JP2600750B2 - 発酵法によるｌ―スレオニンの製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ―スレオニンの製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は発酵法によるＬ−スレオニン（以下スレオニ
ンと略記）の製造法に関する。スレオニンは飼料用、医
薬品用に利用される重要なアミノ酸である。
ンと略記）の製造法に関する。スレオニンは飼料用、医
薬品用に利用される重要なアミノ酸である。
（本発明が解決しようとする課題） 従来、発酵法によるスレオニンノ製造法としてはブレ
ビバクテリウム属殺菌のスレオニンアナログであるα−
アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸（以下AHVと略記）に耐
性を有する変異株を使用する方法（Agric.Biol.Chem.,3
4（３）448−456（1970），特公昭45−26708）が知られ
ている。この方法はAHV耐性変異株のうち、スレオニン
によるフィートバック阻害の解除されたホモセリンデヒ
ドロゲナーゼ（以下HDと略記）を持つ株を用いる方法で
ある（J.Biochem.,68,859−866（1970））。この方法に
よるスレオニン生成収率は低く、したがって飼料用に利
用できる程安価ではない。そこで収率向上のためにリジ
ン生産株から変異誘導されることが多い。この場合しば
しばリジンを副生するためにスレオニン収率が十分でな
く、培養液からの分離より困難としている。
ビバクテリウム属殺菌のスレオニンアナログであるα−
アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸（以下AHVと略記）に耐
性を有する変異株を使用する方法（Agric.Biol.Chem.,3
4（３）448−456（1970），特公昭45−26708）が知られ
ている。この方法はAHV耐性変異株のうち、スレオニン
によるフィートバック阻害の解除されたホモセリンデヒ
ドロゲナーゼ（以下HDと略記）を持つ株を用いる方法で
ある（J.Biochem.,68,859−866（1970））。この方法に
よるスレオニン生成収率は低く、したがって飼料用に利
用できる程安価ではない。そこで収率向上のためにリジ
ン生産株から変異誘導されることが多い。この場合しば
しばリジンを副生するためにスレオニン収率が十分でな
く、培養液からの分離より困難としている。
（課題を解決するための手段） 本発明者らは上述の課題を解決するために種々検討の
結果、ブレビバクテリウム属細菌からのジヒドロジピコ
リン酸シンターゼ（以下DPSと略記）欠失あるいは低下
変異株がスレオニンを生産することを見出した。これら
の変異株はHDのスレオニンによるフィードバック障害が
解除されていないため、公知菌とな異なる新型のスレオ
ニン生産株である。
結果、ブレビバクテリウム属細菌からのジヒドロジピコ
リン酸シンターゼ（以下DPSと略記）欠失あるいは低下
変異株がスレオニンを生産することを見出した。これら
の変異株はHDのスレオニンによるフィードバック障害が
解除されていないため、公知菌とな異なる新型のスレオ
ニン生産株である。
後述のようにこれらの変異株のスレオニン収率は従来
型の生産株とほぼ同じである。またDPSはリジン生合成
経路上の第一酵素であるため、これの欠失あるいは低下
変異株を誘導すればリジンの副生を軽減することがで
き、さらに、この変異は従来型のそれと全く異なる性質
であるため、従来型の株に重ね合わることでスレオニン
収率の向上も期待できる。
型の生産株とほぼ同じである。またDPSはリジン生合成
経路上の第一酵素であるため、これの欠失あるいは低下
変異株を誘導すればリジンの副生を軽減することがで
き、さらに、この変異は従来型のそれと全く異なる性質
であるため、従来型の株に重ね合わることでスレオニン
収率の向上も期待できる。
本発明のスレオニン製造法において用いられる微生物
は、ブレビバクテリウム属に属するDPS欠失あるいは低
下株である。この性質の他にさらにHDのフィードバック
阻害解除、Ｌ−メチオニン要求性、Ｌ−イソロイシン要
求性、エチオニン耐性、リジンアナログ耐性、ピルビン
酸キナーゼ欠失などを付与すると生産能をさらに向上さ
せることができる。
は、ブレビバクテリウム属に属するDPS欠失あるいは低
下株である。この性質の他にさらにHDのフィードバック
阻害解除、Ｌ−メチオニン要求性、Ｌ−イソロイシン要
求性、エチオニン耐性、リジンアナログ耐性、ピルビン
酸キナーゼ欠失などを付与すると生産能をさらに向上さ
せることができる。
本発明の変異株の親株はいわゆるＬ−グルタミン酸生
産菌として知られているブレビバクテリウム属の微生物
であり、例えば次のような菌株をあげることができる。
産菌として知られているブレビバクテリウム属の微生物
であり、例えば次のような菌株をあげることができる。
ブレビバクテリウム フラブム ATCC
14067 ブレビバクテリウム ディバリカタム ATCC
14020 ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム ATCC
13869 ブレビバクテリウム ロゼウム ATCC
13825 本発明で用いる変異株はこれら上述の菌株を親株とし
て変位操作を施してDPSの欠失あるいは低下を付与する
ことによって得られる。なお変異操作は通常の方法、例
えば紫外線照射或いはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジン（以下NGと略記）、亜硝酸等の化学
薬剤処理により行うことができる。DPS欠失あるいは低
下変異株は変異処理後、AHV耐性で且つスレオニンを生
産する株を選択し、これらの株のDPS活性を測定するこ
とにより分離できる。特に親株としてアスパルトキナー
ゼ（以下AKと略記）のスレオニンとリジンによる相乗阻
害解除型のリジン生産株を用いる場合は、得られた、AH
V耐性スレオニン生産株のうち、スレオニン生産量に比
較してリジン副生量が少い株を選択することでさらに効
率よくDPS欠失株を得ることができる。
14067 ブレビバクテリウム ディバリカタム ATCC
14020 ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム ATCC
13869 ブレビバクテリウム ロゼウム ATCC
13825 本発明で用いる変異株はこれら上述の菌株を親株とし
て変位操作を施してDPSの欠失あるいは低下を付与する
ことによって得られる。なお変異操作は通常の方法、例
えば紫外線照射或いはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジン（以下NGと略記）、亜硝酸等の化学
薬剤処理により行うことができる。DPS欠失あるいは低
下変異株は変異処理後、AHV耐性で且つスレオニンを生
産する株を選択し、これらの株のDPS活性を測定するこ
とにより分離できる。特に親株としてアスパルトキナー
ゼ（以下AKと略記）のスレオニンとリジンによる相乗阻
害解除型のリジン生産株を用いる場合は、得られた、AH
V耐性スレオニン生産株のうち、スレオニン生産量に比
較してリジン副生量が少い株を選択することでさらに効
率よくDPS欠失株を得ることができる。
以下に本発明の使用菌株の一例ブレビバクテリウム
フラバム AJ 12360（FERM P−9821）の具体的誘導方
法を述べる。本菌株はブレビバクテリウム フラバム
AJ14067から誘導されたアスパラギン酸生産株AJ11955
（FERM P−6665,特開昭59−45895） を親株として誘導された。ブレビバクテリウムフラバム
AJ11955を150μg/mlのNGで30℃,15分処理した。次いでA
HV10g/とリジン5g/を含む第１表に示したグルコー
ス最少寒天平板培地（直径9cm）に平板あたりの菌数が
約105となるように接種し、５日間培養後に出現したコ
ロニーを耐性株として第２表に示した完全寒天平板培地
に釣菌した。次にこれらの株を試験管に3ml分注した第
３表に示したスレオニン生産用培地（硫酸アンモニウム
70g/，大豆加水分解物30ml/を含む培地を用いた
が、この組成を以後に単にN70S30と略記する）に接種
し、30℃で72時間振盪培養し、スレオニンを生産する株
を選択した。これらのうち最高の生産能を示した変異株
AJ12360は、後述の方法で測定したところ、HDのフィー
ドバック阻害は親株と変わらないが、DPS活性は欠失し
ていた（第４表）。
フラバム AJ 12360（FERM P−9821）の具体的誘導方
法を述べる。本菌株はブレビバクテリウム フラバム
AJ14067から誘導されたアスパラギン酸生産株AJ11955
（FERM P−6665,特開昭59−45895） を親株として誘導された。ブレビバクテリウムフラバム
AJ11955を150μg/mlのNGで30℃,15分処理した。次いでA
HV10g/とリジン5g/を含む第１表に示したグルコー
ス最少寒天平板培地（直径9cm）に平板あたりの菌数が
約105となるように接種し、５日間培養後に出現したコ
ロニーを耐性株として第２表に示した完全寒天平板培地
に釣菌した。次にこれらの株を試験管に3ml分注した第
３表に示したスレオニン生産用培地（硫酸アンモニウム
70g/，大豆加水分解物30ml/を含む培地を用いた
が、この組成を以後に単にN70S30と略記する）に接種
し、30℃で72時間振盪培養し、スレオニンを生産する株
を選択した。これらのうち最高の生産能を示した変異株
AJ12360は、後述の方法で測定したところ、HDのフィー
ドバック阻害は親株と変わらないが、DPS活性は欠失し
ていた（第４表）。
次に親株としてスレオニンとリジンによる相乗阻害の
解除されたAKを有するリジン生産株ブレビバクテリウム
フラバム AC664株を用いて得られたDPS欠失あるいは
低下株AJ12361〜２（FERM P−9822〜３）の具体的誘導
方法について述べる。AC664を株を600μg/mlのNGで30
℃,15分処理した。次いでNG処理菌体を２〜5g/のAHV
を含む第５表に示した酢酸−ピルビン酸寒天平板培地に
平板あたりの菌数が約107個となるように接種し、12日
間培養後までに出現したコロニーを耐性株として釣菌し
た。これらの株のスレオニン，リジン生産能を前述の培
養方法で調べた。ただしスレオニン生産用培用としては
N25S35の組成のものを用いた。スレオニン生産量に比べ
てリジン副生量が少い５株を選択した。これらのうち、
第６表に示したようにAJ12361〜2,DA110の３株でHDのフ
ィードバック阻害は親株と変わらないが、DPS活性が欠
失あるいは低下していた。なおリジン副生量の少い株を
選択した理由は、DPSはジアミノピメリン酸（以下DAPと
略記）、リジン生合成経路上の反応を触媒する酵素であ
るため、DPS欠失株においてはリジン生産量が大幅に低
下すると考えられるからである。実際、これら３株は、
第６表に示したように、同じ親株から誘導された従来か
ら知られているスレオニンによるフィードバック阻害の
解除されたHDを持つスレオニン生産株の代表株AJ12363
（FERM P−9824）に比べ、リジン／スレオニン比が低か
った。
解除されたAKを有するリジン生産株ブレビバクテリウム
フラバム AC664株を用いて得られたDPS欠失あるいは
低下株AJ12361〜２（FERM P−9822〜３）の具体的誘導
方法について述べる。AC664を株を600μg/mlのNGで30
℃,15分処理した。次いでNG処理菌体を２〜5g/のAHV
を含む第５表に示した酢酸−ピルビン酸寒天平板培地に
平板あたりの菌数が約107個となるように接種し、12日
間培養後までに出現したコロニーを耐性株として釣菌し
た。これらの株のスレオニン，リジン生産能を前述の培
養方法で調べた。ただしスレオニン生産用培用としては
N25S35の組成のものを用いた。スレオニン生産量に比べ
てリジン副生量が少い５株を選択した。これらのうち、
第６表に示したようにAJ12361〜2,DA110の３株でHDのフ
ィードバック阻害は親株と変わらないが、DPS活性が欠
失あるいは低下していた。なおリジン副生量の少い株を
選択した理由は、DPSはジアミノピメリン酸（以下DAPと
略記）、リジン生合成経路上の反応を触媒する酵素であ
るため、DPS欠失株においてはリジン生産量が大幅に低
下すると考えられるからである。実際、これら３株は、
第６表に示したように、同じ親株から誘導された従来か
ら知られているスレオニンによるフィードバック阻害の
解除されたHDを持つスレオニン生産株の代表株AJ12363
（FERM P−9824）に比べ、リジン／スレオニン比が低か
った。
なお、スレオニン生産量は後述の方法により、リジン
生産量は酸性ニンヒドリン法により測定した。またDPS
活性は次にように測定した。第３表に示したスレオニン
生産用培地にDAP1g/を添加した培地を500ml容振盪フ
ラスコに20ml分注し、加熱滅菌した。ただしAJ12360株
にはN50S30,AJ12361〜2,DA110株にはN25S35の組成のも
のを使用した。これにからかじめ第２表に示した完全寒
天平板培地にDAP1g/,L−ヒスチジン塩酸塩300mg/を
添加した培地で30℃,24時間培養した菌体を１白金耳接
種し、30℃で40時間振盪培養後集菌し、0.2％塩化カリ
ウム溶液洗浄した。この洗浄菌体を50mMリン酸カリウム
緩衝液（pH7.0）に懸濁し、超音波処理後遠心分離して
得た上清を、同バッファーを用いてセファデックスG25
カラムでゲルろかして粗酵素液を調製した。活性測定は
第７表に示した反応液で30℃,10分間反応を行わせた
後、1mlの0.05N塩酸を添加して反応を停止し、消費され
たピルビン酸量を第８表に示した反応液を用いて340nm
における吸光度変化を測定することにより求めた。なお
反応の対照はDL−アスパルテート−β−セミアルデヒド
無添加系とした。HD活性は次のように測定した。粗酵素
液の調製は前述のDPSの活性測定と同様の方法で行った
が、緩衝液として50mMリン酸カリウム緩衝液の代りに0.
5M塩化カリウムを含む0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.
0）を用いた。活性測定は第９表に示した反応系で340nm
の吸光度の減少を測定することにより行った。反応の対
照はDL−アスパルテート−β−セミアルデヒド無添加系
とした。
生産量は酸性ニンヒドリン法により測定した。またDPS
活性は次にように測定した。第３表に示したスレオニン
生産用培地にDAP1g/を添加した培地を500ml容振盪フ
ラスコに20ml分注し、加熱滅菌した。ただしAJ12360株
にはN50S30,AJ12361〜2,DA110株にはN25S35の組成のも
のを使用した。これにからかじめ第２表に示した完全寒
天平板培地にDAP1g/,L−ヒスチジン塩酸塩300mg/を
添加した培地で30℃,24時間培養した菌体を１白金耳接
種し、30℃で40時間振盪培養後集菌し、0.2％塩化カリ
ウム溶液洗浄した。この洗浄菌体を50mMリン酸カリウム
緩衝液（pH7.0）に懸濁し、超音波処理後遠心分離して
得た上清を、同バッファーを用いてセファデックスG25
カラムでゲルろかして粗酵素液を調製した。活性測定は
第７表に示した反応液で30℃,10分間反応を行わせた
後、1mlの0.05N塩酸を添加して反応を停止し、消費され
たピルビン酸量を第８表に示した反応液を用いて340nm
における吸光度変化を測定することにより求めた。なお
反応の対照はDL−アスパルテート−β−セミアルデヒド
無添加系とした。HD活性は次のように測定した。粗酵素
液の調製は前述のDPSの活性測定と同様の方法で行った
が、緩衝液として50mMリン酸カリウム緩衝液の代りに0.
5M塩化カリウムを含む0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.
0）を用いた。活性測定は第９表に示した反応系で340nm
の吸光度の減少を測定することにより行った。反応の対
照はDL−アスパルテート−β−セミアルデヒド無添加系
とした。
次にDPS欠失株AJ12360,AJ12361のAHV耐性度をそれら
の親株と比較した。AHV耐性度は、DAP1g/，ジピコリ
ン酸50mg/，およびAJ12361とその親株AC664の場合に
はさらに生育促進物質としてＬ−ヒスチジン塩酸塩を30
0ml/添加した第２表に示した完全寒天平板培地で30
℃,24時間培養した菌体を、第10表にしたグルコース最
少液体培地で洗浄後、試験管に3ml分注した同培地に接
種し、24時間振盪培養後の培養液の562nmにおける吸光
度をAHV添加、無添加条件で測定比較することにより求
めた。なおこのグルコース最少液体培地には生育促進物
質としてAJ12361とAC664株の場合にはＬ−ヒスチジン塩
酸塩を200mg/,AJ12360とAJ11955株の場合にはDAPとリ
ジンを各々500mg/添加した。特にDAPあるいはDAPとリ
ジンはDPS欠失あるいは低下株の生育をしばしば促進し
たので、これまでの実験においても必要に応じて液体、
平板培地にDAPを添加している。第11表に示したように
いずれのDPS欠失株とも親株に比較してAHVによる生育阻
害を受けにくくなっており、AHV耐性を獲得していた。
の親株と比較した。AHV耐性度は、DAP1g/，ジピコリ
ン酸50mg/，およびAJ12361とその親株AC664の場合に
はさらに生育促進物質としてＬ−ヒスチジン塩酸塩を30
0ml/添加した第２表に示した完全寒天平板培地で30
℃,24時間培養した菌体を、第10表にしたグルコース最
少液体培地で洗浄後、試験管に3ml分注した同培地に接
種し、24時間振盪培養後の培養液の562nmにおける吸光
度をAHV添加、無添加条件で測定比較することにより求
めた。なおこのグルコース最少液体培地には生育促進物
質としてAJ12361とAC664株の場合にはＬ−ヒスチジン塩
酸塩を200mg/,AJ12360とAJ11955株の場合にはDAPとリ
ジンを各々500mg/添加した。特にDAPあるいはDAPとリ
ジンはDPS欠失あるいは低下株の生育をしばしば促進し
たので、これまでの実験においても必要に応じて液体、
平板培地にDAPを添加している。第11表に示したように
いずれのDPS欠失株とも親株に比較してAHVによる生育阻
害を受けにくくなっており、AHV耐性を獲得していた。
スレオニン生産用の培養培地は特に制限するところは
なく、炭素源，窒素源，無機塩及び必要ならば有機微量
栄養量を含有する通常の培地である。炭素源としては炭
水化物（グルコース，フラクトース或いはデンプン，セ
ルロース等の加水分解物，糖蜜等），有機酸（酢酸，ク
エン酸等），アルコール（グリセリン，エタノール
等），或いは炭化水素（ノルマルパラフィン等）が使用
できる。窒素源としは硫酸アンモニウム，尿素，硝酸ア
ンモニウム，リン酸アンモニウム，塩化アンモニウム，
アンモニアガス，その他を、無機塩としてはリン酸塩，
マグネシウム塩，カルシウム塩，鉄塩，マンガン塩，そ
の他微量金属塩等を必要に応じて使用する。有機微量栄
養素としては、栄養要求性のある場合には該当するアミ
ノ酸，ビタミン，脂肪酸類，有機塩基物質等を適量添加
し、必要に応じて更に生育促進物質としてアミノ酸，ビ
タミン，味液（登録商標，大豆加水分解物），酵母エキ
ス，ペプトン，カザミン酸等が使用できる。特DPS欠失
あるいは低下株の場合は、DAPやDAPとリジンの添加によ
って生育が促進され、良好な結果が得られることが多
い。
なく、炭素源，窒素源，無機塩及び必要ならば有機微量
栄養量を含有する通常の培地である。炭素源としては炭
水化物（グルコース，フラクトース或いはデンプン，セ
ルロース等の加水分解物，糖蜜等），有機酸（酢酸，ク
エン酸等），アルコール（グリセリン，エタノール
等），或いは炭化水素（ノルマルパラフィン等）が使用
できる。窒素源としは硫酸アンモニウム，尿素，硝酸ア
ンモニウム，リン酸アンモニウム，塩化アンモニウム，
アンモニアガス，その他を、無機塩としてはリン酸塩，
マグネシウム塩，カルシウム塩，鉄塩，マンガン塩，そ
の他微量金属塩等を必要に応じて使用する。有機微量栄
養素としては、栄養要求性のある場合には該当するアミ
ノ酸，ビタミン，脂肪酸類，有機塩基物質等を適量添加
し、必要に応じて更に生育促進物質としてアミノ酸，ビ
タミン，味液（登録商標，大豆加水分解物），酵母エキ
ス，ペプトン，カザミン酸等が使用できる。特DPS欠失
あるいは低下株の場合は、DAPやDAPとリジンの添加によ
って生育が促進され、良好な結果が得られることが多
い。
培養条件は通常の方法でpH5ないし９、温度は20ない
し40℃で好気的条件下に24ないし72時間培養すれば良
い。培養中のpHが下がる場合には炭酸カルシウムを別殺
菌して加えるか又はアンモニア水，アンモニアガス等の
アルカリで中和する。又有機酸を炭素源とする場合はpH
の上昇を鉱酸又は有機酸で中和する。
し40℃で好気的条件下に24ないし72時間培養すれば良
い。培養中のpHが下がる場合には炭酸カルシウムを別殺
菌して加えるか又はアンモニア水，アンモニアガス等の
アルカリで中和する。又有機酸を炭素源とする場合はpH
の上昇を鉱酸又は有機酸で中和する。
スレオニンの単離採取は常法によって行いうる。得ら
れたものは薄層クロマトグラム上のRf値及び微生物定量
法による生物活性値により、スレオニン標品のそれらと
一致することを確めスレオニンと同定した。スレオニン
の定量はロイコノストックメセンテロイデス（ATCC804
2）を用いる微生物定量法に従って行った。
れたものは薄層クロマトグラム上のRf値及び微生物定量
法による生物活性値により、スレオニン標品のそれらと
一致することを確めスレオニンと同定した。スレオニン
の定量はロイコノストックメセンテロイデス（ATCC804
2）を用いる微生物定量法に従って行った。
以下実施例にて説明する。
実施例1. 第３表に示したスレオニン生産用培地（N50S30）20ml
を500ml容振盪フラスコに分注し、加熱滅菌した。これ
にあらかじめDAP1g/，ジピコリン酸mg/を添加した
第２表の完全寒天平板培地で30℃,24時間培養したDPS欠
失株AJ12360およびその親株AJ11955の菌体を一白金耳接
種し、30℃で72時間振盪培養した。それぞれの培養液中
のスレオニン生成量は、10.7g/,0g/（検出限界以
下）であった。
を500ml容振盪フラスコに分注し、加熱滅菌した。これ
にあらかじめDAP1g/，ジピコリン酸mg/を添加した
第２表の完全寒天平板培地で30℃,24時間培養したDPS欠
失株AJ12360およびその親株AJ11955の菌体を一白金耳接
種し、30℃で72時間振盪培養した。それぞれの培養液中
のスレオニン生成量は、10.7g/,0g/（検出限界以
下）であった。
実施例2. スレオニン生産用培地としてN25S36の組成のものを用
い、完全培地にＬ−ヒスチジン塩酸塩を300mg/添加し
た以外は実施例１と全く同様にDPS欠失株AJ12361,DA11
0,DPS低下株AJ12362,親株AC664および従来型生産株AJ12
363を培養した。それぞれの培養液中のスレオニン生成
量は9.0,6.3,6.2,0,8.9g/であった。第１表 グルコース最少平板培地組成 グルコース 20 g/ 硫酸アンモニウム 10 〃 KH2PO4 10 〃 MgSO4・7H2O 0.4〃 FeSO4・7H2O 10 mg/ MnSO4・4H2O 8.1〃 チアミン塩酸塩 0.1〃 ビオチン 0.3〃 寒天 20 g/pH7.0（NaOH） 第２表 完全寒天平板培地組成 ポリペプトン 10 g/ 酵母エキス 10 〃 NaCl ５ 〃 グルコース ５ 〃 寒天 20 〃 pH7.0（NaOH） 第３表 スレオニン生産用培地 グルコース 100 g/ 硫酸アンモニウム＊ 70 〃 KH2PO4 １ 〃 MgSO4・7H2O 0.4〃 FeSO4・7H2O 10 mg/ MnSO4・4H2O 8.1〃 チアミン塩酸塩 0.2〃 ビオチン 0.3〃 大豆加水分解物（全窒素32g/）＊ 30ml/pH7.0（NaOH） ＊硫酸アンモニウム70g/，大豆加水分解物 30ml/の組成の場合N70S30と表記する。
い、完全培地にＬ−ヒスチジン塩酸塩を300mg/添加し
た以外は実施例１と全く同様にDPS欠失株AJ12361,DA11
0,DPS低下株AJ12362,親株AC664および従来型生産株AJ12
363を培養した。それぞれの培養液中のスレオニン生成
量は9.0,6.3,6.2,0,8.9g/であった。第１表 グルコース最少平板培地組成 グルコース 20 g/ 硫酸アンモニウム 10 〃 KH2PO4 10 〃 MgSO4・7H2O 0.4〃 FeSO4・7H2O 10 mg/ MnSO4・4H2O 8.1〃 チアミン塩酸塩 0.1〃 ビオチン 0.3〃 寒天 20 g/pH7.0（NaOH） 第２表 完全寒天平板培地組成 ポリペプトン 10 g/ 酵母エキス 10 〃 NaCl ５ 〃 グルコース ５ 〃 寒天 20 〃 pH7.0（NaOH） 第３表 スレオニン生産用培地 グルコース 100 g/ 硫酸アンモニウム＊ 70 〃 KH2PO4 １ 〃 MgSO4・7H2O 0.4〃 FeSO4・7H2O 10 mg/ MnSO4・4H2O 8.1〃 チアミン塩酸塩 0.2〃 ビオチン 0.3〃 大豆加水分解物（全窒素32g/）＊ 30ml/pH7.0（NaOH） ＊硫酸アンモニウム70g/，大豆加水分解物 30ml/の組成の場合N70S30と表記する。
第５表 酢酸−ピルビン酸寒天平板培地組成 酢酸 ５ g/ ピルビン酸ナトリムウ ５ 〃 硫酸アンモニウム ５ 〃 KH2PO4 １ 〃 MgSO4・7H2O 0.4〃 FeSO4・7H2O 10 mg/ MnSO4・4H2O 8.1〃 チアミン塩酸塩 0.1 ビオチン 0.5 HEPES 23.8g/ 生育促進物質 ＊ 寒天 20 g/pH7.0（NaOH） ＊酵母エキス0.4g/,L−シスチン,L−アラニン各20mg/
,L−トリプトファン,L−フェニルアラニン,L−チロシ
ン,L−リジン塩酸塩,L−−メチオニン,L−アルギニン塩
酸塩各300mg/ 第８表 ピルビン酸測定用反応液組成 トリス塩酸緩衝液（pH7.5） 100mM NADH2 0.15mM 乳酸脱水素酵素 20μｇ第７表の反応停止済反応液 0.2ml 全量 2ml 第10表 グルコース最少液体培地組成 グルコース 20 g/ 硫酸アンモニウム 10 〃 KH2PH4 １ 〃 MgSO4・7H2O 0.4〃 FeSO4・7H2O 10mg MnSO4・4H2O 8.1〃 チアミン塩酸塩 0.1〃 ビオチン 0.3〃 尿素 ３ g/pH7.3（NaOH）
,L−トリプトファン,L−フェニルアラニン,L−チロシ
ン,L−リジン塩酸塩,L−−メチオニン,L−アルギニン塩
酸塩各300mg/ 第８表 ピルビン酸測定用反応液組成 トリス塩酸緩衝液（pH7.5） 100mM NADH2 0.15mM 乳酸脱水素酵素 20μｇ第７表の反応停止済反応液 0.2ml 全量 2ml 第10表 グルコース最少液体培地組成 グルコース 20 g/ 硫酸アンモニウム 10 〃 KH2PH4 １ 〃 MgSO4・7H2O 0.4〃 FeSO4・7H2O 10mg MnSO4・4H2O 8.1〃 チアミン塩酸塩 0.1〃 ビオチン 0.3〃 尿素 ３ g/pH7.3（NaOH）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川村 和枝 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１―１ 味 の素株式会社中央研究所内 審査官 植野 浩志
Claims (2)
- 【請求項１】ブレビバクテリウム属に属し、ジヒドロジ
ピコリン酸シンターゼが欠失または低下した変異株を液
体培地に培養し、培養液中にＬ−スレオニンを生成蓄積
せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−スレオニ
ンの製造法。 - 【請求項２】ブレビバクテリウム属に属しα−アミノ−
β−ヒドロキシ吉草酸に耐性を有し、かつジヒドロジピ
コリン酸シンターゼが欠失または低下した変異株を液体
培地に培養し、培養液中にＬ−スレオニンを生成蓄積せ
しめ、これを採取することを特徴とするＬ−スレオニン
の製造法。
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