JPS61239887A

JPS61239887A - Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素

Info

Publication number: JPS61239887A
Application number: JP60080293A
Authority: JP
Inventors: Yasuhisa Asano; 泰久浅野; Akiko Nakazawa; 仲沢　章子; Atsuro Terajima; 孜郎寺島; Sei Kondo; 近藤　聖
Original assignee: Sagami Chemical Research Institute
Current assignee: Sagami Chemical Research Institute
Priority date: 1985-04-17
Filing date: 1985-04-17
Publication date: 1986-10-25
Anticipated expiration: 2009-04-27
Also published as: JPH0630572B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕この発明は、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素及びその
製造方法、該酵素を産生ずる微生物、並びに該酵素を使
用するＬ−フェニルアラニンの製造方法に関する。

〔従来の技術〕

本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素に類似する作
用を有するＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ及び
この酵素を利用するし一α−アミノカルボン酸の製造方
法が特開昭５９−１９８９７２に記載されている。しか
しながらこの公開された明細書に記載されているＬ−フ
ェニルアラニンデヒドロゲナーゼはブレビバクテリウム
（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｎ＋）属細菌により生産
されたものであり、この明細書にはスポロサルシナ（Ｓ
ｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属細菌及びバシルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）属細菌が同様の酵素を生産することは全く
示唆されていない。またこのＬ−フェニルアラニンデヒ
ドロゲナーゼは１３０．０００±ｔｏ、　ｏｏｏの分子
量を有し、分子量６６．０００±５．０００のサブユニ
ットから成る点、及びフェニルピンピン酸のみならずｐ
−ヒドロキシフェニルピルビン酸、インドールピルビン
酸等広範囲の基質に対して高い特異性を有する点等にお
いて、本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素とは全
く異なる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って本発明は、今までＬ−フェニルアラニン脱水素酵
素を生産することが知られていなかった微生物に由来す
る新規なＬ−フェニルアラニン脱水素酵素、該酵素を生
産する新規な微生物及び該酵素の新規な製造方法、並び
に該酵素を利用するＬ−フェニルアラニンの新規な製造
方法を提供しようとするものである。

〔問題点を解決するための手段〕前記の目的は、次の性質：（１）１モルのＬ−フェニルアラニン、１モルのＮＡＤ
“及び１モルの水から１モルのフェニルピルビン酸、１
モルのＮＡＤＨ及び１モルのアンモニウムイオンを生成
する反応、並びにこの逆反応を触媒する；（２）高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法において
約２９０，０００の分子量を有し、５ＯＳ−ポリアクリ
ルアミドゲルディスク電気泳動法において約３８．００
０〜３９，０００の分子量を有するサブユニットを示す
；（３）Ｌ−フェニルアラニンに特異的に作用し、Ｌ−ト
リプトファン、Ｌ−チロシン及びＬ−メチオニンに対す
る特異性が非常に低い；を有することを特徴とするＬ−フェニルアラニン脱水素
酵素；前記酵素を生産することができるスポロサルシナ
属に属する細菌；これらの細菌を培養し、この培養物か
ら前記酵素を採取することを特徴とする前記酵素の製造
方法；並びに前記酵素又は該酵素の含有物の存在下でフ
ェニルピルビン酸、ＮＡＤＨ及びアンモニウムイオンを
反応せしめてＬ−フェニルアラニンを生成せしめ、該フ
ェニルアラニンを採取することを特徴とするし一フエニ
１　　　ルアラニンの製造方法；を提供することにより解決される。

（具体的な説明〕（１）漿生隻本発明において使用する微生物としてはスポロサルシナ
属又はバシルス属に属し、Ｌ−フェニルアラニン脱水素
酵素を生産することができるものであればよく、このよ
うな微生物は保存菌の中から選択することができる場合
もあり、また自然界から新たに分離することができる。

スポロサルシナ属に属する微生物としては、スポロサル
シナ・ウレアエを挙げることができる。

この種に属する保存菌として例えばスポロサルシナ・ウ
レアエＩＦ０１２６９８、及びスポロサルシナ・ウレア
エＩＰＯ１２６９９（ＡＴＣＣ６４７３）を挙げること
ができ、また新菌株として本発明者等が分離したスポロ
サルシナ・ウレアエ５ＣＲＣ−Ｒ０４を挙げることがで
きる。

前記の保存菌はそれぞれ前記寄託番号のもとにＩＦＯ又
はＡＴＣＣから自由に入手することができ、また新菌株
スポロサルシナ・ウレアエ５ＣＲＣ−Ｒ０４は工業技術
院微生物工業技術研究所に徽工研菌寄第９／７ｇ号（Ｐ
Ｉ！ＲＭ　Ｐ　−？／　７ｇ）として寄託されている。

バシルスに属する微生物としては、例えば本発明者等に
より分離された新菌株バシルスｓｐ、５ＣＲＣ−Ｒ５３
ｂ、バシルスｓｐ、５ＣＲＣ−Ｒ７９ａ、バシルスｓｐ
、５ＣＲＣ−１０１Ａ、及びバシルスｓｐ、５ＣＲＣ−
１１４０を挙げることができる。これらの菌株の菌学的
性質は非常に近似しており、これらの代表株としてバシ
ルスｓｐ、　５ＣＲＣ−Ｒ７９ａが工業技術院微生物工
業技術研究所に微工研菌寄第Ｓ／７２号（ＦＥＲＭ　ｐ
−？１７？＞として寄託されている。

前記の新菌株は次のようにして分離した。次の第１表に
示す組成の培地を調整した。

第１表Ｌ−フェニルアラニン　　　　　　　１％ペプトン　　
　　　　　　　　　　　１％酵母エキス　　　　　　　
　　　　０．５％ＫＪＰＯ＊　　　　　　　　　　　　
　０．２％Ｎａ（Ｊ　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，
１％」■ムニ測硯−ｏ、競坦− 水道水　　　　　　　　　　　　ｐＨ７，０この培地を
試験管（φ１８１）に５ｍＩｔずつ分注し、１２０℃で
１５分間滅菌した。この培地に各地より採取した土壌サ
ンプルを少量加え３０℃で３日間振とう培養した。この
培養液を一白金耳とり、同じ培地に接種しさらに３０℃
で３日間振とう培養した。表の培地に２％の寒天を加え
た平板培地に、培養液の一部を白金耳を用いて画線塗布
し、３０℃で数日保温した。出現したコロニーを同じ培
地組成の斜面培地に釣菌した。

このようにして各地より採取した土壌サンプルから多数
の菌株を分離した。次に、表の培地２００ｎ＋ｆを５０
０ｓＪの三角フラスコに分注し、同様に滅菌した。それ
ぞれの菌株をこの培地で３０℃、２４時間回転振とう培
養し、得られた菌体を洗浄後、超音波処理により破砕し
た。遠心後得られた上清を０．１ｍＭのＨＤＴＡおよび
５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む０．０１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で透析した。この上清に含ま
れるＬ−フェニルアラニン脱水素酵素活性を後記の方法
により測定した。

このようにして、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を顕
著に生産する下記の５株を得た。これらの菌株の分離源
は次表の通りであった。

第２表菌　　　　　　採集士５ＣＲＣ−Ｒ０４神奈川県相模原市５ＣＲＣ−Ｒ５３ｂ　　　　　　　神奈川県相模原市５
ＣＲＣ−Ｒ７９ａ　　　　　　　神奈川県相模原市５Ｃ
ＲＣ−１０１Ａ　　　　　千葉県松戸市５ＣＲＣ−１１
４０葉７松−市前記の新規な５菌株はそれぞれ次のような菌学的性質を
有する。

以下余日上記の菌学的性質に基づき、バーゼイズ・マニュアル・
オブ・ディターミネーティブ・バクテリオロジー（Ｂｅ
ｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版、１９７
４年の分類基準に従って、前記５菌株を次の様に同定し
た。

（ｉ　）　５ＣＲＣ−Ｒ０４株は、好気性で運動性及び
胞子形成能を有し、ダラム陽性の２連〜４連の球菌であ
ることからスポロサルシナ属に属する。スポロサルシナ
属には唯一の種としてスポロサルシナ・ウレアエが知ら
れており、前記性質が文献記載のそれとほぼ一致するの
で、ＳＣＩ？Ｃ−Ｒ０ｄ株はスポロサルシナ・ウレアエ
であると同定される。

（ｉｉ　）　５ＣＲＣ−Ｒ５３ｂ、、５ＣＲＣ−Ｒ７９
ａ、　５ＣＲＣ−１０１Ａ、及び５ＣＲＣ−１１４０株
はいずれもダラム陽性の桿菌で内生胞子を形成し、カタ
ラーゼの生成が認められることからバシルス属に属する
ことが明らかである。

なお、菌株５ＣＲＣ−Ｒ０４，５ＣＲＣ−Ｒ５３ｂ、　
５ＣＲＣ−Ｒ７９ａ。

ｊ　　　　　５ＣＲＣ−１０１Ａ、及び５ＣＲＣ−１１
４０の電子顕微鏡写真をそれぞれ第１図〜第５図に示す
。

以上、主として自然界から分離した菌株について詳細に
記載したが、これらの菌に変異を生じさせて一層生産性
の高い菌株を得ることもできる。

また、これらの菌株の細胞中に存在するＬ−フェニルア
ラニン脱水素酵素の生産に関与する遺伝子を切り出し、
これを適切なベクター例えばプラスミドに挿入し、この
ベクターを用いて適当な宿主、例えばエッシェリッヒヤ
・コリ（Ｅｓｈｃｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）や酵母の
ごとき異種宿主、又はバシルス属菌株もしくはスポロサ
ルシナ属菌株のごとき同種宿主を形質転換することによ
り、本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素生産株を
人為的に創成することもできる。

この発明の菌株は、常法に従って保存することができ、
例えば寒天スラント培地上で、又は凍結乾燥法により保
存することができる。寒天スラント培地としてはスポロ
サルシナ属又はバシルス属細菌の保存に常用されている
培地、例えば菌の分離に関して前記した培地を使用する
ことができる。

また、凍結乾燥保存も常法に従って行うことができる。

（２）菫Ｊ！ｌｕ１友汰前記の微生物を培養して本発明のＬ−フェニルアラニン
脱水素酵素を製造しようをする場合、基礎栄養培地とし
て、この発明の微生物が増殖し得るものであればいずれ
を使用してもよい。この培地は、窒素源として例えば酵
母エキス、ペプトン、肉エキス等の１種類又は複類種類
を含有する。また、この培地には必要に応じて炭素源と
してグルコース、澱粉、グリセリン等を加えることがで
きる。この培地には無機塩類、例えばリン酸二カリウム
、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等を加えることが
好ましい。

Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の製造に当たっては前
記基礎培地に、誘導物質として少量のＬ−フェニルアラ
ニンを添加するのが好ましい。このＬ−フェニルアラニ
ンの添加量は、基礎培地の組成、培養する菌株の性質等
により異なるがおよそ０．０１〜ｌＯｗ／ｖ％であり、
好ましくは０．１〜１　ｗ／ｖ％である。

培養は固体培地又は液体培地のいずれを用いて行っても
よいが、目的酵素を多量に得るためには、液体培地を用
い、振とう培養、通気・攪拌培養等により好気的条件下
で培′養を行うのが好ましい。

培養温度は菌が生育し、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵
素が生産される温度範囲内であればいずれの温度でも良
いが、好ましくは２５〜４５℃である。

ＤＨは６〜１１、好ましくは７〜１０の範囲である。

培養時間は酵素活性が発現される時間を選べば良いが好
ましくは６〜４８時間である。

次に得られた培養物から本発明のＬ−フェニルアラニン
脱水素酵素が採取されるが、精製法として通常の酵素精
製法を用いることが出来る。遠心分離等によって菌体を
集め、超音波処理、ダイノミル等の機械的方法によって
菌体を破砕する。細胞片などの固形物を遠心分離などに
よって除き、粗酵素を得、さらにこれに硫酸プロタミン
又は硫酸ストレプトマイシンを加えて処理を行い、塩析
、有機溶媒沈澱、吸着クロマトグラフィー、イオン交換
クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を
行い、さらに硫酸アンモニウム等の塩やポリエチレング
リコール等の添加による結晶化等の公知の方法によって
均一の結晶酵素標品を単離することが出来る。なお、本
発明の酵素の製造方法の具体的な１例を実施例に記載す
る。

（３）先負■皿定方広本発明においては次の方法により力価を測定した。

酸化的脱アミノ化反応ニゲリシン−ＫＣｊ２−ＫＯＨ緩
衝液（ｐＨ１０，５）　１００μｍｏｎ、ＮＡＤ″″２
．５　ｐｍｏｌｌ　。

Ｌ−フェニルアラニン１０μｔａａｌｌ　、及び適当量
のサンプルを１ｍｆになるように混合して反応せしめ、
２５℃におけるＮＡＤＨの増加を３４０　ｎ　ｍの吸光
度の増加として計測し、１分間当り１マイクロモルのＮ
ＡＤＨを増加せしめる酵素量を１単位とした。

還元的アミノ化反応：各種緩衝液１００μｌｌｌ０！、
ＮＡＤＨＯ，１，ｌｊｍｏＪ　、ＮＨ＃（Ｊ　　２００
μｍｏｊ！　、フエ、ニルピルビン酸ナトリウム１０μ
ｍａｉｌ及び適当量のサンプルを１ｍｌになるように混
合して反応せしめ、２５℃におけるＮＡＤＨの減少を３
４０ｎｍの吸光度の減少として計測し、１分間当り１マ
イクロモルのＮＡＤＨを減少せしめる酵素量を１単位と
した。

フェニルピルビン酸の還元的アミノ化反応の速度は、至
適ｐＨにおいて上記酸化的脱アミノ化反応速度に比べて
約５．５倍速い。従って前記特開昭５９−１９８９７２
に記載されているように還元的アミノ化反応速度を測定
し、上記のように力価を定義した場合、同量の酵素が約
５．５倍の単位数を示す。

（４）鼠塞至炸！本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素は次の性質を
有する。

Ａ。スポロサルシナ・ウレアエ５ＣＲＣ−Ｒ０４により
生産される酵素（１）作用：次式に示す反応を触媒する。

Ｌ−フェニルアラニン十ＮＡＤ″″十〇、０　：フェニ
ルピルビン酸十ＮＡＤＨ＋ＮＨ３＋Ｈ”（２）　　基質
特異性二本酵素は第３表に示すようにＬ−フェニルアラ
ニン以外のし一アミノ酸には極めてわずかにしか反応せ
ず又は全く反応しない。

第３表Ｌ−フェニルアラニン　　　　　１００Ｌ−トリプトフ
ァン　　　　　　　　６．８Ｌ−チロシン（１，４ｍＭ
）　　　　　５゜４Ｌ−メチオニン　　　　　　　　　
４．１Ｌ−エチオニン　　　　　　　　　７．ＯＬ−バ
リン　　　　　　　　　　３．ＩＬ−ロイシン　　　　
　　　　　　２．３Ｌ−イソロイシン　　　　　　　　
０．５４Ｌ−α−アミノ−ｎ−酪酸　　　　１．６Ｌ−
ノルバリン　　　　　　　　　６．３Ｌ−ノルロイシン
　　　　　　　　　１５上記の表は酸化的脱アミノ化反
応について測定した結果を示す。基質濃度はＬ−チロシ
ンを１．４ｍＭとしたのを除き、１０ｍＭとした。

Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジン
、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−
アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、
Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−ス
レオニン、Ｌ−システィンおよびＤＬ−フェニルグリシ
ンは基質とならない。

補酵素としてはＮＡＤ＋が必要であり、ＮＡＤＰ″″は
ＮＡＤ＋に対して約３．９％の活性を示すにすぎない。

（３）　　至適ｐＨ二酸化的脱アミノ化反応ではｐ）１
１０．５付近が至適であり、還元的アミノ化反応では９
．０付近が至適である（第６図）。

（４）　　ｐＨ安定性：各ｐＨの緩衝液（０，０５Ｍ）
中３０℃にて１時間保温した後の残存活性を酸化的脱ア
ミノ化について測定した場合、第７図に示す（処理前の
活性を１００％とする）ごと＜ｐＨ９付近において安定
である。

（５）至適温度：４０℃付近における活性が最大である
（第８図）。

（６）　　温度安定性：　０．１　Ｍグリシン−ＮａＯ
Ｈ緩衝液（ｐＨ９，０）中、各温度において１０分間処
理した後の残存活性を酸化的脱アミノ化反応について測
定したところ、第９図に示す（処理前の活性を１００％
とする）ごとく４２℃において活性の半分を失う。

（７）吸収スペクトル：２７８ｎｍに極大吸収、２８３
ｎｍ付近に肩を有する。可視部の吸収は認められない。

この様子を第１０図に示す。

（８）金属イオン、阻害剤の影響：銀、水銀等の金属イ
オン、およびＰＣＭＢ５Ｎ−エチルマレイミド、５．５
’−ジチオ−ビス（２−二トロ安息香酸）等のＳＨ阻害
剤によって活性が阻害される（第４表）。

以下余白茅−」ニー表Ｌｉ１　　　　　　　　　　　　　　９６％Ｎａ”　　
　　　　　　　　　　　　　　　ｇ　２Ａｇ’　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　Ｑｙｌ　ｇ２◆　　　
　　　　　　　　　　　９゜Ｃａ”　　　　　　　　　
　　　　　１００Ｃｕｔ◆　　　　　　　　　　　　　
　９１Ｍｎ”　　　　　　　　　　　　　　１２９Ｚｎ
”　　　　　　　　　　　　　　　９９Ｎｉ”　　　　
　　　　　　　　　　１００Ｆｅ”　　　　　　　　　
　　　　　１２７Ｂａ”◆　　　　　　　　　　　　　
１０６Ｃｄ”◆　　　　　　　　　　　　　　　７０ｐ
ｂ”◆　　　　　　　　　　　　　　８１３　ｎ　”（
０，５＋Ｍ）　　　　　　　　　　１２３Ｈｇ　”（０
，０１ｍＭ）　　　　　　　　　　　　ＯＡＮ”　　　
　　　　　　　　　　　　１５３Ｆｅ”　　　　　　　
　　　　　　　１６１ヒドロキシルアミン（１０ｍＭ）
　　　ｌ　７３ＫＣＮ（０，５ｍＭ）　　　　　　　　
　１０２０−フェナンスロリン　　　　１０３ α、α′−ジピリジル　　　　１２４８−オキシキノリン　　　　　１０１ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　１１９Ｐ　ＣＭ　Ｂ　
（０，２ｍＭ）　　　　　　　　　　０５．５１−ジチ
オビス（２−ニトロ安息香酸）　　　　　　　ＯＮ−エチルマ
レイミド　　　　　２１ヨード酢酸　　　　　　　　　　９１限り１ｍＭである。

（９）等電点：アンホラインを用いる焦点電気泳動によ
り測定した場合５．３〜５．４である。

ａω　分子量：高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ　
３０００　ＳＷ）により約２９０　、０００と算出され
る。

αυ　サブユニットの分子量：　ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲルディスク電気泳動により約３８．０００〜３
９．０００と算出される。

（２）均一性：ポリアクリルアミドゲル電気泳動（７，
５％、ｐＨ８，４）により第１１図Ａに示す如く単一の
バンドを与える。また５Ｏ８−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（１０，０％、ｐＨ７，２）により第１１図已
に示す如く単一のバンドを与える。

■　結晶形：第１２図に拡大して示すように板状である
。

以上のどと（、本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素酵
素は他の微生物起源のそれとは明らかに異なっており、
新規な酵素である。

Ｂ、バシルスｓｐ、５ＣＲＣ−Ｒ７９ａにより生産され
る酵素（１）作用：次式に示す反応を触媒する。

Ｌ−フェニルアラニン＋ＮＡＤ”　＋Ｈ２０芒戸フェニ
ルピルビン酸十ＮＡＤＨ＋ＮＨ３＋Ｈ“（２）基質特異
性二本酵素は第５表に示すようにＬ−フェニルアラニン
及びＬ−チロシン以外のし一アミノ酸には極めてわずか
にしか反応せず、又は全く反応しない。

第５表Ｌ−フェニルアラニン　　　　　１００Ｌ−チロシン（
１，４ｍＭ）　　　　　７２Ｌ−）リブトファン　　　
　　　　１．６Ｌ−メチオニン　　　　　　　　　３゜
ＯＬ−エチオニン　　　　　　　　　３．ＩＬ−ノルバ
リン　　　　　　　　　１．３Ｌ−ノルロイシン　　　
　　　　　　３．９上記の表は酸化的脱アミノ化反応に
ついて測定した結果を示す。基質濃度はＬ−チロシンを
１．４ｍＭとしたのを除き、１０ｍＭとした。

Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジン
、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−
アスパラギン、Ｌ−アスパラ）　　　　　　　ギン酸、
Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、Ｌ
−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−システィン、Ｌ−バリ
ン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、およびＬ−α−
アミノ−ｎ−酪酸は基質とならない。

なお、還元的アミノ化反応ではフェニルピルビン酸をＬ
−フェニルアラニンにする速度を１００％とすると、？
−ヒドロキシフェニルピルビン酸をＬ−チロシンにする
相対速度は１３６％である。

Ｌ−フェニルアラニンの酸化的脱アミノ化反応ではＮＡ
ＤＰ”はＮＡＤ”の２．９％の補酵素活性しか有さない
。

（３）　　至適ｐＨ二酸化的脱アミノ化反応ではｐｉｌ
ｏ、６〜１１．３付近が至適であり、還元的アミノ化反
応ではｐＨ９，８〜１０．８付近が至適である（第１３
図）。

（４）　　ｐＨ安定性：各ｐＨの緩、樹液（０，０５Ｍ
）中３０℃にて１時間保温した後の残存活性を酸化的脱
アミノ化について測定した場合、第１４図に示す（処理
する前の活性を１００％とする）ごとく、ｐＨ４〜１１
．３の範囲で安定であり、特にｐＨ９〜１１の範囲で安
定であった。

（５）至適温度＝５０℃付近における活性が最大である
（第１５図）。

（６）　　温度安定性：　０．１　Ｍグリシン−ＮａＯ
Ｈ緩衝液（ｐＨ９，ｏ；第１６図Ａ）、及び０．１　Ｍ
グリシン−ＫＣｌ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ１１，０；第１
６図Ｂ）中、各温度において１０分間処理した後の残存
活性を酸化的脱アミノ化反応について測定する場合、Ｐ
Ｈ９，０においては５７℃で活性が半減し、ｐＨ１１，
０においては４８℃で活性が半減する。

（７）吸収スペクトル：　２７８ｎｍに極大吸収、２８
ａｎｍ付近に肩を有する。可視部の吸収は認められない
。この様子を第１７図に示す。

（８）　　金属イオン、阻害剤の影響：銀、水銀等の金
属イオンおよびＰＣＭＢによって活性が阻害される（第
６表）。

以下余日茅−」Ｌ−表Ｌｉ”　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９５％
Ｎａ”　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９　３
Ａｇ’″　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏｙｌ
　ｇ２”　　　　　　　　　　　　　　　９９Ｃａ”　
　　　　　　　　　　　　　　　　９２Ｃｕ２“　　　
　　　　　　　　　　　　　　８５Ｎｉ”　　　　　　
　　　　　　　　　　　　９５Ｚｎ”　　　　　　　　
　　　　　　　　　　９６Ｎｉ”　　　　　　　　　　
　　　　　　　１００Ｆｅ”　　　　　　　　　　　　
　　　　１１６　　　　　　　　　　　　　　　　１Ｂ
ａ”　　　　　　　　　　　　　　　　　９３Ｃｄ”　
　　　　　　　　　　　　　　　１０２Ｐｂ２・　　　
　　　　　　　　　　　　　５３Ｓｎｚ″″（０，５ｍ
Ｍ）　　　　　　　　　　　１　１０Ｈｇ　”（０，０
１ｍＭ）　　　　　　　　　　　３８Ａｆ”　　　　　
　　　　　　　　　　　　　９９Ｆ　ｅ：ｌ（″　　　
　　　　　　　　　　　　　１１７無添加　　　　　　
　　　　１００ＮａＮ３　　　　　　　　　　　　　　　１０２％ヒド
ロキシルアミン（１０ｍＭ）　　　　９０ＫＣＮ（０，
５ｎ＋Ｍ）　　　　　　　　　１１３０−フェナンスロ
リン　　　　　９９ α、α′−ジピリジル　　　　１０４８−オキシキノリン　　　　　　９６ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　１２０Ｐ　ＣＭ　Ｂ　
（０，２＋＋＋Ｍ）　　　　　　　　　　０５．５′−
ジチオビス（２−二トロ安息香酸）７４Ｎ−エチルマレイミド　　　　１６２ヨード酢酸　　　　　　　　　１２７限り１ｍＭである。

（９）等電点：テンポラインを用いる焦点電気１　　　
　　　泳動により測定した場合４．３〜４．４である。

αω　分子量：高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ　
３０００　ＳＷ）により約２９０　、０００と算出され
る。

αＢ　サブユニットの分子量：　ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲルディスク電気泳動により約３８．０００〜３
９，０００と算出される。

＠　均一性：ポリアクリルアミドゲル電気泳動（７，５
％、ｐＨ８，４）により第１８図Ａに示す如く単一のバ
ンドを与える。またＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（１０，０％、ｐＨ７゜２）により第１８図Ｂに
示す如く単一のバンドを与える。

（５）Ｌ−フェニルアラニンの″　法本発明のＬ−フェニルアラニンの製造方法においては、
スポロサルシナ属細菌又はバシルス属細凹によって生産
されるＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の存在下でフェ
ニルピルビン酸、ＮＡＤＨ及びアンモニウムイオンを反
応せしめることによりＬ−フェニルアラニンを生成せし
め、該フェニルアラニンを採取する。

この方法において使用されるＬ−フェニルアラニン脱水
素酵素の使用形態は特に限定されない。

例えば、この発明によって精製された酵素を使用するこ
とができるのは無給のこと、細胞を含有する培養液、培
養生菌体、アセトン等によって脱水処理された乾燥菌体
、菌体破砕物、種々の段階まで精製された部分精製酵素
標品等の酵素含有物を使用することができる。さらにこ
れらの酵素又は酵素含有物を常法に従って固定化したも
のを使用することもできる。工業的な実施に当っては生
菌体、固定化菌体等を用いるのが有利である。反応液中
のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の量は基質であるフ
ェニルピルビン酸又はその塩の濃度等によって異なり特
に限定されないが、通常１０〜１０．０００単位／Ｅと
するのが便利である。

基質としてフェニルピルビン酸又はその塩、例えばナト
リウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩等を
使用することができる。フェニルピルビン酸又はその塩
の添加量は、反応液中の前記酵素の濃度等により異なり
特に限定されないが、１〜５００ｇ／　７！とするのが
便利である。低濃度で使用する場合には遊離酸の形で使
用することができるが、比較的高濃度で使用する場合に
は塩の形で使用するのがｐＨ調整の観点から好ましい。

例えばフェニルピルビン酸ナトリウムは高濃度では完全
には溶解しないが、反応液中に未溶解のナトリウム塩が
存在していても差しつかえない。また、フェニルピルビ
ン酸アンモニウム又はフェニルピルビン酸をアンモニウ
ムで中和したものを使用することもでき、この場合この
アンモニウム塩はフェニルピルビン酸の給源であると同
時に後に記載するアンモニウムイオンの給源としても機
能する。

フェニルピルビン酸又はその塩はバッチ式反応において
は反応開始時に一度に添加することもでき、又反応の進
行と共に複数回に分割して、もしくは連続的に添加する
こともできる。

アンモニウムイオンの給源としてはアンモニウム塩、例
えば塩化アンモニウム又は硫酸アンモニウムの形で使用
するのが便利である。また、アンモニアガス又は水酸化
アンモニウム水溶液を、反応液のｐＨを所定値に維持し
ながら反応の進行と共に連続的に導入することも可能で
ある。前記のようにフェニルピルビン酸アンモニウムを
使用スる場合にはこの物質がアンモニウム塩の給源とし
ても機能する。アンモニウム塩の使用量はフェニルピル
ビン酸の量と同モル量又はそれより多量とする。この量
は一般にフェニルピルビン酸の量に対して１〜２倍モル
量とするのが便利である。アンモニウム塩のモル量を多
くすることによって酵素反応の平衡をＬ−フェニルアラ
ニン側に傾け、フェニルピルビン酸に対するＬ−フェニ
ルアラニンの収率を上昇せしめることができる。

ＮＡＤＨは、フェニルピルビン酸と等モルを加えてもよ
いが、ＮＡＤＨは非常に高価であるから、工業的見地か
ら、前記の反応系のほかに、ＮＡＤＨ再生系、すなわち
前記反応により生成したＮＡＤ＋をＮＡＤＩ（に還元す
る系を共有させるのが好ましい。このような系としてＮ
ＡＤ＋をＮＡＤＨに変換する酵素とその基質との組合わ
せ、例えば蟻酸脱水素酸素（ＥＣ１，２゜１．２）と蟻
酸、Ｌ−グルタミン酸脱水素酸素（ＥＣ１゜４．１．２
）とグルタミン酸、アルコール脱水素酵素’　　　　　
　（ＥＣ１，１，１，１）とエタノール、アルデヒド脱
水素酵素（ＥＣ１，２，１，３）とアセトアルデヒド、
グルコース−６−リン酸脱水素酵素（ＥＣｉ、１．１．
４９）とグルコース−６−リン酸等を使用することがで
きる。また、ヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１８，３，１，
）による分子状水素を電子供与体とするＮＡＤ”のＮＡ
ＤＨへの還元反応や、電気化学的に還元されたメチルビ
オローゲンやジヒドロリボアミドのジアホラーゼ（ＥＣ
１，６゜４．３）による酸化に伴うＮＡＤ”のＮＡＤＨ
への還元反応をも使用することができる。蟻酸脱水素酵
素と蟻酸を使用する場合、ＮＡＤ”が還元されてＮＡＤ
Ｈとなると同時に蟻酸が酸化されて二酸化炭素が生成し
、これは反応系から容易に除去され、反応が常に所望の
方向に進行するため特に好ましい。蟻酸脱水素酵素は市
販されており容易に入手することができる。又、例えば
カンジダ・ボイディニ（Ｃａｎｄｉｄａｂｏｉｄｉｎｉ
ｉ）　Ｎａ　２２０１　（ＡＫＵ　４７０５）や、ハン
ゼヌラ・ポリモルフｙ　（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌ
ｙｍｏｒｐｈａ）　（ＡＴＣＣ２６０１２）から公知の
方法〔カトウら、アグリカルチエラル・アンド・バイオ
ロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉ−ｃｕｌｔｕｒａｌ
　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
）　　３８＋１１１〜１１６　（１９７４））により精
製して使用することもてきる。ＮＡＤＨ再生系の酵素濃
度は、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素濃度等に依存し
て異なり、一般に基質フェニルピルビン酸の還元的アミ
ノ化速度（従ってＮＡＤ”生成速度）に匹敵する速度で
ＮＡＤ”をＮＡＤＨに還元するために必要な量である。

例えば、前記のように１０〜１０．０００単位／ｉｔの
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を使用し、ＮＡＤＨ再
生系酵素として蟻酸脱水素酵素を使用する場合、この酵
素の使用量は１０〜１０，０００単位／ｌ程度とするの
が好ましい。蟻脱水素酵素の基質としては蟻酸の塩、例
えば蟻酸ナトリウム、蟻酸カリウム、蟻酸アンモニウム
等を使用するのが便利である。蟻酸塩の使用量はフェニ
ルピルビン酸又はその塩の量の１〜２倍モル量とするの
が好ましい。ＮＡＤＨ再生系を用いる場合は、ＮＡＤ　
”又はＮＡＤＨを通常の生理的濃度である０、　１〜１
０ｍＭ加えればよい。

反応媒体としては水、又は水性液、例えば水性緩衝液を
用いることができる。緩衝液としては例えばトリス−Ｈ
ＩＪ緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液等を使用するこ
とができる。

反応液のｐＨとしては、前記のＮＡＤＨ再生系を用いな
い場合には、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素による還
元的アミノ化に適するｐｉを用いることができ、例えば
スポロサルシナ属細菌由来の酵素を用いる場合にはｐＨ
８〜１０、好ましくはｐＨ約９とし、バシルス属細菌由
来の酵素を用いる場合にはｐＨ９〜１１、好ましくはｐ
Ｈ約１０とする。フェニルピルビン酸酸の還元的アミノ
化系と共にＮＡＤＨ再生系を用いる場合には、これら両
者の反応が共に良好に進行するｐＨ範囲を選択する必要
がある。このようなｐＨは、例えば、スポロサルシナ属
細菌由来のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素とカンジダ
・ポディニ由来の蟻酸脱水素酵素を用いる場合には通常
はｐＨ７，５〜９．５、好ましくはｐＨ８，０〜９．０
である。また、バシルス属細菌由来のＬ−フェニルアラ
ニン脱水素酵素とカンジダ・ボディニ由来の蟻酸脱水素
酵素を用いる場合には通常はｐＨ８〜１０好ましくはｐ
Ｈ８，５〜９．５である。

反応温度も、反応ｐＨの場合と同様に考えることができ
るが酵素のいずれの組合わせにおいても通常は２０℃〜
５０°Ｃ５好ましくは２５℃〜４０℃である。

反応時間は特に臨界的でなく、反応混合物の基質濃度、
酵素力価等に依存して、基質フェニルピルビン酸が十分
な収率でＬ−フェニルアラニンに転換されるまで反応を
維持する。

反応方式は回分式であっても連続式であってもよく、反
応時間はいずれの方式を用いるかにより異なる。

生成したＬ−フェニルアラニンは任意の常法に従って精
製採取することができる。例えば、反応終了後にトリク
ロロ酢酸を加えて蛋白質を沈澱せしめ、菌体（存在する
場合には）と共に濾去し、濾液をイオン交換樹脂等によ
り精製し、結晶化する。

フェニルアラニンの定量は、例えばロイコノストック・
メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅ
ｎｔ−ｅｒｏｉｄｅｓ）　ＡＴＣＣ８０４２を用いるバ
イオアッセイによ１　　　　　　り行う真が７き６・次に実施例によりこの発明をさらに具体的に説明する。

ｍエ　スポロサルシナ・ウレアエ５ＣＲ（ニーＲ０４Ｌ
−フェニルアラニン０．２％、酵母エキス０．５％、ペ
プトン１．０％、ＫＪＰＯ＊　０−２％、ＮａＣ１１０
，１％及びＭｇ５Ｏａ、　”　７Ｈｚ００．０２％を含
有し、ｐＨ７，０に調整した培地３０Ｊを１２０℃、１
５分間加熱殺菌した後、スポロサルシナ・ウレアエ５Ｃ
ＲＣ−Ｒ０４（徽工研菌寄第９１７？号）を接種し、３
０℃で２４時間好気的に培養した。培養後、遠心分離機
で菌体を採取し湿重量約３８０ｇの菌体を得た。菌体を
０．８５％の食塩水で１回洗浄した後、０．１　ｍ　Ｍ
　ＥＤＴＡおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを
含むリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　　１１に懸濁し、９
ＫＨｚにおける超音波処理を約１０時間行い菌体を破砕
した。破砕菌体は１４．ＯＯＯｘｇ、２０分間の遠心分
離で除去し、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を含む粗
抽出液を得た。この無細胞抽出液に５％プロタミン硫酸
水溶液を１ｇ蛋白当り０．１ｇとなるように添加し、３
０分間攪拌した。生成した沈澱を１４．０ＯＯｘ　ｇ、
　２０分間遠心分離し、得られた粗酵素液を０．１ｍＭ
のＥＤＴＡおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを
含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に対して透
析した。透析後の酵素液（１９９０ｍ７りに固体硫酸ア
ンモニウム（４１２ｇ）を加え３０％硫酸アンモニウム
飽和とした。３０分間攪拌の後、１４．０ＯＯｘｇで２
０分間遠心して得られる上清（２１００ｍｎ　）にさら
に固体硫酸アンモニウム（４１６ｇ）を加え６０％硫酸
アンモニウム飽和とした。１４，０ＯＯｘｇで２０分間
遠心して得られる、酵素活性を有する沈澱を少量の０．
０１Ｍリン酸緩衝液（ｐｔｌ　７．０　）に溶解し、さ
らに０．１　ｍ　ＭのＥＤＴＡおよび５ｍＭの２−メル
カプトエタノールを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）で透析した。この酵素液をあらかじめ、０．１
ｍＭのＥＤＴＡおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノー
ルを含む０．０１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平
衡化したＤＥＡＥ−）ヨパール６５０Ｍのカラムに通過
させ、０．１ｍＭのＥＤＴＡおよび５ｍＭの２−メルカ
プトエタノールを含む０．１　Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）で溶出した。

活性区分を集め、０．１ｍＭのＥＤＴＡおよび５ｍＭの
２−メルカプトエタノールを含む０．０１Ｍリン酸緩衝
液で透析後、あらかじめ同じ緩衝液で平衡化したヒドロ
キシアパタイトのカラムに通過させ、０゜１ｍＭのＥＤ
ＴＡおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む０
．０１Ｍから０．１５Ｍのリン酸緩衝液（ｐ）１７．０
　）の直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた。この活性
区分を集め０．１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの２−メルカ
プトエタノールおよび０．１　Ｍ　ＮａＣｌ１を含む０
．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したセフ
ァデックスＧ−２００によるゲル減化クロマトグラフィ
ーを行なった。このようにして得られた酵素液を限外瀘
化により濃縮し、硫酸アンモニウムを添加し結晶化を行
った。こうして収率３１％で板状結晶Ｌ−フェニルアラ
ニン脱水素酵素が得られた。この結晶の拡大図を第１２
図に示す。

なお第７表に菌体抽出液から結晶化に至るまでの精製工
程における比活性および回収率を示す。

Ｗ　　バシルスｓ　、５ＣＲＣ−Ｒ７９ａか゛のＬ−フ
Ｌ−フェニルアラニン０．２％、酵母エキス０．５％、
ペプトン１．０％、ＫＪＰ０４０−２％、ＮａＣＪ　０
．１％、及びＭｇ５Ｏ，・７ｎｚｏ　　Ｏ，０２％を含
有し、ｐＨ７，０に調製した培地１０１を１２０℃、１
５分間加熱殺菌した後、バシルスｓｐ、５ＣＲＣ−Ｒ７
９ａ　（微工研菌寄第９１７２号）を接種し、３０℃で
２４時間好気的に培養した。培養後１０ｆの培養液から
遠心分離機で菌体を採取し湿重量約１０８ｇの菌体を得
た。菌体を０．８５％の食塩水で１回洗浄した後、０．
１ｍＭＥＤＴＡおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノー
ルを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）約０．４１に懸濁
し、９ｋＨｚにおける超音波処理を約６時間行ない菌体
を破砕した。破砕菌体は１４．０００ｘ　ｇ、　２０分
間の遠心分離で除去し、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵
素を含む粗抽出液を得た。この無細胞抽出液に５％プロ
タミン硫酸水溶液を１ｇ蛋白当り０．１ｇとなるように
添加し、３０分間攪拌した。生成した沈澱を１４．０Ｏ
Ｏｘ　ｇ、２０分間遠心分離し、得られた粗酵素液を０
．１ｍＭのＥＤＴＡおよび５ｍＭの２−メルカプトエタ
ノールを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に
対して透析した。透析後の酵素液（４００ｍ　ｌ　）に
固体硫酸アンモニウム（７０，４ｇ）を加え３０％硫酸
アンモニウム飽和とした。３０分攪拌の後、１４，００
０ｘｇで２０分間遠心して得られる、上滑（４３０ｍｌ
）にさらに固体硫酸アンモニウム（８５，６ｇ）を加え
６０％硫酸アンモニウム飽和とした。１４．ＯＯＯｘｇ
で２０分間遠心して得られる、酵素活性を有する沈澱を
少量の０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し
、さらに０．１ｍＭのＥＤＴＡおよび５ｍＭの２−メル
カプトエタノールを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）で透析した。この酵素液を、あらかじめ０．１
ｍＭのＥＤＴＡおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノー
ルを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡
化したＤＥＡＥ−１−ヨパール６５０Ｍのカラムに通過
させ、０．１　ｍ　ＭのＥＤＴＡおよび５ｍＭの２−メ
ルカプトエタノールを含む０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）で溶出した。

活性区分を集め、０．１ｍＭのＥＤＴＡおよび５ｍＭの
２−メルカプトエタノールを含む０．０１Ｍリン酸緩衝
液で透析後、あらかじめ同じ緩衝液で平衡化したヒドロ
キシアパタイトのカラムに通過させ、０．１ｍＭのＥＤ
ＴＡおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む０
．０１Ｍから０．４Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）の
直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた。この活性区分を
集め、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの２−メルカプト
エタノールおよび０．１　ＭＮａ（Ｊを含む０．０５Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したセファデック
スＧ−２００によるゲル減化クロマトグラフィーを行な
った。こうして、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を約
６０％の収率で約１８００倍に精製した。この精製過程
における比活性および回収率を第８表に示す。この酵素
はポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動において均一であることが
証明された。

以下余白実施班１　スポロサルシナ・ウレアエ５ＣＲＣ−Ｒ０４
フェニルピルビン酸ナトリウム５　ｇ　（２２ｍ＋５ｏ
ｉｔ）、蟻酸アンモニウム３　ｇ　（４９ｍｍｏｊ！　
）、ＮＡＤ”　０．２１ｇ　（０，２９ｍｍｏｊ！　）
　、）リスーＨＣＩＩ緩衝液（ｐＨ８，５）１８　ｍｍ
ｏｌ、粗し−フェニルアラニン脱水素酵素４３．２単位
（実施例１、第５表の工程３の硫酸アンモニウム分画ま
で部分精製した粗酵素画分に相当）および粗蟻酸脱水素
酵素４９．０単位（（ｐＨ８，５）、カンジダ・ボイデ
ィニ隘２２０１より部分精製）を含む３ＱＱｍｊ！の反
応液を３０℃において２４時間反応させた。反応液中に
生成したＬ−フェニルアラニンの量をロイコノストック
・メセンテロイデスを用いる微生物定量法により定量し
たところ１．９１　ｇ（１１，６ｍｍｏ＃　、　５２．
７％の転換率）のし−フェニルアラニンが生成していた
。この反応液に２０％トリクロロ酢酸３０ｍｊ＋を加え
除蛋白後、陽イオン交換樹脂アンバーライト（Ａｍｂｅ
ｒｌｉｔｅ）　ＩＲ−１２０（Ｈつカラムに吸着させ、
１Ｍアンモニア水で溶出させた。Ｌ−フェニルアラニン
を含む両分を集め、濃縮後陰イオン交換樹脂アンバーラ
イ）　（Ａｍｂｅｒｌ　ｉ　ｔｅ）ＩＲＡ−４００（Ｏ
Ｈ−）カラムに吸着させ、１Ｍ蟻酸で溶出させた。Ｌ−
フェニルアラニンを含む両分を濃縮乾固した。小量の温
水に溶解し、エタノールを５０％となるように加え、冷
蔵すると結晶が析出した。この結晶を同様の操作により
再結晶化し、０．４５８ｇの無色固体を得た。この標品
の元素分析値は以下のとおりであった。

実測値（％）　　計算値（％）Ｃ６５，３３６５，４３Ｈ６，６１６，７１Ｎ８゜４８　　　　　　８．４８融点：２７０℃で分解した。

比旋光度（α）　　−３５，５°（ｃ＝０．４８　、　
ＨｚＯ）で光学的に純粋なＬ体であった。マススペクト
ル、核磁気共鳴吸収スペクトル、および赤外吸収スペク
トルによる分析結果はいずれも、生成物がＬ−フェニル
アラニンであることを示した。

ＩＪＩ　　スポロサルシナ・ウレアエ５ＣＲＣ−Ｒ０４
フェニルピルビン酸ナトリウム　３．５７ｍｍｏｆ　。

ＮＡＤ”　　１００μｍｏｆ　５ＮＨａ、Ｃｊ２５　ｍ
ｍｏＪ　、　　）リスーＨＣＪ緩衝液（ｐＨ８，５）　
　２７２μｍｏＡ’　、蟻酸ナトリウム７．８４ｍｍｏ
／　、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素３５単位（実施
例１、第５表の工程４のＤＥＡＥ−トヨバールカラムを
通過させた両分）および蟻酸脱水素酵素１０．２単位（
（ｐＨ８，５）、カンジダ・ボイディニ１１ｈ２２０１
より部分精製）を５ｍＪ中に含む反応液を３０℃で２４
時間保温した。微生物定量法により定量したところ、５
８０ｍｇ　（３，５１ｍｍｏｊ！　、　９８．５％の転
換率）のし−フェニルアラニンが生成していた。

フェニルピルビン酸ナトリウム２００μｍｏｌ、ＮＡＤ
”　　２０１１ｍｏｌ　、蟻酸ナトリウム２００．ｃｒ
ｍｏＡ　。

トリス−ＩＣ１！緩衝液（ｐＨ８，５）　６００　ｐｍ
ａｌｔ　、蟻酸脱水素酵素１１．９単位（（ｐＨ８，’
５）、カンジダ・ポイディニｌ１ｈ２２０１の無細胞抽
出液）およびＬ−フェニルアラニン脱水素酵素１３．２
単位（ＳＣＲＣ−Ｒ０ｄ株の培養菌体の無細胞抽出液を
硫酸アンモニウム３０〜６０％飽和として沈澱した粗酵
素画分；実施例１の第５表の工程３に相当）を含む１３
．０ｍＪの反応液を３０℃で１５時間反応させた。反応
液中に生成したＬ−フェニルアラニンの量を微生物定量
法により測定したところ３２．８ｍ　ｇ　（１９８，８
＃ｍｏｆ　、　９８．４％の転換率）のし−フェニルア
ラニンが生成していた。

フェニルピルビン酸ナトリウム４００μｍｏｊ２−、　
蟻酸アンモニウム８００　ｐ　ｍｏ７！、ＮＡＤ”　５
　ｐｍａｌｌ　％　　）リスー〇Ｃ４緩衝液（ｐＨ８，
５）　　２６０１ｎｏＡ　、粗蟻酸脱水素酵素０．５単
位（ｐＨ８，５）、およびＬ−フェニルアラニン脱水素
酵素０．２５単位（ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａの無細胞抽出液
よりプロタミン処理、硫安分画、　ＤＥＡＥ−トヨパー
ル、およびヒドロキシアパタイトの各カラムクロマグラ
フィーにより、約１８０倍に精製した酵素標品）を含む
５．０ｒｒｌの反応液を３０℃で２４時間反応させた。

微生物定量法により定量したところ６４．４ｍ　ｇ　（
３９０，０μｔａｏｉｌ　、　９７．５％の転換率）の
Ｌ−フェニルアラニンが生成していた。

この反応液から、実施例３の方法に準じてＬ−フェニル
アラニンを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はスポロサルシナ・ウレアエ５ＣＲＣ−Ｒ０４の
電子顕微鏡写真であって、生物の形態を表わす図面に代
る写真であり；第２図はバシルスｓｐ、５ＣＲＣ−Ｒ５３ｂの電子顕微
鏡写真であって、生物の形態を表わす図面に代る写真で
あり；第３図はバシルスｓｐ、５ＣＲＣ−Ｒ７９ａの電子顕微
鏡写真であって、生物の形態を表わす図面に代る写真で
あり；第４図はバシルスｓｐ、５ＣＲＣ−１０１Ａの電子顕微
鏡写真であって、生物の形態を表わす図面に代る写真で
あり；第５図はバシルスｓｐ、５ＣＲＣ−１１４０の電子顕微
鏡写真であって、生物の形態を表わす図面に代る写真で
あり；第６図はスポロサルシナ・ウレアエ５ＣＲＣ−Ｒ０４が
生産するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素のｐＨと反応
速度の関係を表わすグラフであって、Ａは酸化的脱アミ
ノ化反応について、Ｂは還元的アミノ化反応についての
結果を示し；第７図はスポロサルシナ・ウレアエ５ＣＲＣ−Ｒ０４が
生産するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素のｐＨ安定性
を示すグラフであり；第８図はスポロサルシナ・ウレアエ５ＣＲＣ−Ｒ０４が
生産するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の温度と反応
速度との関係を表わすグラフであって、酸化的脱アミノ
化反応についての結果を示し；第９図はスポロサルシナ
・ウレアエ５ＣＲＣ−Ｒ０４が生産するＬ−フェニルア
ラニン脱水素酵素の温度安定性を示すグラフであり；第１０図はスポロサルシナ・ウレアエ５ＣＲＣ−Ｒ０４
が生産するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の紫外部吸
収スペクトラムであり；第１１図はスポロサルシナ・ウレアエ５ＣＲＣ−Ｒ０４
が生産するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の均一性を
示す電気泳動図であって、Ａはポリアクリルアミド電気
泳動く７．５％ゲル、ｐＨ８，４）を示し、そしてＢは
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（１０，０％ゲル
、ｐＨ７，２）を示し；第１２図はスポロサルシナ・ウ
レアエ５ＣＲＣ−Ｒ０４が生産するＬ−フェニルアラニ
ン脱水素酵素の顕微鏡拡大スケッチであり；第１３図はバシルスｓｐ、５ＣＲＣ−Ｒ７９ａが生産す
るＬ−フェニルアラニン脱水素酵素のｐＨと反応速度の
関係を表わすグラフであって、Ａは酸化的脱アミノ化反
応について、Ｂは還元的アミノ化反応についての結果を
示し；第１４図はバシルスｓｐ、５ＣＲＣ−Ｒ７９ａが生産す
るＬ−フェニルアラニン脱水素酵素のｐＨ安定性を示す
グラフであり；第１５図はバシルスｓｐ、５ＣＲＣ−Ｒ７９ａが生産す
るＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の温度と反応速度と
の関係を表わすグラフであって、酸化的脱アミノ化反応
についての結果を示し；第１６図はバシルスｓｐ、５ＣＲＣ−Ｒ７９ａが生産す
るＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の温度安定性を示す
グラフであり、Ａは０．１Ｍグリシン−Ｎａ　ＯＨ４７
４衝液（ｐＨ９，０）中での結果を示し、そしてＢは０
．１　Ｍグリシン−Ｋ（Ｊ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ１１，
０）中での結果を示し；第１７図はバシルスｓｐ、５ＣＲＣ−Ｒ７９ａが生産す
るし−フェニルアラニン脱水素酵素の紫外部吸収スペク
トラムであり；そして、第１８図はバシルスｓｐ、　５ＣＲＣ−Ｒ７９ａが生産
するし−フェニルアラニン脱水素酵素の均一性を示す電
気泳動図であって、Ａはポリアクリルアミド電気泳動（
７，５％ゲル、ｐＨ８，４＞を示し、て（てＢはＳＤＳ
−ポリアクリルアミド電気泳動（１０，０％ゲル、ｐＨ
７，２）の結果を示す。第　１　図　　ＳＣＲ，Ｃ−ＩＬ０４株細胞の形態第　
３図　　５ＯｒＬＣ（Ｌ７９ａ株の形態第　４　国　　
５ＣａＣ−１０１Ａ株の形態第７図５ＣＲＣ−ＲＯＡ株由来酵素の一安定性５ＣＲＣ−Ｒ０
４Ａ：酸化的脱アミン化Ｈ第６図株由来酵素のＰＨ特性Ｂ゛還元的アミノ化Ｈ第８国５ＣＲＣ−Ｒ０４株由来酵素の至適温度温度（°Ｃ）第９図５ＣＲＣ−Ｆ！０４株由来酵素の温度安定性○　］０２
０３０４０　５０６０温度じＣ）第１０図５ＣＲＣ−８０４株由来酵素の紫外部吸収液　　長　（
ｎｍ）第１１図５ＣＲＣ−１：Ｑ４株由来酵素の電気泳動Ａ：ポリアク
リルアミドゲル７．５°１０　、ｐＨ８，４８：ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル１０・Ｏ’１０　、　ｐＨ７
・２第１２図５ＣＲＣ−８０４株由来酵素の結晶りｍ−」゛　　１四ｍ第１４図５ＣＲＣ−Ｒ７９ａ株Ａ−酸化的膜アミン化第１３図由来酵素のＰＨ特性Ｂ：還元的アミン化ｐＨ第１５国５ＣＲＣ−Ｒ７９ａ株由来酵素の至適温度温度じＣ）第１６図５ＣＲＣ−Ｒ７９ａ株由来酵素の温度安定性Ａ：　ｐＨ
９，０Ｂ：ｐＨ１１，○ 温　　度　（０Ｃ）第１７図５ＣＲＣ−Ｒ７９ａ株由来酵素の紫外部吸収波長（ｎｍ
）第１８図５ＣＲＣ−Ｒ７９ｏ株由来酵素の電気泳動＋　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−Ａ、ポ
リアクリルアミドゲル　７．５０１．、ｐＨ８，４Ｂ　
：　ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル１０．０’１０．
ｐＨ７，２手続補正書（自発）１、事件の表示昭和６０年特許願第０８０２９３号２、発明の名称Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素３、補正をする者事件との関係　　　特許出願人名称　財団法人　和積中央化学研究所４、代理人住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号（外
４名）５、補正の、対象（１）明細書の「特許請求の範囲」の欄。（２）明細書の「発明の詳細な説明」の欄。６、補正の内容（１）特許請求の範囲を別紙の通りに補正する。（２）■　明細書第８頁第２０行目〜第９頁第１行目「
されている。」を「され、微工研凍寄第１０１２号（Ｆ
ＥＲＭ４ＥＢＰ−１０１２）としてブタペスト条約に基
く国際寄託に移管された。」に補正する。 ■　同第９頁第１０行目「されている。」をｒされ、微
工研−１Ｗ第１０１３号（ＦＥＲＭ′＃：ＢＰ−１０１
３）としてブタペスト条約に基く国際寄託に移管された
。またバシルスｓｐ、５ＣＲＣ−１１４０が微工研壕寄
第１０１１号としてブタペスト条約に基き国際寄託され
ている。Ｊに補正する。 ■　同第９頁第１２行目「調整」を「調製」に補正する
。 ■　同第１０頁第１２行目ｒ　５００ｍ１の」を’　５
００ｍＪ容の」に補正する。 ■　同第１７頁第１行目「バーゼイズ」を「バ−ジイズ
Ｊに補正する。 ■　同第１７頁第２行目「ディターミネーティブ」をｒ
ディターミネイティブＪに補正する。 ■　同第１９頁第７行目「複類種類」を「複数種類Ｊに
補正する。 ■　同第３０頁第７行目〜８行目「１３６％である。」
を’ｐＨ９，０において１７６％である。Ｊに補正する
。 ■　同第３６頁第６行目「アンモニウム」を「アンモニ
ア１に補正する。［相］　同第３７頁第１６行目、及び同第１７行目「脱
水素酸素」を「脱水素酵素ｊに補正する。 ■　同第３９頁第１０行目「蟻脱水素酵素」を「蟻酸脱
水素酵素ｊに補正する。 ■　同第４０頁第８行目「酸酸の」を「酸の」に補正す
る。 ■　同第４０頁第１３行目及び同第１６行目「ボディエ
」を「ボイディニ」に補正する。 ■　同第４２頁第９行目「号）を接種し」を「号）（微
工研粂寄第１０１２号）を接種しＪに補正する。［相］　同第４４頁第１行目、第４４頁第８行目、第４
７頁第２０行目及び第４８頁第７行目「活性区分」を「
活性画分Ｊに補正する。［相］　同第４６頁第８行目「号）を接種し」を１号）
（徽工研粂寄第１０１３号）を接種しＪに補正する。 ■　同第５０頁第８行目、第５２頁第８行目、及び第５
３頁６行目「第５表」をｒ第７表」に補正する。［株］　同第５１頁１５行目「〔α〕。」を「〔α〕。」に補正する。７、添付書類の目録（１）補正特許請求の範囲　　　　　　　１通（２）受
託証の写し　　　　　　　　　　１通２、特許請求の範
囲１、次の性１！ｔ：（１）１モルのＬ−フェニルアラニン、１モルのＮＡＤ
”及び１モルの水から１モルのフェニルピルビン酸、１
モルのＮＡＤＨ及び１モルのアンモニウムイオンを生成
する反応、並びにこの逆反応を触媒する；（２）　　高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法にお
いて約２９０．０００の分子量を有し、ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲルディスク電気泳動法において約３８．
０００〜３９．０００の分子量を有するサブユニットを
示す；（３）Ｌ−フェニルアラニンに特異的に作用し、Ｌ−１
−リプトファン、Ｌ−チロシン及びＬ−メチオニンに対
する特異性が非常に低い；を有することを特徴とするＬ
−フェニルアラニン脱水素酵素。２、　スポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属
細菌により生産される特許請求の範囲第１項記載の酵素
。３、次の性質：（１）１モルのＬ−フェニルアラニン、１ルモのＮＡＤ
”″及び１モルの水から１モルのフェニルピルビン酸、
１モルのＮＡＤＨ及び１モルのアンモニウムイオンを生
成する反応、並びにこの逆反応を触媒する；（２）　　高速流体クロマトグラフィーゲル濾過法にお
いて約２９０．０００の分子量を有し、ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲルディスク電気泳動法において約３８．
０００〜３９，０００の分子量を有するサブユニットを
示す；（３）Ｌ−フェニルアラニンに特異的に作用し、Ｌ−ト
リプトフアン、Ｌ−チロシン及びＬ−メチオニンに対す
る特異性が非常に低い；を有するＬ−フェニルアラニン
脱水素酵素の製造方法において、該酵素を生産すること
ができるスポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）
属細菌を培養し、この培養物から該酵素を採取すること
を特徴とする方法。４、前記細菌がスポロサルシナ・ウレアエ（Ｓｐｏｒｏ
ｓａｒｃｉｎａ　ｕｒｅａｅ）である特許請求の範囲第
３項記載の方法。５、　　Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を生産するこ
とができるスポロサルシナ・ウレアエ（Ｓｐｏｒｏ−ｓ
ａｒｃｉｎａ　ｕｒｅａｅ）種細菌。６、　スポロサルシナ・ウレアエ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃ
ｉｎａｕｒｅａｅ）　５ＣＲＣ−Ｒ０４（微工研菌寄第
８１７８号）（盈工班−＋　岑１０１２”）である特許
請求の範囲第５項記載の細菌。７、　スポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属
細菌によって生産されるＬ−フェニルアラニン脱水素酵
素の存在下でフェニルピルビン酸、ＮＡＤｌｆ及びアン
モニウムイオンを反応せしめてＬ−フェニルアラニンを
生成せしめ、該フェニルアラニンを採取することを特徴
とするＬ−フェニルアラニンの製造方法。８、前記細菌がスポロサルシナ・ウレアエ、　　　　　
（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ　ｕｒｅａｅ）である特許
請求の範囲第７項記載の方法。９゜　前記Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素が次の性質
：（１）１モルのＬ−フェニルアラニン、１モルのＮＡＤ
”及び１モルの水から１モルのフェニルピルビン酸、１
モルのＮＡＤＨ及び１モルのアンモニウムイオンを生成
する反応、並びにこの逆反応を触媒する；（２）高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法において
約２９０，０００の分子量を有し、ＳＯ３−ポリアクリ
ルアミドゲルディスク電気泳動法において約３８，００
０〜３９．０００の分子量を有するサブユニットを示す
；（３）Ｌ−フェニルアラニンに特異的に作用し、Ｌ−ト
リプトファン、Ｌ−チロシン及びＬ−メチオニンに対す
る特異性が非常に低い；を有することを特徴とする特許
請求の範囲第７項記載の方法。

Claims

【特許請求の範囲】１、次の性質：（１）１モルのＬ−フェニルアラニン、１モルのＮＡＤ
＾＋及び１モルの水から１モルのフェニルピルビン酸、
１モルのＮＡＤＨ及び１モルのアンモニウムイオンを生
成する反応、並びにこの逆反応を触媒する；（２）高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法において
約２９０，０００の分子量を有し、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲルディスク電気泳動法において約３８，００
０〜３９，０００の分子量を有するサブユニットを示す
；（３）Ｌ−フェニルアラニンに特異的に作用し、Ｌ−ト
リプトファン、Ｌ−チロシン及びＬ−メチオニンに対す
る特異性が非常に低い；を有することを特徴とするＬ−フェニルアラニン脱水素
酵素。２、スポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属細
菌により生産される特許請求の範囲第１項記載の酵素。３、次の性質：（１）１モルのＬ−フェニルアラニン、１モルのＮＡＤ
＾＋及び１モルの水から１モルのフェニルピルビン酸、
１モルのＮＡＤＨ及び１モルのアンモニウムイオンを生
成する反応、並びにこの逆反応を触媒する；（２）高速流体クロマトグラフィーゲル濾過法において
約２９０，０００の分子量を有し、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲルディスク電気泳動法において約３８，００
０〜３９，０００の分子量を有するサブユニットを示す
；（３）Ｌ−フェニルアラニンに特異的に作用し、Ｌ−ト
リプトファン、Ｌ−チロシン及びＬ−メチオニンに対す
る特異性が非常に低い；を有するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の製造方法に
おいて、該酵素を生産することができるスポロサルシナ
（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属細菌を培養し、この培
養物から該酵素を採取することを特徴とする方法。４、前記細菌がスポロサルシナ・ウレアエ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ　ｕｒｅａｅ）である特許
請求の範囲第３項記載の方法。５、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を生産することが
できるスポロサルシナ・ウレアエ（Ｓｐｏｒｏ−ｓａｒ
ｃｉｎａ　ｕｒｅａｅ）種細菌。６、スポロサルシナ・ウレアエ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉ
ｎａｕｒｅａｅ）ＳＣＲＣ−Ｒ０４（微工研菌寄第８１
７８号）である特許請求の範囲第５項記載の細菌。７、スポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属細
菌によって生産されるＬ−フェニルアラニン脱水素酵素
の存在下でフェニルピルビン酸、ＮＡＤＨ及びアンモニ
ウムイオンを反応せしめてＬ−フェニルアラニンを生成
せしめ、該フェニルアラニンを採取することを特徴とす
るＬ−フェニルアラニンの製造方法。８、前記細菌がスポロサルシナ・ウレアエ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ　ｕｒｅａｅ）である特許
請求の範囲第７項記載の方法。９、前記Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素が次の性質：（１）１モルのＬ−フェニルアラニン、１モルのＮＡＤ
＾＋及び１モルの水から１モルのフェニルピルビン酸、
１モルのＮＡＤＨ及び１モルのアンモニウムイオンを生
成する反応、並びにこの逆反応を触媒する；（２）高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法において
約２９０，０００の分子量を有し、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲルディスク電気泳動法において約３８，００
０〜３９，０００の分子量を有するサブユニットを示す
；（３）Ｌ−フェニルアラニンに特異的に作用し、Ｌ−ト
リプトファン、Ｌ−チロシン及びＬ−メチオニンに対す
る特異性が非常に低い；を有することを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の
方法。