WO2010067578A1 - 新規なアミノ酸脱水素酵素、およびｌ－アミノ酸、２－オキソ酸、又はｄ－アミノ酸の製造方法 - Google Patents

新規なアミノ酸脱水素酵素、およびｌ－アミノ酸、２－オキソ酸、又はｄ－アミノ酸の製造方法 Download PDF

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dna
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金丸博幸
三木隆二
上田真
難波弘憲
八十原良彦
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株式会社カネカ
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Definitions

  • the present invention relates to a novel amino acid dehydrogenase produced by a microorganism, a DNA encoding the same, a method for producing an amino acid dehydrogenase using a microorganism or transformant having the ability to produce an amino acid dehydrogenase,
  • the present invention relates to an efficient method for producing an L-amino acid, 2-oxoacid, or D-amino acid using an amino acid dehydrogenase.
  • An amino acid dehydrogenase is an enzyme that catalyzes a reaction that reductively aminates 2-oxoacid in a coenzyme-dependent manner and a reaction that oxidatively deaminates an amino acid, which is the reverse reaction.
  • industrially useful activities such as the production of L-amino acids with high stereoselectivity from 2-oxoacids in the presence of ammonia and coenzymes.
  • L-amino acids are useful as synthetic intermediates for foods, feeds, agricultural chemicals, industrial chemicals, cosmetics and pharmaceuticals, and are also important as optical resolution agents and chiral building block agents in organic synthesis.
  • amino acid dehydrogenases examples include phenylalanine dehydrogenase (enzyme number [EC1.4.1.20]) and leucine dehydrogenase (enzyme number [EC1.4.1.9]).
  • microorganisms that produce phenylalanine dehydrogenase include Rhodococcus sp. (Patent Document 1), Rhodococcus maris (Non-patent Document 1), Bacillus Badius (Patent Document 2), Bacillus sphaericus (Non-patent document 2), Microbacterium sp.
  • Non-patent document 3 Thermoactinomyces intermedius (Patent document 3), Brevibacterium sp ( Microorganisms such as Brevibacterium sp. (Patent Document 4) and Sporosarcina ureae (Patent Document 5, Non-Patent Document 4) are known.
  • Amino acid dehydrogenases are classified according to the type of compound that the enzyme is likely to act on. For example, leucine dehydrogenase works well with branched chain amino acids such as L-leucine, L-valine, and L-isoleucine, short-chain linear amino acids such as L-norvaline, and their corresponding 2-oxo acids. However, it has little effect on aromatic amino acids such as L-phenylalanine and L-tyrosine and their corresponding 2-oxoacids.
  • phenylalanine dehydrogenase is known to act well on the above-mentioned aromatic amino acids and their corresponding 2-oxoacids such as phenylpyruvic acid and 4-hydroxyphenylpyruvic acid.
  • hitherto known phenylalanine dehydrogenase is not suitable for 2-oxoacids having a larger side chain than phenylpyruvic acid, such as naphthylpyruvic acid or homophenylpyruvic acid.
  • the activity is weak (Non Patent Literature 2, Non Patent Literature 3).
  • Unnatural amino acids such as L-2-naphthylalanine and L-homophenylalanine are useful as synthetic intermediates for agricultural chemicals, industrial chemicals, cosmetics and pharmaceuticals.
  • Non-patent Document 5 Rhodococcus sp.
  • Non-patent Document 6 Bacillus Badius
  • Bacillus sp. sphaericus Bacillus sp. sphaericus
  • Sporosarcina ureae Patent document 6
  • Thermoactinomyces intermedius Non-patent document 8
  • a phenylalanine dehydrogenase derived from Rhodococcus sp., Bacillus sphaericus, or Thermoactinomyces intermedius and an enzyme with coenzyme reactivation ability are converted into 2-oxoacids. Reactions that are converted to L-amino acids are already known (Patent Document 1, Non-Patent Document 9, Non-Patent Document 10). Also, glutamic acid dehydrogenase derived from bovine liver or leucine dehydrogenase derived from Clostridium thermoaceticum, D-amino acid oxidase and an enzyme capable of coenzyme regeneration are allowed to act on racemic amino acids. A reaction for converting an amino acid into an L-amino acid via 2-oxo acid or imino acid is already known (Non-Patent Document 10 and Non-Patent Document 11).
  • the object of the present invention is to deal with 2-oxoacids such as naphthylpyruvic acid and homophenylpyruvic acid, which have low reactivity with the conventionally known amino acid dehydrogenase, in addition to phenylpyruvic acid.
  • Another object is to provide a novel amino acid dehydrogenase having high activity.
  • Another object of the present invention is to clarify the amino acid sequence of the amino acid dehydrogenase, the DNA sequence of the gene, a microorganism or transformant capable of producing the enzyme, and the amino acid dehydrogenase using the same. It is in providing the manufacturing method of.
  • a further object of the present invention is to provide an efficient method for producing L-amino acids, 2-oxoacids or D-amino acids using the amino acid dehydrogenase.
  • the present inventors have extensively searched for microorganisms having amino acid dehydrogenase activity from soil.
  • a new bacterium belonging to the genus Rhodococcus that highly produces amino acid dehydrogenase having excellent novel properties is newly obtained. separated.
  • amino acid dehydrogenase was isolated and purified from the microorganism, and the amino acid dehydrogenase gene was isolated and expressed in the host microorganism.
  • amino acid dehydrogenase obtained in the present invention is allowed to act on 2-oxo acid, racemic amino acid, or L-amino acid alone or in combination with an enzyme having coenzyme regeneration ability, thereby allowing L-amino acid, 2-amino acid, Oxo acids or D-amino acids can be produced, and the present invention has been completed.
  • an L-amino acid can be produced by combining the amino acid dehydrogenase obtained in the present invention with a racemic amino acid or a D-amino acid in combination with a D-amino acid oxidase and an enzyme having coenzyme re-performance. The present invention has been completed.
  • the present invention has one or more of the following features.
  • the present invention is the following DNA (a), (b), (c), (d), (e) or (f): (a) DNA encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (b) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, inserted, deleted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having amino acid dehydrogenase activity DNA to do (c) DNA encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence having 70% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and having amino acid dehydrogenase activity (d) DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing (e) a polypeptide having a base sequence in which one or several bases are substituted, inserted, deleted and / or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having amino acid dehydrogenas
  • the present invention is the following polypeptide (g), (h) or (i): (g) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing (h) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, inserted, deleted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having amino acid dehydrogenase activity (i) A polypeptide comprising an amino acid sequence having 70% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having amino acid dehydrogenase activity.
  • the present invention is a polypeptide having amino acid dehydrogenase activity, which is represented by the general formula (1)
  • R ′ has an optionally substituted alkyl group having 5 to 20 carbon atoms, an optionally substituted alkenyl group having 5 to 20 carbon atoms, and a substituent. And an alkynyl group having 5 to 20 carbon atoms, an aryl group having 4 to 20 carbon atoms which may have a substituent, or an aralkyl group having 5 to 20 carbon atoms which may have a substituent.
  • X represents a hydrogen atom, an alkali metal or an alkaline earth metal.
  • the present invention is the above polypeptide, wherein in the general formula (1), R ′ is an indolylmethyl group or a phenylethyl group. 5) The present invention is the above polypeptide which is derived from Rhodococcus.
  • the present invention is a recombinant plasmid containing the DNA.
  • the present invention is a transformant obtained by transforming a host microorganism with the recombinant plasmid. 8) The present invention is a transformant obtained by transforming the above DNA and a DNA encoding a chaperone.
  • the present invention is a microorganism having the ability to produce the polypeptide and belonging to the genus Rhodococcus.
  • the present invention is a method for producing an amino acid dehydrogenase in which a microorganism having the ability to produce the polypeptide is cultured, the polypeptide is accumulated in the culture, and the polypeptide is collected.
  • the present invention relates to the polypeptide (polypeptide having amino acid dehydrogenase activity), the transformant, or the microorganism represented by the general formula (2)
  • R may have an optionally substituted alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, an optionally substituted alkenyl group having 2 to 20 carbon atoms, or an optionally substituted group.
  • X represents a hydrogen atom, an alkali metal or an alkaline earth metal).
  • the present invention relates to the polypeptide (polypeptide having amino acid dehydrogenase activity), transformant, or microorganism in the presence of D-amino acid oxidase.
  • R and X are as defined above, or a general formula (5)
  • the present invention relates to the polypeptide (polypeptide having amino acid dehydrogenase activity), transformant, or microorganism, General formula (3)
  • the present invention has the above-described configuration, and can efficiently produce a novel amino acid dehydrogenase exhibiting high reactivity with a substrate that has been reported to be less reactive with previously reported amino acid dehydrogenases.
  • L-amino acid, 2-oxoacid, or D-amino acid can be efficiently produced by using the amino acid dehydrogenase, a transformant that produces the amino acid dehydrogenase, or a microorganism. it can.
  • FIG. 1 is a graph showing the relationship (including optimum temperature) between the working temperature and relative activity of an amino acid dehydrogenase as an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the relationship (including optimum pH) between the working pH and relative activity of the amino acid dehydrogenase as an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing the structure of a recombinant plasmid pRPD002 containing an amino acid dehydrogenase gene as an embodiment of the present invention.
  • polypeptide as an embodiment of the present invention will be described.
  • the polypeptide as an embodiment is a polypeptide having amino acid dehydrogenase activity, and has the following physicochemical properties.
  • 2-oxoacid is reductively aminated to produce an L-amino acid.
  • L-amino acid is oxidatively deaminated in the presence of a coenzyme to produce 2-oxo acid and ammonia.
  • Temperature range at least about 5 ° C to about 70 ° C
  • Optimal temperature about 45 ° C to about 50 ° C
  • the temperature range is a temperature range in which the enzyme suitably acts, and the optimum temperature is a temperature at which the enzyme acts most favorably. This enzyme also acts at temperatures outside the above temperature range.
  • Range of working pH pH range at least about 7.1 to about 11.0 An optimum pH of about 8.8 to about 10.0;
  • the pH range is a pH range in which the enzyme preferably acts, and the optimum pH is a pH at which the enzyme acts most suitably. This enzyme acts even at a pH outside the above range.
  • Specific activity) 204 units (30 ° C.) per mg of pure enzyme. The amount of enzyme that consumes 1 ⁇ mol of NADH per minute is defined as 1 unit.
  • phenylpyruvic acid has higher activity against 2-oxoacids having a large side chain structure such as naphthylpyruvic acid, indolepyruvic acid, or homophenylpyruvic acid.
  • the high activity here means having an activity of 1/50 or more, preferably 1/25 or more, more preferably 1/10 or more of the activity with respect to phenylpyruvic acid.
  • the 2-oxo acid having a structure having a large side chain means that, in the general formula (1), R ′ has an optionally substituted alkyl group having 5 to 20 carbon atoms or a substituent.
  • the alkyl group having 5 to 20 carbon atoms which may have a substituent in R ′ is not particularly limited, and examples thereof include a pentanyl group, a hexanyl group, a heptanyl group, and an octanyl group.
  • the alkenyl group having 5 to 20 carbon atoms which may have a substituent is not particularly limited, and examples thereof include a pentenyl group, a hexenyl group, a heptenyl group, and an octenyl group.
  • the alkynyl group having 5 to 20 carbon atoms which may have a substituent is not particularly limited, and examples thereof include a pentynyl group, a hexynyl group, a heptynyl group, and an octynyl group.
  • the aryl group having 4 to 20 carbon atoms which may have a substituent is not particularly limited, and examples thereof include a phenyl group, a 4-hydroxyphenyl group, an anthranyl group, a pyridyl group, a pyrimidyl group, an indanyl group, and an indenyl group. Or a naphthyl group.
  • the aralkyl group having 5 to 20 carbon atoms which may have a substituent is not particularly limited, and examples thereof include an indolylmethyl group, a naphthylmethyl group, an anthranylmethyl group, an indanylmethyl group, an indenylmethyl group, Examples include phenylethyl group, phenylpropyl group, phenylbutyl group, diphenylmethyl group and the like.
  • substituents examples include an amino group, a hydroxyl group, a nitro group, a cyano group, a carboxyl group, an alkyl group, an aralkyl group, an aryl group, an alkanoyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an alkoxyl group, and a halogen atom.
  • X represents a hydrogen atom, an alkali metal or an alkaline earth metal, and is not particularly limited. Examples thereof include a hydrogen atom, lithium, sodium, potassium, magnesium, and calcium.
  • the amino acid dehydrogenase of the embodiment is classified into phenylalanine dehydrogenase (enzyme number [EC1.4.1.20]) based on its substrate specificity. Compared with other phenylalanine dehydrogenases, it has the following different properties, for example.
  • Patent Document 1 Phenylalanine dehydrogenase of Rhodococcus sp.
  • Patent Document 5 which is a homotetrameric structure consisting of subunits with a molecular weight of 39,500, is the molecular weight and structure of the enzyme. to differ greatly.
  • the amino acid sequence is also greatly different (amino acid sequence identity 66.9%). Further, assuming that the enzyme activity for phenylpyruvic acid is 100, the enzyme activities for indolepyruvic acid and 4-hydroxypyruvic acid are 3 and 5, respectively, and the ratio of the enzyme activity is greatly different.
  • the molecular weight of the enzyme is greatly different from the phenylalanine dehydrogenase of Rhodococcus maris (Non-patent Document 1), which is a homodimeric structure composed of subunits with a molecular weight of 36,000. Further, when the enzyme activity for phenylpyruvic acid is 100, the enzyme activities for indolepyruvic acid and 2-oxo-4- (methylthio) butanoic acid are 5 and 9, respectively, and the ratio of the enzyme activity is greatly different.
  • Non-patent document 2 Phenylalanine dehydrogenase of Bacillus iusbadius
  • Non-patent document 6 which is a homooctameric structure composed of subunits having a molecular weight of 41,000 to 42,000, is an enzyme Molecular weight and structure vary greatly. The amino acid sequence also varies greatly (amino acid sequence identity 36.1%).
  • Phenylalanine dehydrogenase of Bacillus sphaericus (Non-patent document 2, Non-patent document 7), which is a homo-octameric structure composed of subunits with a molecular weight of 39,000, is the molecular weight and structure of the enzyme. to differ greatly.
  • the amino acid sequence is also greatly different (amino acid sequence identity 36.6%).
  • the enzyme activity for phenylpyruvic acid is 100
  • the enzyme activities for naphthylpyruvic acid, homophenylpyruvic acid, and indolepyruvic acid are 0.46, 3.4, and 0.39, respectively.
  • Patent Document 3 The phenylalanine dehydrogenase of Thermoactinomyces intermedius (Patent Document 3, Non-Patent Document 8), which is a homohexameric structure composed of subunits having a molecular weight of 41,000, is the molecular weight of the enzyme. And the structure is very different.
  • the amino acid sequence also varies greatly (amino acid sequence identity 32.9%). Furthermore, assuming that the enzyme activity for phenylpyruvic acid is 100, the enzyme activity for 4-hydroxyphenylpyruvic acid is 0, and the ratio of enzyme activity is greatly different.
  • the molecular weight of the enzyme is significantly different from the phenylalanine dehydrogenase of Brevibacterium sp. (Patent Document 4), which is a homodimeric structure composed of subunits having a molecular weight of 66,000 ⁇ 5000. In addition, the specific activity of pure enzymes is also greatly different.
  • the molecular weight and structure of the enzyme are different from the phenylalanine dehydrogenase of Sporosarcina ureae (Patent Document 5, Non-Patent Document 4), which is a homooctameric structure composed of subunits with a molecular weight of 39,000. .
  • the amino acid sequence is also greatly different (amino acid sequence identity 35.4%).
  • the enzyme activity with respect to phenylpyruvic acid is set to 100, the enzyme activity with respect to indolepyruvic acid is 0.73, and the ratio of enzyme activity is greatly different.
  • sequence identity in the embodiment can be determined using a method well-known to those skilled in the art, sequence analysis software, and the like.
  • sequence analysis software and the like.
  • GENETYX Ver The homology search of 7 Genetic Information Processing Software / Windows version (Genetics) was used.
  • the measurement of the amino acid dehydrogenase activity of a polypeptide is performed, for example, by adding 0.1 ml of 0.1 M sodium carbonate buffer (pH 9.0) containing 10 mM of the substrate phenylpyruvic acid to 0.1 ml. 1.2 ml of 5 M NH 3 / NH 4 Cl buffer (pH 9.0), 0.2 ml of 0.1 M sodium carbonate buffer (pH 9.0) containing 3 mM coenzyme NADH, and 0.1 ml of appropriately diluted enzyme solution Can be calculated from the rate of decrease in absorbance at a wavelength of 340 nm when reacted at 30 ° C. for 1 minute. In the embodiment, amino acid dehydrogenase activity was measured using this method unless otherwise specified.
  • the polypeptide of the embodiment can be obtained from a microorganism having amino acid dehydrogenase activity.
  • a microorganism having amino acid dehydrogenase activity for example, the microorganisms which belong to Rhodococcus (Rhodococcus) genus are mentioned, Rhodococcus kingshengi (Rhodococcus qingshengii) is especially preferable, Rhodococcus kingshengi (Rhodococcus qingshengii) KNK2108 strain It is.
  • Rhodococcus iiqingshengii strain KNK2108 is a strain isolated and obtained by the inventors in the present invention, and is incorporated by reference number FERM BP-11067 on November 26, 2008, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Deposited at the Patent Biological Depositary Center (Tsukuba Center Chuo 6th, 1-1 1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, 305-8565)
  • the KNK2108 strain was identified as Rhodococcus qingshengii.
  • the microorganism that produces the polypeptide of the embodiment may be a wild strain of the above-described microorganism, or may be a mutant strain improved in mutation. Mutant strains can be obtained by methods well known to those skilled in the art, such as UV irradiation and treatment with drugs such as N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) and ethylmethanesulfonate (EMS). it can.
  • NTG N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine
  • EMS ethylmethanesulfonate
  • the medium for culturing the microorganism producing the polypeptide of the present invention is not particularly limited as long as the microorganism can grow.
  • a carbon source sugars such as glucose and sucrose, alcohols such as ethanol and glycerol, fatty acids such as oleic acid and stearic acid and esters thereof, oils such as rapeseed oil and soybean oil, and ammonium sulfate as a nitrogen source , Sodium nitrate, peptone, casamino acid, corn steep liquor, bran, yeast extract, etc.
  • inorganic salts magnesium sulfate, sodium chloride, calcium carbonate, dipotassium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, etc. as other nutrient sources
  • Ordinary liquid media containing malt extract, meat extract and the like can be used.
  • a substance that enhances the production of amino acid dehydrogenase for example, an amino acid or an amino acid derivative may be added in a small amount.
  • concentration of these amino acid dehydrogenase production-enhancing substances in the medium is selected from the range of 0.001% by weight to 10% by weight, preferably 0.01% by weight to 1% by weight.
  • the culture is usually performed aerobically, and the temperature ranges from 10 ° C. to 60 ° C., preferably from 20 ° C. to 50 ° C., and the pH ranges from 3 to 11, preferably from 5 to 9.
  • the culturing time can be about 1 day or more and 5 days or less.
  • either a batch or continuous culture method may be used.
  • the polypeptide of the present invention can be obtained by purifying the crude enzyme solution by a salting-out method, a column chromatography method or the like.
  • the polypeptide of the present invention may be a natural enzyme obtained from a microorganism as described above, or may be a recombinant enzyme produced using a gene recombination technique.
  • Examples of the natural enzyme include the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the polypeptide as an embodiment of the present invention comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, inserted, deleted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 It may be a polypeptide having dehydrogenase activity, and 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, more preferably the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. May be a polypeptide having an amino acid sequence having a homology of 99% or more and having amino acid dehydrogenase activity.
  • severe amino acids is not limited as long as the amino acid dehydrogenase activity is not lost, but is, for example, 25 amino acids or less, preferably 20 amino acids or less, more preferably 15 amino acids or less, and still more preferably No more than 10 amino acids, most preferably no more than 5, 4, 3, or 2.
  • polypeptide having amino acid dehydrogenase activity is 10% or more, preferably 40% or more when the polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is used under the above activity measurement conditions. More preferably, it refers to a polypeptide having an activity of 60% or more, more preferably 80% or more.
  • DNA “DNA” as an embodiment of the present invention will be described.
  • the DNA of the present invention may be any DNA that encodes a polypeptide as described above. It may be the DNA represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, or a base sequence in which one or several bases are substituted, inserted, deleted and / or added in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 It may be a DNA encoding a polypeptide having and having amino acid dehydrogenase activity.
  • the “several bases” is not limited as long as the polypeptide encoded by DNA does not lose amino acid dehydrogenase activity, but is preferably 50 bases or less, more preferably 30 bases or less, More preferably, it is 20 bases or less, and most preferably 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, or 2 or less.
  • nucleotide sequence having 70% or more, preferably 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, more preferably 99% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • a DNA encoding a polypeptide having amino acid dehydrogenase activity is also included in the nucleotide sequence.
  • the DNA of the present invention includes a polypeptide that hybridizes under stringent conditions to a DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and has amino acid dehydrogenase activity. It may be DNA that encodes.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions to DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 means colony hybridization, plaque hybridization, or Southern. This refers to DNA that can specifically form a hybrid with DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing when the hybridization method or the like is carried out.
  • stringent conditions include, for example, 75 mM trisodium citrate, 750 mM sodium chloride, 0.5% sodium dodecyl sulfate, 0.1% bovine serum albumin, 0.1% polyvinylpyrrolidone, and 0.1
  • the conditions under which cleaning is performed at 60 ° C. are used.
  • washing is performed at 65 ° C.
  • the washing is performed at 65 ° C. using an aqueous solution composed of 1.5 mM trisodium citrate, 15 mM sodium chloride, and 0.1% sodium dodecyl sulfate.
  • the DNA (amino acid dehydrogenase gene) of the present invention can be obtained from a microorganism having amino acid dehydrogenase activity as described above.
  • the following method can be used.
  • the amino acid sequence at the N-terminal of amino acid dehydrogenase purified from a microorganism having amino acid dehydrogenase activity is determined using a gas phase protein sequencer or the like.
  • the purified amino acid dehydrogenase is allowed to act on a protease such as V8 protease to digest it into a polypeptide of an appropriate size, and then the polypeptide obtained using HPLC or the like is purified, and the same method as above Determine the internal amino acid sequence according to A DNA primer designed based on the N-terminal amino acid sequence thus obtained and the internal amino acid sequence is synthesized.
  • chromosomal DNA is isolated from the microorganism that is the source of the amino acid dehydrogenase.
  • Chromosomal DNA is obtained from cultured cells using UltraClean® Microbial® DNA® Isolation® Kit (MO® BIO® Laboratories, Inc.). Using this chromosomal DNA as a template and performing PCR using the above DNA primers, a part of the target gene can be obtained.
  • DNA fragments encoding the N-terminal side and C-terminal side of the already acquired partial gene can be acquired by inverse PCR (see, for example, Nucleic® Acids® Res., Vol.16, p8186 (1988)). ).
  • a DNA primer was prepared based on the base sequence of the DNA estimated to be upstream from the DNA encoding the N-terminus of the enzyme and downstream from the DNA encoding the C-terminus.
  • a DNA fragment containing the full length of the target amino acid dehydrogenase gene can be obtained by amplifying the interstitial DNA by PCR using the previously obtained chromosomal DNA as a template.
  • a recombinant plasmid can be obtained by combining the obtained DNA fragment containing the amino acid dehydrogenase gene with vector DNA and T4 DNA ligase or the like.
  • the base sequence of the DNA fragment containing the amino acid dehydrogenase gene inserted into the vector was analyzed, and it was confirmed that there was a base encoding the N-terminal amino acid sequence of the amino acid dehydrogenase and the internal amino acid sequence.
  • the open reading frame is determined by confirming the translation start site and stop codon.
  • Transformant / vector By using the DNA obtained by the above method or a recombinant plasmid obtained by incorporating the DNA into a vector, a host microorganism can be transformed to obtain a transformant.
  • the host-vector system described in “Recombinant DNA Experiment Guidelines” (Science and Technology Agency, Research and Development Bureau, Life Science Division, revised on March 22, 1996) can be used.
  • a microorganism belonging to the genus (Rhodococcus) can be used.
  • the vector can be a microorganism-derived plasmid, phage or derivative thereof that can autonomously replicate in the host.
  • Escherichia coli as a host microorganism and a vector capable of autonomous replication in the microorganism as a vector.
  • examples of such vectors include pUC18, pUC19, pBR322, pACYC184, pSTV28, pSTV29, pSC101, pT7Blue, or pUCNT, or derivatives thereof.
  • These derivatives are modified genes for promoters, terminators, enhancers, SD sequences, replication initiation sites (ori), other regulation, etc., for the purpose of increasing enzyme production and stabilizing plasmids.
  • Drug resistance refers to a modified restriction enzyme site at the cloning site.
  • the produced enzyme may become insoluble and form an inclusion body.
  • insolubilization of the enzyme may be avoided by changing the culture conditions, changing the host microorganism, or simultaneously expressing the target gene and the chaperone gene in the host microorganism.
  • a chaperone is a protein that plays a role in assisting protein folding into a normal three-dimensional structure in a living body (see, for example, Appl. Biochem. Biotech., Vol. 66, pp 197-238 (1997)).
  • a recombinant plasmid pRPD002 in which a DNA obtained as described above from Rhodococcus qingshengii KNK2108 strain is incorporated into pUCT (a plasmid vector in which the NdeI site of pUCNT (see WO94 / 03613) is disrupted) is incorporated.
  • pUCT a plasmid vector in which the NdeI site of pUCNT (see WO94 / 03613) is disrupted
  • Escherichia coli HB101 The bacteriological properties of Escherichia coli HB101 are described in “BIOCHEMICALS FOR LIFE SCIENCE” (Toyobo Co., Ltd., 1993, pp. 116-119) and various other known literatures and are well known to those skilled in the art. It is. Escherichia coli HB101 (pRPD002) has the same mycological properties as Escherichia coli HB101 except that it can produce a specific enzyme by genetic recombination.
  • the culture of microorganisms may be performed using a normal medium.
  • the medium used for the culture may be a normal medium containing nutrients such as a carbon source, a nitrogen source and inorganic salts.
  • nutrients such as a carbon source, a nitrogen source and inorganic salts.
  • organic micronutrients such as vitamins and amino acids are added to this, favorable results are often obtained.
  • the carbon source carbohydrates such as glucose and sucrose, organic acids such as acetic acid, alcohols and the like are appropriately used.
  • the nitrogen source ammonium salt, aqueous ammonia, ammonia gas, urea, yeast extract, peptone, corn steep liquor and the like are used.
  • inorganic salts include phosphate, magnesium salt, potassium salt, sodium salt, calcium salt, iron salt, sulfate, chlorine and the like.
  • Cultivation can be performed in a temperature range of 25 ° C to 40 ° C, with 25 ° C to 37 ° C being particularly preferred.
  • the pH can be cultured from 4 to 8, but preferably from 5 to 7.5.
  • either a batch or continuous culture method may be used.
  • treatment for enzyme induction such as addition of isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galactoside (IPTG) or lactose can be performed.
  • IPTG isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galactoside
  • L-amino acids can be obtained by reacting 2-oxoacids with an amino acid dehydrogenase to reductively aminate 2-oxoacids (reductive amination reaction). Further, L-amino acid is obtained by reacting racemic amino acid or D-amino acid with D-amino acid oxidase to oxidize D-amino acid to 2-oxo acid, and further contacting with amino acid dehydrogenase. It can also be converted to an L-amino acid (steric inversion reaction).
  • D-amino acid oxidase is an enzyme that oxidizes D-amino acid in the presence of oxygen to produce 2-oxo acid, hydrogen peroxide, and ammonia.
  • D-amino acid oxidase used in the present invention those derived from animals, plants and microorganisms can be used, but those derived from microorganisms are preferred for industrial use.
  • microorganisms capable of producing D-amino acid oxidase include, for example, the following known microorganisms capable of producing the enzyme, Arthrobacter genus, Aspergillus genus, Candida genus , Cryptococcus genus, Curvularia genus, Exophiala genus, Fusarium genus, Gibberella genus, Hansenula genus, Kloeckera genus, Kluyveromyces ces Neurospora genus, Pichia genus, Rhodosporidium genus, Rhodotorula genus, Sporobolomyces genus, Trigonopsis genus, Verticillium genus and Examples include the genus Yarrowia.
  • Preferred examples include enzymes derived from microorganisms belonging to the genus Candida. Among them, enzymes derived from Candida intermedia are preferred, and more preferably derived from Candida intermedia NBRC0761 strain. Enzymes.
  • a highly active bacterium that efficiently produces D-amino acid oxidase, it is effective to produce a transformed microorganism, as is well known.
  • a preparation method for example, as described in WO07 / 015511, after cloning a D-amino acid oxidase gene from a strain exhibiting D-amino acid oxidase activity, a recombinant plasmid with an appropriate vector is prepared and used. It can be obtained by transforming an appropriate host bacterium. Recombinant DNA technology is well known in the art.
  • D-amino acid oxidase by these transformants or D-amino acid oxidase by the aforementioned strain exhibiting D-amino acid oxidase activity may be carried out, for example, by culturing using a normal nutrient medium described in WO07 / 015511. If necessary, treatment for enzyme induction can also be performed.
  • Coenzyme regeneration system The reductive amination reaction by amino acid dehydrogenase requires a reduced coenzyme such as NADH, and coenzyme NADH is converted to an oxidized form as the reaction proceeds.
  • An enzyme having the ability to convert this oxidized coenzyme into a reduced form hereinafter referred to as reduced coenzyme regeneration ability
  • a compound serving as a substrate for the enzyme coexist with an amino acid dehydrogenase in the reaction.
  • polypeptides having reducible coenzyme regeneration ability include hydrogenase, formate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, or glucose dehydrogenase it can.
  • formate dehydrogenase is used.
  • formate dehydrogenase those derived from plants and microorganisms can be used, but those derived from microorganisms are preferred for industrial use.
  • Any microorganism can be used as long as it has the ability to produce the enzyme.
  • Candida Kloeckera Genus, Pichia genus, Lipomyces genus, Pseudomonas genus, Moraxella genus, Hyphomicrobium genus, Paracoccus genus, Thiobacillus genus, Ansilobacter There is a genus (Ancylobacter).
  • enzymes derived from microorganisms belonging to the genus Thiobacillus and the genus Anncylobacter are mentioned. More preferable examples include enzymes derived from Thiobacillus sp. KNK65MA (FERM BP-7671) and Ansilobacter aquaticus KNK607M strain (FERM BP-7335).
  • a transformant that highly produces formate dehydrogenase contains a formate dehydrogenase gene derived from Thiobacillus sp. KNK65MA (FERM BP-7671) described in WO03 / 031626.
  • Escherichia coli HB101 pFT001
  • pFT002 Escherichiacoli HB101
  • An02 Examples include Escherichia coli HB101 (pFA001) (FERM BP-7334) containing a formate dehydrogenase gene derived from the KNK607M strain (FERM BP-7335).
  • formate dehydrogenase by these transformants or the production of formate dehydrogenase by a strain exhibiting the above-mentioned formate dehydrogenase activity can be carried out using a normal nutrient medium described in WO03 / 031626, for example. What is necessary is just to carry out the process for enzyme induction as needed.
  • the oxidative deamination reaction by amino acid dehydrogenase requires an oxidized coenzyme such as NAD, and coenzyme NAD is converted to a reduced form as the reaction proceeds.
  • An enzyme having the ability to convert this reduced coenzyme into an oxidized form hereinafter referred to as oxidized coenzyme regeneration ability
  • oxidized coenzyme regeneration ability an enzyme having the ability to convert this reduced coenzyme into an oxidized form
  • a compound serving as a substrate for the enzyme coexist with an amino acid dehydrogenase in the reaction.
  • NADH oxidase examples include NADH oxidase.
  • NADH oxidase is preferable in that oxygen can be used as a substrate for the coenzyme regeneration reaction, many of which are specific to NADH, and that the catalyzed reaction is irreversible.
  • Two types of NADH oxidase are known, one that generates water (water-generating NADH oxidase) and one that generates hydrogen peroxide (hydrogen peroxide-generating NADH oxidase). In that respect, water-generating NADH oxidase is more preferable.
  • the amino acid sequence of the water-producing NADH oxidase derived from Streptococcus mutans NCIMB 11723 has already been reported (Japanese Patent Laid-Open No. 8-196281).
  • Catalase may be added to the stereoinversion reaction. Even when catalase is not added, the reaction proceeds and a product can be obtained, but the substrate, reaction intermediate, or product is decomposed by hydrogen peroxide generated by the D-amino acid oxidase reaction, resulting in a decrease in yield. there's a possibility that. By adding catalase, decomposition of such a substrate, reaction intermediate, or product can be suppressed, and an improvement in yield can be expected.
  • Catalase is an enzyme that catalyzes the reaction of decomposing hydrogen peroxide into water and oxygen.
  • the catalase those derived from animals, plants and microorganisms can be used, but those derived from microorganisms are preferred for industrial use. Any microorganism can be used as long as it has the ability to produce the enzyme.
  • the following known microorganisms that have the ability to produce the enzyme such as the genus Escherichia and the genus Aspergillus, , The genus Micrococcus, or the genus Rhodopseudomonas.
  • the amino acid dehydrogenase, the enzyme capable of coenzyme regeneration, D-amino acid oxidase and catalase used in the present invention are produced by breeding and culturing transformants into which the respective enzyme genes have been introduced.
  • the product obtained by breeding and culturing a transformant introduced with a plurality of enzyme genes may be used.
  • the produced amino acid dehydrogenase, the enzyme having coenzyme regeneration ability, D-amino acid oxidase, and catalase can be used not only as the enzyme itself, but also as a microorganism or a processed product thereof.
  • the treated product of the microorganism means, for example, a crude extract, a cultured cell freeze-dried organism, an acetone-dried organism, or a crushed product of these cells.
  • Immobilized enzyme obtained by immobilizing the enzyme itself or the microbial cells by a known means. Immobilization can be performed by a cross-linking method, a covalent bonding method, a physical adsorption method, a comprehensive method, and the like, which are well known to those skilled in the art.
  • Examples of the substrate for the oxidative deamination reaction include an L-amino acid represented by the general formula (3) or a racemic amino acid represented by the general formula (4).
  • Examples of the substrate for the reductive amination reaction include 2-oxo acids represented by the general formula (2).
  • Examples of the substrate for the steric inversion reaction include a racemic amino acid represented by the general formula (4) or a D-amino acid represented by the general formula (5).
  • R has an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms which may have a substituent, an alkenyl group having 2 to 20 carbon atoms which may have a substituent, and a substituent. And an alkynyl group having 2 to 20 carbon atoms, an aryl group having 4 to 20 carbon atoms which may have a substituent, or an aralkyl group having 5 to 20 carbon atoms which may have a substituent.
  • the alkyl group having 1 to 20 carbon atoms which may have a substituent in R is not particularly limited, and examples thereof include a methyl group, isopropyl group, isobutyl group, 1-methylpropyl group, carbamoylmethyl group, 2 -Carbamoylethyl group, hydroxymethyl group, 1-hydroxyethyl group, mercaptomethyl group, 2-methylthioethyl group, (1-mercapto-1-methyl) ethyl group, 4-aminobutyl group, 3-guanidinopropyl group, 4 (5) -Imidazolemethyl group, ethyl group, n-propyl group, n-butyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, pentanyl group, hexanyl group, heptanyl group, octanyl group, 2,2-dimethylpropyl group Chloromethyl group, methoxymethyl group, 2-hydroxyethyl group, 3-
  • the alkenyl group having 2 to 20 carbon atoms which may have a substituent is not particularly limited, and examples thereof include an ethenyl group, a propenyl group, a butenyl group, a pentenyl group, a hexenyl group, a heptenyl group, and an octenyl group. Is mentioned.
  • the alkynyl group having 2 to 20 carbon atoms which may have a substituent is not particularly limited, and examples thereof include ethynyl group, propynyl group, butynyl group, pentynyl group, hexynyl group, heptynyl group, and octynyl group. Is mentioned.
  • the aralkyl group having 5 to 20 carbon atoms which may have a substituent is not particularly limited, and examples thereof include a benzyl group, an indolylmethyl group, a thiazolemethyl group, a 4-hydroxybenzyl group, a naphthylmethyl group, and anthranyl.
  • Examples of the aryl group having 4 to 20 carbon atoms which may have a substituent include a phenyl group, a 4-hydroxyphenyl group, an anthranyl group, a pyridyl group, a pyrimidyl group, an indanyl group, an indenyl group, and a naphthyl group. It is done.
  • substituents examples include an amino group, a hydroxyl group, a nitro group, a cyano group, a carboxyl group, an alkyl group, an aralkyl group, an aryl group, an alkanoyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an alkoxyl group, and a halogen atom.
  • X represents a hydrogen atom, an alkali metal, or an alkaline earth metal, and is not particularly limited. Examples thereof include a hydrogen atom, lithium, sodium, potassium, magnesium, and calcium. 14 Oxidative deamination reaction
  • an oxidative deamination reaction the aforementioned amino acid dehydrogenase, the aforementioned enzyme having the ability to regenerate coenzyme, and the compound serving as the substrate are simultaneously present in the substrate, and the reaction is carried out in an aqueous medium.
  • a coenzyme such as NAD may be added to the oxidative deamination reaction.
  • the reaction may proceed with a coenzyme such as NAD present in the microorganism, but the reaction efficiency is improved by adding a coenzyme such as NAD. Can be expected.
  • the added concentration of a coenzyme such as NAD is preferably 0 equivalents or more and 2 equivalents or less, more preferably 0.00001 equivalents or more and 0.1 equivalents or less, still more preferably 0.0001 equivalents or more, relative to the substrate. 0.01 equivalent or less.
  • Reductive amination reaction In the reductive amination reaction, the above-mentioned amino acid dehydrogenase, ammonia or a salt thereof, and the above-mentioned enzyme having the ability to regenerate coenzyme and the compound serving as the substrate are present simultaneously in an aqueous medium. Perform the reaction.
  • a coenzyme such as NAD may be added to the reductive amination reaction. Even when no coenzyme such as NAD is added, the reaction may proceed with a coenzyme such as NAD present in the microorganism, but the reaction efficiency is improved by adding a coenzyme such as NAD. Can be expected.
  • the added concentration of a coenzyme such as NAD is preferably 0 equivalents or more and 2 equivalents or less, more preferably 0.00001 equivalents or more and 0.1 equivalents or less, still more preferably 0.0001 equivalents or more, relative to the substrate. 0.01 equivalent or less.
  • Stereo-inversion reaction In the stereo-inversion reaction, the aforementioned D-amino acid oxidase, the aforementioned amino acid dehydrogenase and the enzyme having the ability to regenerate coenzyme, and the compound serving as the substrate are simultaneously present in the above substrate, and the reaction is performed in an aqueous medium. . Catalase may be added to the reaction. By adding catalase, hydrogen peroxide generated by the reaction of D-amino acid oxidase can be decomposed, and decomposition of the substrate, reaction intermediate, or product can be suppressed.
  • FAD may be added to the above reaction.
  • FAD is a coenzyme for D-amino acid oxidase, and the addition of FAD can be expected to improve the efficiency of the reaction.
  • the concentration of FAD added is preferably 0 equivalents or more and 10 equivalents or less, more preferably 0 equivalents or more and 1 equivalents or less, still more preferably 0 equivalents or more and 0.1 equivalents or less with respect to the substrate.
  • a coenzyme such as NAD may be added to the steric inversion reaction. Even when no coenzyme such as NAD is added, the reaction may proceed with a coenzyme such as NAD present in the microorganism, but the reaction efficiency is improved by adding a coenzyme such as NAD. Can be expected.
  • the added concentration of a coenzyme such as NAD is preferably 0 equivalents or more and 2 equivalents or less, more preferably 0.00001 equivalents or more and 0.1 equivalents or less, still more preferably 0.0001 equivalents or more, relative to the substrate. 0.01 equivalent or less.
  • ammonia or a salt thereof may be added to the stereoinversion reaction.
  • concentration of ammonia added is preferably 0 equivalents or more and 10 equivalents or less, more preferably 0 equivalents or more and 2 equivalents or less, still more preferably 0.1 equivalents or more and 1.5 equivalents or less with respect to the substrate.
  • the substrate concentration of the oxidative deamination reaction, reductive amination reaction, and steric inversion reaction is 0.1% (w / v) or more and 90% (w / v) or less, preferably 1% (w / v).
  • the reaction is carried out in a dissolved or suspended state at 60% (w / v) or less, and the reaction temperature in the oxidative deamination reaction, reductive amination reaction, and steric inversion reaction is 10 ° C. or higher, 80 The temperature may be adjusted at an appropriate temperature of not higher than ° C., preferably not lower than 20 ° C.
  • the substrate may be added all at once, dividedly or continuously.
  • the oxidative deamination reaction, the reductive amination reaction, and the steric inversion reaction can be performed by a batch method or a continuous method.
  • the oxidative deamination reaction, reductive amination reaction, and steric inversion reaction of the present invention can also be performed using an immobilized enzyme, a membrane reactor, or the like.
  • the aqueous medium include water, a buffer solution, an aqueous medium containing a water-soluble organic solvent such as ethanol, or an organic solvent that is difficult to dissolve in water, such as ethyl acetate, butyl acetate, toluene, chloroform, and n-hexane.
  • a suitable solvent such as a two-layer system with an aqueous medium containing an organic solvent such as can be used.
  • an antioxidant, a surfactant, a coenzyme, a metal, and the like can be added.
  • L-amino acid, 2-oxoacid, or D-amino acid produced can be isolated by conventional separation methods such as extraction, concentration, crystallization, column chromatography, etc. It can be separated and purified by combination.
  • Example 1 Isolation and purification of amino acid dehydrogenase Rhodococcus qingshengii KNK2108 strain was sterilized in a 500 ml Sakaguchi flask in 50 ml medium (meat extract 1.0%, polypeptone 1.0%, yeast extract). 0.5%, NaCl 0.3%, pH 7.0 before sterilization) and inoculated aerobically at 30 ° C. for 23 hours.
  • the cells were collected by centrifugation, and the cells were suspended in 0.1 M Tris (Tris (hydroxymethyl) aminomethane) -hydrochloric acid buffer (pH 8.0) containing 10% glycerin.
  • Tris Tris (Tris (hydroxymethyl) aminomethane) -hydrochloric acid buffer (pH 8.0) containing 10% glycerin.
  • the bacterial cells were crushed by ultrasonic waves and centrifuged. A precipitate that salted out when ammonium sulfate was added to the supernatant at 50% saturation was obtained by centrifugation.
  • This fraction was dissolved in 0.1 M Tris (tris (hydroxymethyl) aminomethane) -hydrochloric acid buffer (pH 8.0) containing 20% glycerin, dialyzed with the same buffer, and then DEAE-TOYOPEAL (manufactured by Tosoh Corporation).
  • Ammonium sulfate was dissolved in the obtained active fraction to a final concentration of 1 M, and column chromatography was performed using 6 ml of RESOURCE PHE (manufactured by GE Healthcare Biosciences). Elution was performed with a 1M to 0M ammonium sulfate concentration gradient using 1M Tris (tris (hydroxymethyl) aminomethane) -hydrochloric acid buffer (pH 8.0).
  • RESOURCE PHE manufactured by GE Healthcare Biosciences
  • Elution was performed with a 1M to 0M ammonium sulfate concentration gradient using 1M Tris (tris (hydroxymethyl) aminomethane) -hydrochloric acid buffer (pH 8.0).
  • Example 2 Properties of amino acid dehydrogenase The properties of the purified amino acid dehydrogenase obtained in Example 1 were examined as follows. [Specific activity] The amino acid dehydrogenase activity was measured in 1.5 ml of 0.1 M sodium carbonate buffer (pH 9.0) containing 10 mM of the substrate phenylpyruvic acid, and 0.5 M NH 3 / NH 4 Cl buffer (pH 9.0). 1.2 ml 0.1 M sodium carbonate buffer (pH 9.0) 0.2 ml containing 3 mM of coenzyme NADH and 0.1 ml of an appropriately diluted enzyme solution were added and reacted at 30 ° C. for 1 minute.
  • the subunit molecular weight was measured by SDS-polyacrylamide electrophoresis in comparison with the mobility with the standard protein, it was about 46,000 (43,000 or more, 49,000 or less), and the amino acid dehydration of the present invention was performed.
  • the elementary enzyme had a dimeric structure consisting of the same subunits.
  • Substrate specificity The substrate specificity of the purified amino acid dehydrogenase was examined. Substrate phenylpyruvic acid in the enzyme activity measurement was changed to each substrate, and enzyme activity was measured. However, the enzyme activity for naphthylpyruvic acid was determined by adding 100 ⁇ l of an appropriately diluted enzyme solution to 100 ⁇ l of 0.1 M sodium carbonate buffer (pH 9.0) containing 1.0 mg of naphthylpyruvic acid, 12.3 mg of ammonium sulfate and 6.1 mg of NADH. The increase in 2-naphthylalanine produced at 30 ° C. for 30 minutes was determined by quantifying by HPLC.
  • the enzyme activity for indolepyruvic acid was added with 100 ⁇ l of 0.1 M sodium carbonate buffer (pH 9.0) containing 2.0 mg of indolepyruvic acid, 26.0 mg of ammonium sulfate and 7.6 mg of NADH, and 100 ⁇ l of appropriately diluted enzyme solution.
  • the increase in L-tryptophan produced in 30 minutes at 30 ° C. was determined by quantifying by HPLC. HPLC analysis was performed using columns: CROWNPAK CR- (4.6 mm ⁇ 150 mm, manufactured by Daicel), eluent: HClO 4 aqueous solution (pH 2.0), flow rate: 1.0 ml / min, column temperature: 30 ° C., detection: 210 nm It was done in. At this time, the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of L-tryptophan per minute was defined as 1 unit. Table 1 shows relative activity values when the activity with respect to phenylpyruvic acid is taken as 100%.
  • Example 3 Determination of N-terminal amino acid sequence and internal amino acid sequence of amino acid dehydrogenase
  • the purified amino acid dehydrogenase obtained in Example 1 was subjected to reverse phase HPLC (column: YMC-Pack PROTEIN-RP (manufactured by YMC)).
  • Eluent gradient from 20% acetonitrile aqueous solution to 80% acetonitrile aqueous solution, flow rate: 1 ml / min, column temperature: 25 ° C., detection: 230 nm
  • the amino acid sequence at the N-terminal was converted to a gas phase protein sequencer. It was determined using PPSQ-33A (manufactured by Shimadzu Corporation).
  • Example 4 Isolation of amino acid dehydrogenase gene Rhodococcus qingshengii KNK2108 strain was sterilized in a test tube in 5 ml of medium (meat extract 1.0%, polypeptone 1.0%, yeast extract 0.5). %, NaCl 0.3%, pH 7.0 before sterilization), and cultured under aerobic shaking at 30 ° C. for 38 hours. Chromosomal DNA was prepared from the obtained cells using UltraClean Microbial DNA Isolation Kit (manufactured by MO BIO Laboratories, Inc.).
  • PCR was performed using the previously obtained chromosomal DNA as a template. PCR was performed by adding 0.25 ⁇ l of Ex Taq DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) 0.25 ⁇ l, 5 ⁇ l of 10 ⁇ Ex Taq Buffer (manufactured by Takara Bio Inc.), 4 ⁇ l of 2.5 mM each dNTP solution, and 2 ⁇ l each of 20 ⁇ M primer aqueous solution to 100 ng of template DNA.
  • a reaction solution adjusted to a total volume of 50 ⁇ l by adding sterilized water, heat denaturation (94 ° C., 60 seconds), annealing (48 ° C., 60 seconds), extension reaction (72 ° C., 60 seconds) 30 After repeating the cycle, it was performed by cooling to 4 ° C. As a result, a part of the target amino acid dehydrogenase gene (referred to as a partial gene) was obtained. The base sequence of this partial gene was determined using a DNA sequencer 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
  • a DNA primer directed toward the outside of the partial gene (Primer-3: SEQ ID NO: 5 in the Sequence Listing, and Primer) -4: SEQ ID NO: 6) in the sequence listing was synthesized.
  • inverse PCR was performed using as a template the DNA obtained by cyclization of the previously obtained chromosomal DNA digested with the restriction enzymes BamHI or HincII using T4 DNA ligase.
  • PCR was basically performed in the same manner as described above, except that heat denaturation (96 ° C., 30 seconds), annealing (60 ° C., 60 seconds), and extension reaction (72 ° C., 300 seconds).
  • a primer having a sequence in which the cleavage sites of restriction enzymes EcoRI and KpnI are linked to the N-terminal and C-terminal portions of the amino acid dehydrogenase gene, respectively (Primer-5: SEQ ID NO: 8 in the Sequence Listing, Primer-6: Sequence Listing)
  • the DNA fragment of the open reading frame shown in SEQ ID NO: 2 was obtained by amplifying by PCR using the chromosomal DNA obtained previously as a template.
  • PCR is performed by adding 0.5 ⁇ l of PrimeSTAR DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) to 100 ng of template DNA, 10 ⁇ l of 5 ⁇ PrimeSTAR Buffer (manufactured by Takara Bio Inc.), 4 ⁇ l of 2.5 mM each dNTP solution, 0.5 ⁇ l each of 20 ⁇ M primer aqueous solution, A reaction solution prepared by adding sterilized water to a total volume of 50 ⁇ l was prepared, and heat denaturation (98 ° C., 10 seconds), annealing (55 ° C., 5 seconds), and extension reaction (72 ° C., 90 seconds) were performed at 25 times. After repeating the cycle, it was performed by cooling to 4 ° C.
  • Example 5 Preparation of recombinant plasmid expressing amino acid dehydrogenase gene
  • the DNA fragment obtained in Example 4 was digested with restriction enzymes EcoRI and KpnI, and vector plasmid pUCT (pUCNT (WO94 / The plasmid designed to express a large amount of the amino acid dehydrogenase gene as shown in the restriction enzyme map of FIG. 3 by binding with the plasmid vector in which the NdeI site was disrupted) (see 03613) and T4 DNA ligase.
  • pRPD002 was obtained.
  • Example 6 Preparation of transformant using recombinant DNA containing amino acid dehydrogenase gene
  • the plasmid pRPD002 obtained in Example 5 was mixed with competent cells of Escherichia coli HB101. Transform and play in medium (tryptone 10 g, yeast extract 5 g, sodium chloride 10 g, agar 15 g, ampicillin 100 mg, make up to 1 liter with deionized water, pH 7.0 before sterilization, but add ampicillin after sterilization)
  • the transformant Escherichia coli HB101 (pRPD002) containing a recombinant DNA containing an amino acid dehydrogenase gene was obtained as a colony.
  • the colony of the obtained transformant was sterilized in a test tube in a volume of 6 ml (tryptone 16 g, yeast extract 10 g, sodium chloride 5 g, ampicillin 100 mg, deionized water to 1 l, pH 7.0 before sterilization, However, after inoculation, ampicillin was added after sterilization, and cultured aerobically by shaking at 37 ° C. for 24 hours.
  • the bacterial cells are collected from the obtained culture broth by centrifugation, suspended in 0.1 M Tris-hydrochloric acid buffer (pH 8.0), disrupted by ultrasonic waves, and then centrifuged to obtain the cells derived from the bacterial cells. Insoluble matter was removed, and an amino acid dehydrogenase solution of the transformant was obtained. When amino acid dehydrogenase activity was measured by the method shown in Example 2 using the obtained enzyme solution, amino acid dehydrogenase activity was confirmed.
  • Example 7 L-amino acid synthesis by reductive amination reaction utilizing amino acid dehydrogenase activity bacteria Rhodococcus qingshengii KNK2108 strain was planted in 6 ml of medium A described in Example 1 sterilized in a test tube. The cells were cultured and aerobically shaken at 30 ° C. for 48 hours. Bacteria obtained for 5 ml of the obtained culture solution are collected by centrifugation, suspended in 1.0 ml of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0), disrupted by ultrasound and centrifuged. The supernatant was collected as a crude enzyme solution.
  • Example 8 Synthesis of L-Amino Acid Using Transformant
  • Escherichia coli HB101 (pRPD002) having amino acid dehydrogenase activity obtained in Example 6 was collected from the culture solution by centrifugation.
  • the cells were suspended in 0.1 M Tris-hydrochloric acid buffer (pH 8.0), and the cells were disrupted by ultrasound to prepare a cell disruption solution.
  • a transformant having formate dehydrogenase activity obtained by the method described later is collected from the culture solution by centrifugation, suspended in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0), and sonicated by bacteria. The body was crushed to prepare a microbial cell disruption solution.
  • a transformant having D-amino acid oxidase activity obtained by the method described later is collected from the culture solution by centrifugation, suspended in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0), and sonicated. The body was crushed to prepare a microbial cell disruption solution. These cell disruptions were allowed to act on DL-naphthylalanine, DL-homophenylalanine, or DL-tryptophan to synthesize the corresponding L-amino acids by steric inversion reaction.
  • a culture solution of a transformant having formate dehydrogenase activity was obtained as follows. Escherichia coli HB101 (pFT002) (FERM BP-7673), a transformant having formate dehydrogenase activity derived from Thiobacillus sp. KNK65MA (FERM BP-7671), is sterilized in vitro. 6 ml of the medium (tryptone 16 g, yeast extract 10 g, sodium chloride 5 g, water 1 l, pre-sterilization pH 7) was inoculated and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours. A culture solution of a transformant having D-amino acid oxidase activity was obtained as follows.
  • Example 9 Production of transformant using recombinant DNA containing amino acid dehydrogenase gene and recombinant DNA containing chaperone gene Plasmid pRPD002 obtained in Example 5 and commercially available chaperone plasmid pGro7 Transformant Escherichia coli (Escherichia coli, which can express an amino acid dehydrogenase gene and a chaperone gene by performing transformation by mixing a competent cell of Escherichia coli HB101 with a chaperone plasmid set (manufactured by Takara). coli) HB101 (pRPD002, pGrO7).
  • Example 10 Production of amino acid dehydrogenase using transformant 6 ml of a medium obtained by sterilizing the transformant Escherichia coli HB101 (pRPD002, pGrO7) obtained in Example 9 in a test tube ( Tryptone 16 g, yeast extract 10 g, sodium chloride 5 g, ampicillin 100 mg, chloramphenicol 100 mg, made up to 1 liter with deionized water, pH 7.0 before sterilization, but ampicillin and chloramphenicol are added after sterilization) And aerobically cultured at 30 ° C. with shaking for 24 hours.
  • a test tube Tryptone 16 g, yeast extract 10 g, sodium chloride 5 g, ampicillin 100 mg, chloramphenicol 100 mg, made up to 1 liter with deionized water, pH 7.0 before sterilization, but ampicillin and chloramphenicol are added after sterilization
  • the bacterial cells are collected from 1 ml of the obtained culture broth by centrifugation, suspended in 1 ml of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0), disrupted by ultrasonic waves, and centrifuged by centrifugation. The insoluble matter derived therefrom was removed, and a cell-free extract (soluble fraction) of the transformant was obtained. The insoluble matter derived from the cells was resuspended in 1 ml of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) to obtain an insoluble fraction solution.
  • the soluble and insoluble fractions obtained from the respective transformants were analyzed by SDS-polyacrylamide electrophoresis.
  • most of the amino acid dehydrogenase was found in the transformant Escherichia coli HB101 (pRPD002).
  • pRPD002 the transformant Escherichia coli HB101
  • pGrO7 the transformant Escherichia coli HB101
  • the obtained transformant was sterilized in a test tube with 6 ml of medium (tryptone 16 g, yeast extract 10 g, sodium chloride 5 g, ampicillin 100 mg, made up to 1 l with deionized water, pH 7.0 before sterilization, but ampicillin Was added after sterilization) and cultured aerobically by shaking at 30 ° C. for 24 hours.
  • medium tryptone 16 g, yeast extract 10 g, sodium chloride 5 g, ampicillin 100 mg, made up to 1 l with deionized water, pH 7.0 before sterilization, but ampicillin Was added after sterilization
  • Bacterial cells were collected from the obtained culture broth by centrifugation, and plasmid pNRH was extracted using QIAprep Spin Miniprep Kit (manufactured by QIAGEN).
  • an EcoRI recognition site was placed at the 5 ′ end of the formate dehydrogenase gene derived from Thiobacillus sp. KNK65MA (FERM BP-7671) (see SEQ ID NO: 3 in WO 03/031626).
  • a gene with a KpnI recognition site added to the terminal side was obtained by PCR using DNA polymerase PrimeSTAR (Takara Shuzo). The obtained DNA fragment was inserted between the EcoRI recognition site and the KpnI recognition site of the plasmid pNRH constructed above to construct a recombinant vector pNRHSFD.
  • Example 12 Synthesis of L-naphthylalanine using a transformant transformed with a vector containing an amino acid dehydrogenase and formate dehydrogenase gene
  • the transformant Escherichia coli obtained in Example 11 6 ml of medium sterilized with HB101 (pNRHSFD) in a test tube (tryptone 16 g, yeast extract 10 g, sodium chloride 5 g, ampicillin 100 mg, made up to 1 l with deionized water, pH 7.0 before sterilization, but ampicillin is sterilized Inoculated later) and cultured aerobically by shaking at 30 ° C. for 24 hours.
  • HB101 pNRHSFD
  • Bacterial cells were collected from the obtained culture broth by centrifugation, suspended in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0), and disrupted by ultrasonic waves to prepare a cell disruption solution.
  • a cell disruption solution of a transformant having D-amino acid oxidase activity was prepared in the same manner as in Example 8.
  • the reaction solution was mixed to 1.0 ml and reacted at 30 ° C. for 19 hours.
  • the reaction solution was diluted 20 times with water, the centrifugal supernatant was analyzed by HPLC, and amino acids were quantified. Amino acid quantification by HPLC analysis was carried out under the same conditions as in Example 7. As a result, L-naphthylalanine having an optical purity of 100% ee was obtained with a reaction yield of 94.2 mol% based on the racemic amino acid.
  • Example 13 Production of transformant transformed with a vector containing amino acid dehydrogenase, formate dehydrogenase, and D-amino acid oxidase gene D-amino acid oxidase derived from Candida intermedia NBRC0761 strain A DNA polymerase PrimeSTAR (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was used for the gene (see SEQ ID NO: 2 described in WO07 / 015511), in which a KpnI recognition site was added to the 5 ′ end and a BamHI recognition site was added to the 3 ′ end. Obtained by PCR.
  • the obtained DNA fragment was inserted between the KpnI recognition site and the BamHI recognition site of the plasmid pNRHSFD constructed in Example 11 to construct a recombinant vector pNRHSFDCDA.
  • Escherichia coli HB101 competent cells Takara Bio
  • pNRHSFDCDA a trait having amino acid dehydrogenase, formate dehydrogenase, and D-amino acid oxidase activity
  • the transformant Escherichia coli HB101 (pNRHSFDCDA) was produced.
  • Example 14 Synthesis of L-amino acid using transformant transformed with a vector containing amino acid dehydrogenase, formate dehydrogenase, and D-amino acid oxidase gene (14-1) From DL-naphthylalanine Synthesis of L-naphthylalanine
  • the transformant Escherichia coli HB101 (pNRHSFDCDA) having amino acid dehydrogenase, formate dehydrogenase, and D-amino acid oxidase activity prepared in Example 13 was sterilized in a test tube.

Abstract

　本発明は、新規なアミノ酸脱水素酵素、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを導入された形質転換体に関する。また、本発明は、当該アミノ酸脱水素酵素もしくは当該酵素を生産しうる微生物又は形質転換体を基質化合物に作用させることを特徴とする、Ｌ－アミノ酸、２－オキソ酸、又はＤ－アミノ酸の製造方法にも関する。本発明のアミノ酸脱水素酵素は、従来既知のアミノ酸脱水素酵素では反応性が低かった、芳香環含有基等の嵩高い側鎖を有するアミノ酸又は２－オキソ酸に対しても良好な反応性を示し、有用な光学活性アミノ酸を安価に、効率よく提供することを可能にする。

Description

新規なアミノ酸脱水素酵素、およびＬ－アミノ酸、２－オキソ酸、又はＤ－アミノ酸の製造方法
　本発明は、微生物の生産する新規なアミノ酸脱水素酵素、これをコードするＤＮＡ、及びアミノ酸脱水素酵素を生産する能力を有する微生物あるいは形質転換体を用いたアミノ酸脱水素酵素の製造方法、また、アミノ酸脱水素酵素を用いた効率的なＬ－アミノ酸、２－オキソ酸、又はＤ－アミノ酸の製造方法に関するものである。
　アミノ酸脱水素酵素とは、補酵素依存的に２－オキソ酸を還元的にアミノ化する反応、およびその逆反応であるアミノ酸を酸化的に脱アミノ化する反応を触媒する酵素である。例えばアンモニアと補酵素の存在下、２－オキソ酸から高い立体選択性でＬ－アミノ酸を生成するなど、産業上有用な活性をもつことが知られている。Ｌ－アミノ酸は、食品や飼料、農薬、工業用薬品、化粧品や医薬品等の合成中間体として有用であり、また有機合成における光学分割剤やキラルビルディングブロック剤としても重要である。
　アミノ酸脱水素酵素として、例えばフェニルアラニン脱水素酵素（酵素番号［EC1.4.1.20］）やロイシン脱水素酵素（酵素番号［EC1.4.1.9］）等を挙げることができる。フェニルアラニン脱水素酵素を産生する微生物としては、例えばロドコッカス　エスピー（Rhodococcus sp.）（特許文献１）、ロドコッカス　マリス（Rhodococcus maris）(非特許文献１)、バチラス　バディウス（Bacillus badius）（特許文献２）、バチラス　スフェリカス（Bacillus sphaericus）（非特許文献２）、マイクロバクテリウム　エスピー（Microbacterium sp.）（非特許文献３）、サーモアクチノマイセス　インターメディウス（Thermoactinomyces intermedius）（特許文献３）、ブレビバクテリウム　エスピー（Brevibacterium sp.）（特許文献４）およびスポロサルシナ　ウレアエ（Sporosarcina ureae）（特許文献５、非特許文献４）等の微生物が知られている。
　アミノ酸脱水素酵素は、酵素が作用しやすい化合物種の違いに応じて分類されている。例えばロイシン脱水素酵素は、Ｌ－ロイシン、Ｌ－バリン、Ｌ－イソロイシンなどの分岐鎖アミノ酸やＬ－ノルバリンなどの短鎖の直鎖状アミノ酸、およびそれらに対応する２－オキソ酸にはよく作用するが、Ｌ－フェニルアラニンやＬ－チロシンなどの芳香族アミノ酸およびそれらに対応する２－オキソ酸にはほとんど作用しない。それに対して、フェニルアラニン脱水素酵素は前述の芳香族アミノ酸、およびそれらに対応する２－オキソ酸であるフェニルピルビン酸や４－ヒドロキシフェニルピルビン酸によく作用することが知られている。しかしながら、これまで知られているフェニルアラニン脱水素酵素は、ナフチルピルビン酸あるいはホモフェニルピルビン酸等のように、フェニルピルビン酸と比較して、側鎖が大きな構造である２－オキソ酸に対しては活性が弱い（非特許文献２、非特許文献３）。Ｌ－２－ナフチルアラニン、Ｌ－ホモフェニルアラニン等の非天然アミノ酸は、農薬、工業用薬品、化粧品や医薬品等の合成中間体として有用である。
　また、フェニルアラニン脱水素酵素遺伝子の形質転換体での発現に関しては、例えば、ロドコッカス　エスピー（Rhodococcus sp.）（非特許文献５）、バチラス　バディウス（Bacillus badius）（非特許文献６）、バチラス　スフェリカス（Bacillus sphaericus）（非特許文献７）、スポロサルシナ　ウレアエ（Sporosarcina ureae）（特許文献６）、サーモアクチノマイセス　インターメディウス（Thermoactinomyces intermedius）（非特許文献８）由来の遺伝子について知られている。
　また、ロドコッカス　エスピー（Rhodococcus sp.）由来、バチラス　スフェリカス（Bacillus sphaericus）由来、あるいはサーモアクチノマイセス　インターメディウス（Thermoactinomyces intermedius）由来のフェニルアラニン脱水素酵素と補酵素再性能を有する酵素を２－オキソ酸に作用させ、Ｌ－アミノ酸へと変換する反応はすでに知られている（特許文献１、非特許文献９、非特許文献１０）
　また、牛肝臓由来のグルタミン酸脱水素酵素、あるいはクロストリジューム　サーモアセティカム（Clostridium thermoaceticum）由来のロイシン脱水素酵素とＤ－アミノ酸オキシダーゼおよび補酵素再生能を有する酵素をラセミ体アミノ酸に作用させ、Ｄ－アミノ酸を２－オキソ酸あるいはイミノ酸を経て、Ｌ－アミノ酸へと変換する反応はすでに知られている（非特許文献１０、非特許文献１１）。
特開昭６１－１４６１８３号公報 特開昭６３－３２４８２号公報 特開昭６３－３０４９８０号公報 特開昭５９－１９８９７２号公報 特開昭６１－２３９８８７号公報 特開昭６３－１５７９８６号公報
Journal of Bacteriology, vol.171(1), p30 (1989) 有機合成化学、１９８９年、４７巻、８号、７４９頁 Arch. Microbiol., vol.169, p.220 (1998) J. of Biological Chemistry, vol.262(21), p10346 (1987) J. of Biological Chemistry, vol.269(23), p16203 (1994) Eur. J. Biochem., vol.168, p153 (1987) Agric. Biol. Chem., vol.51, p2621 (1987) J. Biochem., vol.109(3), p371 (1991) J. Org. Chem., vol.55, p5567 (1990) Biomolecular Engineering, vol.17, p167 (2001) J. Chem. Soc.: Chem. Commun., vol.13, p947 (1990)
　本発明の目的は、フェニルピルビン酸に加え、側鎖が大きいため、従来知られているアミノ酸脱水素酵素では反応性が低かったナフチルピルビン酸およびホモフェニルピルビン酸等の２－オキソ酸に対しても高い活性を有する新規なアミノ酸脱水素酵素を提供することにある。また、本発明の目的は、当該アミノ酸脱水素酵素のアミノ酸配列、その遺伝子のＤＮＡ配列を明らかにし、当該酵素を生産する能力を有する微生物あるいは形質転換体、及びそれらを用いた当該アミノ酸脱水素酵素の製造方法を提供することにある。さらに本発明の目的は、当該アミノ酸脱水素酵素を利用した効率的なＬ－アミノ酸、２－オキソ酸、又はＤ－アミノ酸の製造方法を提供することにある。
　本発明者らは上記課題に鑑み、広く土壌よりアミノ酸脱水素酵素活性を有する微生物を探索した結果、優れた新規な性質を有するアミノ酸脱水素酵素を高生産するロドコッカス（Rhodococcus）属細菌を新たに分離した。そして、当該微生物からアミノ酸脱水素酵素を単離、精製し、アミノ酸脱水素酵素遺伝子の単離、ならびに宿主微生物での発現を達成した。さらに、本発明で得たアミノ酸脱水素酵素を単独、あるいは補酵素再生能を有する酵素と組み合わせて２－オキソ酸、ラセミ体アミノ酸、又はＬ-アミノ酸に作用させることにより、Ｌ－アミノ酸、２－オキソ酸、又はＤ－アミノ酸を製造することが可能となり、本発明を完成するに至った。さらに、本発明で得たアミノ酸脱水素酵素をＤ－アミノ酸オキシダーゼおよび補酵素再性能を有する酵素と組み合わせて、ラセミ体アミノ酸、又はＤ－アミノ酸に作用させることにより、Ｌ－アミノ酸を製造することが可能となり、本発明を完成するに至った。
　本発明は、以下の１または複数の特徴を有する。
１）本発明は、以下の(ａ)、(ｂ)、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡである：
 (ａ) 配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ
 (ｂ) 配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(ｃ) 配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(ｄ) 配列表配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ
(ｅ) 配列表配列番号２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
 (ｆ) 配列表配列番号２に示される塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
　２）本発明は、以下の(ｇ)、(ｈ)又は(ｉ)のポリペプチドである:
(ｇ) 配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(ｈ) 配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド
(ｉ) 配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
　３）本発明は、アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであって、一般式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
（式中、Ｒ'は置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアルキニル基、置換基を有していてもよい炭素数４～２０のアリール基、または置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアラルキル基を示す。また、Ｘは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を示す。）で表される２－オキソ酸に対する活性を有し、かつナフチルピルビン酸に対する活性が、フェニルピルビン酸に対する活性の１／５０以上であるポリペプチドである。
４）本発明は、上記一般式（１）において、Ｒ'がインドリルメチル基あるいはフェニルエチル基である前記ポリペプチドである。
５）本発明は、ロドコッカス（Rhodococcus）由来である前記ポリペプチドである。
　６）本発明は、前記ＤＮＡを含む組換えプラスミドである。
　７）本発明は、前記組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体である。
８）本発明は、前記ＤＮＡ、及びシャペロンをコードするＤＮＡで形質転換して得られる形質転換体である。
　９）本発明は、前記ポリペプチドを生産する能力を有し、かつ、ロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物である。
　１０）本発明は、前記ポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物中に当該ポリペプチドを蓄積させ、これを採取するアミノ酸脱水素酵素の製造方法である。
１１）本発明は、前記ポリペプチド（アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド）、形質転換体、または微生物を、一般式（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
（式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１～２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数２～２０のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数２～２０のアルキニル基、置換基を有していてもよい炭素数４～２０のアリール基、または置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアラルキル基を示す。また、Ｘは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を示す。）で表される２－オキソ酸に作用させ、
一般式（３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
（式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるＬ－アミノ酸を製造する方法である。
　１１）本発明は、前記ポリペプチド（アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド）、形質転換体、または微生物を、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ存在下、
一般式（４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるラセミ体アミノ酸、又は
一般式（５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるＤ－アミノ酸に作用させ、
一般式（３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるＬ－アミノ酸を製造する方法である。
　１２）本発明は、前記ポリペプチド（アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド）、形質転換体、または微生物を、
一般式（３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
（式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるＬ－アミノ酸、又は
一般式（４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
（式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるラセミ体アミノ酸に作用させ、
一般式（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
（式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表される２－オキソ酸、又は
一般式（５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
（式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるＤ－アミノ酸を製造する方法である。
　本発明は上述の構成からなり、従来から報告のあるアミノ酸脱水素酵素では反応性が低かった基質に対して高い反応性を示す新規なアミノ酸脱水素酵素を効率よく製造することができる。また、当該アミノ酸脱水素酵素、または、当該アミノ酸脱水素酵素を生産する形質転換体、または微生物を利用することで、効率良くＬ－アミノ酸、２－オキソ酸、又はＤ－アミノ酸を製造することができる。
図１は、本発明の実施形態としてのアミノ酸脱水素酵素の作用温度と相対活性との関係（至適温度を含む）を示すグラフである。 図２は、本発明の実施形態としてのアミノ酸脱水素酵素の作用ｐＨと相対活性との関係（至適ｐＨを含む）を示すグラフである。 図３は、本発明の実施形態としてのアミノ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミドｐＲＰＤ００２の構成を示す図である。
　以下、実施形態に基づいて本発明を詳細に説明する。本発明の範囲は、実施形態および実施例によって限定されるものではない。
　１．ポリペプチド
　まず、本発明の実施形態としてのポリペプチドについて説明する。実施形態としてのポリペプチドは、アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであって、以下のような理化学的性質を有することを特徴とする。
　１）作用
　アンモニアおよび補酵素の存在下、２－オキソ酸を還元的にアミノ化してＬ－アミノ酸を生成する。あるいは補酵素の存在下、Ｌ－アミノ酸を酸化的に脱アミノ化し、２－オキソ酸、アンモニアを生成する。
　２）分子量
　分子量約９４,０００
　サブユニットの分子量約４６,０００。
　３）作用温度の範囲
　温度範囲：少なくとも約５℃～約７０℃
　至適温度：約４５℃～約５０℃
　温度範囲とは酵素が好適に作用する温度範囲であり、至適温度は酵素が最も好適に作用する温度である。本酵素は上記温度範囲以外の温度でも作用する。
　４）作用ｐＨの範囲
　ｐＨ範囲：少なくとも約７．１～約１１．０
　至適ｐＨ約８．８～約１０．０；
　ｐＨ範囲とは酵素が好適に作用するｐＨ範囲であり、至適ｐＨは酵素が最も好適に作用するｐＨである。本酵素は上記範囲以外のｐＨでも作用する。
５）比活性）
　純粋酵素１ｍｇあたり　　２０４ｕｎｉｔ（３０℃）。
１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを消費する酵素量を１ｕｎｉｔと定義する。
　６）基質特異性
　フェニルピルビン酸と比較して、ナフチルピルビン酸、インドールピルビン酸、あるいはホモフェニルピルビン酸等の側鎖が大きな構造の２－オキソ酸に対しても高い活性を有する。ここでいう高い活性とは、フェニルピルビン酸に対する活性の１／５０以上、好ましくは１／２５以上、さらに好ましくは１／１０以上の活性を有することをいう。
　また、側鎖が大きな構造の２－オキソ酸とは、前記一般式（１）おいて、Ｒ'が置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアルキニル基、置換基を有していてもよい炭素数４～２０のアリール基、または置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアラルキル基である２－オキソ酸を表す。
　上記Ｒ'における置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアルキル基としては、特に限定されず、例えば、ペンタニル基、ヘキサニル基、ヘプタニル基、オクタニル基等が挙げられる。
　置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアルケニル基としは、特に限定されず、例えば、ペンテニル基、ヘキセニル基、ヘプテニル基、又はオクテニル基等が挙げられる。
　置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアルキニル基としては、特に限定されず、例えば、ペンチニル基、ヘキシニル基、ヘプチニル基、又はオクチニル基等が挙げられる。
　置換基を有していてもよい炭素数４～２０のアリール基としては、特に限定されず、例えば、フェニル基、４－ヒドロキシフェニル基、アントラニル基、ピリジル基、ピリミジル基、インダニル基、インデニル基、又はナフチル基等が挙げられる。
　置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアラルキル基とは、特に限定されず、例えば、インドリルメチル基、ナフチルメチル基、アントラニルメチル基、インダニルメチル基、インデニルメチル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基、ジフェニルメチル基等が挙げられる。
　置換基としては、アミノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、アルキル基、アラルキル基、アリール基、アルカノイル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、又はハロゲン原子等が挙げられる。
　また、Ｘは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を表し、特に限定されないが、例えば、水素原子、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどが挙げられる。
　実施形態のアミノ酸脱水素酵素は、その基質特異性からフェニルアラニン脱水素酵素（酵素番号［EC1.4.1.20］）に分類される。他のフェニルアラニン脱水素酵素と比べて、例えば以下のような異なる性質を有している。
　（ａ）分子量３９，５００のサブユニットからなるホモ四量体構造であるロドコッカス　エスピー（Rhodococcus sp.）（特許文献１、非特許文献５）のフェニルアラニン脱水素酵素とは、酵素の分子量および構造が大きく異なる。またアミノ酸配列でも大きく異なる（アミノ酸配列同一性６６．９％）。さらに、フェニルピルビン酸に対する酵素活性を１００とした場合、インドールピルビン酸および４－ヒドロキシピルビン酸に対する酵素活性がそれぞれ３および５であり、酵素活性の比率が大きく異なる。
　（ｂ）分子量３６，０００のサブユニットからなるホモ二量体構造であるロドコッカス　マリス（Rhodococcus mariｓ） (非特許文献１)のフェニルアラニン脱水素酵素とは、酵素の分子量が大きく異なる。また、フェニルピルビン酸に対する酵素活性を１００とした場合、インドールピルビン酸および２－オキソ－４－（メチルチオ）ブタン酸に対する酵素活性がそれぞれ５および９であり、酵素活性の比率が大きく異なる。
　（ｃ）分子量４１，０００～４２，０００のサブユニットからなるホモ八量体構造であるバチラス　バディウス（Bacillus badius）（非特許文献２、非特許文献６）のフェニルアラニン脱水素酵素とは、酵素の分子量および構造が大きく異なる。またアミノ酸配列でも大きく異なる（アミノ酸配列同一性３６．１％）。
　（ｄ）分子量３９，０００のサブユニットからなるホモ八量体構造であるバチラス　スフェリカス（Bacillus sphaericus）（非特許文献２、非特許文献７）のフェニルアラニン脱水素酵素とは、酵素の分子量および構造が大きく異なる。またアミノ酸配列でも大きく異なる（アミノ酸配列同一性３６．６％）。さらに、フェニルピルビン酸に対する酵素活性を１００とした場合、ナフチルピルビン酸、ホモフェニルピルビン酸、およびインドールピルビン酸に対する酵素活性がそれぞれ、０．４６、３．４、および０．３９であり、酵素活性の比率が大きく異なる。
　（ｅ）分子量４１，０００のサブユニットからなるホモ八量体構造であるマイクロバクテリウム　エスピー（Microbacterium sp.）（非特許文献３）のフェニルアラニン脱水素酵素とは、酵素の分子量および構造が大きく異なる。また、フェニルピルビン酸に対する酵素活性を１００とした場合、ホモフェニルピルビン酸に対する酵素活性が０．１であり、酵素活性の比率が大きく異なる。
　（ｆ）分子量４１，０００のサブユニットからなるホモ六量体構造であるサーモアクチノマイセス　インターメディウス（Thermoactinomyces intermedius）（特許文献３、非特許文献８）のフェニルアラニン脱水素酵素とは、酵素の分子量および構造が大きく異なる。またアミノ酸配列でも大きく異なる（アミノ酸配列同一性３２．９％）。さらに、フェニルピルビン酸に対する酵素活性を１００とした場合、４－ヒドロキシフェニルピルビン酸に対する酵素活性が０であり、酵素活性の比率が大きく異なる。
　（ｇ）分子量６６，０００±５０００のサブユニットからなるホモ二量体構造であるブレビバクテリウム　エスピー（Brevibacterium sp.）（特許文献４）のフェニルアラニン脱水素酵素とは、酵素の分子量が大きく異なる。また、純粋酵素の比活性も大きく異なる。
　（ｈ）分子量３９，０００のサブユニットからなるホモ八量体構造であるスポロサルシナ　ウレアエ（Sporosarcina ureae）（特許文献５、非特許文献４）のフェニルアラニン脱水素酵素とは、酵素の分子量および構造が異なる。またアミノ酸配列でも大きく異なる（アミノ酸配列同一性３５．４％）。さらに、フェニルピルビン酸に対する酵素活性を１００とした場合、インドールピルビン酸に対する酵素活性が０．７３であり、酵素活性の比率が大きく異なる。
　なお、実施形態における「配列同一性」は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等を使用して求めることができる。ここでは、例示としてＧＥＮＥＴＹＸ　Ｖｅｒ．７遺伝情報処理ソフトウェア／Ｗｉｎｄｏｗｓ版（ゼネティックス社製）のホモロジー検索を使用した。
　２．アミノ酸脱水素酵素活性測定
　実施形態において、ポリペプチドのアミノ酸脱水素酵素活性測定は、例えば、１０ｍＭの基質フェニルピルビン酸を含む０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）１．５ｍｌに、０．５Ｍ　ＮＨ３／ＮＨ４Ｃｌ緩衝液（ｐＨ９．０）１．２ｍｌ、３ｍＭの補酵素ＮＡＤＨを含む０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）０．２ｍｌ、および適宜希釈した酵素溶液０．１ｍｌを添加し、３０℃で１分間反応させた際の、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から算出できる。実施形態では、特に明記しない場合を除き、本方法を用いてアミノ酸脱水素酵素活性を測定した。
　３．微生物
　実施形態のポリペプチドは、アミノ酸脱水素酵素活性を有する微生物から取得できる。同ポリペプチドを生産する微生物であれば特に限定されないが、例えばロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物が挙げられ、なかでもロドコッカス　キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii)が好ましく、より好ましくはロドコッカス　キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii)ＫＮＫ２１０８株である。
　上記のロドコッカス　キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii)ＫＮＫ２１０８株は、本発明において発明者らが分離、取得した菌株であり、平成２０年１１月２６日に受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１０６７として独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（〒３０５－８５６６　茨城県つくば市東１丁目１番１号　つくばセンター中央第６）に寄託されている。
　以下に、ロドコッカス　キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii)ＫＮＫ２１０８株の菌学的性質を示す。
　１．形態
１）桿菌　ｒｏｄ－ｃｏｃｃｕｓ　ｃｙｃｌｅあり
　２４時間：直径０．７－０．８μｍ×１．５－２．５μｍ程度
　７２時間：直径０．６－０．７μｍ×１．０－１．２μｍ程度
２）グラム染色：陽性。
３）運動性：無し。
４）胞子の有無：無し。
５）寒天平板培地培養でのコロニー形態：円形、周縁全縁、半球状、表面の形状スムーズ、不透明、粘稠度バター様、淡いオレンジ色。
　２．培養的性質
１）生育温度試験：３７℃（＋）、４５℃（－）。
　３．生理学的性質
１）カタラーゼ反応：＋
２）オキシダーゼ反応：－
３）グルコースからの酸／ガス産生（酸産生／ガス産生）：－／－
４）Ｏ／Ｆテスト（酸化／発酵）：－／－
５）発酵性試験
　グルコース：－
　リボース：－
　キシロース：－
　マンニトール：－
　マルトース：－
　乳糖：－
　白糖：－
　グルコーゲン：－
６）生化学試験
　硝酸塩還元：－
　ピラジンアミダーゼ：－
　ピロリドニルアリルアミダーゼ：－
　アルカリフォスフォターゼ：＋
　β－グルクロニダーゼ：－
　β－ガラクトシダーゼ：－
　α－グルコシダーゼ：＋
　Ｎ－アセチル－β－グルコサミニダーゼ：－
　エスクリン（β－グルコシダーゼ）：－
　ウレアーゼ：＋
　ゼラチン加水分解：－
７）嫌気での生育：－
８）デンプンの加水分解：－
９）ＭＲ（メチルレッド試験）：－
１０）ＶＰ（アセトイン産生）：－。
　上記の菌学的性質、及び、１６ＳｒＤＮＡ配列解析から、ＫＮＫ２１０８株はロドコッカス　キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii)と同定された。
　なお、実施形態のポリペプチドを生産する微生物は、上述した微生物の野生株であっても良いし、変異改良された変異株であってもよい。変異株は、ＵＶ照射や、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）等の薬剤による処理といった当業者に周知の方法で取得することができる。
　本発明のポリペプチドを生産する微生物を培養する培地としては、その微生物が増殖し得るものである限り特に限定されない。例えば、炭素源として、グルコース、シュークロース等の糖質、エタノール、グリセロール等のアルコール類、オレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸及びそのエステル類、菜種油、大豆油等の油類、窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、ふすま、酵母エキスなど、無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウムなど、他の栄養源として、麦芽エキス、肉エキス等を含有する通常の液体培地が使用され得る。
　更に、アミノ酸脱水素酵素の生産を増強させるような物質、例えば、アミノ酸又はアミノ酸誘導体を少量添加することもできる。これらアミノ酸脱水素酵素生産増強物質の培地中濃度は、０．００１重量％以上、１０重量％以下、好ましくは０．０１重量％以上、１重量％以下の範囲から選ばれる。
　培養は通常好気的に行い、温度として１０℃以上、６０℃以下、好ましくは２０℃以上、５０℃以下の範囲、ｐＨとしては３以上、１１以下、好ましくはｐＨ５以上、９以下の範囲が用いられ、培養時間は１日以上、５日間以下程度で行い得る。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。
　培養終了後に培養液から遠心分離などにより菌体を集め、超音波破砕などの手段により菌体を破砕して粗酵素液を得る。この粗酵素液を、塩析法、カラムクロマトグラフィー法などにより精製することで、本発明のポリペプチドを得ることができる。
　４．アミノ酸配列
　本発明のポリペプチドは、上記のように微生物から取得される天然酵素であってもよいし、遺伝子組換え技術を利用して生産される組換え酵素であってもよい。天然酵素としては、配列表の配列番号１に示されるポリペプチドをあげることができる。
　また、本発明の実施形態としてのポリペプチドは、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであってもよいし、配列番号１に示されるアミノ酸配列と７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであってもよい。「数個のアミノ酸」とは、アミノ酸脱水素酵素活性が失われない限り、その個数は制限されないが、例えば２５アミノ酸以下であり、好ましくは２０アミノ酸以下、より好ましくは１５アミノ酸以下、さらに好ましくは１０アミノ酸以下、最も好ましくは、５、４、３、または２個以下である。
　また、「アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド」とは、上記の活性測定条件において、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上の活性を示すポリペプチドのことをいう。
　５．ＤＮＡ
　本発明の実施形態としての「ＤＮＡ」について説明する。本発明のＤＮＡは、上記のようなポリペプチドをコードするＤＮＡであればよい。配列表の配列番号２で示されるＤＮＡであってもよいし、配列表配列番号２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。「数個の塩基」とは、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドがアミノ酸脱水素酵素活性を失われない限り、その個数は制限されないが、好ましくは５０塩基以下であり、より好ましくは３０塩基以下、さらに好ましくは２０塩基以下、最も好ましくは、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２個以下である。
　また、配列番号２で示される塩基配列と７０％以上、好ましくは７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。
　また、本発明のＤＮＡとしては、配列表配列番号２で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。
　ここで「配列表配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を実施した際に、配列表配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、特異的にハイブリッドを形成し得るＤＮＡを言う。
　ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、および、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ　４００（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）の組成からなる水溶液中、６５℃でハイブリダイズさせた後に、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６０℃で洗浄が行われる条件を言う。好ましくは、上記条件でハイブリダイズさせた後に、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６５℃で洗浄が行われる条件であり、より好ましくは、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６５℃で洗浄が行われる条件である。
　本発明のＤＮＡ（アミノ酸脱水素酵素遺伝子）は、前述したようなアミノ酸脱水素酵素活性を有する微生物から取得することができる。目的のＤＮＡを取得するには、例えば以下の方法によることができる。
　まず、アミノ酸脱水素酵素活性を有する微生物より精製されたアミノ酸脱水素酵素のＮ末端のアミノ酸配列を、気相プロテイン・シークエンサーなどで決定する。また、精製されたアミノ酸脱水素酵素にＶ８プロテアーゼ等のプロテアーゼを作用させて適当な大きさのポリペプチドに消化した後、ＨＰＬＣ等を用いて得られたポリペプチドを精製し、上記と同様の方法に従って内部アミノ酸配列を決定する。このようにして得られたＮ末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列にもとづいて設計したＤＮＡプライマーを合成する。
　次に、アミノ酸脱水素酵素の起源となる微生物より、染色体ＤＮＡを単離する。染色体ＤＮＡは、培養された細胞から、UltraClean Microbial DNA Isolation Kit（MO BIO Laboratories, Inc.社製）等を用いて得られる。この染色体ＤＮＡを鋳型に、上記のＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、目的遺伝子の一部を取得できる。
　次に、既に取得した部分遺伝子のさらにＮ末側とＣ末側をコードするＤＮＡ断片を、インバースＰＣＲ法により取得することができる（例えばNucleic Acids Res., vol.16, p8186 (1988)を参照）。このＤＮＡ断片の塩基配列を決定後、酵素のＮ末端をコードするＤＮＡよりも上流、Ｃ末端をコードするＤＮＡより下流と推定されるＤＮＡの塩基配列にもとづきＤＮＡプライマーを作成して、この配列の間のＤＮＡを先に得た染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより増幅することで目的アミノ酸脱水素酵素遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を取得できる。
　次いで、得られたアミノ酸脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片をベクターＤＮＡとＴ４　ＤＮＡリガーゼなどを用いて結合させることにより組換えプラスミドを得ることができる。このプラスミドを用いて、ベクターに挿入したアミノ酸脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片部分の塩基配列を解析、アミノ酸脱水素酵素のＮ末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列をコードする塩基があることを確認し、また、これより翻訳開始部位と終止コドンを確認することでオープンリーディングフレームを決定する。
　６．形質転換体・ベクター
　上記方法によって取得したＤＮＡ、または該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換えプラスミドを用いることにより、宿主微生物を形質転換し形質転換体を得ることができる。
　宿主、ベクターとしては、「組換えＤＮＡ実験指針」（科学技術庁研究開発局ライフサイエンス課編：平成８年３月２２日改定）に記載の宿主―ベクター系を用いることができる。
　例えば、宿主としては、エシェリヒア（Escherichia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、バチルス（Bacillus）属、セラチア（Serratia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アセトバクター（Acetobacter）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、又はロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物を用いることができる。
　ベクターは上記の宿主内で自律複製できる微生物由来のプラスミド、ファージまたはその誘導体が使用できる。なかでも、宿主微生物としてエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、ベクターとして当該微生物中で自律複製できるベクターを用いるのが好ましい。このようなベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９、ｐＳＣ１０１、ｐＴ７Ｂｌｕｅ、又はｐＵＣＮＴ、若しくはそれらの誘導体を挙げることができる。それらの誘導体とは、酵素の生産量上昇、プラスミド安定化を目的として、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ＳＤ配列、複製開始部位（ｏｒｉ）、その他の調節などに関わる遺伝子を改質したもの、また、薬剤耐性、クローニング部位の制限酵素サイトを改質したものなどを指す。
　形質転換体によっては、生産された酵素が不溶化し、インクルージョンボディーを形成する場合がある。このような場合には、培養条件を変更する、宿主微生物を変更する、あるいは目的遺伝子とシャペロン遺伝子を宿主微生物内で同時発現させることで、酵素の不溶化を回避できる場合がある。シャペロンとは、生体内で、蛋白質の正常な立体構造への折りたたみを介助する役割を持つ蛋白質である（例えばAppl. Biochem. Biotech.,　vol.66, pp197-238 (1997)を参照）。
　形質転換体の一例として、ロドコッカス　キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii)ＫＮＫ２１０８株から上記のようにして取得したＤＮＡをｐＵＣＴ（ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３参照）のＮｄｅＩサイトを破壊したプラスミドベクター）に組み込んだ組換えプラスミドｐＲＰＤ００２を用いて、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１を形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＲＰＤ００２）を得ることができる。
　エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１の菌学的性質は、「BIOCHEMICALS FOR LIFE SCIENCE」（東洋紡績株式会社、１９９３年、１１６－１１９頁）およびその他種々の公知文献に記載されており当業者に周知である。エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＲＰＤ００２）は、遺伝子組換えによって特定の酵素を産生し得る性質以外は、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１と同様の菌学的性質を有する。
　なお、本発明で用いた組換えＤＮＡ技術は当該分野において周知であり、例えば、Molecular Cloning 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、 (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)に記載されている。
　７．形質転換体等の培養
　本発明のアミノ酸脱水素酵素を生産しうる上記形質転換体等を培養することにより当該酵素を大量に生産することができ、Ｌ－アミノ酸、２－オキソ酸、又はＤ－アミノ酸の製造に利用することができる。
　微生物の培養は、通常の培地を用いて行えば良い。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源および無機塩類などの栄養素を含む通常の培地で良い。これに、ビタミン、アミノ酸などの有機微量栄養素を添加すると、好ましい結果が得られる場合が多い。炭素源としては、グルコースやシュークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類などが適宜使用される。窒素源としては、アンモニウム塩、アンモニア水、アンモニアガス、尿素、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカーなどが用いられる。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、鉄塩、硫酸塩、塩素などが用いられる。
　培養は温度範囲２５℃から４０℃で行えるが、２５℃から３７℃が特に好ましい。また、ｐＨは４から８で培養できるが５から７．５が好ましい。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。
　必要に応じてイソプロピル－１－チオ－β―Ｄ－ガラクトサイド（ＩＰＴＧ）、ラクトース等の添加等の酵素誘導のための処理を行なうこともできる。
　８．Ｌ－アミノ酸等の製造方法
　実施形態で得られるアミノ酸脱水素酵素を使用することによる、効率的なＬ－アミノ酸、２－オキソ酸、又はＤ－アミノ酸の製造方法について説明する。２－オキソ酸は、ラセミ体アミノ酸、又はＬ－アミノ酸にアミノ酸脱水素酵素を作用させ、Ｌ－アミノ酸を酸化することにより得ることができる（酸化的脱アミノ化反応）。Ｄ－アミノ酸は、前記酸化的脱アミノ化反応において、ラセミ体アミノ酸を基質とした時の残基質として得ることが可能である。Ｌ－アミノ酸は、２－オキソ酸にアミノ酸脱水素酵素を作用させ、２－オキソ酸を還元的にアミノ化することにより得ることができる（還元アミノ化反応）。またＬ－アミノ酸は、ラセミ体アミノ酸、又はＤ－アミノ酸にＤ－アミノ酸オキシダーゼを作用させ、Ｄ－アミノ酸を２－オキソ酸へと酸化し、さらにアミノ酸脱水素酵素を接触せしめ、反応させることにより、Ｌ－アミノ酸へと変換することもできる（立体反転反応）。
　９．Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ
　ここでＤ－アミノ酸オキシダーゼとは、酸素の存在下、Ｄ－アミノ酸を酸化し、２－オキソ酸、過酸化水素、及びアンモニアを生成する酵素である。本発明で用いるＤ－アミノ酸オキシダーゼとしては、動物、植物、微生物由来のものが使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。Ｄ－アミノ酸オキシダーゼの生産能力を有する微生物としては、例えば、以下の公知の当該酵素の生産能力を有する微生物である、アースロバクター（Arthrobacter）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、キャンディダ（Candida）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、クルブラリア（Curvularia）属、エクソフィアラ（Exophiala）属、フサリウム（Fusarium）属、ジベレラ（Gibberella）属、ハンセヌラ（Hansenula）属、クオエッケラ（Kloeckera）属、クリベロマイセス（Kluyveromyces）属、ニューロスポラ（Neurospora）属、ピキア（Phichia）属、ロドスポリディウム（Rhodosporidium）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、スポロボロマイセス（Sporobolomyces）属、トリゴノプシス（Trigonopsis）属、バーチシリウム（Verticillium）属、及びヤロヴィア（Yarrowia）属等が挙げられる。
　好ましくはキャンディダ（Candida）属に属する微生物由来の酵素が挙げられ、なかでもキャンディダ　インターメディア（Candida intermedia）由来の酵素が好ましく、さらに好ましくは、キャンディダ　インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株由来の酵素が挙げられる。
　Ｄ－アミノ酸オキシダーゼを効率良く高生産する高活性菌を得るためには、周知のとおり、形質転換微生物を作成することが有効である。作成方法としては、例えばＷＯ０７／０１５５１１記載のように、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ活性を示す菌株からＤ－アミノ酸オキシダーゼ遺伝子をクローニングした後、適当なベクターとの組換えプラスミドを作成して、これを用いて適当な宿主菌を形質転換することで得られる。なお、組換えＤＮＡ技術については当該分野において周知である。
　このようにして得られたＤ－アミノ酸オキシダーゼを高生産する形質転換体としてはＷＯ０７／０１５５１１記載の、キャンディダ　インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株由来のＤ－アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含有するエシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ　ＢＰ-１０６３９）又はエシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０６３８）を挙げることができる。
　これら形質転換体によるＤ－アミノ酸オキシダーゼ、あるいは前述のＤ－アミノ酸オキシダーゼ活性を示す菌株によるＤ－アミノ酸オキシダーゼの生産は、例えば、ＷＯ０７／０１５５１１記載の、通常の栄養培地を用いて培養を行なえば良く、必用に応じて、酵素誘導のための処理を行うこともできる。
　１０．補酵素再生系
　アミノ酸脱水素酵素による還元アミノ化反応は、ＮＡＤＨのような還元型の補酵素を必要とし、当該反応の進行に伴い、補酵素ＮＡＤＨは酸化型に変換される。この酸化型の補酵素を還元型に変換する能力（以後、還元型補酵素再生能と呼ぶ）を有する酵素、および、当該酵素の基質となる化合物を、アミノ酸脱水素酵素と共存させて当該反応を行うことにより、補酵素の使用量を大幅に削減できる。
　還元型補酵素再生能を有するポリペプチドとしては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルコース－６－リン酸脱水素酵素、又はグルコース脱水素酵素などを使用できる。
　好適には、ギ酸脱水素酵素が使用される。ギ酸脱水素酵素としては、植物、微生物由来のものが使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。微生物としては、当該酵素の生産能力を有する微生物であればいずれも利用できるが、例えば、以下の公知の、当該酵素の生産能力を有する微生物である、キャンディダ（Candida）属、クロイッケラ（Kloeckera）属、ピキア（Pichia）属、リポマイセス（Lipomyces）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、モラキセラ（Moraxella）属、ハイホマイクロビウム（Hyphomicrobium）属、パラコッカス（Paracoccus）属、チオバシラス（Thiobacillus）属、アンシロバクター（Ancylobacter）属がある。
　好ましくはチオバシラス（Thiobacillus）属、アンシロバクター（Ancylobacter）属に属する微生物由来の酵素が挙げられる。さらに好ましくはチオバシラス　エスピー（Thiobacillus sp．）ＫＮＫ６５ＭＡ（ＦＥＲＭ　ＢＰ－７６７１）、アンシロバクター　アクアティカス（Ancylobacter aquaticus）ＫＮＫ６０７Ｍ株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－７３３５）由来の酵素が挙げられる。
　ギ酸脱水素酵素を効率良く高生産する高活性菌を得るためには、周知のとおり、形質転換微生物を作成することが有効である。作成方法としては、例えばＷＯ０３／０３１６２６記載のように、ギ酸脱水素酵素活性を示す菌株からギ酸脱水素酵素遺伝子をクローニングした後、適当なベクターとの組換えプラスミドを作成して、これを用いて適当な宿主菌を形質転換することで得られる。なお、組換えＤＮＡ技術については当該分野において周知である。
　このようにして得られたギ酸脱水素酵素を高生産する形質転換体としてはＷＯ０３／０３１６２６記載の、チオバシラス　エスピー（Thiobacillus sp.）ＫＮＫ６５ＭＡ（ＦＥＲＭ　ＢＰ－７６７１）由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含有するエシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴ００１）（ＦＥＲＭ　ＢＰ-７６７２）又はエシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴ００２）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－７６７３）、又はＷＯ０２／４６４２７記載の、アンシロバクター　アクアティカス（Ancylobacter aquaticus）ＫＮＫ６０７Ｍ株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－７３３５）由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含有するエシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＡ００１）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－７３３４）を挙げることができる。
　これら形質転換体によるギ酸脱水素酵素の生産、あるいは前述のギ酸脱水素酵素活性を示す菌株によるギ酸脱水素酵素の生産は、例えば、ＷＯ０３／０３１６２６記載の、通常の栄養培地を用いて培養を行なえば良く、必用に応じて、酵素誘導のための処理を行うこともできる。
　アミノ酸脱水素酵素による酸化的脱アミノ化反応は、ＮＡＤのような酸化型の補酵素を必要とし、当該反応の進行に伴い、補酵素ＮＡＤは還元型に変換される。この還元型の補酵素を酸化型に変換する能力（以後、酸化型補酵素再生能と呼ぶ）を有する酵素、および、当該酵素の基質となる化合物を、アミノ酸脱水素酵素と共存させて当該反応を行うことにより、補酵素の使用量を大幅に削減できる。
　酸化型補酵素再生能を有するポリペプチドとしては、例えばＮＡＤＨオキシダーゼ等が挙げられる。ＮＡＤＨオキシダーゼは、補酵素再生反応のための基質として酸素が利用できること、その多くがＮＡＤＨに特異的であり、また触媒される反応が不可逆的である点などにおいて好ましい。なお、ＮＡＤＨオキシダーゼには水を生成するもの（水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ）と過酸化水素を生成するもの（過酸化水素生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ）の２種が知られているが、過酸化水素は酵素などに悪影響を与えることが知られており、その点で、水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼがより好ましい。
　上記水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼの酵素源としては、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ラクトバシルス（Lactobacillus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、ロイコノストック（Leuconostock）属、エンテロコッカス（Entrococcus）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、メタノコッカス（Methanococcus）属、セルプリナ（Serpulina）属、マイコプラズマ（Mycoplasma）属、ジアルディア（Giardia）属からなる群から選ばれた微生物由来の酵素群が挙げられ、好ましくはストレプトコッカス（Streptococcus）属微生物、さらに好ましくはストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、さらに好ましくはストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）ＮＣＩＭＢ１１７２３由来の酵素群が挙げられる。ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）ＮＣＩＭＢ１１７２３由来の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼは、そのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡの塩基配列はすでに報告されている(特開平８－１９６２８１)。
　１１．カタラーゼの添加
　前記立体反転反応には、カタラーゼを添加してもよい。カタラーゼを添加しない場合にも反応は進行し、生成物を得ることができるが、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ反応で生成する過酸化水素により基質、反応中間体、あるいは生成物が分解され、収率が低下する可能性がある。カタラーゼを添加することで、そのような基質、反応中間体、あるいは生成物の分解を抑えることができ、収率の向上が期待できる。カタラーゼは過酸化水素を水と酸素に分解する反応を触媒する酵素である。
　カタラーゼとしては、動物、植物、微生物由来のものが使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。微生物としては、当該酵素の生産能力を有する微生物であればいずれも利用できるが、例えば、以下の公知の、当該酵素の生産能力を有する微生物である、エシェリヒア（Escherichia）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、マイクロコッカス（Micrococcus）属、又はロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属等がある。
　また、市販の酵素も使用することもできる。市販酵素としては例えば、Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）、Ｔｅｒｍｉｎｏｘ　Ｕｌｔｒａ　２００Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）、ＣＡＴＡＬＡＳＥ（Ｂｅｅｆ　Ｌｉｖｅｒ）（Ｐ－Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｃａｌｓ，Ｉｎｃ．社製）がある。
　１２．形質転換体等
　なお、本発明において使用するアミノ酸脱水素酵素、補酵素再生能を有する酵素、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ、カタラーゼは、それぞれの酵素遺伝子を導入した形質転換体を育種し、培養して生産したものを使用してもよいし、複数の酵素遺伝子を導入した形質転換体を育種し、培養して生産したものを使用してもよい。
　本発明において、生産されたアミノ酸脱水素酵素、補酵素再生能を有する酵素、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ、およびカタラーゼは、酵素自体として用いることができるほか、微生物もしくはその処理物としても用いることができる。ここで、微生物の処理物とは、例えば、粗抽出液、培養菌体凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、またはそれらの菌体の破砕物を意味する。
　更にそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化して得た固定化酵素として用いられ得る。固定化は当業者に周知の方法である架橋法、共有結合法、物理的吸着法、包括法などで行い得る。
　１３．Ｌ－アミノ酸等の生産
　本発明の酸化的脱アミノ化反応による２－オキソ酸、又はＤ－アミノ酸の生産、還元アミノ化反応によるＬ－アミノ酸の生産、又は立体反転反応によるＬ－アミノ酸の生産は以下の方法で行なうことができる。
　酸化的脱アミノ化反応の基質としては、前記一般式（３）で表されるＬ－アミノ酸、又は前記一般式（４）で表されるラセミ体アミノ酸が挙げられる。還元アミノ化反応の基質としては、前記一般式（２）で表される２－オキソ酸が挙げられる。立体反転反応の基質としては、前記一般式（４）で表されるラセミ体アミノ酸、又は前記一般式（５）で表されるＤ－アミノ酸が挙げられる。
　これらの基質において、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１～２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数２～２０のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数２～２０のアルキニル基、置換基を有していてもよい炭素数４～２０のアリール基、または置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアラルキル基を示す。
　上記Ｒにおける置換基を有していてもよい炭素数１～２０のアルキル基としては、特に限定されず、例えば、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、１－メチルプロピル基、カルバモイルメチル基、２－カルバモイルエチル基、ヒドロキシメチル基、１－ヒドロキシエチル基、メルカプトメチル基、２－メチルチオエチル基、（１－メルカプト－１－メチル）エチル基、４－アミノブチル基、３－グアニジノプロピル基、４（５）－イミダゾールメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンタニル基、ヘキサニル基、ヘプタニル基、オクタニル基、２，２－ジメチルプロピル基、クロロメチル基、メトキシメチル基、２－ヒドロキシエチル基、３－アミノプロピル基、２－シアノエチル基、３－シアノプロピル基、４－（ベンゾイルアミノ）ブチル基、又は２－メトキシカルボニルエチル基等が挙げられる。
　置換基を有していてもよい前記炭素数２～２０のアルケニル基としては、特に限定されず、例えば、エテニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、ヘプテニル基、又はオクテニル基等が挙げられる。
　置換基を有していてもよい前記炭素数２～２０のアルキニル基としては、特に限定されず、例えば、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、ヘプチニル基、又はオクチニル基等が挙げられる。

　置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアラルキル基としては、特に限定されず、例えば、ベンジル基、インドリルメチル基、チアゾールメチル基、４－ヒドロキシベンジル基、ナフチルメチル基、アントラニルメチル基、ピリジルメチル基、ピリミジルメチル基、インダニルメチル基、インデニルメチル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基、ジフェニルメチル基、２－フルオロベンジル基、３－フルオロベンジル基、４－フルオロベンジル基、又は３，４－メチレンジオキシベンジル基等が挙げられる。
　置換基を有していてもよい炭素数４～２０のアリール基としては、フェニル基、４－ヒドロキシフェニル基、アントラニル基、ピリジル基、ピリミジル基、インダニル基、インデニル基、又はナフチル基等が挙げられる。
　置換基としては、アミノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、アルキル基、アラルキル基、アリール基、アルカノイル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、又はハロゲン原子等が挙げられる。
　また、Ｘは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を表し、特に限定されないが、例えば、水素原子、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどが挙げられる。　１４．酸化的脱アミノ化反応
　酸化的脱アミノ化反応では、上記基質に前述のアミノ酸脱水素酵素、前述の補酵素再生能を有する酵素とその基質となる化合物を同時に存在させ、水性媒体中で反応を行なう。上記酸化的脱アミノ化反応には、ＮＡＤ等の補酵素を添加してもよい。ＮＡＤ等の補酵素を添加しない場合にも、微生物中に存在するＮＡＤ等の補酵素により反応が進行する場合もあるが、ＮＡＤ等の補酵素を添加することで、反応の効率が向上することが期待できる。ＮＡＤ等の補酵素の添加濃度としては、基質に対して、好ましくは０当量以上、２当量以下、より好ましくは０．００００１当量以上、０．１当量以下、さらに好ましくは０．０００１当量以上、０．０１当量以下である。
　１５．還元アミノ化反応
　還元アミノ化反応では、上記基質に前述のアミノ酸脱水素酵素、アンモニア又はその塩、および前述の補酵素再生能を有する酵素とその基質となる化合物を同時に存在させ、水性媒体中で反応を行なう。上記還元アミノ化反応には、ＮＡＤ等の補酵素を添加してもよい。ＮＡＤ等の補酵素を添加しない場合にも、微生物中に存在するＮＡＤ等の補酵素により反応が進行する場合もあるが、ＮＡＤ等の補酵素を添加することで、反応の効率が向上することが期待できる。ＮＡＤ等の補酵素の添加濃度としては、基質に対して、好ましくは０当量以上、２当量以下、より好ましくは０．００００１当量以上、０．１当量以下、さらに好ましくは０．０００１当量以上、０．０１当量以下である。
　１６．立体反転反応
　立体反転反応では、上記基質に前述のＤ－アミノ酸オキシダーゼ、前述のアミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素とその基質となる化合物を同時に存在させ、水性媒体中で反応を行なう。反応にはカタラーゼを添加してもよい。カタラーゼを添加することでＤ－アミノ酸オキシダーゼの反応で生成する過酸化水素を分解し、基質、反応中間体、あるいは生成物の分解を抑えることができる。
　また、上記反応にＦＡＤを添加してもよい。ＦＡＤはＤ－アミノ酸オキシダーゼの補酵素であり、添加することにより、反応の効率が向上することが期待できる。ＦＡＤの添加濃度としては、基質に対して、好ましくは０当量以上、１０当量以下、より好ましくは０当量以上、１当量以下、さらに好ましくは０当量以上、０．１当量以下である。
　また、上記立体反転反応にはＮＡＤ等の補酵素を添加してもよい。ＮＡＤ等の補酵素を添加しない場合にも、微生物中に存在するＮＡＤ等の補酵素により反応が進行する場合もあるが、ＮＡＤ等の補酵素を添加することで、反応の効率が向上することが期待できる。ＮＡＤ等の補酵素の添加濃度としては、基質に対して、好ましくは０当量以上、２当量以下、より好ましくは０．００００１当量以上、０．１当量以下、さらに好ましくは０．０００１当量以上、０．０１当量以下である。
　また、上記立体反転反応にアンモニア又はその塩を添加してもよい。アンモニアの添加濃度としては、基質に対して、好ましくは０当量以上、１０当量以下、より好ましくは０当量以上、２当量以下、さらに好ましくは０．１当量以上、１．５当量以下である。
　上記酸化的脱アミノ化反応、還元アミノ化反応、および立体反転反応の基質の仕込み濃度は０．１％（ｗ／ｖ）以上、９０％（ｗ／ｖ）以下、好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上、６０％（ｗ／ｖ）以下で溶解または懸濁した状態で反応を行い、上記酸化的脱アミノ化反応、還元アミノ化反応、および立体反転反応における反応温度は１０℃以上、８０℃以下、好ましくは２０℃以上、６０℃以下の適当な温度で調節し、ｐＨ４以上、１２以下、好ましくはｐＨ６以上、１１以下に保ちつつ暫時静置または攪拌すればよい。また、基質は一括添加してもよいし、分割添加してもよいし、連続的に添加してもよい。上記酸化的脱アミノ化反応、還元アミノ化反応、および立体反転反応は、バッチ法または連続方式で行い得る。
　本発明の酸化的脱アミノ化反応、還元アミノ化反応、および立体反転反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。水性媒体としては、水、緩衝液、これらにエタノールのような水溶性有機溶媒を含む水性媒体、あるいは、水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ－ヘキサンなどの有機溶媒を含む水性媒体との２層系などの適当な溶媒を用いることができる。さらに必用に応じて、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、金属などを添加することもできる。
　１７．生成物の単離
　生成したＬ－アミノ酸、２―オキソ酸、又はＤ－アミノ酸の単離は、常套分離方法、例えば、抽出、濃縮、晶析、またはカラムクロマトグラフィーなどの分離方法や、それらの組み合わせにより分離、精製することができる。
　以下に本発明の具体的な実施例を示す。しかし、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
　（実施例１）アミノ酸脱水素酵素の単離・精製
　ロドコッカス　キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii)ＫＮＫ２１０８株を、５００ｍｌ坂口フラスコ内で滅菌した５０ｍｌの培地（肉エキス１．０％、ポリペプトン１．０％、イーストエキス０．５％、ＮａＣｌ０．３％、滅菌前ｐＨ７．０）に植菌して３０℃で２３時間、好気的に振とう培養した。この培養液３０ｍｌを５Ｌジャーファーメンター内で滅菌した３Ｌの培地Ａ（Ｌ－Ｐｈｅ１．０％、ポリペプトン０．１％、イーストエキス０．１％、肉エキス０．１％、ＫＨ２ＰＯ４０．４５％、Ｎａ２ＨＰＯ４０．６２％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．０２％、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ０．０００２％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．００００４％、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ０．００００２％、アデカノールＬＧ１０９０．０１％、滅菌前ｐＨ７．０）に植菌して通気量０．３ｖｖｍ、攪拌４５０ｒｐｍ、３０℃で３１時間、好気的に培養した。
　培養終了後、遠心分離で菌体を集菌して、１０％のグリセリンを含む０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に菌体を懸濁後、超音波により菌体を破砕し、これを遠心分離した。上清に硫酸アンモニウムを５０％飽和で加えた時に塩析する沈殿を遠心分離で取得した。この画分を２０％のグリセリンを含む０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解、同緩衝液で透析後、ＤＥＡＥ－ＴＯＹＯＰＥＡＬ（東ソー社製）にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、同緩衝液で洗浄後、同緩衝液で０Ｍから０．４Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配をかけて溶出し、活性のあるフラクションを集めた。この活性画分を、Ｂｌｕｅ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、２０％のグリセリンを含む０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で０Ｍから０．４Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配をかけて溶出した。得られた活性画分に、終濃度１Ｍとなるように硫酸アンモニウムを溶解した後、ＲＥＳＯＵＲＣＥ　ＰＨＥ　６ｍｌ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いてカラムクロマトグラフィーを行ない、２０％のグリセリンを含む０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で１Ｍから０Ｍの硫酸アンモニウムの濃度勾配をかけて溶出した。ここで得られた活性画分をＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動によって分析したところ、アミノ酸脱水素酵素は単一バンドとして検出され、精製酵素の純粋性が確認できた。
　（実施例２）アミノ酸脱水素酵素の性質
　実施例１で得られた精製アミノ酸脱水素酵素の性質を以下のように調べた。
[比活性]
　アミノ酸脱水素酵素の活性測定は、１０ｍＭの基質フェニルピルビン酸を含む０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）１．５ｍｌに、０．５Ｍ　ＮＨ３／ＮＨ４Ｃｌ緩衝液（ｐＨ９．０）１．２ｍｌ、３ｍＭの補酵素ＮＡＤＨを含む０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）０．２ｍｌ、および適宜希釈した酵素溶液０．１ｍｌを添加し、３０℃で１分間反応させた際の、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から算出した。このとき１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを消費する酵素量を１ｕｎｉｔと定義した。また、タンパク質の定量は、ＢＳＡを標準タンパク質としてＢｒａｄｆｏｒｄ法で行った。精製したアミノ酸脱水素酵素の比活性は２０４ｕｎｉｔ／ｍｇタンパク質（３０℃）であった。
　[作用温度の範囲・至適温度]
　作用温度の範囲と至適温度を調べた。３０℃での活性を１００％とした場合の各温度での相対活性を図１に示した。本酵素は少なくとも検討した５～７０℃の範囲でよく作用し、至適温度は４５℃～５０℃であった。
　[作用ｐＨの範囲・至適ｐＨ]
　作用ｐＨの範囲と至適ｐＨを調べた。ｐＨ７．０から７．９の範囲では０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液を、ｐＨ７．９から８．８の範囲では０．１ＭのＴｒｉｓ－塩酸緩衝液を、ｐＨ８．８から１０．５までの範囲では０．１Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液を、ｐＨ１０．５から１１．０の範囲では０．１Ｍのグリシン／塩化ナトリウム／水酸化ナトリウム緩衝液を使用し、ｐＨ９．０での活性を１００％とした場合の各ｐＨでの相対活性を図２に示した。本酵素は少なくとも検討したｐＨ７．１～１１．０の範囲で作用し、至適ｐＨは８．８～１０．０であった。
　[分子量の測定]
　実施例１で得られた精製アミノ酸脱水素酵素を含む画分を、限外濾過膜(分画分子量１０，０００)を用いて濃縮した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００　ＨＲ　１０／３０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライしてＦＰＬＣによるゲルろ過クロマトグラフィーを行い、０．１５Ｍの塩化ナトリウムと２０％のグリセリンを含む０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出した。標準タンパク質の溶出時間と比較して分子量を測定したところ、約９４,０００（８６,０００以上、９８，０００以下）であった。また、ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動により標準タンパク質との移動度と比較してサブユニット分子量を測定したところ、約４６，０００（４３，０００以上、４９，０００以下）であり、本発明のアミノ酸脱水素酵素は同一のサブユニットからなる２量体構造であった。
　[基質特異性]
　精製アミノ酸脱水素酵素の基質特異性を調べた。前記酵素活性測定における基質フェニルピルビン酸をそれぞれの基質に変更し、酵素活性を測定した。ただし、ナフチルピルビン酸に対する酵素活性は、ナフチルピルビン酸１．０ｍｇ、硫酸アンモニウム１２．３ｍｇおよびＮＡＤＨ６．１ｍｇを含む０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに、適宜希釈した酵素溶液１００μｌを添加し、３０℃で３０分間に生成する２－ナフチルアラニンの増加量をＨＰＬＣで定量することにより求めた。ＨＰＬＣ分析は、カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ　５Ｃ１８－ＡＲII（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）、溶離液：１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．０）／アセトニトリル＝５／１、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出：２１０ｎｍで行なった。このとき１分間に１μｍｏｌの２－ナフチルアラニンを生成する酵素量を１ｕｎｉｔと定義した。また、インドールピルビン酸に対する酵素活性は、インドールピルビン酸２．０ｍｇ、硫酸アンモニウム２６．０ｍｇおよびＮＡＤＨ７．６ｍｇを含む０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌ、適宜希釈した酵素溶液１００μｌを添加し、３０℃で３０分間に生成するＬ－トリプトファンの増加量をＨＰＬＣで定量することにより求めた。ＨＰＬＣ分析は、カラム：ＣＲＯＷＮＰＡＫ　ＣＲ－（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、ダイセル社製）、溶離液：ＨＣｌＯ４水溶液（ｐＨ２．０）、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：３０℃、検出：２１０ｎｍで行なった。このとき１分間に１μｍｏｌのＬ－トリプトファンを生成する酵素量を１ｕｎｉｔと定義した。表１は、フェニルピルビン酸に対する活性を１００％としたときの相対活性値を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（実施例３）アミノ酸脱水素酵素のＮ末端アミノ酸配列および内部アミノ酸配列決定
　実施例１で得られた精製アミノ酸脱水素酵素を、逆相ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ　ＰＲＯＴＥＩＮ－ＲＰ（ＹＭＣ社製）、溶離液：２０％アセトニトリル水溶液～８０％アセトニトリル水溶液のグラジエント、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：２５℃、検出：２３０ｎｍ）により分取精製した後、Ｎ末端のアミノ酸配列を気相プロテイン・シークエンサーＰＰＳＱ－３３Ａ（島津社製）を用いて決定した。さらに、実施例１で精製したアミノ酸脱水素酵素にＶ８プロテアーゼ（Ｗａｋｏ社製）を４Ｍの尿素の存在下作用させて生成したポリペプチド断片を上記と同様の逆相ＨＰＬＣを用いて精製した後、上記と同様の方法でアミノ酸脱水素酵素の内部アミノ酸配列を決定した。
　（実施例４）アミノ酸脱水素酵素遺伝子の単離
　ロドコッカス　キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii)ＫＮＫ２１０８株を、試験管内で滅菌した５ｍｌの培地（肉エキス１．０％、ポリペプトン１．０％、イーストエキス０．５％、ＮａＣｌ０．３％、滅菌前ｐＨ７．０）に植菌して３０℃で３８時間、好気的に振とう培養した。得られた菌体から、UltraClean Microbial DNA Isolation Kit（MO BIO Laboratories, Inc.社製）を用いて染色体ＤＮＡを調製した。Ｎ末端アミノ酸配列にもとづいて設計したＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ－１：配列表の配列番号３）と、内部アミノ酸配列にもとづいて設計したＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ－２：配列表の配列番号４）を用いて、先に得た染色体ＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ１００ｎｇにＥｘ　ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）０．２５μｌ、１０×Ｅｘ　Ｔａｑ　Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）５μｌ、２．５ｍＭ各ｄＮＴＰ溶液４μｌ、２０μＭプライマー水溶液各２μｌを添加し、さらに滅菌水を加えて総量が５０μｌになるように調整した反応液を調製し、熱変性（９４℃、６０秒）、アニーリング（４８℃、６０秒）、伸長反応（７２℃、６０秒）を３０サイクル繰り返した後、４℃まで冷却することにより行なった。この結果、目的のアミノ酸脱水素酵素遺伝子の一部（部分遺伝子と称す）を取得した。この部分遺伝子の塩基配列をＤＮＡシーケンサー3130xl Genetic Analyzer（Applied Biosystems社製）を用いて決定した。
　次に、目的遺伝子の全長を取得するために以下の操作を行った。上記部分遺伝子において、酵素のＮ末端側、Ｃ末端側それぞれの部分に相当する塩基配列にもとづき、部分遺伝子の外側方向へ向けたＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ－３：配列表の配列番号５、及び、Ｐｒｉｍｅｒ－４：配列表の配列番号６）を合成した。このプライマーを用い、先に得た染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ、あるいはＨｉｎｃIIで分解したものをＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて環化させて得たＤＮＡを鋳型に、インバースＰＣＲを行った。ＰＣＲは、基本的に上記と同様に行ったが、熱変性（９６℃、３０秒）、アニーリング（６０℃、６０秒）、伸長反応（７２℃、３００秒）とした。
　これにより、既に取得した部分遺伝子のさらに外側の遺伝子部分を含むＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片の塩基配列を上記と同様の方法で決定後、先の部分遺伝子の塩基配列と合わせることで、配列表の配列番号７に示す開始コドンから終止コドンまでを含むアミノ酸脱水素酵素遺伝子の全塩基配列を決定した。決定した全塩基配列中に、実施例３で、精製したアミノ酸脱水素酵素を用いて決定したＮ末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列をコードする塩基が含まれることを確認した。次にアミノ酸脱水素酵素遺伝子のＮ末端、Ｃ末端部分にそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩの切断部位を結合させた配列を持つプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ－５：配列表の配列番号８、Ｐｒｉｍｅｒ－６：配列表の配列番号９）を用いて、この間のＤＮＡを先に得た染色体ＤＮＡを鋳型にＰＣＲにより増幅することで、配列表配列番号２に示されるオープンリーディングフレームのＤＮＡ断片を取得した。ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ１００ｎｇにＰｒｉｍｅＳＴＡＲＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）０．５μｌ、５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）１０μｌ、２．５ｍＭ各ｄＮＴＰ溶液４μｌ、２０μＭプライマー水溶液各０．５μｌを添加し、さらに滅菌水を加えて総量が５０μｌになるように調整した反応液を調製し、熱変性（９８℃、１０秒）、アニーリング（５５℃、５秒）、伸長反応（７２℃、９０秒）を２５サイクル繰り返した後、４℃まで冷却することにより行なった。
　（実施例５）アミノ酸脱水素酵素遺伝子を発現する組換えプラスミドの作成
　実施例４で得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＫｐｎＩで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＵＣＴ（ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３参照）のＮｄｅＩサイトを破壊したプラスミドベクター）とＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、図３の制限酵素地図で表され、アミノ酸脱水素酵素遺伝子を大量に発現できるように設計されたプラスミドｐＲＰＤ００２を取得した。
　（実施例６）アミノ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを用いた形質転換体の作成
　実施例５で得られたプラスミドｐＲＰＤ００２をエシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセルと混合することで形質転換を行い、培地（トリプトン１０ｇ、イーストエキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、寒天１５ｇ、アンピシリン１００ｍｇ、脱イオン水にて１ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）にプレーティングして、アミノ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体エシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＲＰＤ００２）をコロニーとして取得した。
　得られた形質転換体のコロニーを、試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地（トリプトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、アンピシリン１００ｍｇ、脱イオン水にて１ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に植菌後、３７℃で２４時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離により菌体由来の不溶物を除去して、形質転換体のアミノ酸脱水素酵素液を取得した。得られた酵素液を用いて、実施例２に示す方法でアミノ酸脱水素酵素活性を測定したところ、アミノ酸脱水素酵素活性が確認された。
　（実施例７）アミノ酸脱水素酵素活性菌を利用した還元アミノ化反応によるＬ－アミノ酸合成
　ロドコッカス　キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii)ＫＮＫ２１０８株を、試験管内にて滅菌した６ｍｌの実施例１記載の培地Ａに植菌して３０℃で４８時間、好気的に振とう培養した。得られた培養液５ｍｌ分の菌体を遠心分離により集菌し、１．０ｍｌの０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。得られた粗酵素液１５０μｌ、ナフチルピルビン酸１．５ｍｇ、硫酸アンモニウム１．９ｍｇ、ＮＡＤＨ９．５ｍｇ、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１５０μｌを混合して、３０℃で１６時間反応した後、反応液を水で５０倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、Ｌ－ナフチルアラニンを定量した。
　ＨＰＬＣ分析は次に示す条件で実施した。カラム：ＣＨＩＲＯＢＩＯＴＩＣ　Ｔ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、ＡＳＴＥＣ社製）、溶離液：水／エタノール＝３／７、流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出：２１０ｎｍ。その結果、反応収率５４．６ｍｏｌ％でＬ－ナフチルアラニンが生成した。
　（実施例８）形質転換体を利用したＬ－アミノ酸の合成
　実施例６で得たアミノ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体エシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＲＰＤ００２）を培養液から遠心分離により集菌し、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕し、菌体破砕液を調製した。また、後述する方法で得たギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体を培養液から遠心分離により集菌し、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕し、菌体破砕液を調製した。また、後述する方法で得たＤ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体を培養液から遠心分離により集菌し、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕し、菌体破砕液を調製した。それらの菌体破砕液を、ＤＬ－ナフチルアラニン、ＤＬ－ホモフェニルアラニン、又はＤＬ－トリプトファンのそれぞれに作用させて、立体反転反応により対応するＬ－アミノ酸を合成した。
　ギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体の培養液は次のようにして得た。チオバシラス　エスピー（Thiobacillus sp.）ＫＮＫ６５ＭＡ（ＦＥＲＭ　ＢＰ－７６７１）由来のギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体であるエシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴ００２）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－７６７３）を、試験管内で滅菌した６ｍｌの培地（トリプトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、水１ｌ、滅菌前ｐＨ７）に接種して、３０℃で２４時間振とう培養した。また、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体の培養液は次のようにして得た。キャンディダ　インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株由来のＤ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体であるエシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０６３９）を、試験管内で滅菌した６ｍｌの培地（トリプトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、水１ｌ、滅菌前ｐＨ７）に接種して、３７℃で２４時間振とう培養した。
　（８－１）ＤＬ－ナフチルアラニンからＬ－ナフチルアラニンの合成
　前記のアミノ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体エシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＲＰＤ００２）の培養液１０ｍｌ分、前記のＤ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体の培養液１０ｍｌ分、前記のギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体培養液１０ｍｌ分の各菌体を、遠心分離により集菌し、それぞれ１ｍｌの０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕し、菌体破砕液を調製した。得られた菌体破砕液と、ＤＬ－ナフチルアラニン１０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、ＮＡＤ＋０．３７ｍｇ、ギ酸アンモニウム２７ｍｇ、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混合して１．０ｍｌになるように反応液を調製し、３０℃で１９時間反応した。反応液を水で２０倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析によるアミノ酸の定量は実施例７と同条件で実施した。その結果、ラセミ体アミノ酸に対して９７．０ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ－ナフチルアラニンが得られた。
　（８－２）ＤＬ－ホモフェニルアラニンからＬ－ホモフェニルアラニンの合成
　上記実施例（８－１）と同様に調製した菌体破砕液と、ＤＬ－ホモフェニルアラニン１０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、ＮＡＤ＋０．３７ｍｇ、ギ酸アンモニウム２７ｍｇ、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混合して１．０ｍｌになるように反応液を調製し、３０℃で１９時間反応した。反応液を水で２０倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析によるアミノ酸の定量は実施例７と同条件で実施した。その結果、ラセミ体アミノ酸に対して９８．６ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ－ホモフェニルアラニンが得られた。
　（８－３）ＤＬ－トリプトファンからＬ－トリプトファンの合成
　上記実施例（８－１）と同様に調製した菌体破砕液と、ＤＬ－トリプトファン１０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、ＮＡＤ＋０．３７ｍｇ、ギ酸アンモニウム２７ｍｇ、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混合して１．０ｍｌになるように反応液を調製し、３０℃で１９時間反応した。反応液を水で２０倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析によるアミノ酸の定量は実施例７と同条件で実施した。その結果、ラセミ体アミノ酸に対して９４．５ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ－トリプトファンが得られた。
　（実施例９）アミノ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ、及びシャペロン遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを用いた形質転換体の作製
　実施例５で得られたプラスミドｐＲＰＤ００２、及び市販のシャペロンプラスミドｐＧｒｏ７（Ｔａｋａｒａ社製、シャペロンプラスミドセット）をエシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセルと混合し形質転換を行うことで、アミノ酸脱水素酵素遺伝子、及びシャペロン遺伝子を発現できる形質転換体エシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＲＰＤ００２、ｐＧｒＯ７）を作製した。
　（実施例１０）形質転換体を用いたアミノ酸脱水素酵素の生産
　実施例９で得た形質転換体エシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＲＰＤ００２、ｐＧｒＯ７）を、試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地（トリプトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、アンピシリン１００ｍｇ、クロラムフェニコール１００ｍｇ、脱イオン水にて１ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリン、及びクロラムフェニコールは滅菌後に添加する）に接種して、３０℃で２４時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液１ｍｌから遠心分離により菌体を集菌し、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌに懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離により菌体由来の不溶物を除去して、形質転換体の無細胞抽出液（可溶性画分）を取得した。菌体由来の不溶物は、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌで再懸濁し、これを不溶性画分溶液とした。また、実施例６で得た形質転換体エシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＲＰＤ００２）から上記と同様の方法（ただし、培地にはクロラムフェニコールを添加しない）で、形質転換体の無細胞抽出液（可溶性画分）と不溶性画分溶液を取得した。
　それぞれの形質転換体から得た可溶性画分と不溶性画分を、ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動によって分析したところ、形質転換体エシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＲＰＤ００２）では、アミノ酸脱水素酵素の大部分が、不溶性画分に存在していたのに対し、形質転換体エシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＲＰＤ００２、ｐＧｒＯ７）では、アミノ酸脱水素酵素の大部分が、可溶性画分に存在することが確認された。
　また、それぞれの形質転換体から得た無細胞抽出液を用いて、実施例２に示す方法でアミノ酸脱水素酵素活性を測定したところ、形質転換体エシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＲＰＤ００２、ｐＧｒＯ７）から得た無細胞抽出液は、形質転換体エシェリヒア　コリ（Eschesrichia coli）ＨＢ１０１（ｐＲＰＤ００２）から得た無細胞抽出液の約６１倍のアミノ酸脱水素酵素活性を示した。
　（実施例１１）アミノ酸脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換体の作製
　ロドコッカス　キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii）ＫＮＫ２１０８株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１０６７）由来のアミノ酸脱水素酵素遺伝子（配列番号２）の５’末端側にＮｄｅＩ認識部位を、３’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位を付加した遺伝子を、ＤＮＡポリメラーゼＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲを行い取得した。上記のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、GenBank Accession No.L09136）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１－４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＲＨを構築した。構築した組換えベクターｐＮＲＨを用いて、エシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、エシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＮＲＨ）を得た。得られた形質転換体を、試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地（トリプトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、アンピシリン１００ｍｇ、脱イオン水にて１ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に接種して、３０℃で２４時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN社製）を用いてプラスミドｐＮＲＨを抽出した。
　次に、チオバシラス　エスピー（Thiobacillus sp.）ＫＮＫ６５ＭＡ（ＦＥＲＭ　ＢＰ－７６７１）由来のギ酸脱水素酵素遺伝子（ＷＯ０３／０３１６２６記載の配列表配列番号３参照）の５’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位を、３’末端側にＫｐｎＩ認識部位を付加した遺伝子を、ＤＮＡポリメラーゼＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲを行い取得した。得られたＤＮＡ断片を上記で構築したプラスミドｐＮＲＨのＥｃｏＲＩ認識部位とＫｐｎＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＲＨＳＦＤを構築した。組換えベクターｐＮＲＨＳＦＤを用いて、エシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換することで、アミノ酸脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体エシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＮＲＨＳＦＤ）を作製した。
　（実施例１２）アミノ酸脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換体を用いたＬ－ナフチルアラニンの合成
　実施例１１で得た形質転換体エシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＮＲＨＳＦＤ）を試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地（トリプトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、アンピシリン１００ｍｇ、脱イオン水にて１ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に接種して、３０℃で２４時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕し、菌体破砕液を調製した。また、実施例８と同様の方法で、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体の菌体破砕液を調製した。調製したそれぞれの菌体破砕液と、ＤＬ－ナフチルアラニン１０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、ＮＡＤ＋０．３７ｍｇ、ギ酸アンモニウム２７ｍｇ、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混合して１．０ｍｌになるように反応液を調製し、３０℃で１９時間反応した。反応液を水で２０倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析によるアミノ酸の定量は実施例７と同条件で実施した。その結果、ラセミ体アミノ酸に対して９４．２ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ－ナフチルアラニンが得られた。
　（実施例１３）アミノ酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、及びＤ－アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換体の作製
　キャンディダ　インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株由来のＤ－アミノ酸オキシダーゼ遺伝子（ＷＯ０７／０１５５１１記載の配列表配列番号２参照）の５’末端側にＫｐｎＩ認識部位を、３’末端側にＢａｍＨＩ認識部位を付加した遺伝子を、ＤＮＡポリメラーゼＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲを行い取得した。得られたＤＮＡ断片を実施例１１で構築したプラスミドｐＮＲＨＳＦＤのＫｐｎＩ認識部位とＢａｍＨＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＲＨＳＦＤＣＤＡを構築した。組換えベクターｐＮＲＨＳＦＤＣＤＡを用いて、エシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換することで、アミノ酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、及びＤ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＮＲＨＳＦＤＣＤＡ）を作製した。
　（実施例１４）アミノ酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、及びＤ－アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換体を利用したＬ－アミノ酸の合成
　（１４－１）ＤＬ－ナフチルアラニンからＬ－ナフチルアラニンの合成
　実施例１３で作製したアミノ酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、及びＤ－アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア　コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＮＲＨＳＦＤＣＤＡ）を、試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地（トリプトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、アンピシリン１００ｍｇ、脱イオン水にて１ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に接種して、３０℃で２４時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液１０ｍｌ分から遠心分離により菌体を集菌し、１ｍｌの０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁することで菌体濃縮液を調製した。得られた菌体濃縮液と、ＤＬ－ナフチルアラニン１０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、ＮＡＤ＋０．３７ｍｇ、ギ酸アンモニウム２７ｍｇ、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混合して１．０ｍｌになるように反応液を調製し、３０℃で２４時間反応した。反応液を水で２０倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析によるアミノ酸の定量は実施例７と同条件で実施した。その結果、ラセミ体アミノ酸に対して８９．６ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度９５．９％ｅｅのＬ－ナフチルアラニンが得られた。
　（１４－２）ＤＬ－ホモフェニルアラニンからＬ－ホモフェニルアラニンの合成
　上記実施例（１４－１）と同様に調製した菌体濃縮液と、ＤＬ－ホモフェニルアラニン１０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、ＮＡＤ＋０．３７ｍｇ、ギ酸アンモニウム２７ｍｇ、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混合して１．０ｍｌになるように反応液を調製し、３０℃で２４時間反応した。反応液を水で２０倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析によるアミノ酸の定量は実施例７と同条件で実施した。その結果、ラセミ体アミノ酸に対して１０２．７ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ－ホモフェニルアラニンが得られた。
　（１４－３）ＤＬ－トリプトファンからＬ－トリプトファンの合成
　上記実施例（１４－１）と同様に調製した菌体濃縮液と、ＤＬ－トリプトファン１０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、ＮＡＤ＋０．３７ｍｇ、ギ酸アンモニウム２７ｍｇ、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混合して１．０ｍｌになるように反応液を調製し、３０℃で２４時間反応した。反応液を水で２０倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析によるアミノ酸の定量は実施例７と同条件で実施した。その結果、ラセミ体アミノ酸に対して９７．３ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ－トリプトファンが得られた。

Claims (25)

  1. 　以下の(ａ)、(ｂ)、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡ：
    (ａ)配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ；
    (ｂ)配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
    (ｃ)配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
    (ｄ)配列表配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ;
    (ｅ)配列表配列番号２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
    (ｆ) 配列表配列番号２に示される塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
  2. 　以下の(ｇ)、(ｈ)又は(ｉ)のポリペプチド:
    (ｇ)配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
    (ｈ)配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド；
    (ｉ)配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
  3. 　アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであって、
    一般式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     （式中、Ｒ'は置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアルキニル基、置換基を有していてもよい炭素数４～２０のアリール基、または置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアラルキル基を示す。また、Ｘは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を示す。）で表される２－オキソ酸に対する活性を有し、かつナフチルピルビン酸に対する活性が、フェニルピルビン酸に対する活性の１／５０以上であるポリペプチド。
  4. 　上記一般式（１）において、Ｒ'がインドリルメチル基あるいはフェニルエチル基である請求項３記載のポリペプチド。
  5. ロドコッカス（Rhodococcus）由来である請求項２から４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  6. ロドコッカス　キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii）由来である請求項２から５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  7. ロドコッカス　キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii）ＫＮＫ２１０８由来である請求項２から６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  8. 請求項１記載のＤＮＡをベクターに挿入して得られる組換えプラスミド。
  9. 請求項８記載の組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体。
  10. 請求項１記載のＤＮＡ、及びシャペロンをコードするＤＮＡで形質転換して得られる形質転換体。
  11. 前記宿主微生物がエシェリヒア　コリ（Escherichia coli）である請求項９又は１０に記載の形質転換体。
  12. 請求項２から４のいずれか１項に記載のポリペプチドを生産する能力を有し、かつ、ロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物。
  13. ロドコッカス　キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii）である請求項１２記載の微生物。
  14. ロドコッカス　キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii）ＫＮＫ２１０８である請求項１２記載の微生物。
  15. 請求項２から７のいずれか１項に記載のポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物中に当該ポリペプチドを蓄積させ、これを採取するアミノ酸脱水素酵素の製造方法。
  16. 前記微生物が、請求項９又は１０記載の形質転換体、又は、請求項１２記載の微生物である、請求項１５に記載のアミノ酸脱水素酵素の製造方法。
  17. 請求項２から７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項９又は１０記載の形質転換体、または請求項１２の微生物を、
    一般式（２）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     （式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１～２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数２～２０のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数２～２０のアルキニル基、置換基を有していてもよい炭素数４～２０のアリール基、または置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアラルキル基を示す。Ｘは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を示す。）で表される２－オキソ酸に作用させ、
    一般式（３）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
     （式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるＬ－アミノ酸を製造する方法。
  18. 還元型補酵素再生能を有する酵素の存在下にて行う、請求項１７記載のＬ－アミノ酸の製造方法。
  19. 請求項２から７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項９又は１０記載の形質転換体、または請求項１２の微生物を、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ存在下、
    一般式（４）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
     （式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるラセミ体アミノ酸、又は
    一般式（５）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
     （式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるＤ－アミノ酸に作用させ、
    一般式（３）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
     （式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるＬ－アミノ酸を製造する方法。
  20. 還元型補酵素再生能を有する酵素の存在下にて行う、請求項１９記載のＬ－アミノ酸の製造方法。
  21. カタラーゼ存在下にて行う、請求項１９又は２０記載のＬ－アミノ酸の製造方法。
  22. 請求項２から７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項９又は１０記載の形質転換体、または請求項１２の微生物を、
    一般式（３）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
     （式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるＬ－アミノ酸、又は
    一般式（４）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
     （式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるラセミ体アミノ酸に作用させ、
    一般式（２）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
     （式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表される２－オキソ酸、又は
    一般式（５）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
     （式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるＤ－アミノ酸を製造する方法。
  23. 酸化型補酵素再性能を有する酵素の存在下にて行う、請求項２２記載の２－オキソ酸、又はＤ－アミノ酸の製造方法。
  24. 前記ポリペプチドが請求項９又は１０に記載の形質転換体、又は請求項１２記載の微生物が生産するアミノ酸脱水素酵素である、請求項１７から２１のいずれか１項に記載のＬ－アミノ酸の製造方法。
  25. 前記ポリペプチドが請求項９又は１０に記載の形質転換体、又は請求項１２記載の微生物が生産するアミノ酸脱水素酵素である、請求項２２又は２３に記載の２－オキソ酸、又はＤ－アミノ酸の製造方法。
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