公昭51−
24592号公報）、６−ジメチルアミノプリンに耐性
を有する変異株による方法〔特公昭53−20593号
公報〕などが知られている。 しかしながら、これら従来の直接発酵法による
Ｌ−アスパラギン酸の製造法では、Ｌ−アスパラ
ギン酸の生産性が低く工業生産することができな
い。本出願人に於ては、Ｌ−アスパラギン酸生産
能の高い微生物を育種することを目的として種々
研究を重ねた結果、ブレビバクテリウム属に属
し、Ｌ−アスパラギン酸による阻害の弱いホスホ
エノールピルビン酸カルボキシラーゼと低いクエ
ン酸合成酵素活性を有する変異株が著量のＬ−ア
スパラギン酸を蓄積することを既に発見した。本
発明者等は更にＬ−アスパラギン酸生産能の高い
変異株について研究したところピルビン酸キナー
ゼ活性が低下した変異株がその親株よりも多量の
Ｌ−アスパラギン酸を倍地中に生成蓄積する事実
を見いだし、本発明を完成した。 一般に、グルタミン酸生産菌においては、グル
コースより解糖系を経て生成したホスホエーノー
ルピルビン酸は、一方ではピルビン酸キナーゼ反
応によつてピルビン酸に変換され、更にアセチル
−CoAを経てトリカルボン酸サイクルに入り完
全酸化されて炭酸ガスと水に分解される。他方、
ホスホエノールピルビン酸からホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼ反応によつて生成した
オキザロ酢酸はアスパラギン酸に変換され、また
はアセチル−CoAと縮合してグルトミン酸に変
換される。従つて、野生株に比べてピルビン酸キ
ナーゼ活性レベルを低下させることは、ホスホエ
ノールピルビン酸の完全酸化を少なくすることに
よつてＬ−アスパラギン酸の前駆体であるオキザ
ロ酢酸の供給を高めることに役立ち、その結果Ｌ
−アスパラギン酸生産能が増大したと考えられ
る。 本発明で使用する微生物はブレビバクテリウム
属に属し、野生株に比べてピルビン酸キナーゼ活
性が低下し、メチオニン非感受性でかつＬ−アス
パラギン酸生産能を有する変異株であり、例え
ば、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibac
−terium flavum）AJ11955（FERM−P6665）が
その代表例として挙げられる。 本発明で使用する、野生株に比べてピルビン酸
キナーゼ活性の低下したメチオニン非感受性のＬ
−アスパラギン酸生産菌は、ブレビバクテリウム
属に属しＬ−アスパラギン酸生産能を有する微生
物を親株とし、これに通常の変異誘導操作を施
し、変異処理した菌体を培養しそのピルビン酸キ
ナーゼ活性を測定し、ピルビン酸キナーゼ活性が
低下し、メチオニン非感受性で、かつＬ−アスパ
ラギン酸生産能の高い菌株を選択することによつ
て採取される。 上記親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸要求
性のＬ−アスパラギン酸生産菌であるブレビバク
テリウム・フラバム AJ11839 FERM−P6461、
或はこのAJ11839から誘導された復帰変異株
AJ11840FERM−P6462等が挙げられる。 上記AJ11840はクエン酸合成酵素活性が原野性
株（ブレビバクテリウム・フラバム
ATCC14067）の1/58に低下しかつホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼのＬ−アスパラギ
ン酸による阻害が親株の1/4にまで弱くなつたＬ
−アスパラギン酸生産菌である。本発明の変異株
の親株としては上記Ｌ−アスパラギン酸生産菌の
他に、従来から、いわゆるコリネフオームのＬ−
グルタミン酸生産菌として知られている微生物、
例えば、 ブレビバクテリウム・デバリカタム ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC14067 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
ATCC13869 等の野生株を使用することもできる。 以下、実施例１及び２にて本発明の変異株の具
体的誘導方法とピルビン酸キナーゼの活性を示
す。 実施例 １ クエン酸合成酵素活性が低くかつＬ−アスパラ
ギン酸による阻害の弱いホスホエノールピルビン
酸を有するＬ−アスパラギン酸生産菌であるブレ
ビバクテリウム・フラバム AJ11840から常法に
よりＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐
性のＬ−リジン生産菌 AJ11841FERM−P6463
を誘導した。このAJ11841株はピルビン酸キナー
ゼ活性が親株AJ11840に比べて1/10に低下しかつ
Ｌ−メチオニン感受性菌である。このAJ11841を
下表の斜面寒天培地で培養し、生育した菌体を集
めて1/10Ｍリン酸緩衝液（PH7.0）に懸濁した。

【表】 この懸濁液にＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジンを最終濃度が750μｇ／mlに
なるように加え30℃に15分間保持して変異を行つ
た。 この変異処理した菌体を同緩衝液で洗篠した
後、Ｌ−メチオニンを含む第１表に示す最小寒天
培地に接種し、30℃にて６日間培養し生育してき
たコロニーを分離した。

【表】 このようにして得られたメチオニン非感受性復
帰変異株の中にはピルビン酸キナーゼ活性が著し
く低下しかつＬ−アスパラギン酸生産能の高いも
のが多く見い出された。その代表株として、
AJ11955株を選択した。 実施例 ２ 第２表に示す組成の培地を500ml容振盪フラス
コに20ml宛分注し、加熱滅菌した。これに別途加
熱滅菌した炭酸カルシウム粉末を2.0ｇを夫々補
添して培地を調整した。

【表】 この培地に0.5％グルコース含有ブイヨン斜面
培地で培養した（30℃、24時間）AJ11955を１白
金耳接種し30℃にて振盪培養した。40時間振盪培
養後、集菌し、0.2％塩化カリウム水溶液で洗篠
後、菌体を5nMの塩化マグネシウムおよび30％
グリセロールを含むPH7.5のTES−NaOH緩衝液
中で20分間超音波破砕した。遠心分離により不溶
性残渣を除去し、上清を同緩衝液で平衡化したセ
フアデツクスＧ−50カラムでゲル濾過し酵素液を
得た。 次いで、第３表に示す組成の基質溶液1.0mlに
対して酵素液を酵素蛋白として100〜200μｇ添加
し、これを22〜24℃に保持して酵素反応を行い、
酵素反応液の340nmにおける吸光度の減少の初速
度を測定してピルビン酸キナーゼ活性を求めた。
その結果を第４表に示す。

【表】 尚、ホスホエノールピルビン酸を除いて同様の
反応を行い、これを対照とした。

【表】 第４表に示すようにAJ11955のピルビン酸キナ
ーゼ活性は親株CJ11841に比べて約1/3に又原株
AJ11840に比べて1/76に低下している。 他方、ピルビン酸キナーゼ低下株AJ11955で
は、クエン酸合成酵素活性、ホスホエノールピル
ビン酸カルボキシラーゼのアスパラギン酸阻害は
原株AJ11840と同様に、原野性株2247
（ATCC14067）より低下しており、ホモセリンデ
ヒドロゲナーゼ活性は親株AJ11841よりも増加
し、原株AJ11840、原野性株2247（ATCC14067）
と同等であつた。 上述のような性質を有する微生物を用いてＬ−
アスパラギン酸を生産せしめるには特に困難はな
く、炭素源、窒素源、無機塩類、生育促進物質、
要求栄養物質を含む通常の栄養培地を用いて常法
により行う。用いる炭素源としては、グルコー
ス、糖蜜、デンプン加水分解物などの糖類の他、
酢酸、コハク酸等の有機酸、エチルアルコール等
のアルコール類、ノルマルパラフイン等の炭化水
素なども使用できる。窒素源としては硫安、硝
安、尿素、アンモニア等が用いられる。更にビオ
チン量の調節やペニシリン等の抗生物質、脂肪酸
エステル系界面活性剤等の添加は良好な結果をも
たらす。 本発酵の条件は通気培養が好適である。温度は
20〜40℃、発酵日数は１〜７日、培養中のPHは５
〜９がよく、必要に応じて常法により調節する。
炭素源又は窒素源を分割添加したり連続的に添加
することもできる。発酵液からのＬ−アスパラギ
ン酸の採取は通常イオン交換樹脂法、直接晶析法
等、常法によつて行われる。 生成したアスパラギン酸の定量は微生物を用い
た生物検定法、特異的酵素定量法によつた。 以下、実施例により本発明を説明する。 実施例 １ 第２表に示した培地、但し、ビオチン量は2.0μ
ｇ／を500ml容振盪フラスコに20ml宛分注し、
110℃にて10分間殺菌した。この培地に、予め0.5
％グルコース含有ブイヨン斜面培地で培養した
（30℃、24時間）試験菌を接種し、30℃にて３日
間振盪培養した。培養液中に蓄積したＬ−アスパ
ラギン酸を定量した。その結果を第５表に示す。

【表】 AJ11955の培養終了液から菌体を除いた濾液１
を強酸性陽イオン交換樹脂（アンバーライト
IR−120）に加えて、Ｌ−アスパラギン酸を吸着
せしめ、樹脂塔を水洗した後、0.1N塩酸で溶出
した。Ｌ−アスパラギン酸を含む画分を集め減圧
下で濃縮し、低温に一夜放置し、Ｌ−アスパラギ
ン酸の結晶を析出せしめた。次いでこれを濾別後
水洗し、8.7ｇのＬ−アスパラギン酸の結晶を採
取した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ブレビバクテリウム属に属し、野生株に比べ
   てピルビン酸キナーゼ活性が低下し、メチオニン
   非感受性でかつＬ−アスパラギン酸生産能を有す
   る変異株を培養し、培養液中にＬ−アスパラギン
   酸を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴
   とする発酵法によるＬ−アスパラギン酸の製造
   法。