JPH069504B2 - フェニルアラニン―デヒドロゲナーゼを含有するロドコッカス・スペック及びその取得法 - Google Patents
フェニルアラニン―デヒドロゲナーゼを含有するロドコッカス・スペック及びその取得法Info
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- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はフエニルアラニン−デヒドロゲナーゼを含有す
る微生物、その収得法及びこれを使用するＬ−α−アミ
ノ酸の製法に関するものである。
る微生物、その収得法及びこれを使用するＬ−α−アミ
ノ酸の製法に関するものである。
従来の技術 Ｌ−フエニルアラニンの立体特異性製造には触媒として
酵素を使用することが有利であることが実証された。
酵素を使用することが有利であることが実証された。
西ドイツ国特許出願公開公報（ＤＥ−ＯＳ）第３３０７
０９５号明細書から、フエニルピルベートをフエニルア
ラニン−デヒドロゲナーゼを用いて還元的にアミノ化す
ること、かつ相応する酵素をブレビバクテリウム・スペ
ツク（Brevibacterium spec.）（DSM２４４８）から得
ることは公知である。しかしながらそうして分離された
酵素は比較的不安定であると実証されている。
０９５号明細書から、フエニルピルベートをフエニルア
ラニン−デヒドロゲナーゼを用いて還元的にアミノ化す
ること、かつ相応する酵素をブレビバクテリウム・スペ
ツク（Brevibacterium spec.）（DSM２４４８）から得
ることは公知である。しかしながらそうして分離された
酵素は比較的不安定であると実証されている。
フエニルアラニン−デヒドロゲナーゼを含有するその他
の微生物を、そこに記載された方法を用いて得るための
試みは成功しなかつた。
の微生物を、そこに記載された方法を用いて得るための
試みは成功しなかつた。
このことは、西ドイツ国特許出願公開公報（ＤＥ−Ｏ
Ｓ）第３３０７０９５号明細書から公知の培地が極めて
種々の微生物の非特異性の成長を可能し、これは当然所
望の種株の選択を極めて困難にすることに基づいてい
る。
Ｓ）第３３０７０９５号明細書から公知の培地が極めて
種々の微生物の非特異性の成長を可能し、これは当然所
望の種株の選択を極めて困難にすることに基づいてい
る。
発明が解決しようとする問題点 本発明は、フエニルアラニン−デヒドロゲナーゼを含有
する微生物の分離のための、適当な菌株の速やかな選択
を可能にする方法及び安定したフエニルアラニン−デヒ
ドロゲナーゼに関する。
する微生物の分離のための、適当な菌株の速やかな選択
を可能にする方法及び安定したフエニルアラニン−デヒ
ドロゲナーゼに関する。
問題点を解決する手段 本発明は、炭素、窒素及び鉱酸塩の給源及びチアミンを
含有する水性培地中で微生物−含有の試料を好気性培養
することによりフエニルアラニン−デヒドロゲナーゼを
含有する微生物を収得するための方法を目的とするもの
であり、この方法は試料を先ずアルカリ金属プロピオン
酸塩０．１〜０．５ｇ／含有の培地中で培養し、引続
き形成する典型コロニーを、誘導物質を含有する培地上
に接種し、培養し、かつ両培地中に成長する微生物を選
択することを特徴とする。
含有する水性培地中で微生物−含有の試料を好気性培養
することによりフエニルアラニン−デヒドロゲナーゼを
含有する微生物を収得するための方法を目的とするもの
であり、この方法は試料を先ずアルカリ金属プロピオン
酸塩０．１〜０．５ｇ／含有の培地中で培養し、引続
き形成する典型コロニーを、誘導物質を含有する培地上
に接種し、培養し、かつ両培地中に成長する微生物を選
択することを特徴とする。
微生物含有の試料として、例えば土壌試料を選び、これ
を無菌食塩溶液（NaCl０．９％）で懸濁し、常法で希釈
し、一部を固体培地を有するペトリシヤーレ上にスパー
テルで取る。培地は例えば本発明によりアルカリ金属プ
ロピオン酸塩、有利にプロピオン酸ナトリウムが添加さ
れる標準−組成を有する：プロピオン 酸、Na−塩０．１〜０．５ｇ、有利に０．２ｇ KNO3 ０．０１ｇ KH2PO4 ０．１ｇ NaCl ０．２５ｇ MgSO4・７H2O １００mg CaCO3 ２０mg 微量元素−溶液 １ml 蒸留水 １ 寒 天 ２０ｇ pH−値 ６．５〜７．５、有利に７．０ 培地はオートクレーブに入れることにより滅菌し、冷却
後、培地１当り滅菌濾過ビタミン−溶液１ml並びに１
当りシクロヘキシミド（アクチジオン（Actidion
e））５０mgを添加し（ビタミン溶液の組成：シユレー
ゲル、（Schlegel）、H.G.“アルゲマイネ・ミクロビオ
ロギイ（Allgemeine Mikrobiologie）”、テイーメ出版
（Thieme Verlag）、第１６９頁〔１９８１年〕によ
る）、かつ培地を無菌ペトリシヤーレ中に注ぐ。
を無菌食塩溶液（NaCl０．９％）で懸濁し、常法で希釈
し、一部を固体培地を有するペトリシヤーレ上にスパー
テルで取る。培地は例えば本発明によりアルカリ金属プ
ロピオン酸塩、有利にプロピオン酸ナトリウムが添加さ
れる標準−組成を有する：プロピオン 酸、Na−塩０．１〜０．５ｇ、有利に０．２ｇ KNO3 ０．０１ｇ KH2PO4 ０．１ｇ NaCl ０．２５ｇ MgSO4・７H2O １００mg CaCO3 ２０mg 微量元素−溶液 １ml 蒸留水 １ 寒 天 ２０ｇ pH−値 ６．５〜７．５、有利に７．０ 培地はオートクレーブに入れることにより滅菌し、冷却
後、培地１当り滅菌濾過ビタミン−溶液１ml並びに１
当りシクロヘキシミド（アクチジオン（Actidion
e））５０mgを添加し（ビタミン溶液の組成：シユレー
ゲル、（Schlegel）、H.G.“アルゲマイネ・ミクロビオ
ロギイ（Allgemeine Mikrobiologie）”、テイーメ出版
（Thieme Verlag）、第１６９頁〔１９８１年〕によ
る）、かつ培地を無菌ペトリシヤーレ中に注ぐ。
接種したプレートを２３〜３２℃、有利に２７℃で４〜
６日間培養する。微生物の成長後、典型コロニーを寒天
プレートから適当なコロニー数（５０〜２００）で無菌
的にビロード製スタンプ上に接種取りする：次いで異な
る寒天培地を有する２枚のプレート上に接種がえする；
１枚のプレートは前記のプロピオン酸塩−培地を有し、
他方は誘導物質としてＬ−フエニルアラニンを有する培
地を、例えば次の組成で有する（フエニルアラニン−培
地）： Ｌ-フェニルアラニン１〜１５ｇ、有利に１０ｇ／ KH2PO4 ２ｇ 酵母抽出物 ０．２ｇ 寒 天 ２０ｇ 蒸留水 １ pH−値は６〜８、有利に７．２である。
６日間培養する。微生物の成長後、典型コロニーを寒天
プレートから適当なコロニー数（５０〜２００）で無菌
的にビロード製スタンプ上に接種取りする：次いで異な
る寒天培地を有する２枚のプレート上に接種がえする；
１枚のプレートは前記のプロピオン酸塩−培地を有し、
他方は誘導物質としてＬ−フエニルアラニンを有する培
地を、例えば次の組成で有する（フエニルアラニン−培
地）： Ｌ-フェニルアラニン１〜１５ｇ、有利に１０ｇ／ KH2PO4 ２ｇ 酵母抽出物 ０．２ｇ 寒 天 ２０ｇ 蒸留水 １ pH−値は６〜８、有利に７．２である。
再びプレートを３〜５日間２３〜３２℃で、有利に２７
℃を培養する。典型コロニーの比較により、プロピオン
酸塩上にも、並びにフエニルアラニン−培地上にも成長
し得る微生物を選び出すことができる；これを接種取り
し、次にフエニルアラニン−培地上で保つ。
℃を培養する。典型コロニーの比較により、プロピオン
酸塩上にも、並びにフエニルアラニン−培地上にも成長
し得る微生物を選び出すことができる；これを接種取り
し、次にフエニルアラニン−培地上で保つ。
次いで分離した微生物を常法で純度について再調査し
（希釈塗抹、顕微鏡観察）、単一で発生する菌株を次い
で２３〜３２℃、有利に27℃で増殖させる。液体培地は
次の組成を有する （ＭＰ−培地）： Ｌ-フエニルアラニン１〜１５ｇ、有利に１０ｇ とうもろこし膨潤水（乾燥粉末） ２ｇ KH2PO4 ２ｇ 蒸留水 １ pH−値 ６〜８、有利に７．２ ２〜３日間後に細胞を沈降させ、破壊された微生物から
酵素を公知方法で得る。
（希釈塗抹、顕微鏡観察）、単一で発生する菌株を次い
で２３〜３２℃、有利に27℃で増殖させる。液体培地は
次の組成を有する （ＭＰ−培地）： Ｌ-フエニルアラニン１〜１５ｇ、有利に１０ｇ とうもろこし膨潤水（乾燥粉末） ２ｇ KH2PO4 ２ｇ 蒸留水 １ pH−値 ６〜８、有利に７．２ ２〜３日間後に細胞を沈降させ、破壊された微生物から
酵素を公知方法で得る。
この分離方法を用いて簡単なやり方で、所望のフエニル
アラニン−デヒドロゲナーゼ−活性を有する微生物を、
一つの土壌試料の微生物−固体群から富化すること及び
分離することが可能である。すなわちブラウンシユバイ
ク州の周域からの２０種の土壌試料から、Phe-DH-活性
を有する７種の分離物が得られる（表１）。分離した微
生物を２種の群に分類することができる：ブレビバクテ
リウム属に属する５種の分離物（もう１つの土壌試料か
らのもの）、並びにロドコツカス属に属し、例えば次の
特性を示す２種の分離物： 成長するに従い球形に移行するグラム陽性短桿菌に成
長；細胞は不動性であり、胞子を生成しない；偏性好気
性成長；ブドウ糖から酸生成；カタラーゼ及びニトレー
ト還元陽性、尿素−分離陽性；ゼラチン−、カゼイン−
及び澱粉−分解陰性；H2S−生成陰性；４１℃での成長
陰性。細胞壁はメゾ−ジアミノ−ピメリン酸を有し、細
胞壁糖としてアラビノース及びガラクトースが確認され
た。メナチノン（Menachinone）はTyp MK−８(Ｈ２)よ
りなる。両分離物は炭素原子３０〜５０を有するツベル
クロステアリン酸及びミコール酸を有する。ミコール酸
メチルエステルから熱分解的分離により遊離する脂肪酸
は１２〜１８個の炭素原子を有する。両分離物のコロニ
ー色はサフラン黄である（RAL−色コードによるTyp４
１）（セイラー（Seiler）、Ｈ．、ジャーナル・オブ・
ゼネラル・ミクロビオロギイ（J.Gen.Microbiol.）第１
２９巻、第１４３３〜１４７１頁〔１９８３年〕）。微
生物は生長のためにチアミンを必要とする。
アラニン−デヒドロゲナーゼ−活性を有する微生物を、
一つの土壌試料の微生物−固体群から富化すること及び
分離することが可能である。すなわちブラウンシユバイ
ク州の周域からの２０種の土壌試料から、Phe-DH-活性
を有する７種の分離物が得られる（表１）。分離した微
生物を２種の群に分類することができる：ブレビバクテ
リウム属に属する５種の分離物（もう１つの土壌試料か
らのもの）、並びにロドコツカス属に属し、例えば次の
特性を示す２種の分離物： 成長するに従い球形に移行するグラム陽性短桿菌に成
長；細胞は不動性であり、胞子を生成しない；偏性好気
性成長；ブドウ糖から酸生成；カタラーゼ及びニトレー
ト還元陽性、尿素−分離陽性；ゼラチン−、カゼイン−
及び澱粉−分解陰性；H2S−生成陰性；４１℃での成長
陰性。細胞壁はメゾ−ジアミノ−ピメリン酸を有し、細
胞壁糖としてアラビノース及びガラクトースが確認され
た。メナチノン（Menachinone）はTyp MK−８(Ｈ２)よ
りなる。両分離物は炭素原子３０〜５０を有するツベル
クロステアリン酸及びミコール酸を有する。ミコール酸
メチルエステルから熱分解的分離により遊離する脂肪酸
は１２〜１８個の炭素原子を有する。両分離物のコロニ
ー色はサフラン黄である（RAL−色コードによるTyp４
１）（セイラー（Seiler）、Ｈ．、ジャーナル・オブ・
ゼネラル・ミクロビオロギイ（J.Gen.Microbiol.）第１
２９巻、第１４３３〜１４７１頁〔１９８３年〕）。微
生物は生長のためにチアミンを必要とする。
分離物は本発明のもう１つの目的であり、１９８４年９
月７日にDSMにおいて、ロドコツカス・スペツクＭ４と
してNo.３０４１で、かつロドコツカス・スペツク１３
としてNO.３０４０で菌寄託された。
月７日にDSMにおいて、ロドコツカス・スペツクＭ４と
してNo.３０４１で、かつロドコツカス・スペツク１３
としてNO.３０４０で菌寄託された。
微生物は凍結乾燥培養として、−８０℃での、又は液体
窒素中−１９６℃での凍結により貯蔵することができ
る；作業培地は傾斜寒天−試験管（フエニルアラニン−
培地）上で保たれる。
窒素中−１９６℃での凍結により貯蔵することができ
る；作業培地は傾斜寒天−試験管（フエニルアラニン−
培地）上で保たれる。
両株はアミノ酸Ｄ−フエニルアラニンを利用しない。
粗抽出物−酵素製剤での予備試験は、ブレビバクテリウ
ム属の個々の分離物からのフエニルアラニン−デヒドロ
ゲナーゼが、西ドイツ国特許公開公報第３３０７０９
５．４号明細書に記載された酵素と、比酵素活性度、容
積収率、誘導性及び安定性に関して比較可能であること
を示した。
ム属の個々の分離物からのフエニルアラニン−デヒドロ
ゲナーゼが、西ドイツ国特許公開公報第３３０７０９
５．４号明細書に記載された酵素と、比酵素活性度、容
積収率、誘導性及び安定性に関して比較可能であること
を示した。
ロドコツカス属の両分離物からの酵素はそれに比較して
明らかに優れていることが判る a) 粗抽出物における酵素はより高い比活性度を示す
（２〜５Ｕ／蛋白質mgの代りに２０〜３０Ｕ／mg）； b) Ｌ−フエニルアラニン１％での成長ではより高い容
積収率が達成される（３〜６．０００Ｕ／の代りに２
０〜２５．０００Ｕ／）： c) 酵素は明らかにより良好な安定性である。
明らかに優れていることが判る a) 粗抽出物における酵素はより高い比活性度を示す
（２〜５Ｕ／蛋白質mgの代りに２０〜３０Ｕ／mg）； b) Ｌ−フエニルアラニン１％での成長ではより高い容
積収率が達成される（３〜６．０００Ｕ／の代りに２
０〜２５．０００Ｕ／）： c) 酵素は明らかにより良好な安定性である。
フエニルアラニン−デヒドロゲナーゼは酵素学的に次の
様に記載され得る： a) これは、系統的な名称はＬ−フエニルアラニンであ
る芳香族α−ケト酸の還元的アミノ化を触媒する：NAD+
−オキシドリダクターゼ（脱アミノ化）、及びこれはE.
C.一群1.4.1に属する； b) フエニルピルベートの還元的アミノ化の最適pH−値
は９．３±１である； c) Ｌ−フエニルアラニンの酸化的脱アミノ化の最適pH
−値は１０．０±１である； d) NADHに対するKM−値は０．０８mMに達する。
様に記載され得る： a) これは、系統的な名称はＬ−フエニルアラニンであ
る芳香族α−ケト酸の還元的アミノ化を触媒する：NAD+
−オキシドリダクターゼ（脱アミノ化）、及びこれはE.
C.一群1.4.1に属する； b) フエニルピルベートの還元的アミノ化の最適pH−値
は９．３±１である； c) Ｌ−フエニルアラニンの酸化的脱アミノ化の最適pH
−値は１０．０±１である； d) NADHに対するKM−値は０．０８mMに達する。
Ｌ−フエニルアラニン及びＬ−フエニルアラニンアミド
は誘導物質として有利に使用されるが、Ｌ−ヒスチジン
も限られた範囲で適合する。
は誘導物質として有利に使用されるが、Ｌ−ヒスチジン
も限られた範囲で適合する。
フエニルアラニン−デヒドロゲナゼーは補酵素としてア
ンモニウムイオン及びNADHの存在でフエニルピルベー
ト、ｐ−ヒドロキシフエニルピルベート、インドールピ
ルベート又は２−ケト−４−メチルメルカプトブチレー
トを相応するＬ−α−アミノカルボン酸に変換するため
に使用される。
ンモニウムイオン及びNADHの存在でフエニルピルベー
ト、ｐ−ヒドロキシフエニルピルベート、インドールピ
ルベート又は２−ケト−４−メチルメルカプトブチレー
トを相応するＬ−α−アミノカルボン酸に変換するため
に使用される。
方法は有利に２０〜３０℃及びpH−値８．５〜１０で実
施される。
施される。
例えば西ドイツ国特許出願公開公報（DE-OS）第３３０
７０９５号明細書から公知である補酵素−再生下に有利
に作業する。
７０９５号明細書から公知である補酵素−再生下に有利
に作業する。
同様の方法で非破壊細菌細胞を使用することもできる。
この酵素は、酵素的方法で水溶液中で前記のα−ケトカ
ルボン酸もしくはα−アミノ酸の濃度を測定するのにも
適している。
ルボン酸もしくはα−アミノ酸の濃度を測定するのにも
適している。
分離物の同定後、寄託機関DSMからのロドコツカス属の
公知菌株をフエニルアラニン−デヒドロゲナーゼ活性に
ついて試験した。現在、この属の１１種が公知である
〔グッドフエロー（Goodfellow）、Ｍ．及びミニキン
（Minnikin）、D.E.：ザ・プロカリョーテス（The Prok
aryo-tes）中（スター（Starr）M.P.等編集者）、第２
０１６〜２０２７頁、スプリンガー（Spr-inger）出
版、ベルリン、ハイデルベルグ、ニューヨーク（１９８
１年）；グッドフエロー（Goodfellow）M.、システム．
アプル．ミクロビオル．（System.Appl.Microbiol.）第
５巻、第２２５〜２２９頁（１９８４年）〕：そのつど
典型菌株をＭＰ−培地（Ｌ−フエニルアラニン１％、ト
ウモロコシ膨潤水0.2％、KH2PO4０．２％）中に接種し
た。２７℃で４０時間の成長後に細胞を破壊し、粗抽出
物中でフエニルアラニン−デヒドロゲナーゼの活性を測
定した。
公知菌株をフエニルアラニン−デヒドロゲナーゼ活性に
ついて試験した。現在、この属の１１種が公知である
〔グッドフエロー（Goodfellow）、Ｍ．及びミニキン
（Minnikin）、D.E.：ザ・プロカリョーテス（The Prok
aryo-tes）中（スター（Starr）M.P.等編集者）、第２
０１６〜２０２７頁、スプリンガー（Spr-inger）出
版、ベルリン、ハイデルベルグ、ニューヨーク（１９８
１年）；グッドフエロー（Goodfellow）M.、システム．
アプル．ミクロビオル．（System.Appl.Microbiol.）第
５巻、第２２５〜２２９頁（１９８４年）〕：そのつど
典型菌株をＭＰ−培地（Ｌ−フエニルアラニン１％、ト
ウモロコシ膨潤水0.2％、KH2PO4０．２％）中に接種し
た。２７℃で４０時間の成長後に細胞を破壊し、粗抽出
物中でフエニルアラニン−デヒドロゲナーゼの活性を測
定した。
ロドコツカス・エリスロポリス（Rhodococcuserythropo
lis）（DSM４３０６６及び７４３）の株だけはＬ−フエ
ニルアラニンを利用し（４３０６６についてはOD578２
８．０及び743についてはOD１５．３）、かつフエニル
アラニン−デヒドロゲナーゼ活性を有する（４３０６６
については１２６０Ｕ／及び７４３については１０３
１Ｕ／）が、この活性は明らかに新種のロドコツカス
株のそれ以下である。
lis）（DSM４３０６６及び７４３）の株だけはＬ−フエ
ニルアラニンを利用し（４３０６６についてはOD578２
８．０及び743についてはOD１５．３）、かつフエニル
アラニン−デヒドロゲナーゼ活性を有する（４３０６６
については１２６０Ｕ／及び７４３については１０３
１Ｕ／）が、この活性は明らかに新種のロドコツカス
株のそれ以下である。
微生物を公知方法で生物反応器中で所望の基準で接種
し、それから酵素を分離することにより、ロドコツカス
株Ｍ４及びＩ３からより多量のフエニルアラニン−デヒ
ドロゲナーゼを得ることができる。
し、それから酵素を分離することにより、ロドコツカス
株Ｍ４及びＩ３からより多量のフエニルアラニン−デヒ
ドロゲナーゼを得ることができる。
効果のある培養には次の有利な条件があてはまる： a) 良好な通気（偏性好気性微生物）； b) 出発pH−値６．０８．０；有利に７．０〜７．６ c) 鉱酸塩の存在（例えばトウモロコシ膨潤水として錯
体の形で）； d) 少量のチアミンの存在（１〜２μg／）； e) PheDHの誘導のために培地中Ｌ−フエニルアラニン
−含量０．５〜１．５％； f) 温度２３〜３２℃ 試料中次のことを測定する： a) 成長のための尺度とし５７８nmにおける培地の光学
密度（混濁）； b) アミノ酸分析器を用いる培地中のフエニルアラニン
含量（細胞の遠心分離後）； (c) 測光試験の適用下に酵素含量。
体の形で）； d) 少量のチアミンの存在（１〜２μg／）； e) PheDHの誘導のために培地中Ｌ−フエニルアラニン
−含量０．５〜１．５％； f) 温度２３〜３２℃ 試料中次のことを測定する： a) 成長のための尺度とし５７８nmにおける培地の光学
密度（混濁）； b) アミノ酸分析器を用いる培地中のフエニルアラニン
含量（細胞の遠心分離後）； (c) 測光試験の適用下に酵素含量。
試験調整物は次のものを含有する：塩化アンモニウム／
アンモニア緩衝液（pH８．５）０．７Ｍ、NADH０．１m
M、フエニルピルベート１０mM及び限界量の酵素（１試
験当りの蛋白質１〜２０μg）。３４０nmでNADHの吸光
の減少を測定する。得られる値から、フエニルピルベー
トの添加なしに試験が経過する場合に得られる零値を差
引く。酵素活性は国際単位で示され、その際１単位はNA
DH１μMol／分の減少を意味する。
アンモニア緩衝液（pH８．５）０．７Ｍ、NADH０．１m
M、フエニルピルベート１０mM及び限界量の酵素（１試
験当りの蛋白質１〜２０μg）。３４０nmでNADHの吸光
の減少を測定する。得られる値から、フエニルピルベー
トの添加なしに試験が経過する場合に得られる零値を差
引く。酵素活性は国際単位で示され、その際１単位はNA
DH１μMol／分の減少を意味する。
工業的な使用のために、培養により得られる細胞を直接
使用するか、又は細胞中に得られる酵素を分離し、次い
で細胞なしの系で使用する。酵素分離は細胞破壊後に酵
素精製の自体公知の方法の組合せにより可能である。
使用するか、又は細胞中に得られる酵素を分離し、次い
で細胞なしの系で使用する。酵素分離は細胞破壊後に酵
素精製の自体公知の方法の組合せにより可能である。
先ず細菌−膨潤物から有利に機械的細胞破壊により、例
えばガラスパールミル、高圧ホモジエナイザー又は超音
波処理により内容物を遊離させる。
えばガラスパールミル、高圧ホモジエナイザー又は超音
波処理により内容物を遊離させる。
第二工程において細胞破壊物を西ドイツ国特許公開公報
第２６３９１２９号明細書に依り粗抽出物から水性二相
系を介して分離する。
第２６３９１２９号明細書に依り粗抽出物から水性二相
系を介して分離する。
上相は実際にＬ−フエニルアラニン−デヒドロゲナーゼ
の総活性を有し、更に透析方法を施こす。
の総活性を有し、更に透析方法を施こす。
透析した酵素を引続きDEAE−セルロース−クロマトグラ
フイーを用いて更に精製し、次いで例えばセフアロース
（Sepharose）４Ｂでの界面塩析クロマトグラフイーを
かけることにより所望の程度の後精製を達する。
フイーを用いて更に精製し、次いで例えばセフアロース
（Sepharose）４Ｂでの界面塩析クロマトグラフイーを
かけることにより所望の程度の後精製を達する。
実施例 例１： フエニルアラニン−デヒドロゲナーゼの製造 培養のために、培地１．５が充たされている２バイ
オリアクターを使用する。培地は１当り、Ｌ−フエニ
ルアラニン１０ｇ；KH2PO4２ｇ；トウモロコシ膨潤水
（乾燥粉末）２ｇ；を含有し、pH−値は７．０である。
オリアクターを使用する。培地は１当り、Ｌ−フエニ
ルアラニン１０ｇ；KH2PO4２ｇ；トウモロコシ膨潤水
（乾燥粉末）２ｇ；を含有し、pH−値は７．０である。
殺菌後、同じ培値中に４８時間培養した前培養物５０ml
を、培地に接種する。醗酵物中の成長条件は次の通りで
ある； 温度：２７℃ 通気率：空気６０／時 ４００UPMでタービン形撹拌器 種々の成長時間で試料（４０ml）を取り出し、酵素活性
についての試験によりこの細胞中の最高に達成可能な酵
素含量もしくは最も有利な採取時期を測定した。
を、培地に接種する。醗酵物中の成長条件は次の通りで
ある； 温度：２７℃ 通気率：空気６０／時 ４００UPMでタービン形撹拌器 種々の成長時間で試料（４０ml）を取り出し、酵素活性
についての試験によりこの細胞中の最高に達成可能な酵
素含量もしくは最も有利な採取時期を測定した。
第２図は酵素が早い成長期に形成されることを示す；微
生物がフエニルアラニンを破壊しはじめる際に酵素含量
は特に上昇する。この際培地１当り明らかに２０００
０単位以上の酵素含量が達成され得る。更に成長が進行
すると再び酵素含量は降下する。
生物がフエニルアラニンを破壊しはじめる際に酵素含量
は特に上昇する。この際培地１当り明らかに２０００
０単位以上の酵素含量が達成され得る。更に成長が進行
すると再び酵素含量は降下する。
醗酵物１．５から細菌の遠心分離により総−酵素活性
２２０００単位を有する細胞（湿潤物）７０ｇが得られ
る。
２２０００単位を有する細胞（湿潤物）７０ｇが得られ
る。
例２ 培地中のアミノ酸に依るPheDHの生成 株Ｍ４を培地中でトウモロコシ膨潤水（乾燥粉末）０．
２％、KH2PO4０．２％及びそのつどアミノ酸１％と共に
培養する；そのpH−値は培養開始前は７．４である。そ
のつど培値１００mlが接種された；４０時間の成長後細
胞を遠心分離し、粒状ガラスで細胞を破壊した後にPheD
Hの活性を測定した。表２は、良好な酵素収率のために
はＬ−フエニルアラニンの添加が必要であり、その他の
天然アミノ酸は僅かしか（ヒスチジン）又は全く（イソ
ロイシン）酵素を含有しないことを示す。Ｌ−フエニル
アラニンは誘導物質として誘導体Ｌ−フエニルアラニン
アミドに代えられ得る。若干の天然アミノ酸上では株Ｍ
４は成長することができない（例えば、Ｌ−トリプトフ
アン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アラニン又はＬ−グルタミン
酸）。同様にこの株はブレビバクテリウム・スペツク
（DSM２４４８）とは反対にアミノ酸Ｄ−フエニルアラ
ニンを利用しない。
２％、KH2PO4０．２％及びそのつどアミノ酸１％と共に
培養する；そのpH−値は培養開始前は７．４である。そ
のつど培値１００mlが接種された；４０時間の成長後細
胞を遠心分離し、粒状ガラスで細胞を破壊した後にPheD
Hの活性を測定した。表２は、良好な酵素収率のために
はＬ−フエニルアラニンの添加が必要であり、その他の
天然アミノ酸は僅かしか（ヒスチジン）又は全く（イソ
ロイシン）酵素を含有しないことを示す。Ｌ−フエニル
アラニンは誘導物質として誘導体Ｌ−フエニルアラニン
アミドに代えられ得る。若干の天然アミノ酸上では株Ｍ
４は成長することができない（例えば、Ｌ−トリプトフ
アン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アラニン又はＬ−グルタミン
酸）。同様にこの株はブレビバクテリウム・スペツク
（DSM２４４８）とは反対にアミノ酸Ｄ−フエニルアラ
ニンを利用しない。
例３ 培地中のフエニルアラニン−濃度に依るPheDHの生成 株Ｍ４を培地中でトウモロコシ膨潤水（乾燥粉末）の
０．２％、KH2PO4０．２％及び増加量のＬ−フエニルア
ラニン（１．５％まで）と共に培養する；培養と開始前
のpH−値は７．４である。
０．２％、KH2PO4０．２％及び増加量のＬ−フエニルア
ラニン（１．５％まで）と共に培養する；培養と開始前
のpH−値は７．４である。
そのつど培値１００mlが接種された；４０時間の成長後
に細胞を遠心分離し、細胞を粒状ガラスで破壊した後
に、PheDHの活性を測定した。表３は、培地中のフエニ
ルアラニン−含量の上昇により酵素収率も高めることが
でき、すなわちフエニルアラニン１．５％で培地１当
り約２６．０００Ｕが得られる。更に比酵素活性（Ｕ／
mg）の経過は、０．５％以上のフエニルアラニンの含量
が有利であることを示す。
に細胞を遠心分離し、細胞を粒状ガラスで破壊した後
に、PheDHの活性を測定した。表３は、培地中のフエニ
ルアラニン−含量の上昇により酵素収率も高めることが
でき、すなわちフエニルアラニン１．５％で培地１当
り約２６．０００Ｕが得られる。更に比酵素活性（Ｕ／
mg）の経過は、０．５％以上のフエニルアラニンの含量
が有利であることを示す。
例４ pH−値に依る反応速度の依存性 a) 還元的アミノ化 Ｌ−フエニルアラニンへのフエニルピルベートの還元的
アミノ化の反応速度を反応溶液のpH−値に依り調査し
た。試験調製物は次の組成を有した： NADH０．２５mM、フエニルピルベート１．５mM及び種々
のpH−値における塩化アンモニウム溶液０．７Ｍ中の酵
素の限界量。種々のpH−値は、試験調製物の混合前に塩
化アンモニウム溶液０．７Ｍにアンモニアもしくは塩酸
を加えることにより調整した。
アミノ化の反応速度を反応溶液のpH−値に依り調査し
た。試験調製物は次の組成を有した： NADH０．２５mM、フエニルピルベート１．５mM及び種々
のpH−値における塩化アンモニウム溶液０．７Ｍ中の酵
素の限界量。種々のpH−値は、試験調製物の混合前に塩
化アンモニウム溶液０．７Ｍにアンモニアもしくは塩酸
を加えることにより調整した。
第２図においては、反応速度は６．０〜１０．２の範囲
におけるpH−値の関数として書かれている。最適pH−値
は９．２５である。pH−値は反応混合物中で測定され
た。
におけるpH−値の関数として書かれている。最適pH−値
は９．２５である。pH−値は反応混合物中で測定され
た。
b) 酸化的脱アミノ化 Ｌ−フエニルアラニンの酸化的脱アミノ化の反応速度は
Ｌ−フエニルアラニン−デヒドロゲナーゼに依り触媒さ
れ、同様にpH−値に依り調査される。試験調製物は次の
組成を有した： 種々のpH−値におけるグリシン／NaCl／NaOH−緩衝液
０．１Ｍ中のNAD+３mM及びＬ−フエニルアラニン６mM。
種々のpH−値は試験調製物の混合前に緩衝液に塩酸又は
苛性ソーダ溶液を添加することにより調整した。結果は
pH６．５〜１０．１の範囲について同様に第１図に総括
して描かれている。逆反応はpH１０．１まで上昇する。
pH−値は反応混合物中で測定した。
Ｌ−フエニルアラニン−デヒドロゲナーゼに依り触媒さ
れ、同様にpH−値に依り調査される。試験調製物は次の
組成を有した： 種々のpH−値におけるグリシン／NaCl／NaOH−緩衝液
０．１Ｍ中のNAD+３mM及びＬ−フエニルアラニン６mM。
種々のpH−値は試験調製物の混合前に緩衝液に塩酸又は
苛性ソーダ溶液を添加することにより調整した。結果は
pH６．５〜１０．１の範囲について同様に第１図に総括
して描かれている。逆反応はpH１０．１まで上昇する。
pH−値は反応混合物中で測定した。
例５： 基質濃度に依る反応速度の依存性 還元的アミノ化 基質NADHに対するＬ−フエニルアラニンへのフエニルピ
ルベートの還元的アミノ化の反応速度の依存性は次の試
験調製物で調査した： 塩化アンモニウム／アンモニア−緩衝液（pH９．５）
０．７Ｍ、フエニルピルベート１．５mM、酵素の限界
量。試験調製物中のNADH−濃度は０．０２５〜０．３mM
の範囲で変化した。
ルベートの還元的アミノ化の反応速度の依存性は次の試
験調製物で調査した： 塩化アンモニウム／アンモニア−緩衝液（pH９．５）
０．７Ｍ、フエニルピルベート１．５mM、酵素の限界
量。試験調製物中のNADH−濃度は０．０２５〜０．３mM
の範囲で変化した。
最適の反応速度は０．２５mMで達成されることが示され
た。NADHに対するKM−値は０．０８mMである。
た。NADHに対するKM−値は０．０８mMである。
b) 種々のα−ケトカルボン酸の還元的アミノ化はケト
酸−濃度に依り調査した。このために次の試験調製物を
使用した： 塩化アンモニウム／アンモニア−緩衝（pH９．５）０．
７Ｍ、NADH０．２５mM、限界量の酵素。ケト酸濃度はそ
のつど０．０１〜３０mMの範囲で変化した。
酸−濃度に依り調査した。このために次の試験調製物を
使用した： 塩化アンモニウム／アンモニア−緩衝（pH９．５）０．
７Ｍ、NADH０．２５mM、限界量の酵素。ケト酸濃度はそ
のつど０．０１〜３０mMの範囲で変化した。
初反応速度（吸光変化３４０nm／分）はミハエリス−メ
ンテン（Michaelis-Menten）法により評価する。実測の
KM−及びVmax−値は表４に総括してある。光学的試験の
障害のために、基質インドールピルベート及びｐ−ヒド
ロキシフエニルピルベートの場合には、Ｌ−トリプトフ
アンもしくはチロシンへの還元的アミノ化は時間の関数
としてアミノ酸分析器で測定した〔１−カラム−プログ
ラム（１−Saeulen-programm）中で積分器ビオトロニッ
ク（Biot-ronik）、システム１を備えたビオトロ（Bio-
tronik）ＢＣ６０００；測定溶液としてピアース（Pier
ce）社のアミノ酸−標準IVを使用した〕。
ンテン（Michaelis-Menten）法により評価する。実測の
KM−及びVmax−値は表４に総括してある。光学的試験の
障害のために、基質インドールピルベート及びｐ−ヒド
ロキシフエニルピルベートの場合には、Ｌ−トリプトフ
アンもしくはチロシンへの還元的アミノ化は時間の関数
としてアミノ酸分析器で測定した〔１−カラム−プログ
ラム（１−Saeulen-programm）中で積分器ビオトロニッ
ク（Biot-ronik）、システム１を備えたビオトロ（Bio-
tronik）ＢＣ６０００；測定溶液としてピアース（Pier
ce）社のアミノ酸−標準IVを使用した〕。
酸化的脱アミノ化 a) NAD+−濃度に依るＬ−フエニルアラニンの酸化的脱
アミノ化の反応速度の依存性を次の試験調製物で検査し
た： グリシン−NaCl／NaOH−緩衝液（pH１０．７）０．１
−、Ｌ−フエニルアラニン４mM、限界量の酵素。NAD+−
濃度は０．１〜５．０mMの範囲で変化した。濃度３mMで
最適変換が達成されることが示された。
アミノ化の反応速度の依存性を次の試験調製物で検査し
た： グリシン−NaCl／NaOH−緩衝液（pH１０．７）０．１
−、Ｌ−フエニルアラニン４mM、限界量の酵素。NAD+−
濃度は０．１〜５．０mMの範囲で変化した。濃度３mMで
最適変換が達成されることが示された。
b) Ｌ−アミノ酸−濃度に依る酸化的脱アミノ化の反応
速度の依存性は次の試験調製物中で検査された： グリシン−NaCl／NaOH−緩衝液（pH１０．７）０．１
Ｍ、NAD３mM、限界量の酵素。Ｌ−アミノ酸−濃度は
０．３〜１５mMの範囲で変化した。
速度の依存性は次の試験調製物中で検査された： グリシン−NaCl／NaOH−緩衝液（pH１０．７）０．１
Ｍ、NAD３mM、限界量の酵素。Ｌ−アミノ酸−濃度は
０．３〜１５mMの範囲で変化した。
Ｌ−フエニルアラニンに対するKM−値は０．８mMであ
る；その他のアミノ酸に対する相応の値は表５に総括し
てある。
る；その他のアミノ酸に対する相応の値は表５に総括し
てある。
例６： PheDHの安定性 株Ｍ４を次の組成の培地１００ml中で培養する：トウモ
ロコシ膨潤水（乾燥粉末）０．２％、KH2PO4０．２％、
Ｌ−Phe１％。pH−値は７．０である。円状振盪機上で
２７℃で４０時間の培養後、細胞を遠心分離により採取
し、粒状ガラスで破壊し、細胞粥状物の遠心分離により
細胞上澄液を得る（粗抽出物）。同じ方法で、ブレビバ
クテリウム・スペツク（DSM２４４８）の粗抽出物を得
る。両抽出物中のPheDH活性を測定し、次いで４℃及び
２２℃の整徐数を貯蔵し、一定の時間後に残留活性を測
定する。
ロコシ膨潤水（乾燥粉末）０．２％、KH2PO4０．２％、
Ｌ−Phe１％。pH−値は７．０である。円状振盪機上で
２７℃で４０時間の培養後、細胞を遠心分離により採取
し、粒状ガラスで破壊し、細胞粥状物の遠心分離により
細胞上澄液を得る（粗抽出物）。同じ方法で、ブレビバ
クテリウム・スペツク（DSM２４４８）の粗抽出物を得
る。両抽出物中のPheDH活性を測定し、次いで４℃及び
２２℃の整徐数を貯蔵し、一定の時間後に残留活性を測
定する。
表６は、粗抽出物中の株Ｍ４からのPheDHの貯蔵安定性
がブレビバクテリウム・スペツクからのPheDHのそれよ
りも明らかに良好であり、４℃で１週間後になお活性９
０％が検出可能であることを示している。
がブレビバクテリウム・スペツクからのPheDHのそれよ
りも明らかに良好であり、４℃で１週間後になお活性９
０％が検出可能であることを示している。
例７ 全細胞を用いるＬ−フエニルアラニンの製造 フエニルピルベートの立体特異性反応は微生物−全細胞
の使用の際に同様に達成される。適当な条件下でフエニ
ルピルベート、ブドウ糖及びアンモニウム塩を株Ｍ４の
細胞と共に培養する場合に、フエニルアラニンの生成が
検知され、反応に必要なNADHはその際ブドウ糖代謝の酵
素により連続的に再生される。
の使用の際に同様に達成される。適当な条件下でフエニ
ルピルベート、ブドウ糖及びアンモニウム塩を株Ｍ４の
細胞と共に培養する場合に、フエニルアラニンの生成が
検知され、反応に必要なNADHはその際ブドウ糖代謝の酵
素により連続的に再生される。
調製物は詳細には次のものを含有する： NH4Cl−溶液pH７．０（２００mM）２ml 細胞懸濁液（１ml当り湿潤物０．１ｇ）３ml ブドウ糖（２００mM）２ml KH2PO4pH７．０（０．１Ｍ）１ml フエニルピルベート（５０mM）２ml 括弧の中に試験における各成分の最終濃度が挙げられて
いる。酵素膨潤物として、例１に相応して得られた株Ｍ
４の細胞懸濁液を使用した。
いる。酵素膨潤物として、例１に相応して得られた株Ｍ
４の細胞懸濁液を使用した。
更に比較のために、ブレビバクテリウム・スペツクDSM
２４４８の細胞を含有する比較調製物を培養した。
２４４８の細胞を含有する比較調製物を培養した。
培養は振盪機（１００UPM）上で３０℃で１００ml入り
エルレンマイヤー−フラスコ中で実施した。
エルレンマイヤー−フラスコ中で実施した。
種々の時間で試料を取り出し、生成したフエニルアラニ
ンの含量をアミノ酸分析器で測定した。
ンの含量をアミノ酸分析器で測定した。
表７が示すように、両微生物の細胞はフエニルアラニン
を生成し得る：株Ｍ４は７時間後にPhe３６．１μMol／
ml（＝Phe５３mg／細菌−膨潤物ｇ）を生成した；これ
は使用した基質の６４％の変換に相応する。ブレビバク
テリウム・スペック（DSM２４４８）はPhe１８．５μMo
l／mlを生成した（＝Phe４６．１mg／細菌−湿潤物
ｇ）；これは使用したフエニルピルベートの３７％の変
換に相応する。
を生成し得る：株Ｍ４は７時間後にPhe３６．１μMol／
ml（＝Phe５３mg／細菌−膨潤物ｇ）を生成した；これ
は使用した基質の６４％の変換に相応する。ブレビバク
テリウム・スペック（DSM２４４８）はPhe１８．５μMo
l／mlを生成した（＝Phe４６．１mg／細菌−湿潤物
ｇ）；これは使用したフエニルピルベートの３７％の変
換に相応する。
例８： NADH−再生下で無細胞系におけるＬ−フエニルアラニン
の製造 Ｌ−フエニルアラニンへのフエニルピルベートの立体特
異性反応は無細胞系でフエニルアラニン−デヒドロゲナ
ーゼを用いて実施することができる。反応方程式に相応
して補酵素NADHを添加しなければならない。反応の際に
酸化される補酵素を再生するために、調製物に蟻酸塩−
デヒドロゲナーゼ（E.C.1.2.1.2）及び蟻酸塩を添加
し、その場合付加的な生成物としてCO2が得られる。
の製造 Ｌ−フエニルアラニンへのフエニルピルベートの立体特
異性反応は無細胞系でフエニルアラニン−デヒドロゲナ
ーゼを用いて実施することができる。反応方程式に相応
して補酵素NADHを添加しなければならない。反応の際に
酸化される補酵素を再生するために、調製物に蟻酸塩−
デヒドロゲナーゼ（E.C.1.2.1.2）及び蟻酸塩を添加
し、その場合付加的な生成物としてCO2が得られる。
調製物は詳細には次のものを含有する： 蟻酸アンモニウム４００mM（pH９．２） Tris-Hcl１５０mM（pH９．２） NADH０．３mM 蟻酸塩−デヒドロゲナーゼ（クローナー（Kroner）等
著、（１９８２年）、ジヤーナル・オブ・ケミカル・ア
ンドテクニカル・ビオテクノロジイ（Ｊ．Chem.Tech.Bi
otechnol.）第３２巻、第１３０〜１３７頁による製
剤）２Ｕ／mlフエニルアラニン−デヒドロゲナーゼ（１
１０Ｕ／mgを有する製剤；表２に依る、第１液体−液体
−分配によるトツプ相：Top-Phase)２Ｕ／ml フエニルピルベート２０mM 総容積は２mlであり、培養は撹拌下２８℃で行なわれ
た。生成物の生成はアミノ酸−分析器で追跡された。
著、（１９８２年）、ジヤーナル・オブ・ケミカル・ア
ンドテクニカル・ビオテクノロジイ（Ｊ．Chem.Tech.Bi
otechnol.）第３２巻、第１３０〜１３７頁による製
剤）２Ｕ／mlフエニルアラニン−デヒドロゲナーゼ（１
１０Ｕ／mgを有する製剤；表２に依る、第１液体−液体
−分配によるトツプ相：Top-Phase)２Ｕ／ml フエニルピルベート２０mM 総容積は２mlであり、培養は撹拌下２８℃で行なわれ
た。生成物の生成はアミノ酸−分析器で追跡された。
次の表は、９０分間後に生成物１９mMが生じたことを示
す（変換率９６％）。
す（変換率９６％）。
表：無細胞系におけるＬ−フエニルアラニンへのフエニ
ルピルベートの変換（変換率＝使用したフエニルピルベ
ートに対して） 時間（分） Ｌ−Phe mM 変換率(%) １５ ７．４ ３７ ３０ １２．８ ６４ ６０ １６．８ ８４ ９０ １９．１ ９６
ルピルベートの変換（変換率＝使用したフエニルピルベ
ートに対して） 時間（分） Ｌ−Phe mM 変換率(%) １５ ７．４ ３７ ３０ １２．８ ６４ ６０ １６．８ ８４ ９０ １９．１ ９６
第１図は本発明によるフエニルアラニンデヒドロゲナー
ゼ（Ｍ４）におけるpH値と反応及び逆反応との関係を示
す曲線図であり、第２図は１．５醗酵槽中でのロドコ
ツカス・スペツクＭ４からのフエニルアラニン−デヒド
ロゲナーゼの生産とpHとの関係を示す曲線図である。
ゼ（Ｍ４）におけるpH値と反応及び逆反応との関係を示
す曲線図であり、第２図は１．５醗酵槽中でのロドコ
ツカス・スペツクＭ４からのフエニルアラニン−デヒド
ロゲナーゼの生産とpHとの関係を示す曲線図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マリア‐レギーナ・クラ ドイツ連邦共和国ヴルフエンビユツテル・ フオルストヴエーク 15 (72)発明者 ヴエルナー・フンメル ドイツ連邦共和国ブラウンシユヴアイク・ グリユツクシユトラーセ ３ (72)発明者 ホルスト・シユツテ ドイツ連邦共和国ザルツギター・ノルトリ ング 29アー
Claims (4)
- 【請求項１】フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼを含
有するロドコッカス・スペック。 - 【請求項２】ロドコッカス・スペックＭ４（Rhodococcu
s spec Ｍ４）（ＤＳＭ３０４１）である、特許請求の
範囲第１項記載の微生物。 - 【請求項３】ロドコッカス・スペックＩ３（Rhodococcu
s spec Ｉ３）（ＤＳＭ３０４０）である、特許請求の
範囲第１項記載の微生物。 - 【請求項４】炭素、窒素及び鉱酸塩のための給源及びチ
アミンを含有する水性培地中で微生物−含有試料を好気
性培養することによりフェニルアラニン−デヒドロゲナ
ーゼを含有するロドコッカス・スペックを取得するため
に、ロドコッカス菌株含有試料を先ずアルカリ金属プロ
ピオン酸塩０．１〜０．５ｇ／ｌ含有の培地中で培養
し、引続き生じた典型コロニーを、誘導物質としてのＬ
−フェニルアラニン又はＬ−フェニルアラニンアミドを
含有する培地上に接種し、培養し、かつ両方の培地中に
成長する微生物を選択することを特徴とするフェニルア
ラニン−デヒドロゲナーゼを含有する微生物ロドコッカ
ス・スペックの取得法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3446304.6 | 1984-12-19 | ||
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