FR2626286A1 - Procede de production de la l-threonine par fermentation - Google Patents

Abstract

Procédé de production de la L-thréonine par fermentation, ledit procédé comprenant la culture d'un mutant appartenant au genre Brevibacterium, et dans lequel l'activité dihydrodipicolinate synthétase a été supprimée ou réduite, dans un milieu liquide, la production et l'accumulation de la L-thréonine dans ledit milieu et la récupération de la L-thréonine produite. Le mutant est de préférence résistant à l'acide alpha-amino-beta-hydroxyvalérique.

Description

I La présente invention concerne un procédé de production

de La L-thréonine (désignée ci-après par thréonine) par ferren-

tation. La thréonine est un aminoacide important utilisé dans les

aliments pour animaux et dans les produits pharmaceutiques.

Jusqu'à présent, pour La production de la thréonine par fermentation, on connait un procédé qui utilise un mutant bactérien

du genre Brevibacterium résistant à l'acide o-amino-f-hydroxy-

vaLérique (désigné ci-après par AHV) qui est un analogue de La thréonine (Agric. Biol. Chem., 34 (3) 448-456 (1970), publication du brevet japonais n 26708/70). Ce procédé utilise, parmi Les mutants résistants à L'AHV une souche ayant une activité hcmosérine

déshydrogénase (désignée ci-après par HD) dans laquelle l'in-i-

bition rétroactive due à La thréonine a été éliminée (J. Biochem., 68, 859-866 (1970)). Le rendement en thréonine produit par ce procédé est faible et par ccnsequent il n'est pas si économicue de l'appliquer aux aliments pour animaux. En conséquence, pour améliorer le rendement, un mutant est souvent dérivé d'une souche productrice de Lysine. Toutefois, dans ce cas, étant donné que La Lysine est fréquemment formée en tant que sous-produit, Le rendement en thréonine n'est pas suffisant et sa séparation du

milieu est rendue plus difficile.

Les présents inventeurs ont procédé à des études intensives en vue de résoudre le problème défini ci-dessus, et ont

découvert que Les mutants qui sont dérivés des bactéries appar-

tenant au genre Brevibacterium et dans Lesquels la dihydrodipico-

linate synthétase (désignée ci-après par DPS) a été supprimée ou réduite, produisent la thréonine. Ces mutants sont des souches nouvelles productrices de thréonine différentes des bactéries connues car l'inhibition rétroactive de L'homosérine déshydrogénase

due à la thréonine n'a pas été supprimée.

Comme on le décrira ci-après, le rendement en thréonine par ces mutants est plus ou moins te même que ceLui donné par les souches productrices du type conventionnel. De plus, étant donné que la DPS est l'enzyme primaire de la voie de biosynthèse de La lysine, chez un mutant dans lequel elle a été supprimée ou réduite, la sous-production de la lysine peut être abaissée, et en outre, étant donné que cette mutation est d'une nature complètement différente de celle des types conventionnels, on peut également s'attendre à obtenir une amélioration du rendement en thréonine en

la juxtaposant aux souches de type conventionnel.

Le micro-organisme utilisé dans le procédé de production de la thréonine de La présente invention est une souche qui appartient au genre Brevibacterium et dans laquelle La DPS a été supprimée ou réduite. En plus de cette propriété, sa productivité

peut encore être améliorée lorsqu'on lui communique Les caracté-

ristiques suivantes: suppression de l'inhibition rétreactive de HD, caractère auxotrophe vis-à-vis de la L-méthionire, caractère auxotrophe vis-à-vis de la L-isoleucine, résistance à L'éthionine, résistance aux analogues de la lysine, suppression de la pyruvate kinase, etc. La souche mère du mutant de la présente invention est un micro-organisme appartenant au genre Brevibacterium connu sous l'appellation de bactérie productrice d'acide L-glutamioue et peut être exemplifiée par les souches suivantes: Brevibacterium flavum ATCC 14067 Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13?69 Brevibacterium roseum ATCC 13825 Le mutant utilisé dans la présente invention peut être obtenu en conduisant une opération de mutation sur les souches décrites ci- dessus comme souches mères pour leur communiquer la suppression ou la réduction de la DPS. L'opération de mutation peut

être conduite par la méthode conventionnelle, par exemple irra-

diation à la lumière ultraviolette, ou par traitement par des

produits chimiques utilisant la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguani-

dine (désignée ci-après par NG), l'acide nitreux, etc. Apres l'opération de mutation, le mutant à suppression ou réduction de DPS peut être séparé par sélection des souches résistant à l'AHV et également productrices de thréonine, et en mesurant L'activité DPS de ces souches. En particulier, lorsqu'une souche productrice de

lysine d'un type dans lequel l'inhibition synergique ce l'asparto-

kinase (désignée ci-après par AK) due à la thréonine et L la ysire a été éliminée, est utilisée comme souche mère, par sélection de la

souche qui produit mains de Lysine en tant que sous-produit compa-

rativement au rendement en thréonine parmi Les souches productrices de thréonine, résistartes à L'AHV obtenues, ix est possible

d'obtenir plus efficacement la souche dépourvue de DPS.

Une méthode spécifique pour dériver Le Brevibacterium flavum AJ 12360 (FERM P-9821), qui est un exemple des souches utilisées dans la pr-ésente invention, est décrite ci-après. La présente souche est cêriVée de La souche productrice d'acide aspartique AJ 11955 (FERM P-6665), (demande de brevet japonais ouvert au public n 45c5/84) en tant que souche mère, qui à son

tour est dérivée du Brevibacterium fLavum AJ 14067. Le Brevi-

bacterium fLavum AJ 11955 est traité par 150 pg/ml ae NG à 30 0C pendant 15 minutes. Ensuite, un milieu minimum de glucose sur plaque de géLose (9 cm de diamètre) montré Cans le tableau 1 et contenant également 10 g/L de AHV et 5 g/L de lysine est inoculé de façon à donner environ 105 cellules par plaque, et les colonies apparaissant après une culture de 5 jours sont transférées sur un milieu compLet sur plaque de gélose montré dans le tableau 2 comme souches résistantes. Ensuite, un miLieu pour la production de la thréonine montré dans Le tableau 3 (le milieu contient 70 g/L de sulfate d'ammonium et 30 ml/L d'hydrolysat de soja est utilisé, et cette composition est simplement désignée par N70S30) est réparti en quantité de 3 ml dans des tubes à essais, inoculé par ces souches, et la culture sous secouage est conduite à 30 0C pendant

72 heures et les souches productrices de thréonine sont sélec-

tionnées. Parmi ces souches, le mutant AJ 12360 montrant la produc-

tivité maximale est mesuré par la méthode décrite ci-après, pour trouver que l'inhibition rétroactive de HD est la même que cettlle de

la souche mère mais que l'activité DPS a été supprimée (tableau 4).

Ensuite, une méthode spécifique pour dériver Les souches à activité DPS supprimée ou réduite AJ 12361-2 (FERM-P9822-3) obtenues en utilisan- comme souche mère la souche productrice de Lysine Brevibacterium fLavum AC 664 ayant de L'AK dans laqueLle L'inhibition synercique due à La thron- e et a La se --_ t supprimée est décrite ci-après. La souche AC 664 est traitée par 600 pg/ml de NG à 3C-C pendant 15 minutes. Ensuite, un mi;eu d'acide acétique-acide pyruvique sur plaque de gélose montré dans le tableau 5 et contenant 2-5 g/L d'AHV est inoculé avec les cellules traitées à la NG pour donner environ 107 cellules par plaque, puis les colonies apparaissant après une culture de 12 jours sont transférées en tant que souches résistantes. La productivité de thréonine et de lysine de ces souches est examinée par la méthode de culture décrite précédemment, sauf que comme

milieu pour la production de la thréonine, celui ayant la comno-

sition N25S35 est utilisé. Cinq souches, dans lesquelles la

quantité de lysine produite comme sous-produit est faible compara-

tivement au rendement en thréonine produite, sont sélectionrées.

Parmi ces souches, comme montré dans le tableau 6, avec 3 souches AJ 12361 et 12362 et DA 110, L'inhibition rétroactive de HD est la même que celle de la souche mère mais l'activité DPS a été supprimée ou réduite. La raison pour laquelle, les souches donnant des quantités inférieures de lysine comme sous-produits sont sélectionnées, est la suivante: étant donné que la DPS est une enzyme qui catalyse une réaction de l'acide diaminopimélique (désigné ci-après par DAP) et la voie de la synthèse de la lysine, 2f4 on pense que la quantité de lysine produite est fortement réduite avec les souches à activité DPS supprimée. En fait, avec ces 3 souches, comme montré dans le tableau 6, les rapports lysine/ thréonine sont inférieurs à ceux de la souche AJ 12363 (FERM P-9824) qui est une souche représentative des souches productrices de thréonine connues dérivées de la même souche mère et ayant de la HD dans laquelle l'inhibition rétroactive due à la thréonine a été supprimée. La quantité de thréonine produite est mesurée par la méthode décrite ci-après et la quantité de lysine produite est mesurée par une méthode à la ninhydrine acide. En outre, L'actîivt DPS est mesurée comme suit. Un milieu obtenu par addition de 1 g/l de DAP à un milieu de production de la thréonine montré dans le tableau 3 est réparti en quantité de 20 ml dans des flacons secoueurs de 500 ml, et stérilisé à l'autoclave. Les compositions utilisées sont les suivantes: N50S30 pour la souche AJ 12360 et N25S35 pour les souches AJ 12361-2 et DA 110. Chaque milieu est

inoculé par le contenu d'une boucle de la souche qui a été préala-

blement cultivée dans un milieu complet sur plaque de gélose montré dans le tableau 2 et supplémenté par 1 g/L de DAP et 300 mg/t de chtorhydrate de L-histidine à 30 C pendant 24 heures, puis la culture sous secouage est conduite à 30 C pendant 40 heures, et les cellules sont recueillies et lavées par une solution à 0,2 % de chlorure de potassium. Ces cellules lavées sont mises en suspension dans un tampon de phosphate de potassium 50 mM (pH 7,0), séparées par centrifugation apres traitement aux ultrasons pour obtenir un liquide surnageant, que l'on filtre ensuite sur gel à travers une colonne de Sephadex G25 en utilisant le même tampon pour préparer une solution brute d'enzyme. L'activité est mesurée en conduidant la réaction à 30 C pendant 10 minutes, en terminant la réaction par addition de 1 ml d'acide chlorhydrique 0,05 N, et en mesurant le changement de l'absorbance à 340 nm en utilisant un milieu de réaction montré dans le tableau 8 pour déterminer la quantité d'acide pyruvique consommée. Le témoin pour cette réaction est un système exempt de DL-aspartate-p-semialdéhyde. L'activité HD est mesurée comme suit. La solution brute d'enzyme est préparée d'une manière similaire à celle indiquée dans la mesure de l'activité DPS décrite précédemment, sauf qu'un tampon phosphate de potassium 0O1 M contenant du chlorure de potassium 0,5 M (pH 7,0) est utilisé comme tampon à la place du tampon phosphate de potassium 50 mM. La mesure' de l'activité est conduite en mesurant la réduction de L'absorbance à 340 nm dans un système réactionnel montré dans le tableau 9. Le témoin pour cette réaction est un système exempt de DL-aspartate-p-semialdéhyde. Ensuite, les degrés de résistance à l'AHV des souches à activité DPS supprimée AJ 12360 et AJ 12361 sont comparés par rapport à leurs souches mères. Le degré de résistance à l'AHV est déterminé par culture de la souche dans un milieu complet sur plaque de géLose montré dans le tableau 2 et contenant également 1 g/l de DAP, 50 ml/l d'acide dipicolinique et en outre, dans le cas de la souche AJ 12361 et de sa souche mère AC 664, 300 mg/l de chlorhydrate de L-histidine comme substance promotrice de croissance, 30 C pendant 24 heures, lavage des cellules avec un croissance, à 30 C pendant 24 heures, Lavage des cellules avec un

milieu liquide minimum de glucose montré dans le tableau 10, inocu-

lation du même milieu réparti par quantité de 3 ml dans des tubes à essais par les cellules, culture sous secouage pendant 24 heures et mesure et comparaison de l'absorbance de chaque milieu à 562 nm dans des conditions avec addition de AHV et sans addition de AHV. A ce milieu liquide minimum de glucose sont ajoutés en tant que substances promotrices de croissance, 200 mg/l de chlorhydrate de L-histidine dans le cas des souches AJ 12361 et AC 664, et 500 mg/l de DAP et 500 mg/l de lysine dans le cas des souches AJ 12360 et AJ 11955. En particulier, étant donné que le DAP ou le DAP et la lysine favorisent souvent la croissance de la souche à activité DPS supprimée ou réduite, le DAP a été ajouté au liquide et au milieu sur plaque dans les expériences décrites lorsque ceci s'est révélé nécessaire. Comme montré dans le tableau 11, les deux souches à activité DPS supprimée sont difficilement sujettes à l'inhibition

de croissance due à l'AHV comparativement aux souches mères respec-

tives et ont ainsi acquis une résistance à l'AHV.

Le milieu de culture pour la production de la thréonine n'est pas particulièrement limité, et il peut être un milieu conventionnel contenant des sources de carbone, des sources d'azote, des sels minéraux, et des nutriments mineurs organiques, si nécessaire. Comme sources de carbone, on peut utiliser des hydrates de carbone (glucose, fructose, ou hydrolysats d'amidon, cellulose, etc., mélasses, etc.), des acides organiques (acide acétique, acide citrique, etc.), des alcools (glycérine, éthanol, etc.), ou des hydrocarbures (paraffines normales, etc.). Comme sources d'azote, on peut utiliser le sulfate d'ammonium, l'urée, le nitrate d'ammonium, le phosphate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, le gaz ammoniac, etc. et comme sels minéraux, on peut utiliser des phosphates, des sels de magnésium, des sels de calcium, des sels de fer, des sels de manganèse, et d'autres sels

métalliques mineurs, etc., si nécessaire. Comme nutriments orga-

niques mineurs, l'aminoacide correspondant lorsqu'il y a auxo-

trophie, les vitamines, les acides gras, les substances basiques organiques, etc. sont ajoutés en quantités appropriées, et si nécessaire, on peut également ajouter comme substances promotrices de croissance, des aminoacides, des vitamines, un hydrolysat de soja connu sous la marque déposée Ajieki, les extraits de Levure, les peptones, les casaminoacides, etc. En particulier, dans Le cas des souches à activité DPS supprimée ou réduite, l'addition de DAP ou de DAP et de lysine améliore souvent la croissance pour donner

de bons résultats.

Les conditions de culture peuvent être conventionnelles,

par exemple la culture est conduite à un pH de 5-9 à une tempé-

rature de 20-40 C dans des conditions en aérobie pendant 24-72 heures.. Durant La culture, lorsque le pH tcmbe, le carbronte de calcium stérilisé séparément est ajouté, ou un alcali tel que L'ammoniaque aqueuse, le gaz ammoniac, etc. est utilisé pour la neutralisation. En outre, lorsqu'un acide organique est utilisé comme source de carbone, l'élévation du pH est neutralisée par un

acide minéral ou par un acide organique.

La séparation et la récupération de la thréonine peuvent être conduites de manière conventionnelle. Le produit obtenu est identifié comme étant la thréonine lorsque la valeur Rf donnée par

chroiatographie en couche mince et la valeur de l'activité biolo-

gique donnée par la méthode de titrage microbiologique concordent avec les valeurs du produit thréonine authentique. L'analyse -quantitative de la thréonine est conduite par la méthode de titrage

microbiotogique utilisant le leuconostoc mesenteroides (ATCC 8042).

Le Brevibacterium flavum FERM-BP 2178 FERM-P 6665 (AJ 11955) était déposé initialement le 14 août 1982 à l'Institut de Recherches de Fermentation, Agence des Sciences Industrielles et de Technologie, Ministère du Commerce International et de l'Industrie (FRT), 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken 305, Japon, et a reçu l'immatriculation FERM-P indiquée ci-dessus. Le Brevibacterium flavum FERM-BP 2179 FERM-P 9821 (AJ 12360), FERM-BP 2180 FERM-P 9823 (AJ 12362) et FERM-BP 2181 FERM-P 9824 (AJ 123o3) étaient déposés initialement le 18 janvier 1988 à FRI, et ont reçu les 'immatriculations FERM-P indiquées ci-zessus. Les sz che ensuite converties en dépôts selon le Traité de Budapest le 7 décembre 1988 et ont reçu les immatriculations correspondantes

FERM-BP.

Le Brevibacterium flavum FERM-BP 2186, FERM-P 988 (AJ 12361) était initialement déposé le 18 janvier 1988 à FRI, et a reçu l'immatriculation FERM-P indiquée ci-dessus. La souche était ensuite convertie en dépôt selon le Traité de Budapest Le

14 décembre 1988 et est enregistrée sous l'immatriculation corres-

pondante FERM-BP.

La présente invention sera décrite en plus grand détail

dans les exemples qui suivent.

Exemple 1

Le milieu pour la production de la thréonine (N50S30) montré dans le tableau 3 est réparti en quantité de 20 ml dans des flacons secoueurs de 500 ml et stérilisé à l'autoclave. Ces flacons sont inoculés chacun par le contenu d'une boucle de la souche à activité DPS supprimée AJ 12360 et de sa souche mère AJ 11955 qui ont été préalablement cultivées dans le milieu complet sur plaque de gélose du tableau 2 et également supplémentées par 1 g/l de DAP o

et 50 mg/l d'acide dipicolinique à 30 C pendant 24 heures, respec-

tivement. Les quantités de thréonine produite dans les milieux respectifs sont de 10,7 g/l et O g/l (en-dessous de la limite de

détection).

Exemple 2

On cultive de la même manière que celle décrite à l'exemple 1, la souche à activité DPS supprimée AJ 12361, la souche DA 110, la souche à activité DPS réduite AJ 12362 et la souche mère AC 664 et la souche productrice du type conventionnel AJ 12363, sauf que le milieu pour la production de la thréonine est un milieu de composition N25S35 et que le chlorhydrate de Lhistidine est ajouté en quantité de 300 mg/l au milieu complet. Les quantités de thréonine produite dans les milieux respectifs sont les suivantes:

9,0, 6,3, 6,2, 0 et 8,9 g/l.

Tableau 1

Composition du milieu minimum de glucose sur plaque GLucose 20 g/l Sulfate d'ammonium 10

KH2P04 10

MgSO4,7H20 0,4 4, FeSO4,7H20 10 mg/L MnSO4,4H20 8,1 Chlorhydrate de thiamine 0,1 Biotine 0,3 Gétose 20 g/l pH 7,0 (NaOH)

Tableau 2

Composition du milieu complet sur plaque de géLose Polypeptone 10 g/l Extrait de Levure 10 NaCt 5 GLucose 5 Gélose 20 pH 7,0 (NaONH)

Tableau 3

Milieu pour La production de la thréonine GLucqse 100 g/l Sulfate d'ammonium 70

KH2PO 1

2 4 MgSO4,7H20 0,4 04" FeSO4,7H20 10 mg/l MnSO4,4H20 8,1 Chtorhydrate de thiamine 0,2 Biotine 0,3 Hydroltysat de soja (Azote total 32 g/l) 30 ml/l pH 7,0 (NaOH) Lorsque la composition comprend 70 g/l de sulfate d'ammonium et

ml/l d'hydrolysat de soja, on la désigne par N70S30.

TabLeau 4

Activités dihydrodipicolinate synthétase et homosérine déshydrogénase Souche Activité dihydrodipicolinate Inhibition rétroactive

snéa* de l'homosérine déshydro-

synthétase génase (%) **

AJ 11955 63,6 98

(souche mère)

AJ 12360 0 98

(mutant) nmol/min/mg protéine **

Degré d'inhibition en présence de 1 mM de thréonine (%).

Tableau 5

Composition du milieu d'acide acétique -

acide pyruvique sur plaque de gélose Acide acétique 5 g/l Pyruvate de sodium 5 Sulfate d'ammonium 5 "

KH2PO 1

2 4 MgSO4,7H20 0,4

04 "-

FeSO4,7H20 10 mg/l MnS04,4H20 8,1 Chlorhydrate de thiamine 0,1 Biotine 0, 5 HEPES 23,8 g/l Substances promotrices de croissance * Gélose 20 g/l pH 7,0 (NaOH) *

Extrait de levure 0,4 g/l, L-cystine et L-alanine 20 mg/l respec-

tivement, L-tryptophane, L-phénylalanine, L-tyrosine, chlorhy-

drate de L-lysine, L-méthionine et chlorhydrate de L-arginine

300 mg/L respectivement.

Tableau 6

Activité dihydrodipicolinate synthétase et homosérine déshydrogénase et rapport de productivité Lysine/thréonine Inhibition rétroactive Quantité de lysine produite/ Activité* dihydrodi- de l'homosérine déshy- quantité de thréonine picolinate.synthétase -drogénase (%) produite AC 664 (souche mère) 75>4 98 AJ 12361 (mutant) 0 98 0,6

DA110 ( ") 0 98 0,4

AJ 12362 ( ") 4,2 96 0,7

AJ 12363 ( ") 59,4 16 1,4

voir tableau 4 rN O0 C.'

Tableau 7

Composition de la solution de réaction pour mesurer la dihydroaipicolinate synthétase Tampon imidazole-acide chlorhydrique (pH 7, 4) 50 mM DL-aspartate--semialdéhyde (forme L-) 2,5 mM Pyruvate de sodium 2,5 mM Solution brute d'enzyme 0,1 ml Volume total 0,5 ml Réaction à 30 0C pendant 10 min, puis addition de 1 ml d'acide

chlorhydrique 0,05 N pour terminer la réaction.

Tableau 8

Composition de la solution de réaction pour mesurer l'acide pyruvique Tampon tris-acide chlorhydrique (pH 7,5) 100 mM NADH 0,15 mM Lactate déshydrogénase 20 pg Solution de réaction du tableau 7 après terminaison de ta réaction 0,2 ml Volume total 2 ml Tableau 9 Composition de la solution de réaction pour mesurer l'homosérine déshydrogénase Tampon phosphate de potassium (pH 7,0) 100 mM DL-aspartate-p-semialdéhyde [(forme L-)] 0,2 mM NADPH2 0,1 mM Solution brute d'enzyme 30 pi Volume total 1,5 ml

Tableau 10

Composition du milieu liquide minimum de glucose Glucose 20 g/l Sulfate d'ammonium 10 "

KH2PO4 1

2 4 MgSO4,7H20 0,4 FeSO4,7H20 10 mg/I 4' 2 10mg/l MnS04,4H20 8,1 " Chlorhydrate de thiamine 0,1 " Biotine 0,3 " Urée 3 g/L pH 7,3 (NaOH)

Tableau 11

Degré de résistance à l'AHV de la souche à activité DPS supprimée Degré relatif de croissance (%) Concentration du AHV ajouté

AJ 11955 AJ 12360 AC 664 AJ 12361

(mg/ml) (souche mère) (mutant) (souche mère) (rutant)

0 100 100 100 100

25 46,7 8,6 105

500 9,5 42,6 6,7 65,8

1 000 5,9 37,5 6,1 39,1

Le degré de croissance dans la section exempte de AHV est Dris

comme 100 %.

Claims (2)

REVENDICATIONS

1. Procédé de production de la L-thréonine, caractérisé en ce qu'il comporte la culture dans un milieu liquide d'un mutant qui appartient au genre Brevibacterium et dans lequel L'activité dihydrodipicolinate synthètase a été sucorirée ou rldaie, La production et l'accumulation de la L-thréonine dans le miLieu et la

récupération de la L-thréenine.

2. Procédé pour la production de la L-thréonine, caractérisé en ce qu'il comporte la culture dans un milieu liquide d'un mutant qui appartient au genre Brevibacterium et qui a une résistance à l'acide v-amino-phydroxyvaiérique, et dans lequel l'activité dihydrodipicolinate synthétise a été supprimée ou réduite, la production et l'accumulation de la L-thréonine dans le milieu et la

récupération de la L-thréonine.