JPS61146183A - フェニルアラニン―デヒドロゲナーゼを含有するロドコッカス・スペック及びその取得法 - Google Patents
フェニルアラニン―デヒドロゲナーゼを含有するロドコッカス・スペック及びその取得法Info
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- JPS61146183A JPS61146183A JP60284510A JP28451085A JPS61146183A JP S61146183 A JPS61146183 A JP S61146183A JP 60284510 A JP60284510 A JP 60284510A JP 28451085 A JP28451085 A JP 28451085A JP S61146183 A JPS61146183 A JP S61146183A
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
- C12P13/222—Phenylalanine
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明ハフェニルアラニンーヂヒドロデナーゼを含有す
る微生物、その収得法及びこれを使用するＬ−α−アミ
ノ酸の製法に関するものである。
る微生物、その収得法及びこれを使用するＬ−α−アミ
ノ酸の製法に関するものである。
従来の技術
Ｌ−フェニルアラニンの立体特異性製造には水媒として
酵素を使用することが有利であることが実証された。
酵素を使用することが有利であることが実証された。
西ドイツ国特許出願公開公報（ＤＩ−Ｏ８）第３３０７
０９５号明細書から、フェニルピルベートをフェニルア
ラニンーヂヒＶロデナーゼを用いて還元的にアミノ化す
ること、かつ相応する酵素をブレビバクテリウム・スペ
ック（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ５ｐｅｃ、 ）
（ＤＥＩＭ ２４４８ ）から得ることは公知である
。しかしながらそうして分離された酵素は比軟的不安定
であると実証されている。
０９５号明細書から、フェニルピルベートをフェニルア
ラニンーヂヒＶロデナーゼを用いて還元的にアミノ化す
ること、かつ相応する酵素をブレビバクテリウム・スペ
ック（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ５ｐｅｃ、 ）
（ＤＥＩＭ ２４４８ ）から得ることは公知である
。しかしながらそうして分離された酵素は比軟的不安定
であると実証されている。
フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼを含有するその他
の微生物を、そこ【記載された方法を用いて得るための
試みは成功しなかった。
の微生物を、そこ【記載された方法を用いて得るための
試みは成功しなかった。
このことは、西−イツ国特許出願公開公報（ＤＢ−Ｏ８
）第３３０７０９５号明細書から公知の培地が極めて種
々の微生物の非特異性の成長を可能にし、これは当然所
望の植株の選択を極めて困難にすることに基づいている
。
）第３３０７０９５号明細書から公知の培地が極めて種
々の微生物の非特異性の成長を可能にし、これは当然所
望の植株の選択を極めて困難にすることに基づいている
。
発明が解決しようとする問題点
本発明は、フェニルアラニンーデヒドロゲナーゼを含有
する微生物の分離のための、適当な菌株の速やかな選択
を可能にする方法及び安定ｔ、７’Ｃフェニルアラニン
ーデヒドロゲナーゼを課題とするものである。
する微生物の分離のための、適当な菌株の速やかな選択
を可能にする方法及び安定ｔ、７’Ｃフェニルアラニン
ーデヒドロゲナーゼを課題とするものである。
問題点を解決する手段
本発明は、炭素、窒素及び鉱酸塩のための給源及びチア
ミンを含有する水性培地中で微生物−含有の試料を好気
性培養することによりフェニルアラニン−デヒドロゲナ
ーゼを含有する微生物を収得するための方法を目的とす
るものであり、この方法は試料を先ずアルカリ金属プロ
ピオン酸塩０．１〜０．５ 、！ｉｒ ／ノ含有の培地
中で培養し、引続き形成する典型コロニーを、誘導物質
を含有する培地上に接種し、培養し、かつ画壇地中に成
長する微生物を選択することを特徴とする。
ミンを含有する水性培地中で微生物−含有の試料を好気
性培養することによりフェニルアラニン−デヒドロゲナ
ーゼを含有する微生物を収得するための方法を目的とす
るものであり、この方法は試料を先ずアルカリ金属プロ
ピオン酸塩０．１〜０．５ 、！ｉｒ ／ノ含有の培地
中で培養し、引続き形成する典型コロニーを、誘導物質
を含有する培地上に接種し、培養し、かつ画壇地中に成
長する微生物を選択することを特徴とする。
微生物含有の試料として、例えば土壌試料を選び、これ
を無菌食塩溶液（ＮａＣ２０，９％ ）で懸濁し、常法
で希釈し、一部を固体培地を有するペトリシャーレ上に
スパーチルで取る。培地は例えば本発明によりアルカリ
金属プロピオン酸塩、有利にゾロピオン酸す） ＩＪウ
ムが餓加される標準−組成を有する： プロピオン酸、Ｎａ−塩ｏ、ｉ 〜ｏ、ｓ 、ｖ 、
有利に０．２１ＫＮｏ、 ０．０１
９ｘＨ２ｐｏ４０．１１１ ＮａＣ１Ｃ０２５ｇ Ｍｇ８０４・７Ｈ２０１００’ｎ９ ＣａＣＯ３２０”；１ 微量元素−溶液 １ｍｌ 蒸留水 １１ 寒 天 ２ＯＮ −一値 ６．５〜７．５、有利に７．０培地は
オートクレーブに入れることにより滅菌し、冷却後、培
地１１当り滅菌濾過ビタミン−溶液１１ｎｌ並びに１１
当りシクロへキシミド（アクチジオン（Ａｃｔｌｉｏｎ
ｅ ） ） ５０ ｍｇを添加しくビタミン溶液の組成
：シュレーゲル、（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ、 ） 、 Ｈ，
Ｇ、 ”アルデマイネ・ミクロビオロギイ（Ａｌｌｇｅ
ｍｅｉｎｅ Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ ）”、テイ
ーメ出版（Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ ） 、第１６
９頁ＣＩ ９８１年〕による）、かつ培地を無菌ペトリ
シャーレ中に注ぐ。
を無菌食塩溶液（ＮａＣ２０，９％ ）で懸濁し、常法
で希釈し、一部を固体培地を有するペトリシャーレ上に
スパーチルで取る。培地は例えば本発明によりアルカリ
金属プロピオン酸塩、有利にゾロピオン酸す） ＩＪウ
ムが餓加される標準−組成を有する： プロピオン酸、Ｎａ−塩ｏ、ｉ 〜ｏ、ｓ 、ｖ 、
有利に０．２１ＫＮｏ、 ０．０１
９ｘＨ２ｐｏ４０．１１１ ＮａＣ１Ｃ０２５ｇ Ｍｇ８０４・７Ｈ２０１００’ｎ９ ＣａＣＯ３２０”；１ 微量元素−溶液 １ｍｌ 蒸留水 １１ 寒 天 ２ＯＮ −一値 ６．５〜７．５、有利に７．０培地は
オートクレーブに入れることにより滅菌し、冷却後、培
地１１当り滅菌濾過ビタミン−溶液１１ｎｌ並びに１１
当りシクロへキシミド（アクチジオン（Ａｃｔｌｉｏｎ
ｅ ） ） ５０ ｍｇを添加しくビタミン溶液の組成
：シュレーゲル、（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ、 ） 、 Ｈ，
Ｇ、 ”アルデマイネ・ミクロビオロギイ（Ａｌｌｇｅ
ｍｅｉｎｅ Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ ）”、テイ
ーメ出版（Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ ） 、第１６
９頁ＣＩ ９８１年〕による）、かつ培地を無菌ペトリ
シャーレ中に注ぐ。
接種したプレートを２３〜３２℃、有利に２７℃で４〜
６日間培養する。微生物の成長後、典型コロニーを寒天
プレートから適当なコロニー数（５０〜２００）で無菌
的にビロード製スタンプ上に接種取りする：次いで異な
る寒天培地を有する２枚のプレート上に接種がえする１
１枚のプレートは前記のプロピオン酸塩−培地を有し、
他方は誘導物質としてＬ−フェニルアラニンを有する培
地を、例えば次の組成で有する（フェニルアラニン−培
地）： Ｌ−フェニルアラニン １〜１５ｇ、有利に１０ｇ／１
ＫＷ２ＰＯ４２１１ 酵母抽出物 ０．２９ 寒天 ２０μ 蒸留水 １ノ ｐＨ−（直は６〜８、有利に７．２である。
６日間培養する。微生物の成長後、典型コロニーを寒天
プレートから適当なコロニー数（５０〜２００）で無菌
的にビロード製スタンプ上に接種取りする：次いで異な
る寒天培地を有する２枚のプレート上に接種がえする１
１枚のプレートは前記のプロピオン酸塩−培地を有し、
他方は誘導物質としてＬ−フェニルアラニンを有する培
地を、例えば次の組成で有する（フェニルアラニン−培
地）： Ｌ−フェニルアラニン １〜１５ｇ、有利に１０ｇ／１
ＫＷ２ＰＯ４２１１ 酵母抽出物 ０．２９ 寒天 ２０μ 蒸留水 １ノ ｐＨ−（直は６〜８、有利に７．２である。
再びプレートを３〜５日間２３〜６２℃で、有利に２７
°Ｃで培養する。典型コロニーの比較により、ゾロピオ
ン酸塩上にも、並びにフェニルアラニン−培地上にも成
長し得る微生物を選び出すことができる；これを接種取
りし、次にフェニルアラニン−培地上で保つ。
°Ｃで培養する。典型コロニーの比較により、ゾロピオ
ン酸塩上にも、並びにフェニルアラニン−培地上にも成
長し得る微生物を選び出すことができる；これを接種取
りし、次にフェニルアラニン−培地上で保つ。
次いで分離した微生物を常法で純度について再検査しく
希釈塗抹、顕微鏡観察）、単一で発生する菌株を次いで
２３〜６２℃、有利に２７°Ｃで増殖させる。液体培地
は次の組成を有する（ＭＰ−培地）： Ｌ−フェニルアラニン １〜１５１１ 有利に１０．Ｆ
ＫＨ２Ｐ０４２ ｇ 蒸留水 １１ 一一値 ６〜８、有利に７．２２〜３日間後に
細胞を沈降させ、破壊された微生物か・ら酵素を公知方
法で得る。
希釈塗抹、顕微鏡観察）、単一で発生する菌株を次いで
２３〜６２℃、有利に２７°Ｃで増殖させる。液体培地
は次の組成を有する（ＭＰ−培地）： Ｌ−フェニルアラニン １〜１５１１ 有利に１０．Ｆ
ＫＨ２Ｐ０４２ ｇ 蒸留水 １１ 一一値 ６〜８、有利に７．２２〜３日間後に
細胞を沈降させ、破壊された微生物か・ら酵素を公知方
法で得る。
この分離方法を用いて簡単なやり方で、所望のフェニル
アラニン−デヒドロゲナーゼー活性を有する微生物を、
一つの土壌試料の微生物−個体群から富化すること及び
分離することが可能である。すなわちブラウンシュバイ
ク州の周域からの２０種の土壌試料から、Ｐｈｅ−ＤＨ
−活性を有する７種の分離物が得られる（表１）。分離
した微生物を２檜の群に分類することができる：ブレビ
パフチリウム属に属する５櫨の分離物（もう１つの土壌
試料からのもの）、並びにロドコッカス属に属し、例え
ば次の特性を示す２種の分離物： 成長するに従い球形に移行するダラム陽性短桿菌に成長
；細胞は不動性であり、胞子を生成しない：＠性好気性
成長；ブドウ糖から駿生成；カタラーゼ及びニトレート
還元陽性、尿素−分離陽性：ゼラチン−、カゼイン−及
び澱粉−分解陰性： Ｈ２Ｓ−生成陰性；４１°Ｃでの
成長陰性。
アラニン−デヒドロゲナーゼー活性を有する微生物を、
一つの土壌試料の微生物−個体群から富化すること及び
分離することが可能である。すなわちブラウンシュバイ
ク州の周域からの２０種の土壌試料から、Ｐｈｅ−ＤＨ
−活性を有する７種の分離物が得られる（表１）。分離
した微生物を２檜の群に分類することができる：ブレビ
パフチリウム属に属する５櫨の分離物（もう１つの土壌
試料からのもの）、並びにロドコッカス属に属し、例え
ば次の特性を示す２種の分離物： 成長するに従い球形に移行するダラム陽性短桿菌に成長
；細胞は不動性であり、胞子を生成しない：＠性好気性
成長；ブドウ糖から駿生成；カタラーゼ及びニトレート
還元陽性、尿素−分離陽性：ゼラチン−、カゼイン−及
び澱粉−分解陰性： Ｈ２Ｓ−生成陰性；４１°Ｃでの
成長陰性。
細胞壁はメゾ−ジアミノ−ピメリン酸を有し、細胞壁糖
としてアラぎノース及びがラクトースが確認された。メ
ナチノン（Ｍｅｎａｃｈｉｎｏｎｅ ）はＴ７Ｐ Ｍ
Ｋ−８１２）よりなる。両分離物は炭素原子３０〜５０
を有するラベルクコステアリン酸及びミコール酸を有す
る。ミコール酸メチルエステルから熱分解的分離により
遊離する脂肪酸は１２〜１８個の炭素原子を有する。両
分離物のコロニー色はサフラン黄である（ ＲＡＬ −
色コードによるＴ７Ｉ） ４−１ ） （セイラー（５
ｅｌｅｒ ）、Ｌ 、ジャーナル・オデ・ゼネラル・ミ
クロビオロギイ（Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
、 ）第１２９巻、第１４６５〜１４７１頁（１９８！
１年〕）。微生物は生長のためにチアミンを必要とする
。
としてアラぎノース及びがラクトースが確認された。メ
ナチノン（Ｍｅｎａｃｈｉｎｏｎｅ ）はＴ７Ｐ Ｍ
Ｋ−８１２）よりなる。両分離物は炭素原子３０〜５０
を有するラベルクコステアリン酸及びミコール酸を有す
る。ミコール酸メチルエステルから熱分解的分離により
遊離する脂肪酸は１２〜１８個の炭素原子を有する。両
分離物のコロニー色はサフラン黄である（ ＲＡＬ −
色コードによるＴ７Ｉ） ４−１ ） （セイラー（５
ｅｌｅｒ ）、Ｌ 、ジャーナル・オデ・ゼネラル・ミ
クロビオロギイ（Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
、 ）第１２９巻、第１４６５〜１４７１頁（１９８！
１年〕）。微生物は生長のためにチアミンを必要とする
。
分離物は本発明のもう１つの目的であり、１９８４年９
月７日にＤＳＭにおいて、ロドコッカス・スペックＭ４
として１６３０４１で、かつロドコッカス・スペック１
６としてｙｔｂ ３０４０で菌寄託された。
月７日にＤＳＭにおいて、ロドコッカス・スペックＭ４
として１６３０４１で、かつロドコッカス・スペック１
６としてｙｔｂ ３０４０で菌寄託された。
微生物は凍結乾燥培養として、−８０°Ｃでの、又は液
体窒素中−１９６°Ｃでの凍結により貯蔵することがで
きる；作業培地は傾斜寒天−試験管（フェニルアラニン
−培地）上で保たれる。
体窒素中−１９６°Ｃでの凍結により貯蔵することがで
きる；作業培地は傾斜寒天−試験管（フェニルアラニン
−培地）上で保たれる。
両法はアミノ酸り−フェニルアラニンを利用しない。
粗抽出物−酵素調剤での予備試験は、ブレビバクテリウ
ム属の個々の分離物からのフェニルアラニンーヂヒドロ
デナーゼが、西ドイツ国特許公開公報第３３０７０９５
．４号明細書に記載され几酵素と、比酵素活性度、容積
収車、誘導性及び安定性に関して比軟可能であることを
示した。
ム属の個々の分離物からのフェニルアラニンーヂヒドロ
デナーゼが、西ドイツ国特許公開公報第３３０７０９５
．４号明細書に記載され几酵素と、比酵素活性度、容積
収車、誘導性及び安定性に関して比軟可能であることを
示した。
ロドコッカス属の両分離物からの酵素はそれに比軟して
明らかに優れていることが判る：ａ）粗抽出物における
酵素はより高い比活性度を示す（２〜５σ／蛋白質ｎ９
の代りに２０〜３０［ｒ／Ｉｎ９）； ｂ）Ｌ−フェニルアラニン１チでの成長ではより高い容
積収率が達成される（３〜６．０００σ／ｌの代りに２
０〜２５．０００ｔｒ／ｌり；Ｃ）酵素は明らかにより
良好な安定性である。
明らかに優れていることが判る：ａ）粗抽出物における
酵素はより高い比活性度を示す（２〜５σ／蛋白質ｎ９
の代りに２０〜３０［ｒ／Ｉｎ９）； ｂ）Ｌ−フェニルアラニン１チでの成長ではより高い容
積収率が達成される（３〜６．０００σ／ｌの代りに２
０〜２５．０００ｔｒ／ｌり；Ｃ）酵素は明らかにより
良好な安定性である。
フェニルアラニン−？ヒドロゲナーゼは酵素学的に次の
様に記載され得る： ａ）これは、系統的な名称はＬ−フェニルアラニンであ
る芳香族α−ケト酸の還元的アミノ化を融媒する： Ｍ
ＡＤ”−オギシドリダクターゼ（脱アミノ化）、及びこ
れはＢ、Ｃ，一群１．４．１に属する； ｂ）フェニルピルベートの還元的アミノ化の最適−４−
値は９．６±１である： ｃ） Ｌ−フェニルアラニンの酸化的脱アミノ化の最
適ｐｉ（−１直は１０．０±１である：ｄ） ＮＡＤ
Ｅ（ニ対するＫＭ −ｒｉはＯ−０８ｍＭに達する。
様に記載され得る： ａ）これは、系統的な名称はＬ−フェニルアラニンであ
る芳香族α−ケト酸の還元的アミノ化を融媒する： Ｍ
ＡＤ”−オギシドリダクターゼ（脱アミノ化）、及びこ
れはＢ、Ｃ，一群１．４．１に属する； ｂ）フェニルピルベートの還元的アミノ化の最適−４−
値は９．６±１である： ｃ） Ｌ−フェニルアラニンの酸化的脱アミノ化の最
適ｐｉ（−１直は１０．０±１である：ｄ） ＮＡＤ
Ｅ（ニ対するＫＭ −ｒｉはＯ−０８ｍＭに達する。
Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−フェニルアラニンアミド
は誘導物質として有利に使用されるが、Ｌ−ヒスチジン
も限られた範囲で適合する。
は誘導物質として有利に使用されるが、Ｌ−ヒスチジン
も限られた範囲で適合する。
フェニルアラニンーヂヒドロデナーゼは補酵素としてア
ンモニウムイオン及びＮＡＤＥ（の存在でフェニルピル
ベート、ｐ−ヒドロキシフェニルピルベート、インド−
ルビ・ルベート又１ｄ２−ケト−４−メチルメルカプト
ブチレートを相応するＬ−α−アミノカルｆン酸に変換
するために使用される。
ンモニウムイオン及びＮＡＤＥ（の存在でフェニルピル
ベート、ｐ−ヒドロキシフェニルピルベート、インド−
ルビ・ルベート又１ｄ２−ケト−４−メチルメルカプト
ブチレートを相応するＬ−α−アミノカルｆン酸に変換
するために使用される。
方法は有利に２０〜６０°Ｃ及びＰＨ−値８．５〜１０
で実施される。
で実施される。
例えば西ドイツ国特許出願公開公報（ＤＩ−Ｏ８）第３
３０７０９５号明細書から公知である補酵素−再生下に
有利に作業する。
３０７０９５号明細書から公知である補酵素−再生下に
有利に作業する。
同様の方法で非破壊細菌細胞を使用することもできる。
この酵素は、酵素的方法で水溶液中で前記のα−ケトカ
ルざン酸もしくはα−アミノ酸の濃度を測定するのにも
適している。
ルざン酸もしくはα−アミノ酸の濃度を測定するのにも
適している。
分離物の同定後、寄託機関ＤＳＭからのロドコッカス属
の公知菌株を７エニルアラニンーデヒドロデナーゼ活性
について試験した。現在、この属の１１櫨が公知である
〔グツドフェロ−（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ ）、Ｍ、及
びミニキン（Ｍｉｎｎｉｋｉｎ）、Ｄ、Ｅ、 ：デ・プ
ロカリョーテス（Ｔｈｅ Ｐｒｏｋａｒｙｏ−ｔｅａ
）中（スター（５ｔａｒｒ ） Ｍ、Ｐ、等編集者）、
第２０１６〜２０２７頁、スプリンガー（ａｐｒ−１ｎ
ｇｅｒ ） 出版、ベルリン、ハイデルベルグ、ニュー
ヨーク（１９８１年）；グツド７エロー（Ｇｏｏｄｆｅ
ｌｌｏｗ ）、Ｍｏ、システム、アプル、ミクロビオル
、 （Ｓｙｓｔｅｍ、 Ａｐｐｌ、 Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ、 ）第５巻、第２２５〜２２９頁（１９８４羊）
〕：そのつと典型菌株をＭＰ−培地（Ｌ−フェニルアラ
ニン１チ、トウモロコシ膨潤水１１．２ ％、ＫＨ２Ｆ
０．０．２チ）中に接１ｊ［シた。２７℃で４０時間の
成長後に細胞を破壊し、粗抽出物中でフェニルアラニン
−デヒドロゲナーゼの活性を測定し念。
の公知菌株を７エニルアラニンーデヒドロデナーゼ活性
について試験した。現在、この属の１１櫨が公知である
〔グツドフェロ−（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ ）、Ｍ、及
びミニキン（Ｍｉｎｎｉｋｉｎ）、Ｄ、Ｅ、 ：デ・プ
ロカリョーテス（Ｔｈｅ Ｐｒｏｋａｒｙｏ−ｔｅａ
）中（スター（５ｔａｒｒ ） Ｍ、Ｐ、等編集者）、
第２０１６〜２０２７頁、スプリンガー（ａｐｒ−１ｎ
ｇｅｒ ） 出版、ベルリン、ハイデルベルグ、ニュー
ヨーク（１９８１年）；グツド７エロー（Ｇｏｏｄｆｅ
ｌｌｏｗ ）、Ｍｏ、システム、アプル、ミクロビオル
、 （Ｓｙｓｔｅｍ、 Ａｐｐｌ、 Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ、 ）第５巻、第２２５〜２２９頁（１９８４羊）
〕：そのつと典型菌株をＭＰ−培地（Ｌ−フェニルアラ
ニン１チ、トウモロコシ膨潤水１１．２ ％、ＫＨ２Ｆ
０．０．２チ）中に接１ｊ［シた。２７℃で４０時間の
成長後に細胞を破壊し、粗抽出物中でフェニルアラニン
−デヒドロゲナーゼの活性を測定し念。
口げコツカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕ
ｓｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ） （ＤＳＭ ４３０６
６及び７４３）の株だけはＬ−フェニルアラニンを利用
シ（４３０６６については０Ｄ５ｙｅ ２８−０及び７
４３についてはＯＤ １５−３ ） 、かつフェエルア
ラニンーデヒＶロデナーゼ活性を有する（ ４５０６６
については１２６０σ／ｌ及び７４３については１０３
１Ｕ／Ａ’）が、この活性は明らかに新種のロドコッカ
ス株のそれ以下である。
ｓｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ） （ＤＳＭ ４３０６
６及び７４３）の株だけはＬ−フェニルアラニンを利用
シ（４３０６６については０Ｄ５ｙｅ ２８−０及び７
４３についてはＯＤ １５−３ ） 、かつフェエルア
ラニンーデヒＶロデナーゼ活性を有する（ ４５０６６
については１２６０σ／ｌ及び７４３については１０３
１Ｕ／Ａ’）が、この活性は明らかに新種のロドコッカ
ス株のそれ以下である。
微生物を公知方法で生物反応器中で所望の基準で接種し
、それから酵素を分離することにより、ロドコッカス株
Ｍ４及び工３からより多量のフェニルアラニン−？ヒド
ロ２ナーゼを得ることができる。
、それから酵素を分離することにより、ロドコッカス株
Ｍ４及び工３からより多量のフェニルアラニン−？ヒド
ロ２ナーゼを得ることができる。
効果のある培養には次の有利な条件があてはまる：
ａ）良好な通気（＠性好気性微生物）；ｂ）出発−一値
６．０〜８．０；有利に７．０〜７．６Ｃ）鉱酸塩の存
在（例えばトウモロコシ膨潤水として錯体の形で）； ｄ）少量のチアミンの存在（１〜２μ９／１３）：ｅ）
ＰｈｅＤＨの誘導のために培地中Ｌ−フェニルアラ
ニンー含ｔＯ０５〜１．５チ； ｆ）温度２３〜３２°Ｃ 試料中火のことを測定する： ａ）成長のための尺度として５７８ ｎｍにおける培地
の光学密度（混濁）； １１＋）アミノ酸分析器を用いる培地中のフェニルアラ
ニン含量（細胞の遠心分離後）； Ｃ）測光試験の適用下に酵素含量。
６．０〜８．０；有利に７．０〜７．６Ｃ）鉱酸塩の存
在（例えばトウモロコシ膨潤水として錯体の形で）； ｄ）少量のチアミンの存在（１〜２μ９／１３）：ｅ）
ＰｈｅＤＨの誘導のために培地中Ｌ−フェニルアラ
ニンー含ｔＯ０５〜１．５チ； ｆ）温度２３〜３２°Ｃ 試料中火のことを測定する： ａ）成長のための尺度として５７８ ｎｍにおける培地
の光学密度（混濁）； １１＋）アミノ酸分析器を用いる培地中のフェニルアラ
ニン含量（細胞の遠心分離後）； Ｃ）測光試験の適用下に酵素含量。
試駆調製物は次のものを含有する：塩化アンモニウム／
アンモニア緩衝液（ｐＨ８，５） ０．７ Ｍ。
アンモニア緩衝液（ｐＨ８，５） ０．７ Ｍ。
ＮＡＤＨ３，１ｍＭ、フェニルぎルペー）１０ｍＭ及び
限界量の酵素（１試験当り蛋白質１〜２０μｇ）。５４
０ ｎｍでＮＡＤＨの吸光の減少を測定する。？昇られ
る１直から、フェニルピルベートの添加なしに試験が経
過する場合に得られる零値を差引く。酵素活性は国際単
位で示され、その際１単位はＮＡＤＨ１μＭ０１／分の
減少を意味する。
限界量の酵素（１試験当り蛋白質１〜２０μｇ）。５４
０ ｎｍでＮＡＤＨの吸光の減少を測定する。？昇られ
る１直から、フェニルピルベートの添加なしに試験が経
過する場合に得られる零値を差引く。酵素活性は国際単
位で示され、その際１単位はＮＡＤＨ１μＭ０１／分の
減少を意味する。
工業的な使用のために１培養により得られる細胞を直接
使用するか、又は細胞中に得られる酵素を分離し、次い
で細胞なしの系で使用する。
使用するか、又は細胞中に得られる酵素を分離し、次い
で細胞なしの系で使用する。
酵素分離は細胞破壊後に酵素Ｈａの自体公知の方法の組
合せにより可能である。
合せにより可能である。
先ず細菌−湿潤物から有利に機械的細胞破壊により、例
えばガラスパールミル、高圧ホモジエナイデー又は超音
処理により内容物を遊離させる。
えばガラスパールミル、高圧ホモジエナイデー又は超音
処理により内容物を遊離させる。
第二工程において細胞破壊物を西ドイツ国特許公開公報
第２６３９１２９号明細書に依り粗抽出物から水性二相
系を介して分離する。
第２６３９１２９号明細書に依り粗抽出物から水性二相
系を介して分離する。
上相は実際にＬ−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼ
の総活性を有し、更に透析方法を砲こす。
の総活性を有し、更に透析方法を砲こす。
透析した酵素を引続きＤＥｌｆＡＢ−セルロース−クロ
マトグラフィーを用いて更に精製し、次いで例えばセフ
ァロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ ） ４ Ｂでの界面塩
析クロマトグラフィーをかげることにより所望の程度の
後精製を達する。
マトグラフィーを用いて更に精製し、次いで例えばセフ
ァロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ ） ４ Ｂでの界面塩
析クロマトグラフィーをかげることにより所望の程度の
後精製を達する。
実施例
例１：
フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼの製造培養のため
に、培地１．５４’が充たされている２１バイオリアク
ターを使用する。培地は１１当り、Ｌ−フェニルアラニ
ン１０９ ； ｘａ、ｐｏ。
に、培地１．５４’が充たされている２１バイオリアク
ターを使用する。培地は１１当り、Ｌ−フェニルアラニ
ン１０９ ； ｘａ、ｐｏ。
２ｐ；トウモロコシ膨潤水（乾燥粉末）２ｇ：を含有し
、−一値は７．０である。
、−一値は７．０である。
殺菌後、同じ培地中に４８時間培養し念前培養物５０Ｍ
を、培地に接ｉする。醗酵物中の成長条件は次の通りで
ある： 温度＝２７°Ｃ 通気藁：空気６０１／時 ４ ［］ ＯＵｐＭでタービン形１１拌器ｉ々の成長時
間で試料Ｃ４０ｍ１）を取り出し、酵素活性くついての
試験によりこの細胞中の最高に達成可能な酵素含量もし
くは最も有利な採取時期を測定した。
を、培地に接ｉする。醗酵物中の成長条件は次の通りで
ある： 温度＝２７°Ｃ 通気藁：空気６０１／時 ４ ［］ ＯＵｐＭでタービン形１１拌器ｉ々の成長時
間で試料Ｃ４０ｍ１）を取り出し、酵素活性くついての
試験によりこの細胞中の最高に達成可能な酵素含量もし
くは最も有利な採取時期を測定した。
第２図は酵素が早い成長期に形成されることを示す；微
生物がフェニルアラニンを破壊しはじめる際に酵素含量
は特に上昇する。この際培地１７当り明らかに２０００
０単位以上の酵素含量が達成され得る。更に成長が進行
すると再び酵素含量は降下する。
生物がフェニルアラニンを破壊しはじめる際に酵素含量
は特に上昇する。この際培地１７当り明らかに２０００
０単位以上の酵素含量が達成され得る。更に成長が進行
すると再び酵素含量は降下する。
醗酵物１．５１から細菌の遠心分離により総−酵素活性
２２０００単位を有する細胞（湿潤物）７０ｇが１与ら
れる。
２２０００単位を有する細胞（湿潤物）７０ｇが１与ら
れる。
例 ２
培地中のアミノ酸に依るＰｈｅＤＨの生成法Ｍ４を培地
中でトウモロコシ膨潤水（乾燥粉末）０．２％、ＫＨ２
Ｆ０．０．２％及びそのつとアミノ酸１ｔｓと共に培養
する；その、Ｈ−値は培養開始前は７．４である。その
つと培地１００ｄが接ｉされた；４０時間の成長後細胞
を遠心分離シ、粒状ガラスで細胞を破壊した後にＰｈｅ
ＤＨの活性を測定した。表２は、良好な酵素収率のため
にはＬ−フェニルアラニンの添加が必要であり、その他
の天然アミノ酸は僅かしか（ヒスチジン）又は全く（イ
ソロイシン）酵素を含有しないことを示す。Ｌ−フェニ
ルアラニンは誘導物質として誘導体Ｌ−フェニルアラニ
ンアミドに代えられ得る。若干の天然アミノ酸について
は株Ｍ４は成長することができない（例えば、Ｔ、＋−
）リゾトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アラニン又はＬ−
グルタミン酸）。同様にこの株はブレビバクテリウム・
スペック（ＤＳＭ ２４４８）とは反対にアミノｆｉＤ
−７二二化アラニンを使用しない。
中でトウモロコシ膨潤水（乾燥粉末）０．２％、ＫＨ２
Ｆ０．０．２％及びそのつとアミノ酸１ｔｓと共に培養
する；その、Ｈ−値は培養開始前は７．４である。その
つと培地１００ｄが接ｉされた；４０時間の成長後細胞
を遠心分離シ、粒状ガラスで細胞を破壊した後にＰｈｅ
ＤＨの活性を測定した。表２は、良好な酵素収率のため
にはＬ−フェニルアラニンの添加が必要であり、その他
の天然アミノ酸は僅かしか（ヒスチジン）又は全く（イ
ソロイシン）酵素を含有しないことを示す。Ｌ−フェニ
ルアラニンは誘導物質として誘導体Ｌ−フェニルアラニ
ンアミドに代えられ得る。若干の天然アミノ酸について
は株Ｍ４は成長することができない（例えば、Ｔ、＋−
）リゾトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アラニン又はＬ−
グルタミン酸）。同様にこの株はブレビバクテリウム・
スペック（ＤＳＭ ２４４８）とは反対にアミノｆｉＤ
−７二二化アラニンを使用しない。
表２
Ｌ−フェニルアラニン ３１ ７．２５
１５２００Ｌ−ヒスチジン ４
１．８１ ８２ＯＬ−フェニルアラニン−アミド
８ ８．４９ ３５５ＯＬ−イソロイシ
ン １４ ０ ０Ｄ−フェニ
ルアラニン ０ 例 ３ 培地中のフェニルアラニンー１度に依るＰｈｅＤＨの生
成 株Ｍ４を培地中でトウモロコシ膨潤水（乾燥粉末）０．
２％、ＫＨ２ＰＯ４０−２％及び増加量のＬ・−フェニ
ルアラニン（１，５％−１で）と共に培養する；培養の
開始前のｐＨ−＋直は７．４である。
１５２００Ｌ−ヒスチジン ４
１．８１ ８２ＯＬ−フェニルアラニン−アミド
８ ８．４９ ３５５ＯＬ−イソロイシ
ン １４ ０ ０Ｄ−フェニ
ルアラニン ０ 例 ３ 培地中のフェニルアラニンー１度に依るＰｈｅＤＨの生
成 株Ｍ４を培地中でトウモロコシ膨潤水（乾燥粉末）０．
２％、ＫＨ２ＰＯ４０−２％及び増加量のＬ・−フェニ
ルアラニン（１，５％−１で）と共に培養する；培養の
開始前のｐＨ−＋直は７．４である。
そのつと培地１００Ｍが接種された；４Ｄ時間の成長後
に細胞を遠心分離し、細胞を粒状ガラスで破壊した後に
、ＰｈｅＤＨの活性を測定した。
に細胞を遠心分離し、細胞を粒状ガラスで破壊した後に
、ＰｈｅＤＨの活性を測定した。
表６は、培地中のフェニルアラニン−含量の上昇により
酵素収率も高めることができ、すなゎちフェニルアラニ
ン１．５チで培地１１当り約２６．００００が得られる
。更に比酵素活性（Ｕ／１ｎ９）の経過は、０．５％以
上のフェニルアラニンの含量が有利であることを示す。
酵素収率も高めることができ、すなゎちフェニルアラニ
ン１．５チで培地１１当り約２６．００００が得られる
。更に比酵素活性（Ｕ／１ｎ９）の経過は、０．５％以
上のフェニルアラニンの含量が有利であることを示す。
表３
フェニルアラニン−デヒドロｒす一−ＩＺ”８
１２．２ １４０００１０
１４．６ １８０００１２
１６．６ ２３０００１５
２０．４ ２６０００例
４ ＰＨ−値に依る反応速度の依存性 ａ）還元的アミノ化 Ｌ−フェニルアラニンへのフェニルピルベートの還元的
アミノ化の反応速度を反応溶液の一一値に依り調査した
。試験調製物は次の組成を有した： ＮＡＤＥ（０，２５ｍＭ 、 フェニルピルベート１．
５ｍＭ及び櫨々のＰＨ−値における塩化アンそニウム浴
液０．７Ｍ中の酵素の限界量。櫨々の一一値は、試験調
製物の混合前に塩化アンモニウム溶液０．７Ｍにアンモ
ニアもしくは塩酸を加えることにより調整し友。
１２．２ １４０００１０
１４．６ １８０００１２
１６．６ ２３０００１５
２０．４ ２６０００例
４ ＰＨ−値に依る反応速度の依存性 ａ）還元的アミノ化 Ｌ−フェニルアラニンへのフェニルピルベートの還元的
アミノ化の反応速度を反応溶液の一一値に依り調査した
。試験調製物は次の組成を有した： ＮＡＤＥ（０，２５ｍＭ 、 フェニルピルベート１．
５ｍＭ及び櫨々のＰＨ−値における塩化アンそニウム浴
液０．７Ｍ中の酵素の限界量。櫨々の一一値は、試験調
製物の混合前に塩化アンモニウム溶液０．７Ｍにアンモ
ニアもしくは塩酸を加えることにより調整し友。
第２図においては、反応速度は６．０〜１０．２の範囲
における一一値の関数として書かれている。最適−一値
は９．２５である。ＰＨ−値は反応混合物中で測定され
た・ ｂ）酸化的脱アミノ化 Ｌ−フェニルアラニンの酸化的脱アミノ化の反応速度は
Ｌ−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼに依り触媒さ
れ、同様に一一値に依り調査される。試験調製物は次の
組成を有した：燻々のｐＨ−１直におけるグリシン／
ＮａＣｔ／ ＮａＯＨ−緩衝液０．１Ｍ中のＨＡＤ”
３ ｍＭ及び−−フェニルアラニン６ｒｎＭｉ ｏ櫨々
の一一値は試験調製物の混合前に緩衝液に塩酸又は苛性
ソーダ溶液を添加することにより調整した。結果はｐＨ
６，５〜１０．１の範囲について同様に第１図に総括し
て描かれている。逆反応はｐＨ１０，１１で上昇する。
における一一値の関数として書かれている。最適−一値
は９．２５である。ＰＨ−値は反応混合物中で測定され
た・ ｂ）酸化的脱アミノ化 Ｌ−フェニルアラニンの酸化的脱アミノ化の反応速度は
Ｌ−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼに依り触媒さ
れ、同様に一一値に依り調査される。試験調製物は次の
組成を有した：燻々のｐＨ−１直におけるグリシン／
ＮａＣｔ／ ＮａＯＨ−緩衝液０．１Ｍ中のＨＡＤ”
３ ｍＭ及び−−フェニルアラニン６ｒｎＭｉ ｏ櫨々
の一一値は試験調製物の混合前に緩衝液に塩酸又は苛性
ソーダ溶液を添加することにより調整した。結果はｐＨ
６，５〜１０．１の範囲について同様に第１図に総括し
て描かれている。逆反応はｐＨ１０，１１で上昇する。
ＰＨ−値は反応混合物中で測定した。
例 ５ ：
基質濃度に依る反応速度の依存性
還元的アミノ化
基質ＮＡｎＨに対するＬ−フェニルアラニンへのフェニ
ルピルベートの還元的アミノ化の反応速度の依存性は次
の試験調製物で副査した：塩化アンモニウム／アンモニ
アー緩衝液（ＰＨ９，５） ０．７ Ｍ、フェニルピル
ベート１−５ ｍＭｓ酵素の限界量。試験調製物中のＮ
ＡＤＨ−濃度は０．０２５〜０．３ｍＭの範囲で変化し
た。
ルピルベートの還元的アミノ化の反応速度の依存性は次
の試験調製物で副査した：塩化アンモニウム／アンモニ
アー緩衝液（ＰＨ９，５） ０．７ Ｍ、フェニルピル
ベート１−５ ｍＭｓ酵素の限界量。試験調製物中のＮ
ＡＤＨ−濃度は０．０２５〜０．３ｍＭの範囲で変化し
た。
最適の反応速度は０．２５ ｍＭで達成されることが示
された。ＮＡＤＨに対するＫＭ−値は０．０８ｍＭであ
る。
された。ＮＡＤＨに対するＫＭ−値は０．０８ｍＭであ
る。
ｂ）偏々のα−ケトカルセン酸の還元的アミノ化はケト
酸−濃度に依り調査した。このために次の試験調製物を
使用した： 塩化アンモニウム／アンモニア−緩衝液（ｐＨ９，５）
ＯＪ Ｍ ５ＮＡＤＨ０，２５ｍＭ 、限界量の酵素
。
酸−濃度に依り調査した。このために次の試験調製物を
使用した： 塩化アンモニウム／アンモニア−緩衝液（ｐＨ９，５）
ＯＪ Ｍ ５ＮＡＤＨ０，２５ｍＭ 、限界量の酵素
。
ケトｒ！！１ａ度はソノツと０．０１〜３０ ｍＭノ範
囲で変化した。
囲で変化した。
初反応速度（吸光変化３４０ ｎｍ ／分）はミバエリ
ス−メンテン（Ｍｉａｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ ）
法により評価する。実測のＫＭ−及びＶエニー値は表４
に総括しである。光学的試験の障害のために、基質イン
げ−ルビルベート及びｐ−ヒドロキシフェニルピルベー
トの場合には、ｂ−トリプトファンもしくはチロシンへ
の還元的アミノ化は時間の関数としてアミノ酸分析器で
測定した〔１−カラム−プログラム（１−Ｓａｅｕｌｅ
ｎ−ｐｒｏｇｒａｍｍ ）中で積分器ビオトｏニック（
Ｂｉｏｔ−ｒｏｎｉｋ ）、システム１を備えたビオト
ロ（Ｂｉｏ−ｔｒｏｎｉｋ ） Ｂ Ｃ６０００；測定
溶液としてピアース（Ｐｉｅｒｃｅ ）社のアミノ酸−
標準■を使用した〕。
ス−メンテン（Ｍｉａｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ ）
法により評価する。実測のＫＭ−及びＶエニー値は表４
に総括しである。光学的試験の障害のために、基質イン
げ−ルビルベート及びｐ−ヒドロキシフェニルピルベー
トの場合には、ｂ−トリプトファンもしくはチロシンへ
の還元的アミノ化は時間の関数としてアミノ酸分析器で
測定した〔１−カラム−プログラム（１−Ｓａｅｕｌｅ
ｎ−ｐｒｏｇｒａｍｍ ）中で積分器ビオトｏニック（
Ｂｉｏｔ−ｒｏｎｉｋ ）、システム１を備えたビオト
ロ（Ｂｉｏ−ｔｒｏｎｉｋ ） Ｂ Ｃ６０００；測定
溶液としてピアース（Ｐｉｅｒｃｅ ）社のアミノ酸−
標準■を使用した〕。
ａ） ＮＡＤ”−ａ度に依るＬ−フェニルアラニンの
酸化的脱アミノ化の反応速度の依存性を次の試験調製物
で検査したニ ゲリシン−ＮａＣ１／ＮａＯＨ−緩衝液（ｐＨ１０，７
）０．１Ｍ、ＩＩ−フェニルアラニン４ｍＭ、限界量の
酵素。ＭＡＤ” −濃度は０−１〜５．０ ｍＭの範囲
で変化した。濃度３ｍＭで最適変換が達成されることが
示された。
酸化的脱アミノ化の反応速度の依存性を次の試験調製物
で検査したニ ゲリシン−ＮａＣ１／ＮａＯＨ−緩衝液（ｐＨ１０，７
）０．１Ｍ、ＩＩ−フェニルアラニン４ｍＭ、限界量の
酵素。ＭＡＤ” −濃度は０−１〜５．０ ｍＭの範囲
で変化した。濃度３ｍＭで最適変換が達成されることが
示された。
ｂ） Ｌ−アミノ酸−濃度に依る酸化的脱アミノ化の
反応速度の依存性は次の試験調製物中で検査され念ニ ゲリシン−ＮａＣ１／ＮａＯＨ−緩衝液（ｐＨ１０，７
）Ｑ、ｉ Ｍ 、 ＮＡＤ ３ ｍＭ 、限界量の酵素
。Ｌ−７ミノ酸−濃度は０．３〜１５ｍＭの範囲で変化
した。
反応速度の依存性は次の試験調製物中で検査され念ニ ゲリシン−ＮａＣ１／ＮａＯＨ−緩衝液（ｐＨ１０，７
）Ｑ、ｉ Ｍ 、 ＮＡＤ ３ ｍＭ 、限界量の酵素
。Ｌ−７ミノ酸−濃度は０．３〜１５ｍＭの範囲で変化
した。
Ｌ−フェニルアラニンに対するＫＭ−値は０．８−であ
る；その他のアミノ酸に対する相応の値は表５に総括し
である。
る；その他のアミノ酸に対する相応の値は表５に総括し
である。
７１ ６ ＝
ＰｈｅＤＨの安定性
株Ｍ４を次の組成の培地１ｏｏｍｔ中で培養する：トウ
モロコシ膨潤水（乾燥粉末）０．２チ、ＫＭ、Ｐｏ４０
−２％、Ｌ−Ｐｈｌｉ１１ｃＩｂ６ＰＨ−値は７．０で
ある。円状振盪機上で２７℃で４０時間の培養後、細胞
を遠心分離により採取し、粒状ガラスで破壊し、細胞粥
状物の遠心分離により細胞上澄液を得る（粗抽出物）。
モロコシ膨潤水（乾燥粉末）０．２チ、ＫＭ、Ｐｏ４０
−２％、Ｌ−Ｐｈｌｉ１１ｃＩｂ６ＰＨ−値は７．０で
ある。円状振盪機上で２７℃で４０時間の培養後、細胞
を遠心分離により採取し、粒状ガラスで破壊し、細胞粥
状物の遠心分離により細胞上澄液を得る（粗抽出物）。
同じ方法で、ブレビバクテリウム・スペックＣＤＳＭ
２４４８ ）の１抽出物を得る。両袖出物中のＰｈｅＤ
Ｈ活性を測定し、次いで４℃及び２２°Ｃで整除数を貯
蔵し、一定の時間後に残留活性を測定する。 ・ ・
表６は、粗抽出物中の株Ｍ４からのＰｈｅＤＨの貯蔵安
定性がブレビバクテリウム・スペックかうのＰｈｅＤＨ
のそれよりも明らかに良好であり、４℃で１週間後にな
お活性９０％が検出可能である。
２４４８ ）の１抽出物を得る。両袖出物中のＰｈｅＤ
Ｈ活性を測定し、次いで４℃及び２２°Ｃで整除数を貯
蔵し、一定の時間後に残留活性を測定する。 ・ ・
表６は、粗抽出物中の株Ｍ４からのＰｈｅＤＨの貯蔵安
定性がブレビバクテリウム・スペックかうのＰｈｅＤＨ
のそれよりも明らかに良好であり、４℃で１週間後にな
お活性９０％が検出可能である。
表６
０−コツカス・スペック ４ ９８ ９３
９３ ９１０ドコツカス・スペック２２ ８４
７４ ６６ ６０プレビペクテリウム・スくツク
４ ７０ ５５ ３０ ２０例
７ 全細胞でのＬ−フェニルアラニンの製造フェニルピルベ
ートの立体特異性反応は微生物−全細胞の使用の猷に同
様に達成される。適当な条件下でフェニルピルベート、
ブドウ糖及びアンモニウム塩を株Ｍ４の細胞と共に培養
する場合に、フェニルアラニンの生成が検知さ粗反応に
必要なＮＡＤＨはその際ブドウ糖代謝の酵素により連続
的に再生される。
９３ ９１０ドコツカス・スペック２２ ８４
７４ ６６ ６０プレビペクテリウム・スくツク
４ ７０ ５５ ３０ ２０例
７ 全細胞でのＬ−フェニルアラニンの製造フェニルピルベ
ートの立体特異性反応は微生物−全細胞の使用の猷に同
様に達成される。適当な条件下でフェニルピルベート、
ブドウ糖及びアンモニウム塩を株Ｍ４の細胞と共に培養
する場合に、フェニルアラニンの生成が検知さ粗反応に
必要なＮＡＤＨはその際ブドウ糖代謝の酵素により連続
的に再生される。
調製物は詳細には次のものを含有する二ＮＨ４Ｃｌ−溶
液ＰＨ７−０（２００ｍＭ ） ２ｍｌ細胞懸濁液（１
ゴ当り湿潤物０．１１Ｉ）３１ＦＬｌデドウＭ！ （２
００ｍｙｔ ） ２ＭＫＨ２ＰＯ４ｐＨ７，０（０，１
Ｍ ） １ ｍｌフェニルビルベー）（５０ｍＭ）２ｍ
／括弧の中に試験における冬成分の最終く濃度が挙げら
れている。酵素膨潤物として、例１に相応して得られた
株Ｍ４の細胞懸濁液を使用した。
液ＰＨ７−０（２００ｍＭ ） ２ｍｌ細胞懸濁液（１
ゴ当り湿潤物０．１１Ｉ）３１ＦＬｌデドウＭ！ （２
００ｍｙｔ ） ２ＭＫＨ２ＰＯ４ｐＨ７，０（０，１
Ｍ ） １ ｍｌフェニルビルベー）（５０ｍＭ）２ｍ
／括弧の中に試験における冬成分の最終く濃度が挙げら
れている。酵素膨潤物として、例１に相応して得られた
株Ｍ４の細胞懸濁液を使用した。
更に比較のために、ブレビバクテリウム・スペックＩ）
ＳＭ ２４４８の細胞を含有する比値せられるｆＪ＠夷
物を培養した。
ＳＭ ２４４８の細胞を含有する比値せられるｆＪ＠夷
物を培養した。
培養は振盪機（１００σ、Ｍ ）上で３０’Ｃで１００
ｍ／入りエルレノマイヤー−フラスコ中テ実施しな。
ｍ／入りエルレノマイヤー−フラスコ中テ実施しな。
種々の時間で試料を取り出し、生成したフェニルアラニ
ンの含量をアミノ酸分析器で測定した。
ンの含量をアミノ酸分析器で測定した。
表７が示すように、両徽生物の細胞は７エ二ルアラニン
を生成し得る：株Ｍ４は７時間後にＰｈｅ ３６−１
μＭｏ１７ａｔ （＝−Ｐｈｅ ５３１ｖ／細菌−湿潤
物ｇ）を生成した；これは使用した基質の６４俤の変換
に相応する。ブレビバクテリウム・スペック（ＤＥＩＭ
２４４８ ）はＰｈｅ １８−５μＭｏ１／ゴを生成
した（ ＝ Ｐｈｏ ４６．１ ｍ９／ ｍ菌−ｉｓ物
ｇ）；これは使用したフェニルピルベートの６７係の変
換に相応する。
を生成し得る：株Ｍ４は７時間後にＰｈｅ ３６−１
μＭｏ１７ａｔ （＝−Ｐｈｅ ５３１ｖ／細菌−湿潤
物ｇ）を生成した；これは使用した基質の６４俤の変換
に相応する。ブレビバクテリウム・スペック（ＤＥＩＭ
２４４８ ）はＰｈｅ １８−５μＭｏ１／ゴを生成
した（ ＝ Ｐｈｏ ４６．１ ｍ９／ ｍ菌−ｉｓ物
ｇ）；これは使用したフェニルピルベートの６７係の変
換に相応する。
表７
０ドコツカス・スペッ／ ２３ ３
５ ５３ブレビバクテリウム・スペック １
５，５ ２７．５ ４６例 ８ ： ＮＡＤＴ（−再生下で無細胞系におけるＬ−フェニルア
ラニンの製造 Ｌ−フェニルアラニンへのフェニルピルベートの立体特
異性反応は無細胞系でフェニルアラニンーデヒドロゲナ
ーゼを用いて実施することができる。反応方程式に相応
して補酵素ＮＡＤＨを添加しなければならない。反応の
際に酸化される補酵素を再生するために、調製物に蟻酸
塩−デヒドロゲナーゼ（Ｅ、Ｃ，Ｌ２．１．２ ）及び
蟻酸塩を添加し、その場合付加的な生成物としてｃｏ、
が得られる。
５ ５３ブレビバクテリウム・スペック １
５，５ ２７．５ ４６例 ８ ： ＮＡＤＴ（−再生下で無細胞系におけるＬ−フェニルア
ラニンの製造 Ｌ−フェニルアラニンへのフェニルピルベートの立体特
異性反応は無細胞系でフェニルアラニンーデヒドロゲナ
ーゼを用いて実施することができる。反応方程式に相応
して補酵素ＮＡＤＨを添加しなければならない。反応の
際に酸化される補酵素を再生するために、調製物に蟻酸
塩−デヒドロゲナーゼ（Ｅ、Ｃ，Ｌ２．１．２ ）及び
蟻酸塩を添加し、その場合付加的な生成物としてｃｏ、
が得られる。
調製物は詳細には次のものを含有する：蟻酸アンモニウ
ム４００ｍＭ（ｐＨ９，２）Ｔｒｔａ−Ｈｃｌｌ ５
［３ｒｒ＊ （ｐＨ９，２）ＮＡＤＨ０，３ｍＭ 蟻酸塩−デヒドロゲナーゼ（クローナ−（Ｋｒｏｎｅｒ
）等著、（１９８２年）、ジャーナル・オデ・ケミカル
・アンドテクニカル・ビオチクノロシイ（Ｊ、 Ｃｈｅ
ｍ、 Ｔｅｃｈ、 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ）第３２巻
、第１６０〜１６７頁による製剤）２ＴＪ／ｖｔｌフエ
ニルアラニンーデヒドｅＩグナーｅ＜ １１゜ｔＴ／９
を有する展剤；表２に依る、第１液体−液体−分配によ
るトップ相： Ｔｏｐ−Ｐｈａｓｅ ） ２Ｕ／ ７ｎ
ｌ フェニルピルペー） ２０ ｍＭ 総容積は２ｒｎｌであり、培養は攪拌下２８°Ｃで行な
われた。生成物の生成はアミノ酸−分析器で追跡された
。
ム４００ｍＭ（ｐＨ９，２）Ｔｒｔａ−Ｈｃｌｌ ５
［３ｒｒ＊ （ｐＨ９，２）ＮＡＤＨ０，３ｍＭ 蟻酸塩−デヒドロゲナーゼ（クローナ−（Ｋｒｏｎｅｒ
）等著、（１９８２年）、ジャーナル・オデ・ケミカル
・アンドテクニカル・ビオチクノロシイ（Ｊ、 Ｃｈｅ
ｍ、 Ｔｅｃｈ、 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ）第３２巻
、第１６０〜１６７頁による製剤）２ＴＪ／ｖｔｌフエ
ニルアラニンーデヒドｅＩグナーｅ＜ １１゜ｔＴ／９
を有する展剤；表２に依る、第１液体−液体−分配によ
るトップ相： Ｔｏｐ−Ｐｈａｓｅ ） ２Ｕ／ ７ｎ
ｌ フェニルピルペー） ２０ ｍＭ 総容積は２ｒｎｌであり、培養は攪拌下２８°Ｃで行な
われた。生成物の生成はアミノ酸−分析器で追跡された
。
次の表は、９０分間後に生成物１９ｍＭが生じたことを
示す（変換率９６チ）。
示す（変換率９６チ）。
表：無細胞系におけるＬ−フェニルアラニンへのフェニ
ルピルベートの変換（変換率＝使用したフェニルピルベ
ートに対して） 時間（分） Ｌ−ＰｈｅｍＭ 変換率（チ
）１５ ７．４ ５７３０
１２、８ ６４６０ １６
．８ ８４９０ １９、１
９６
ルピルベートの変換（変換率＝使用したフェニルピルベ
ートに対して） 時間（分） Ｌ−ＰｈｅｍＭ 変換率（チ
）１５ ７．４ ５７３０
１２、８ ６４６０ １６
．８ ８４９０ １９、１
９６
第１図は本発明によるフェニルアラニンデヒドロビナ−
ぜ（Ｍ４）における−値と反応及び逆反応との関係を示
す曲線図であり、第２図は１．５１醗酵槽中でのロドコ
ッカス・スペックＭ４からのフェニルアラエンーデヒド
ロデナーゼの生産と−との関係を示す曲線図である。
ぜ（Ｍ４）における−値と反応及び逆反応との関係を示
す曲線図であり、第２図は１．５１醗酵槽中でのロドコ
ッカス・スペックＭ４からのフェニルアラエンーデヒド
ロデナーゼの生産と−との関係を示す曲線図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼを含有するロ
ドコッカス属の微生物。 ２、ロドコッカス・スペックＭ４（Ｒｈｏｄｏｃｃｕｓ
ｓｐｅｃＭ４）（ＤＳＭ３０４１）である特許請求の
範囲第１項記載の微生物。 ３、ロドコッカス・スペックＩ３（Ｒｈｏｄｏｃｃｕｓ
ｓｐｅｃＩ３）（ＤＳＭ３０４０）である特許請求の
範囲第１項記載の微生物。 ４、炭素、窒素及び鉱酸塩のための給源及びチアミンを
含有する水性培地中で微生物−含有試料を好気性培養す
ることによりフェニルアラニン−デヒドロゲナーゼを含
有する微生物を収得するために、試料を先ずアルカリ金
属プロピオン酸塩０．１〜０．５ｇ／ｌ含有の培地中で
培養し、引続き生じた典型コロニーを、誘導物質を含有
する培地上に接種し、培養し、かつ両方の培地中に成長
する微生物を選択することを特徴とするフェニルアラニ
ン−デヒドロゲナーゼを含有する微生物の収得法。 ５、ロドコッカス属菌を培養し、かつ誘導物質としてＬ
−フェニルアラニン又はＬ−フェニルアラニンアミドを
使用する特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６、フェニルピルベート、ｐ−ヒドロキシフェニルピル
ベート、インドリルピルベート又は２−ケト−４−（メ
チルメルカプト）酪酸を還元的アミノ化して相応するＬ
−α−アミノ酸にするために、ロドコッカス・スペック
Ｍ４（Ｒｈｏｄｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃＭ４）（ＤＳＭ３
０４１）又はロドコッカス・スペックＩ３（Ｒｈｏｄｏ
ｃｃｕｓ ｓｐｅｃＩ３）（ＤＳＭ３０４０）のロドコ
ッカス属菌を使用することを特徴とするＬ−α−アミノ
酸の製法。 ７、ロドコッカス・スペックＭ４（Ｒｂｏｄｏｃｃｕｓ
ｓｐｅｃＭ４）（ＤＳＭ３０４１）又はロドコッカス
・スペックＩ３（Ｒｈｏｄｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃＩ３）
（ＤＳＭ３０４０）のロドコッカス属菌から得られるフ
ェニルアラニン−デヒドロゲナーゼ。 ８、フェニルピルベート、ｐ−ヒドロキシフェニルピル
ベート、インドリルピルベート又は２−ケト−４−（メ
チルメルカプト）−酪酸の還元的アミノ化により相応す
るＬ−α−アミノ酸を得るために、ロドコッカス・スペ
ックＭ４（Ｒｈｏｄｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃＭ４）（ＤＳ
Ｍ３０４１）又はロドコッカス・スペックＩ３（Ｒｈｏ
ｄｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃＩ３）（ＤＳＭ３０４０）のロ
ドコッカス属菌から得られるフェニルアラニン−デヒド
ロゲナーゼを使用することを特徴とするＬ−α−アミノ
酸の製法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3446304.6 | 1984-12-19 | ||
| DE19843446304 DE3446304A1 (de) | 1984-12-19 | 1984-12-19 | Verfahren zur gewinnung von phenylalanin-dehydrogenase enthaltenden mikroorganismen, mikroorganismen, die in ihnen enthaltene phenylalanin-dehydrogenase und deren verwendung zur herstellung von l-(alpha)-aminosaeuren |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61146183A true JPS61146183A (ja) | 1986-07-03 |
| JPH069504B2 JPH069504B2 (ja) | 1994-02-09 |
Family
ID=6253196
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60284510A Expired - Lifetime JPH069504B2 (ja) | 1984-12-19 | 1985-12-19 | フェニルアラニン―デヒドロゲナーゼを含有するロドコッカス・スペック及びその取得法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5416019A (ja) |
| EP (1) | EP0188712B1 (ja) |
| JP (1) | JPH069504B2 (ja) |
| DE (2) | DE3446304A1 (ja) |
| DK (1) | DK576985A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63157986A (ja) * | 1986-08-12 | 1988-06-30 | Sagami Chem Res Center | 遺伝子組換によるｌ−フエニルアラニンの製造方法 |
| WO2010067578A1 (ja) | 2008-12-09 | 2010-06-17 | 株式会社カネカ | 新規なアミノ酸脱水素酵素、およびｌ－アミノ酸、２－オキソ酸、又はｄ－アミノ酸の製造方法 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4849345A (en) * | 1985-04-17 | 1989-07-18 | Sagami Chemical Research Center | L-phenylalanine dehydrogenase and use thereof |
| DE4029296A1 (de) * | 1990-09-17 | 1992-03-19 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren und anordnung zur enzymatischen bestimmung von substanzen mit nichtendstaendigen nad(pfeil hoch)+(pfeil hoch)-abhaengig enzymatisch umsetzbaren gruppen, insb. von aspartam |
| GB9321764D0 (en) * | 1993-10-21 | 1993-12-15 | Health Lab Service Board | Phenylalanine dehydrogenase production |
| DE10054492A1 (de) * | 2000-11-03 | 2002-05-16 | Degussa | Reduktive Aminierung von alpha-Ketodicarbonsäurederivaten |
| DE10055512A1 (de) * | 2000-11-09 | 2002-05-23 | Degussa | L-Aminosäure-Oxidase aus Rhodococcus-Arten |
| DE10337614A1 (de) * | 2003-08-16 | 2005-03-17 | Degussa Ag | Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren |
| US9755705B2 (en) * | 2008-08-07 | 2017-09-05 | Qualcomm Incorporated | Method and apparatus for supporting multi-user and single-user MIMO in a wireless communication system |
| JP5741099B2 (ja) * | 2010-03-25 | 2015-07-01 | 住友化学株式会社 | 含硫アミノ酸またはその塩の製造方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3036958A (en) * | 1959-03-17 | 1962-05-29 | Ajinomoto Kk | Process for producing l-tryptophan from 3-indolepyruvic acid |
| US3660235A (en) * | 1969-08-22 | 1972-05-02 | Ajinomoto Kk | Method for producing phenylalanine by fermentation |
| JPS5335152B1 (ja) * | 1971-03-09 | 1978-09-26 | ||
| DE2930070A1 (de) * | 1979-07-25 | 1981-02-19 | Biotechnolog Forschung Gmbh | Verfahren zur kontinuierlichen enzymatischen umwandlung von wasserloeslichen alpha -ketocarbonsaeuren in die entsprechenden aminosaeuren |
| DE3307094A1 (de) * | 1983-03-01 | 1984-09-06 | Degussa Ag, 6000 Frankfurt | Verfahren zur kontinuierlichen enzymatischen umwandlung von (alpha)-hydroxycarbonsaeuren in entsprechende optisch aktive (alpha)-aminocarbonsaeuren |
| DE3307095A1 (de) * | 1983-03-01 | 1984-09-06 | Degussa Ag, 6000 Frankfurt | Mikrobiologisch hergestellte l-phenylalanin-dehydrogenase, verfahren zu ihrer gewinnung und ihre verwendung |
-
1984
- 1984-12-19 DE DE19843446304 patent/DE3446304A1/de active Granted
-
1985
- 1985-12-03 DE DE8585115344T patent/DE3575743D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-03 EP EP85115344A patent/EP0188712B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-12 DK DK576985A patent/DK576985A/da not_active Application Discontinuation
- 1985-12-19 JP JP60284510A patent/JPH069504B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-01-26 US US08/186,501 patent/US5416019A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63157986A (ja) * | 1986-08-12 | 1988-06-30 | Sagami Chem Res Center | 遺伝子組換によるｌ−フエニルアラニンの製造方法 |
| WO2010067578A1 (ja) | 2008-12-09 | 2010-06-17 | 株式会社カネカ | 新規なアミノ酸脱水素酵素、およびｌ－アミノ酸、２－オキソ酸、又はｄ－アミノ酸の製造方法 |
| JPWO2010067578A1 (ja) * | 2008-12-09 | 2012-05-17 | 株式会社カネカ | 新規なアミノ酸脱水素酵素、およびｌ−アミノ酸、２−オキソ酸、又はｄ−アミノ酸の製造方法 |
| JP2015126752A (ja) * | 2008-12-09 | 2015-07-09 | 株式会社カネカ | 新規なアミノ酸脱水素酵素、およびｌ−アミノ酸、２−オキソ酸、又はｄ−アミノ酸の製造方法 |
| US9267116B2 (en) | 2008-12-09 | 2016-02-23 | Kaneka Corporation | Amino acid dehydrogenase, and process for producing L-amino acid, 2-oxo acid or D-amino acid |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK576985D0 (da) | 1985-12-12 |
| EP0188712B1 (de) | 1990-01-31 |
| DE3575743D1 (de) | 1990-03-08 |
| US5416019A (en) | 1995-05-16 |
| JPH069504B2 (ja) | 1994-02-09 |
| EP0188712A1 (de) | 1986-07-30 |
| DE3446304C2 (ja) | 1992-01-02 |
| DK576985A (da) | 1986-06-20 |
| DE3446304A1 (de) | 1986-07-10 |
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