JPS59198972A - 微生物学的に製造したＬ−フエニルアラニン−デヒドロゲナ−ゼ、その取得法及びＬ−α−アミノカルボン酸の製法 - Google Patents
微生物学的に製造したＬ−フエニルアラニン−デヒドロゲナ−ゼ、その取得法及びＬ−α−アミノカルボン酸の製法Info
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- JPS59198972A JPS59198972A JP59037384A JP3738484A JPS59198972A JP S59198972 A JPS59198972 A JP S59198972A JP 59037384 A JP59037384 A JP 59037384A JP 3738484 A JP3738484 A JP 3738484A JP S59198972 A JPS59198972 A JP S59198972A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明は、次の反応：
０Ｈ３−Ｓ−０Ｈ２−０Ｈ２−）
を触媒する従来記載されなかった酵素、その取得法及び
その使用に関する。 Ｌ−グルタミン酸及び種々の他の脂肪族Ｌ−（５） α−アミノカルゼン酸、例えばＬ−アラニンＴ、 −／
々’Ｊ ／ ｂ Ｌ−ｏイシン及びＬ−インロイシンは
相応するα−ケトカルボン酸をアンモニウムイオン及び
補酵素の存在において還元的にアミン化することにより
製造することができ、その際に使用する酵素は公知であ
る。Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼは窒素−物質代
謝において中心的な役割を果しかつ普遍的に産出する一
方で、とシわけ／々テルス属がらの酵素に関して他の脂
肪族α−ケトカルビン酸の還元的アミン化が記載されて
いる。しかし従来公知のＬ−アミノ酸−デヒドロゲナー
ゼは芳香族又はへテロ芳香族α−ケトカルボン酸が相応
するＬ−α−アミノカルゼン酸へ変換するのを触媒しな
い。 本発明によるＬ−７エニルアラニ７−ｆ’ヒＦロゲナー
ゼは次の性質を特徴とする： ａ）フェニル熱性ブドウ酸ヲアンモニウムイオンの存在
で及び補酵素としてのＮＡＤＨにコチンアミドーアデニ
ンージスクレオチド）により４Ｌ−フェニルアラニンに
還元的にア（６） ミノ化するのを触媒する、 ｂ）他のα−ケトカルゼン酸を相応するα−アミノカル
ゼン酸に、特にｐ−ヒドロキシ７エ二ル蕪性ブドウ酸を
Ｌ−チロシンに、インドリル無性ブドウ酸をＬ−）リゾ
ドアアンに及び２−ケト−４−（メチルメルカプト）−
酪酸をＬ−メチオニンにアンモニウムイオンの存在で及
び補酵素としてのＮＡＤＨによシ還元的にアミノ化する
のを触媒する。 ｃ ） ＴＪ −フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ
−トリプトファン及びＬ−メチオニンを補酵素としての
ＮＡＤ＋と共に酸化的に脱アミノするのを触媒する。 ｄ〕還元的アミノ化の至適、Ｈ範囲８．５±１、ｅ）酸
化的脱アミノ反応の至適、Ｈ範囲工０士１゜本発明によ
るＩ、−フェニル アラニンーデヒドロケナーゼはブレ
ビメ々クテリウム（Ｂｒｅｖｉ −ｂａｃｔｅｒｉｕｍ
） 菌株を用いて得られ、これは１９８２年８月１９
日にゲッチンゲン（Ｇｏｔｔｉ−ｎｇｅｎ ）在のドイ
ツ微生物保存機関（Ｄｅｕｔｓ、Ｃｈｅ（７〕 Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓ
ｍｅｎ ）にＡ ２４４８として寄託された。この菌株
は次の形態学的及び生化学的性質を特徴とする： ブレビ／々クテリウム種ＤＳＭ２４４８は時間と共にコ
ツコイド形（ｋｏｋｋｏｉｄｅ Ｆｏｒｍ ）に変化す
るダラム陽性の短稈に成長する。細胞は非運動性で、胞
子を形成しかい。成長は全く好気性である。グルコース
からは酸は形成されない。カタラーゼ−及びニトレート
還元は正、尿素分解ハ正、ゼラチン−、カゼイン−及び
デンプン分解は負、Ｈ，Ｓ形成は負、４１℃の成長は負
である。細胞壁の糖としてはアラビノース、マンノース
及びガラクトースが検出された。この細菌は全く好気性
でありかつコリネ−々クテリウムとは異なる。細胞壁は
メン−ジアミノピメリン酸を含有しかつアルトロ・セク
タ属とは異なる。 更に、チトクロムのスペクトルがこの細菌をミクロ−々
クテリウム屑と区別する。新しく見出された細菌ブレビ
／々クテリウム種Ｄ Ｓ Ｍ ２４４８Ｈ現在＋７）と
ころゾレビー々クテリウム属の公知の
その使用に関する。 Ｌ−グルタミン酸及び種々の他の脂肪族Ｌ−（５） α−アミノカルゼン酸、例えばＬ−アラニンＴ、 −／
々’Ｊ ／ ｂ Ｌ−ｏイシン及びＬ−インロイシンは
相応するα−ケトカルボン酸をアンモニウムイオン及び
補酵素の存在において還元的にアミン化することにより
製造することができ、その際に使用する酵素は公知であ
る。Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼは窒素−物質代
謝において中心的な役割を果しかつ普遍的に産出する一
方で、とシわけ／々テルス属がらの酵素に関して他の脂
肪族α−ケトカルビン酸の還元的アミン化が記載されて
いる。しかし従来公知のＬ−アミノ酸−デヒドロゲナー
ゼは芳香族又はへテロ芳香族α−ケトカルボン酸が相応
するＬ−α−アミノカルゼン酸へ変換するのを触媒しな
い。 本発明によるＬ−７エニルアラニ７−ｆ’ヒＦロゲナー
ゼは次の性質を特徴とする： ａ）フェニル熱性ブドウ酸ヲアンモニウムイオンの存在
で及び補酵素としてのＮＡＤＨにコチンアミドーアデニ
ンージスクレオチド）により４Ｌ−フェニルアラニンに
還元的にア（６） ミノ化するのを触媒する、 ｂ）他のα−ケトカルゼン酸を相応するα−アミノカル
ゼン酸に、特にｐ−ヒドロキシ７エ二ル蕪性ブドウ酸を
Ｌ−チロシンに、インドリル無性ブドウ酸をＬ−）リゾ
ドアアンに及び２−ケト−４−（メチルメルカプト）−
酪酸をＬ−メチオニンにアンモニウムイオンの存在で及
び補酵素としてのＮＡＤＨによシ還元的にアミノ化する
のを触媒する。 ｃ ） ＴＪ −フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ
−トリプトファン及びＬ−メチオニンを補酵素としての
ＮＡＤ＋と共に酸化的に脱アミノするのを触媒する。 ｄ〕還元的アミノ化の至適、Ｈ範囲８．５±１、ｅ）酸
化的脱アミノ反応の至適、Ｈ範囲工０士１゜本発明によ
るＩ、−フェニル アラニンーデヒドロケナーゼはブレ
ビメ々クテリウム（Ｂｒｅｖｉ −ｂａｃｔｅｒｉｕｍ
） 菌株を用いて得られ、これは１９８２年８月１９
日にゲッチンゲン（Ｇｏｔｔｉ−ｎｇｅｎ ）在のドイ
ツ微生物保存機関（Ｄｅｕｔｓ、Ｃｈｅ（７〕 Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓ
ｍｅｎ ）にＡ ２４４８として寄託された。この菌株
は次の形態学的及び生化学的性質を特徴とする： ブレビ／々クテリウム種ＤＳＭ２４４８は時間と共にコ
ツコイド形（ｋｏｋｋｏｉｄｅ Ｆｏｒｍ ）に変化す
るダラム陽性の短稈に成長する。細胞は非運動性で、胞
子を形成しかい。成長は全く好気性である。グルコース
からは酸は形成されない。カタラーゼ−及びニトレート
還元は正、尿素分解ハ正、ゼラチン−、カゼイン−及び
デンプン分解は負、Ｈ，Ｓ形成は負、４１℃の成長は負
である。細胞壁の糖としてはアラビノース、マンノース
及びガラクトースが検出された。この細菌は全く好気性
でありかつコリネ−々クテリウムとは異なる。細胞壁は
メン−ジアミノピメリン酸を含有しかつアルトロ・セク
タ属とは異なる。 更に、チトクロムのスペクトルがこの細菌をミクロ−々
クテリウム屑と区別する。新しく見出された細菌ブレビ
／々クテリウム種Ｄ Ｓ Ｍ ２４４８Ｈ現在＋７）と
ころゾレビー々クテリウム属の公知の
【８】
種類に分類することはできない。付加的に、ブレビ−々
クテリウム及び一部はアミノ酸生産者として知られてい
る類縁風の一連の種々の菌株に、ゾレビ／々クテリウム
種Ｄ８ Ｍ２４４８がＬ−フェニルアラニン−デヒドロ
ゲナーゼを形成する条件を適用しかつフェニル無性ブド
ウ酸をアンモニウムイオン及びＮＡＤＨの存在において
還元的にアミノ化する能力について試験した。いずれの
場合モＩ、−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼを検
出することはできなかった。 本発明によるＬ−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼ
を取得するに当υ、ゾレビ／々クテリウム種Ｔ） Ｓ
Ｍ ２４４８ を、炭素及び窒素の供給源、チアミン
、鉱物塩並びに誘導質を含有する水性培地中で、Ｈ６，
５〜７．５及び温度２５〜３２℃で好気培養し、細胞物
質を分離しかつ酵素を細胞から単離する。例えば、誘導
質としてはＬ−フェニルアラニン、Ｄ−フェニルアラニ
ン、Ｄ、Ｌ、−フェニルアラニン、Ｄ、Ｌ−フェニルア
ラニンエステル又はＬ−ヒスチジンを使用す（９） ることかできる。 本発明によるＬ−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼ
は従来の方法、例えば超音波処理又は湿式摩砕によシ細
胞を砕解しかつ不溶性の細胞フラグメントを分離するこ
とによシ溶解形で取得する。酵素活性は、光度測定試験
で、ＮＡＤ Ｈの吸光度の低下（３４０ｎｍで）を測定
して確定する。試験２々ツチは塩化アンモニウム０．７
モル（アンモニアで、）Ｔ８．５に調節）、 ＮＡＤＨ
Ｏ，２０ミＩＪモル、フェニルピルベート及び限定量の
酵素を含有する。酵素活性は国際単位（Ｕ）で記載し、
その際に１単位は１分間当シにＮＡ、ＤＨ１μモル減少
させることを表わす。計算には３４０ ｎｍでモル吸光
係数６．２２ Ｘ １０”を使う。 既に触媒として粗製エキスを使っても、消費ＮＡＤＨＩ
モル当シＴＪ −フェニルアラニン０．９２モルが試験
条件下にアミノ酸分析器で検出される。その際に、次い
でフェニルピルベートのアミノ基置換が起るグルタミン
酸デヒドロゲナーゼの共役反応に関連しないことは、膜
反応器中（１０） で、１１０時間以上フェニルぎルベートからのＴ、−フ
ェニルアラニンの連続的形成を、使用した分子量を拡大
したＮＡＤＨを蟻酸デヒＰロゲナーぜで再生しながら立
証することができた。 接触反応の反応速度は、Ｈに相応して測定した。 還元的アミン化では最高、ＨＢ、５であシ、酸化的脱ア
ミノでは約、Ｈ１０，５ｔで上昇する。最高反応速度け
ＮＡＤＨの濃度的０．３ ミＩＪモル／ｌで認められる
。反応速度は少なくともアンモニウムイオン０．５モル
までの増加するアンモニウムイオン濃度と共に上昇する
。これに対して、芳香族α−ケトカルゼン酸もしくは芳
香族Ｌ−アミノカルゼン酸の基質濃度がそのＫＭ値に比
べて低い場合、反応速度は基質濃度と直線的な相関関係
を有する。この事実は、Ｌ−フエ二に７５ニン、Ｌ−チ
ロシン、Ｌ−ドリフトファン、フェニルビル−ｑ−ト及
びヒドロキシフェニルピルベートを測定するための簡単
な動力学的試験に利用することができる。Ｄ−フェニル
アラニンＵＬ−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼに
よって変換されずかつ他方ではＬ−フェニルアラニンの
酸化的脱アミノの阻害剤である。酵素膜反応器中でフェ
ニルピルベートの還元的アミン化によジ生成したＬ−フ
ェニルアラニンヲ偏光分析又はＤ−ＡＯＤ（Ｄ−アミノ
酸−オキシダーゼ： Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ社〕の変換により光学的純度について試験した
。両方の試験により生成物中にＤ−フェニルアラニンに
よる不純化は検出されなかった。生成物の少なくとも９
９．９９ ％がＬ−異性体から成っていた。 ブレピー々クテリウム種Ｄ ５Ｍ２４４８を酵母エキス
上で培養する場合、その粗製エキスは芳香族もしくはヘ
テロ芳香族、更にまた脂肪族の一連のα−ケトカルヂン
酸を相応α−アミノカルゼン酸に変換するのを触媒する
。 この広範な、変換可能な基質のスペクトルから、これら
の成長条件下に粗製エキス中に数種の酵素活性が存在す
ることを予測することができる。 硫酸アンモニウムで分別沈殿し、次いで降下する傾斜量
の硫酸アンモニウムを用いて塩析条件下にクロマトグラ
フィ処理することによシ、ＴＪ −ｙエニルアラニンー
デヒドロゲナーゼが５２倍富化される。このクロマトグ
ラフィによシ、−々チルスス７エリクス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ８ｐｈａｅ −ｒｌｃｕｓ ）からのＬ−ロイシ
ン−デヒドロゲナーゼと同様に相応する脂肪族α−ケト
ヵルヂン酸ヲＴ、 −０イシン、Ｌ−ノルロイシン４Ｔ
Ｊ−一々リン、Ｌ−ノル／々リン及びＬ−インロイシン
に変換するのを触媒するデヒドロゲナーゼが分離する。 更に、クロマトグラフィによシ精製したＬ−フェニルア
ラニン−デヒドロゲナーゼｈ＊ 相応する芳香族α−ケ
トカルゼン酸をＬ−７エニルアラニン、Ｌ−チロシン及
びＬ−トリプトファンに並びに２−ヶ）−４−（メチル
メルカプト）−酪酸をＬ−メチオニンに還元的にアミノ
化するのを触媒する。他の冥験で、フェニル熱性ブドウ
酸、ｐ−ヒドロキシフェニル伸性ブドウ酸、インドリル
熱性ブドウ酸及び２−ケト−４−（メチルメルカプト）
−酪酸の還元的アミ（１３〕 ノ化が同じ酵素蛋白で触媒されることが明らかである。 そのために、一方では種々のα−アミノカルゼン酸の存
在において培養することにより種々のデヒドロゲナーゼ
活性を誘発することを試験する。この目的のために、麦
芽エキス１％、グルコース０．５憾、チアミン２μｔ／
ｌ ｈＫＨｚＰＯ４０，２％及び濃度１％の種々のα
−アミノカルゼン酸を含む培地中のブレビ２々クテリウ
ム種ＤＳＭ２４４８を使用する。培地のｐＨ値は７．４
に調節する。細胞を３０℃で２４時間成長させた後採取
し、超音波で砕解しかつ各々の抽出液中で光学試験によ
りα−ケトカルゼン酸６種の還元的アミノ化を試験する
。インドリル伸性ブドウ酸からのＴ、 −）リプトファ
ンの形成は、この基質により光学試験が妨害されるので
アミノ酸分析器で試験する。結果を表１に掲載する。 （１４） ◆ 還元的アミン化に使用したα−ケトカルジン酸： ■ フェニル伸性ブドウ酸 ２ ｐ−ヒドロキシフェニル帰件ブドウ酸３２−ヶ）−
４−（メチルメルカプト）−酪酸 ４ インドリル伸性ブドウ酸 ５２−ケトヘキサン酸 ６２−ケト−４−メチルペンタン酸 ◆※ 培地中の濃度は僅かに０．５％ ｎｂ−測定せず 該表から、ブレビバクテリウムｆｌｉＤ８Ｍ２４４８が
２種の誘導可能々Ｌ−アミノ酸−デヒドロゲナーゼ、即
ちＬ−ロイシンーデヒドロゲ−）−−ゼ及びＬ−フェニ
ルアラニン−デヒドロゲナーゼを生産することが明らか
である。Ｌ−ロイシン−デヒドロゲナーゼは試験したα
−ケトカルジン酸のうち２−ケトヘキサン酸及び２−ケ
ト−４−メチルペンタン酸を変換しかつＬ−Ｃ１Ｇ） ノルロイシン、Ｌ−一々リン、Ｌ−インロイシン及びＬ
−ロイシンにより誘導される。Ｌ−７エニルアラニンー
デヒドロゲナーゼはフェニル伸性ブドウ酸、ｐ−ヒドロ
キシフェニル伸性ブドウ酸、インドリル照性ブドウ酸及
び２−ケト−４−（メチルメルカプト）−酪酸を変換し
かつＬ−フェニルアラニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ
、Ｉ、−７ｘニル７ラニン、Ｌ−ヒスチジン及Ｕ ＴＪ
−”ｙエニルーアラニンーメチルエステルによシ誘導
される。これらの結果は、両方のＬ−アミノ酸−デヒド
ロゲナーゼをクロマトグラフィによシ分離するための実
験と一致する。 更に、５２℃で加熱変性することにょシ粗製エキス中に
存在する種々のデヒドロゲナーゼ活性の差異のある失活
化を達成することを試験した。その際に、この条件下で
２−ケトヘキサン酸及び２−ケト−４−メチルペンタン
酸の還元的アミノ化を触媒する酵素が均一な動力学的経
過によって急速に失活化することが明らかになった。他
方、フェニル伸性ブドウ酸、ｐ−ヒト（１７） ロキシフェニル伴性ブドウ酸、インドリル伸性ゾドウ酸
及び２−ケト−４−（メチルメルカプト）−酪酸を触媒
する酵素は５２℃に９０分間加熱した後で５０％より高
い残留活性を有する高い熱安定性を示す。この場合にも
、試験したすべての基質に関して同じ失活化の動力学的
経過が認められ、それ故これらの変換が同じ蛋白質によ
り触媒されていると結論することができる。 Ｌ−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼの分子量はア
ンドリスウス法〔′”Ｍｅｔｈ、Ｂｉｏｃｈｅ −ｍｉ
ｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ”、１８巻、１〜５３頁（１
９７０年）〕により〕セファクリルー８３００スーＪＲ
ファイン（５ｅｐｈａｃｒｙｌ −８３００５ｕｐｅｒ
−ｆｉｎｅ ） でゲル濾過により測定し、１３０
０００±１００００ダルトンと決定した。展開剤として
はリン酸カリウム緩衝剤５０ミリモルｋ 、Ｈ７，５
及び塩化ナトリウム１００ミリモルを使用した。 Ｌ−フェニルアラニン−デヒドロ）ｙ’ｆ−４２ヲ安定
化するため、展開剤に恢酸アンモニウムを５（１８） 係−溶液が得られるように添加した。使用した標準蛋白
（カタラーゼ、牛血清アルブミン、卵アルブミン及びキ
モトリプシノゲン）を同じ条件下にクロマトグラフィ処
理した。ゲル濾過の条件下にＬ−フェニルアラニン−デ
ヒドロゲナーゼの解離は６６０００±５０００ダルトン
で認められた。 本発明によるＬ フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼ
は公知の方法でアンモニウムイオンの存在で及び補酵素
としてのＮ Ａ Ｄ Ｈと共にフェニル無性ブドウ酸、
ｐ−ヒドロキシフェニル伸性ブＦつ酸、インドリル熱性
ブドウ酸又は２−ケドー４−
クテリウム及び一部はアミノ酸生産者として知られてい
る類縁風の一連の種々の菌株に、ゾレビ／々クテリウム
種Ｄ８ Ｍ２４４８がＬ−フェニルアラニン−デヒドロ
ゲナーゼを形成する条件を適用しかつフェニル無性ブド
ウ酸をアンモニウムイオン及びＮＡＤＨの存在において
還元的にアミノ化する能力について試験した。いずれの
場合モＩ、−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼを検
出することはできなかった。 本発明によるＬ−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼ
を取得するに当υ、ゾレビ／々クテリウム種Ｔ） Ｓ
Ｍ ２４４８ を、炭素及び窒素の供給源、チアミン
、鉱物塩並びに誘導質を含有する水性培地中で、Ｈ６，
５〜７．５及び温度２５〜３２℃で好気培養し、細胞物
質を分離しかつ酵素を細胞から単離する。例えば、誘導
質としてはＬ−フェニルアラニン、Ｄ−フェニルアラニ
ン、Ｄ、Ｌ、−フェニルアラニン、Ｄ、Ｌ−フェニルア
ラニンエステル又はＬ−ヒスチジンを使用す（９） ることかできる。 本発明によるＬ−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼ
は従来の方法、例えば超音波処理又は湿式摩砕によシ細
胞を砕解しかつ不溶性の細胞フラグメントを分離するこ
とによシ溶解形で取得する。酵素活性は、光度測定試験
で、ＮＡＤ Ｈの吸光度の低下（３４０ｎｍで）を測定
して確定する。試験２々ツチは塩化アンモニウム０．７
モル（アンモニアで、）Ｔ８．５に調節）、 ＮＡＤＨ
Ｏ，２０ミＩＪモル、フェニルピルベート及び限定量の
酵素を含有する。酵素活性は国際単位（Ｕ）で記載し、
その際に１単位は１分間当シにＮＡ、ＤＨ１μモル減少
させることを表わす。計算には３４０ ｎｍでモル吸光
係数６．２２ Ｘ １０”を使う。 既に触媒として粗製エキスを使っても、消費ＮＡＤＨＩ
モル当シＴＪ −フェニルアラニン０．９２モルが試験
条件下にアミノ酸分析器で検出される。その際に、次い
でフェニルピルベートのアミノ基置換が起るグルタミン
酸デヒドロゲナーゼの共役反応に関連しないことは、膜
反応器中（１０） で、１１０時間以上フェニルぎルベートからのＴ、−フ
ェニルアラニンの連続的形成を、使用した分子量を拡大
したＮＡＤＨを蟻酸デヒＰロゲナーぜで再生しながら立
証することができた。 接触反応の反応速度は、Ｈに相応して測定した。 還元的アミン化では最高、ＨＢ、５であシ、酸化的脱ア
ミノでは約、Ｈ１０，５ｔで上昇する。最高反応速度け
ＮＡＤＨの濃度的０．３ ミＩＪモル／ｌで認められる
。反応速度は少なくともアンモニウムイオン０．５モル
までの増加するアンモニウムイオン濃度と共に上昇する
。これに対して、芳香族α−ケトカルゼン酸もしくは芳
香族Ｌ−アミノカルゼン酸の基質濃度がそのＫＭ値に比
べて低い場合、反応速度は基質濃度と直線的な相関関係
を有する。この事実は、Ｌ−フエ二に７５ニン、Ｌ−チ
ロシン、Ｌ−ドリフトファン、フェニルビル−ｑ−ト及
びヒドロキシフェニルピルベートを測定するための簡単
な動力学的試験に利用することができる。Ｄ−フェニル
アラニンＵＬ−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼに
よって変換されずかつ他方ではＬ−フェニルアラニンの
酸化的脱アミノの阻害剤である。酵素膜反応器中でフェ
ニルピルベートの還元的アミン化によジ生成したＬ−フ
ェニルアラニンヲ偏光分析又はＤ−ＡＯＤ（Ｄ−アミノ
酸−オキシダーゼ： Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ社〕の変換により光学的純度について試験した
。両方の試験により生成物中にＤ−フェニルアラニンに
よる不純化は検出されなかった。生成物の少なくとも９
９．９９ ％がＬ−異性体から成っていた。 ブレピー々クテリウム種Ｄ ５Ｍ２４４８を酵母エキス
上で培養する場合、その粗製エキスは芳香族もしくはヘ
テロ芳香族、更にまた脂肪族の一連のα−ケトカルヂン
酸を相応α−アミノカルゼン酸に変換するのを触媒する
。 この広範な、変換可能な基質のスペクトルから、これら
の成長条件下に粗製エキス中に数種の酵素活性が存在す
ることを予測することができる。 硫酸アンモニウムで分別沈殿し、次いで降下する傾斜量
の硫酸アンモニウムを用いて塩析条件下にクロマトグラ
フィ処理することによシ、ＴＪ −ｙエニルアラニンー
デヒドロゲナーゼが５２倍富化される。このクロマトグ
ラフィによシ、−々チルスス７エリクス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ８ｐｈａｅ −ｒｌｃｕｓ ）からのＬ−ロイシ
ン−デヒドロゲナーゼと同様に相応する脂肪族α−ケト
ヵルヂン酸ヲＴ、 −０イシン、Ｌ−ノルロイシン４Ｔ
Ｊ−一々リン、Ｌ−ノル／々リン及びＬ−インロイシン
に変換するのを触媒するデヒドロゲナーゼが分離する。 更に、クロマトグラフィによシ精製したＬ−フェニルア
ラニン−デヒドロゲナーゼｈ＊ 相応する芳香族α−ケ
トカルゼン酸をＬ−７エニルアラニン、Ｌ−チロシン及
びＬ−トリプトファンに並びに２−ヶ）−４−（メチル
メルカプト）−酪酸をＬ−メチオニンに還元的にアミノ
化するのを触媒する。他の冥験で、フェニル熱性ブドウ
酸、ｐ−ヒドロキシフェニル伸性ブドウ酸、インドリル
熱性ブドウ酸及び２−ケト−４−（メチルメルカプト）
−酪酸の還元的アミ（１３〕 ノ化が同じ酵素蛋白で触媒されることが明らかである。 そのために、一方では種々のα−アミノカルゼン酸の存
在において培養することにより種々のデヒドロゲナーゼ
活性を誘発することを試験する。この目的のために、麦
芽エキス１％、グルコース０．５憾、チアミン２μｔ／
ｌ ｈＫＨｚＰＯ４０，２％及び濃度１％の種々のα
−アミノカルゼン酸を含む培地中のブレビ２々クテリウ
ム種ＤＳＭ２４４８を使用する。培地のｐＨ値は７．４
に調節する。細胞を３０℃で２４時間成長させた後採取
し、超音波で砕解しかつ各々の抽出液中で光学試験によ
りα−ケトカルゼン酸６種の還元的アミノ化を試験する
。インドリル伸性ブドウ酸からのＴ、 −）リプトファ
ンの形成は、この基質により光学試験が妨害されるので
アミノ酸分析器で試験する。結果を表１に掲載する。 （１４） ◆ 還元的アミン化に使用したα−ケトカルジン酸： ■ フェニル伸性ブドウ酸 ２ ｐ−ヒドロキシフェニル帰件ブドウ酸３２−ヶ）−
４−（メチルメルカプト）−酪酸 ４ インドリル伸性ブドウ酸 ５２−ケトヘキサン酸 ６２−ケト−４−メチルペンタン酸 ◆※ 培地中の濃度は僅かに０．５％ ｎｂ−測定せず 該表から、ブレビバクテリウムｆｌｉＤ８Ｍ２４４８が
２種の誘導可能々Ｌ−アミノ酸−デヒドロゲナーゼ、即
ちＬ−ロイシンーデヒドロゲ−）−−ゼ及びＬ−フェニ
ルアラニン−デヒドロゲナーゼを生産することが明らか
である。Ｌ−ロイシン−デヒドロゲナーゼは試験したα
−ケトカルジン酸のうち２−ケトヘキサン酸及び２−ケ
ト−４−メチルペンタン酸を変換しかつＬ−Ｃ１Ｇ） ノルロイシン、Ｌ−一々リン、Ｌ−インロイシン及びＬ
−ロイシンにより誘導される。Ｌ−７エニルアラニンー
デヒドロゲナーゼはフェニル伸性ブドウ酸、ｐ−ヒドロ
キシフェニル伸性ブドウ酸、インドリル照性ブドウ酸及
び２−ケト−４−（メチルメルカプト）−酪酸を変換し
かつＬ−フェニルアラニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ
、Ｉ、−７ｘニル７ラニン、Ｌ−ヒスチジン及Ｕ ＴＪ
−”ｙエニルーアラニンーメチルエステルによシ誘導
される。これらの結果は、両方のＬ−アミノ酸−デヒド
ロゲナーゼをクロマトグラフィによシ分離するための実
験と一致する。 更に、５２℃で加熱変性することにょシ粗製エキス中に
存在する種々のデヒドロゲナーゼ活性の差異のある失活
化を達成することを試験した。その際に、この条件下で
２−ケトヘキサン酸及び２−ケト−４−メチルペンタン
酸の還元的アミノ化を触媒する酵素が均一な動力学的経
過によって急速に失活化することが明らかになった。他
方、フェニル伸性ブドウ酸、ｐ−ヒト（１７） ロキシフェニル伴性ブドウ酸、インドリル伸性ゾドウ酸
及び２−ケト−４−（メチルメルカプト）−酪酸を触媒
する酵素は５２℃に９０分間加熱した後で５０％より高
い残留活性を有する高い熱安定性を示す。この場合にも
、試験したすべての基質に関して同じ失活化の動力学的
経過が認められ、それ故これらの変換が同じ蛋白質によ
り触媒されていると結論することができる。 Ｌ−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼの分子量はア
ンドリスウス法〔′”Ｍｅｔｈ、Ｂｉｏｃｈｅ −ｍｉ
ｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ”、１８巻、１〜５３頁（１
９７０年）〕により〕セファクリルー８３００スーＪＲ
ファイン（５ｅｐｈａｃｒｙｌ −８３００５ｕｐｅｒ
−ｆｉｎｅ ） でゲル濾過により測定し、１３０
０００±１００００ダルトンと決定した。展開剤として
はリン酸カリウム緩衝剤５０ミリモルｋ 、Ｈ７，５
及び塩化ナトリウム１００ミリモルを使用した。 Ｌ−フェニルアラニン−デヒドロ）ｙ’ｆ−４２ヲ安定
化するため、展開剤に恢酸アンモニウムを５（１８） 係−溶液が得られるように添加した。使用した標準蛋白
（カタラーゼ、牛血清アルブミン、卵アルブミン及びキ
モトリプシノゲン）を同じ条件下にクロマトグラフィ処
理した。ゲル濾過の条件下にＬ−フェニルアラニン−デ
ヒドロゲナーゼの解離は６６０００±５０００ダルトン
で認められた。 本発明によるＬ フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼ
は公知の方法でアンモニウムイオンの存在で及び補酵素
としてのＮ Ａ Ｄ Ｈと共にフェニル無性ブドウ酸、
ｐ−ヒドロキシフェニル伸性ブＦつ酸、インドリル熱性
ブドウ酸又は２−ケドー４−
【メチルメルカプト】−酪
酸を相応するＬ−α−アミノカルゼン酸に変換するため
に使用することができる。この新規酵素は、酵素法で水
溶液中でフェニル無性ブドウ酸又は、−ヒドロキシフェ
ニル熱性ブドウ酸もしくはＴＪ −フェニルアラニン又
はＬ−チロシンの濃度を測定するために使用することも
できる。この測定は非常に簡単に実施することができる
：ＮＡＤＨの吸光度の変化を３４０ ｎｍで追跡し、相
応する検量線から濃度を読み取る。 次に、本発明を実施例により詳説する。特に記載のない
限１１」は「重量％」を表わす。 例１ ： Ｔ、−フェニルアラニンーデヒドロケナーゼ
生産菌のスクリーニング ブラウンシュヴアイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ ）
地方の異なる場所からの１４種の土壌試料を滅菌塩
溶液（Ｎａ（Ｍ Ｏ，９係）で懸濁し、その水性の上澄
みのアリコートを固体培地を含むＫ） ＋Ｊ皿上に塗抹
しかつペトリ皿を２７℃で２〜３日間恒温保持した。培
地は次のように調製した：Ｌ−フェニルアラニン１０２
、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２０４，８ｔ 、 Ｋ２ＨＰＯ４
１，５Ｓ’、Ｍ２ＳＯ４・７Ｈ２００，２？、０ａＯｚ
２−２）Ｔ２Ｏ２＋ｖ、ＺｎＳＯ４−７Ｈ２００，４Ｗ
、Ｆｅ０１５ ’ ６Ｈ２００，２Ｗ及び寒天２０．を
脱イオン水に溶解してｉｚとし。 、Ｈ値を７．２に調節しかつ滅菌する。冷却後、シュレ
ーゲル（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ ）による滅菌ビタミン溶液
１ｒｎｔを加えかつこの培地を滅菌ペトリ皿中に注いだ
。順調な成長を示す細菌を数回の稀釈塗抹を介して精製
した。顕微鏡で均一に観察される菌株を１０ Ｏｒｐｍ
の回転振盪機上、２７′Ｃでシカーネ（５ｃｈｉｋａｎ
ｅ ） ２個を備えた５００−一三角フラスコ中の液
体培地１ｏｏ−中で成長させた。液体培地は寒天を含ま
ないことを除いて前記の組成を有していた。２〜３日後
に振盪フラスコの内容物を遠心しかつ沈殿をリン酸カリ
ウム緩衝剤０．０５モル（、Ｈ７，４） で洗浄した
。細胞の上澄みと沈殿を超音波で５分間で砕解した。不
溶細胞成分を遠心分離しかつ上澄みを酵素源として試験
した。１４個の土壌試料から、唯一の炭素−窒素源とし
てのＬ−フェニルアラニン上で成長しｆｃ菌株５７個を
単離した。 そのうちの１つの菌株（ブレビバクテリウム種ＤＳＭ２
４４Ｂ）が所望の酵素活性を示した。光度測定試験を酵
素の検出に利用した。試験−々ツチトシて０．７モル塩
化アンモニウム／アンモニア緩衝液（ｐＨ８，５）、Ｎ
ＡＤＨ０，１ミリモル、フェニルピルベート１０ミリモ
ル及ヒ限定量の（２工） 酵素（１試験当り蛋白質１０〜２０μ、）を使用した。 ３４０ ｎｍでＮＡＤ）Ｉの吸光度の低下を測定した。 得られた数値から、試験をフェニルピルベートを添加せ
ずに行なった場合に得られたゼロ値を差引い７’ｊ、酵
素活性は国際単位で表わし、１０はＮＡＤＨ１μモル／
分の減少を表わす。 プレビー々クテリウム種Ｄ８Ｍ２４４８は時間と共にコ
ツコイド形（ｋｏｋｋｏｉｄｅ Ｆｏｒｍ ）に変化す
るダラム陽性の短稈に成長する。細胞は非運動性で、胞
子を形成しない。成長は全く好気性である。グルコース
からは酸は形成されない。カタラーゼ−及びニトレート
還元は正、尿素分解は正、ゼラチン−、カゼイン−及び
殿粉分解は負、Ｈ２Ｓ形成は負、４１℃の成長は負であ
る細胞壁はメン−ジアミノピメリン酸を含有する細胞壁
の糖としてアラビノース、マンノース及びガラクトース
が見出される。 ９１４２ ： Ｔ、 −フェニルアラニン−デヒドロゲ
ナーゼの製造 （２２） 酵素を製造するために、ブレビ／々クテリウム種ＤＳＭ
２４．４８を次の培地中で増殖し７？１．ニゲルコース
５．酵母エキスｓ、麦芽エキス１０２、Ｌ−フェニルア
ラニン１０２、ＫＨ２ＰＯ４３、。固体培地を脱イオン
水に溶解して１ｔとし、この溶液の、Ｈ値を７．２
に調節しかつそれを１２１℃、過圧１−々−ルで１５分
間滅菌した。 培養は培地ｌｏｏｍ／を装入したシツカーネ２個を有す
る５００−一三角フラスコ中で行なった。 滅菌培地に、■白金耳借のブレビバクテリウム種ＤＳＭ
２４４８を斜面寒天試験管から採シ、接種した。この培
養培地を２０〜２３時間１２０ｒｐｍの回転振盪機上２
７℃で培養した。成長した培養培地を遠心しく ５ｏｏ
ｏ、で工５分間）、沈殿をリン酸カリウム緩衝液（、Ｈ
７，４） ０．０５モルで懸濁させた。再度遠心分離し
、このようにして得られた洗浄沈殿をリン酸カリウム緩
衝剤（，８７，４） ０．０５モル中で懸濁させ、その
故細胞湿潤物雀１．当り緩衝液４−を使用した。 この懸濁液を３藺−チップ（５ｐｌｔｃｅ ）を備えた
超音波機（ＭＳＢ、１５０ワツト、ＭＫ２）で、水浴中
で冷却しながら１分間曝射を５回行ない、この際に懸濁
液を冷却するために小力くとも１分間休憩した。遠心分
離（１０分間、１２０００、で）後に、一般に蛋白質１
〜２１ｎ９／１ｎ！、及びＬ−フェニルアラニン−デヒ
ドロゲナーゼ３〜６Ｕ ／−を含有する粗製抽出物が得
られた。これは＝１８℃で貯蔵することができ、１ｔ月
後でも活性の低下は認められガい。所望の場合には、低
分子成分を粗製抽出物から透析沖過又はセファデックス
Ｇ−２５カラムを介してゲルクロマトグラフィにより常
用の作業法により除去することもできる。生育する間の
酵素形成の進行は１．５を一醗酵槽（Ｂｉｏｌａｆｉｔ
ｔｅ）中で追跡した。 菌株は生成培地中で生育し、接種には２４時間経過した
前培培養培地３０−を使用した。 生育条件＝３０℃、通気量６０ｔ／ｈ、４００ｒｐｍの
タービン形攪拌機 試料中で、 ａ）培養物の光学密度（混濁〕を５７８ ｎｍで生育の
尺度として測定し、 １１）細胞の遠心分離後に培地中のＬ−フェニルアラニ
ン含量をアミノ酸分析器で測定し、Ｃ）遠心分離した細
胞を砕解しかつ懸濁液（粗製抽出物）中でＰｈｅＤＨの
活性（Ｕ／ｍ／）及び蛋白質含量（■／−）を測定し、
それにより比酵素活性（Ｕ／Ｗｑ）及び培養物ＩＬ当り
のＰｈｅ Ｄ Ｈの容量活性を計算した。 この結果を第１図に記載する。 酵素は早い成長期に形成され、活性の発生と共に培養物
中のＬ−Ｐｈｅ含量は低下する。最大活性はこの成長条
件下に３０〜３５時間後に達成され、更に進行すると酵
素含量は約５０幅に低下する（６５時間〕。 例３ニア０を規模での製造 例２による製造培地６８１を醗酵槽（容量１００ ｔ％
Ｆａｂｒｉｋａｔ Ｇｉｏｖａｎｏｌａ Ｆｒｅｒｅｓ
ＳＡＭｏｎｔｈｅｙ ）中１２０℃で滅菌しかつ冷却
後に前培養培地（２４時間成長させたもの）２１を接種
した。培養を３０℃で、通気量１ ｖｖｍ及びり（２５
） 一ビン形攪拌機の回転数２０ Ｏｒｐｍで行なった。 ２４時間の生育後、細胞を遠心処理によシ採取した。合
計して、全酵素含−１％１−７７０００単位の細菌湿潤
物質５．９Ｋｇが得られた。この細胞のアリコートヲ例
２によシ砕解しかつＬ−フェニルアラニン−デヒドロゲ
ナーゼの活性を測定した。 砕解した試料は和製抽出物中で死活Ｑ１．６［Ｊ／ｍ９
を示した。 例４：Ｌ−フェニルアラニンーデヒドロケナーゼの誘導 ブレビ／々クテリウム種Ｄ ５Ｍ２４４８を麦芽エキス
１％、グルコース０．５係、チアミン２μｔ／ｌ、ＫＨ
２ＰＯ４０，３％及びそれぞれ＃度１憾の種々のアミノ
酸を含む培地中で生育した。更に、Ｌ−フェニルアラニ
ン−メチルエステル（培地中の濃度０．５％）を誘導質
として試験した。培養開始前の培地の、Ｈは７．４であ
った。回転式振盪機（１２０ｒｐｍ ）上、３０℃で２
４時間生育させた後で、細胞を遠心し、超音波で砕解し
かつそれぞれの抽出物を用いて光学試験でα−（２６） ケトカルデン酸５種の還元的アミノ化を試験した。 更に、インドリルピルベートからのＬ−トリプトファン
の形成をアミノ酸分析器で追跡した。 供給可能な品質のインドリルピルペー） （Ｆｉ −ｒ
ｍａ ８ｉｇｍａ ）は３４０ ｎｍ で非常に高い吸
収性を有しておシ、それ放光学的試験を適用することは
できガかった。 結果は前記の表１に掲載されている。結果から、プレビ
ー々クテリウム種ＤＳＭ２４４８には誘導可能なアミノ
酸−デヒドロゲナーゼ２種が存在することが明らかであ
る。Ｌ−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼはフェニ
ルビルヘート、ｐ−ヒドロキシフェニルピルベート、イ
ンドリルピルベート及び２−ケト−４−（メチルメルカ
プト）−ブチレートを相応するＬ−アミノ酸のフェニル
アラニン、チロシン、トリプトファン及ヒメチオニンに
変換する。このＬ−フェニＡ／ ７５ニンーデヒドロゲ
ナーゼはＬ−フェニルアラニン、Ｄ−フェニルアラニン
、ラセミ体のり、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニル
アラニン−メチルエステル及びＬ−ヒスチジンヲ通して
誘導される。Ｄ−フェニルアラニンが非常に良好な誘導
質であることが注目される。更に、Ｌ−ヒスチジンｌｄ
、Ｔ、−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼがイミダ
ゾリル弾性ブドウ酸を実際には基質として変換しないが
、誘導質として作用することが認められる。 例５ ： Ｌ−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼの
精製 ブレビ−々クテリウム種Ｄ Ｓ Ｍ ２４４８４．の超
音波砕解、次の遠心により得られた粗製抽出物２０ｍ１
に攪拌下に硫酸アンモニウムを４０１飽和まで加えかつ
４℃で１時間攪拌した。沈殿した蛋白質を１５０００９
で３０分間遠心分離した。 上澄み（１７，５ｒＪ）を４０％硫酸アンモニウム溶液
で平衡化したセファクリル−８３００カラム（２，５Ｘ
８５ｃｒｎ）上に注いだ。この条件下でアミノ酸−デ
ヒドロゲナーゼはセファクリルカラムに結合する。億酸
アンモニウムａ度ｔ４０係飽和から１０％への傾斜を適
用して低下させる際に、デヒドロゲナーゼも溶離する。 まず初めに約３２％の硫酸アンモニウムでＬ−ロイシン
−デヒドロゲナーゼが溶離する。明らかにそれとは別に
硫酸アンモニウム約２６憾でＩ、−フェニルアラニン−
デヒドロゲナーゼが溶離する。 その溶出液は３．６−の両分で捕集される。Ｌ −フェ
ニルアラニン−デヒドロゲナーゼを含有スる両分を一緒
にし、ＹＭ５膜を介して限外沖過によシ濃縮する。その
精製を表２に掲載する。 この酵素は硫酸アンモニウム２０％の存在で４Ｌで長時
間安定に貯蔵することができる。 （２９〕 例６：Ｌ−フェニルアラニンーデヒドロケナーゼの精製 例５の別法によシブレビー々クテリウム種ＤＢＭ２４４
８を工業的規模でガラスピーズミル中で砕解することが
できる。例として細胞２７０ｔをダイノミルＫＤＬ型（
Ｄｙｎｅ−Ｍ目１ ’ｒＶｐＫＤＩ、）中で砕解しかつ
細胞残分を水性の２相系によシ分離した（西ドイツ国特
許第２６３９１２９号明細書）。使用した系は、細胞２
０％ン、ポリエチレングリコール１５４０ １８％シ
及びリン酸カリウム（ｐＨ８，０） ７％ｌの組成を有
していた。Ｄ−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼを
完全にポリエチレングリコール分の多い上層（１０７３
ｄ）中に抽出することができた。 酵素含有上層を、硫酸アンモニウム３０％を添加したリ
ン酸カリウム緩衝物質（ｐＨ７，５） ５０ミリモルで
稀釈しかつアミコン中空繊維ノぞトローネ（Ｈ２Ｐ５０
）によシ透析濾過し、その際異種蛋白質及びポリエチ
レングリコール１５４０を除去した。透析炉液（２５０
ｆｎｔ）を、硫酸アンモニウム４０％を飽和させたリン
酸カリウム緩衝物質（ｐＨ７，５） ５０ミリモルで平
衡化したセファロース４Ｂカラム（５Ｘ２０α〕に加え
た。 この緩衝液（１ｔ）で洗浄することによシ蛋白質の主要
量がこのカラムから溶出し、この条件下でＴ、 −フェ
ニルアラニン−デヒドロゲナーゼはカラムに結合した。 この酵素を例５に相応して傾斜法を適用して溶離し、次
いで濃縮した。この方法による精製について表３に掲載
する。 例７：反応速度とｐＨとの相関関係 フェニルピルベートをＬ−フェニルアラニンーデヒドロ
ゲナーぜの存在においてＬ−フェニルアラニンに還元的
にアミノ化する際の反応速度を反応溶液の、Ｈ値との関
係で試験した。試験−々ツチは次の組成を有していた： 異なるｐＨ値で塩化アンモニウム溶液中のＮ Ａ Ｄ
Ｈ０，１ミリモル、フェニルピルベート１０ミリモル及
び制限量の酵素（例２による粗裏抽出物、■試験当シ蛋
白質２０μ、）。選択した。Ｈ値６．７５〜９．０は試
験−々ツチを一緒にする前に塩化アンモニウム溶液０．
７モルにアンモニアもしくは塩酸を添加することにより
調節した。 第２図・に反応速度を、Ｈ値の関数としてプロットした
。至適、Ｈは８．５である。 Ｌ−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼによシ触媒し
ｇＬ−フェニルアラニンの酸化的脱アミノの反応速度も
同様に、Ｈ値との相関関係で試験した。試験Ｉ々ラッチ
次の組成を有してい７２：： （３４） 異なる。Ｈ値でグリシン／ Ｎ ａ ０１．−ｅｌｌ（
ｌｉＨｌｔｏ、１モル中のＬ−フェニルアラニン４．０
ミ９モル及びＮＡＤ＋３ミリモル。範囲６．０〜１０
．５の、Ｈ値は試験２々ツチを一緒に混合する前にグリ
シン／Ｎａ１ｌ緩衝液に塩酸又はカセイソーダを添加し
て調節した。 この結果も同様に第２図に記載した。 逆反応はｐＨ１０，５まで上昇する。 例８：反応速度と基質濃度の相関関係 フェニルピルベートをＬ−フェニルアラニンに還元的に
アミノ化する際に、ＮＡＤＨに対するその反応速度の相
関関係を次の試験−々ツチで試験し部 塩化アンモニウム／アンモニア緩衝液（、Ｈ８，５）
０．７モル、フェニルピルベート１０ミリモル、制限量
の酵素（例２による粗製抽出物。 １試験肖り蛋白質２０μ？）。試験／−！′ツテ中のＮ
ＡＤＨ濃度は範囲０．０２５〜０．３５ミリモルで変動
させた。 最適匁反応速度は０．３ミリモルで達成されることが明
らかになった。ＮＡＤＨＯＫＭ値は０．０６４ミリモル
である。 フェニルピルベートＱＬ−フェニルアラニンに還元的に
アミノ化する際にその反応速度とアンモニウムイオン濃
度の相関関係を次の試験−々ツテで試験した： フェニルビルベ−）ｔｏミｌＪモル、ＮＡＤＨＯ０２ミ
リモル、限定量の酵素（例２による粗製抽出物、■試験
当シ蛋白質２０μ、）。、Ｈ値をアンモニアで８．５に
調節した塩化アンモニウム緩衝液を使用した。試験中の
塩化アンモニウムモル濃度は範囲０．０９５〜０．７モ
ルで変化させた。 反応速度が塩化アンモニウム少なくとも０．５モルまで
上昇したことが明らかになった。塩化アンモニウム０．
７モルは阻害作用せず、それ故酵素試験に最適である。 種々のα−ケトカルゼン酸の還元的アミノ化をケト酸濃
度との相関関係において試験した。 そのため次の試験−々ツチを使用した：塩化アンモニウ
ム／アンモニア緩衝ｉ（、Ｈ８，５） ０．７モル、Ｎ
ＡＤＨｏ、２ミリモル、限定量の酵素（例５により精製
した蛋白質ｌμ？）。 ケト酸濃度はその都度範囲０．０１〜３０ミリモルで変
化させた。 開始反応速度（Δ吸光度３４．０ ｎｍ ７分）をミバ
エリス・メンテンにより評価する。得られたＫＭ−及び
Ｖｍａｘ−値を表４に記載した。基質インドリルピルベ
ートの場合には光学的試験が妨害されるので、インドリ
ルピルベートをＬ−トリシト７アンに還元的にアミノ化
する際に形成されたＬ−トリシト７アンを時間の関数と
してアミノ酸分析器で測定した（ Ｂｉｏｔｒｏｎｉｋ
ＢＯ６０００％積分器Ｂｉｏｔｒｏｎｉｋを具備、Ｓｙ
ｓｔ−ｅｍｌ、１カラムプログラムで、標準溶液として
Ｆｉｒｍａ Ｐｉｅｒｃｅ のアミノ酸標準■を使用
した）。 （３７） 表 ４ 精製ＰｈｅＤＨ（蛋白質０．０５５１１９／ｍ／ ）で
のＫＭ値及びＶｍａｘ値 フェニルピルベート ０．１１
１．８２Ｐ−ヒドロキシフェニル ０．２４
１．７５ぎルペート ２−ケト−４−（メチル ３．０
１．０８メルカプト）−ブチレート インドリルピルベート ８．０
０．４４Ｌ−フェニルアラニンの酸化的脱アミノ反応の
反応速度とＮＡＤ十濃度との相関関係を次の試験／々ラ
ッチ試験し７？１．： グリシｙ−ＮａＯ２／Ｎａ０Ｈ（、Ｈｌ Ｏ，７）０．
１モル、Ｌ−フェニルアラニン４ ミリモル、限定量の
酵素（例６により精製した蛋白質２０μ？）。 （３８） ＮＡＤ十濃度は範囲０．１〜５．０ミリモルで変化させ
た。濃度３ミリモルで至適変換率が達成されることが明
らかである。 酸化的脱アミノの反応速度とＬ−フェニルアラニン濃度
との相関関係は次の試験／々マツチ試験し九ニ ゲリシンーＮａＯ１／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０，３）
０．１モル、ＮＡＤ＋３ミリモル、限定量の酵素（例６
により精製し次蛋白質２０ ｆｉｇ ）。フェニルアラ
ニン濃度は範囲０．３〜１５ミリモルで変化させた。 反応で生じるＮ Ａ、 Ｄ Ｈを３４０皿 で測定した
。開始反応速度をミバエリス・メンテンによす評価した
。フェニルアラニンのＫＭ値は０．８ミリモルであシ、
最大反応速度は１．０２Ｕ／ＩＮｉである。 例９：類縁α−ケトカルゼン酸の還元的アミノ化による
’ｌ、−ｌニールアラニン、Ｌ−チロシン％Ｌ−トリプ
トファン及びＬ−メチオニンの製造 還元的アミノ化で消費したＮＡＤＨを再生するため、反
応？マツチに過剰量の蟻酸アンモニウム及び酵素の蟻酸
デヒドロゲナーゼ（Ｅ、０゜１．２．１．２）を添加し
、これがホルミエートをＣＯ２に酸化する際にＮＡＤ＋
をＮＡＤＨに還元する。 一連のα−ケトカルボン酸の還元的アミノ化を比較条件
下に試験した。その際、試験／々マツチ均一に蟻酸アン
モニウム（ｐＨ８，５） ４００ ミリモル、ＮＡＤＨ
ｏ、３ミリモル、蟻酸デヒドロゲナーゼ［Ｋｒｏｎｅｒ
及びその他による製剤（１９８２）、”Ｊ 、 Ｏ
ｈｅｍ、 Ｔｅｅｈ、 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、’３２
巻、１３０〜１３７頁）０．６０／ｍ／、Ｌ−フェニル
アラニン−デヒドロゲナーゼｏ、ｓｏ／ゴ、α−ケトカ
ルゼン酸２５ミリモルを含有していた。全容量は３−で
あった。アミノ酸分析器で生成物の形成を追跡した。そ
の結果を表５ｖｃ ｍ 括した。フェニルピルベート、
ｐ−ヒドロキシフェニルピルベート、インドリルビルヘ
ート及び２−ケト−４−（メチルメルカプト）−ブチレ
ートは良好に変換される。これに対して、イミダゾリル
ピルベートは冥際に基質として有用ではない。 （４１） 例１０ ： Ｔ、−フェニルアラニンの連続的製造フェ
ニルビルヘ−）７５．うのフェニルアラニンの連続合成
は１分子量を拡大した、ポリエチレンｆ リコール（Ｐ
ＥＧ）に結合したＮＡＤＨの使用下に酵素膜反応器中で
可能である。ＰＥＧ−ＮＡＤＨは西ドイツ国特許第２８
４１４１４号明細書によシ製造する。変性した補酵素並
びに使用した酵素の蟻酸デヒドロゲナーゼ及びＬ−フェ
ニルアラニン−デヒドロゲナーゼは限外濾過膜Ｙ Ｍ５
（Ｆｉｒｍａ Ａｍ１ｃｏｎ の製品、Ｗｉｔｔｅ
ｎ在）によシ反応器中に残シ、反応溶液の低分子成分、
未反応基質及び形成しｆｃＬ−フェニルアラニンは連続
的に溶液から除去される。限外炉液が反応器から流出す
るのと同じ量で溜めからフェニルピルベートと蟻酸アン
モニウムを後配量して、反応器の容量を一定に保持する
。反応器の容量はｌＯ−であシ、ＰＥＧ−ＮＡＤＨの濃
度０．３ミリモル、蟻酸デヒドロゲナーゼ２０単位及び
Ｌ−フェニルアラニンーデヒドロゲナーゼ２０単位を反
応器中に注加した。基質溶液は蟻酸アンモニウム（ｐＨ
８，３） ４００ ミｌＪモル及びフェニルピルベート
（ナトリウム塩）２０ミリモルを含有していた。 反応溶液をチューブポンプによ多連続的に３０−７時間
で膜を介してポンプ処理した。限外炉液約４−／時間が
得られた。これは滞留時間２．５時間に相当する。この
実験構成で１１０時間テフェニル♂ルピン酸ナトリウム
９．８ミリモル（１，８３、）を処理した。限外ろ液を
分画捕集し、Ｌ−フェニルアラニン含量をアミノ酸分析
器で測定した。１１０時間で平均して装入シタフェニル
ピルベートの７０係がＬ−フェニルアラニンに変換され
、−緒にした限外ろ液中ＫＬ−フェニルアラニン６．９
ミリモル（１，１４ｆ）が測定された。この例で得られ
た反応生成物は比較的簡単にｎ裂することができる。そ
れというのもその溶液は未反応のフェニルピルベートと
蟻酸アンモニウムで不純化されているに過ぎないからで
ある。限外ろ液（４５０＊ｔｌ ｈ Ｌ−フェニルアラ
ニン１．１４９ ）を凍結乾燥し。 ０．５モル蟻酸５ｏ−で採シ、その１２．５−を身オン
交換体力うＡ （Ｂｊｏｒａｄ ＡＧ ５０ＷＸ８、
メツシュ２００〜４００．Ｈ十型＊ｌＸ１０ｃｒｎ）
上に注いだ。カラムを０．５モル蟻酸１００ｍ７！で洗
った。この条件下に７工ニルピルペートカ結合した。塩
化鉄（Ｉ［）溶液（７，５憾、、Ｈ２，５，４３６ｎｍ
で吸収を測定）との呈色反応にょシ、洗浄溶液２０〜２
５−の通過後にフェニルピルベートがカラムから除去さ
れたことを明らかにすることができた。Ｌ−フェニルア
ラニンを５％−ピリジン溶液を用いてイオン交換体から
溶離した。 この条件下ではアンモニウムイオンはイオン交換体に結
合して残シ、それ故溶出液中のＬ−フェニルアラニンの
検出はニンヒドリンで可能である。交換体は４Ｎ−塩酸
で処理することにょシ再生しかつ脱イオン水で洗浄技に
再び使用する。フェニルアラニンを含有する溶出液を合
しかつ真空中回転式蒸発器で濃縮乾固した。ピリジンを
完全に除去するために数回水で採った。 このようにしてＬ−フェニルアラニン１．１２ 。 （４５〕 が単離し、これを更に分析的測定に使用した。 アミノ酸分析ニアミノ酸分析器から５例１゜からの生成
物がＴ−−フェニルアラニン以外に他のアミノ酸を含有
していないことが明らかとなった。 旋光性：測定にパーキン・エルマー・ボラリメータ（Ｐ
ｅｒｋｉｎ −Ｅｌｍｅｒ Ｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ
） 型２４１を使用した。測定は４３６ ｎｍでｐＨ
２，１及び３０℃で実施した。Ｌ−フェニルアラニンに
よる標準曲線は旋光度とｍ度５〜１ｏｏミリモルとの直
線的関係を示す。例１０で合成した試料の旋光度は７１
ミリモル溶液（濃度測定はアミノ酸分析器を介する）中
で−０，３７１’であった。標準曲線との比較によシ、
光学的に純粋なＬ−フェニルアラニンが得られたことが
明らかである。 Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（Ｄ−ＡＯＤ ）にょるＤ−
アミノ酸に関する試験：豚の腎からのＤ−Ａ ＯＤ （
Ｂｏｅｈｒｌｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｇｍｂ Ｈ
社の製品）はＤ−アミノ酸に対して特異的である。Ｄ（
４６） アミノ酸のＤ−ＡＯＤ［よる酸化で生成する過酸化水素
は酵素ペルオキシダーゼによシ白色色素に変化する。Ｄ
−フェニルアラニンによる標率列を作成する。これは範
囲０．０１〜０．３５ミリモルで吸光度差とＤ−フェニ
ルアラニンの濃度との間に直線関係を示す。検出限界は
０．００５ミリモルである。使用した試料（例１０によ
るＬ−フェニルアラニン５５ミリモル）ハこの試験では
不活性であった。それ故、Ｄ−フェニルアラニンによる
不純化は０．０１ ％より低い。
酸を相応するＬ−α−アミノカルゼン酸に変換するため
に使用することができる。この新規酵素は、酵素法で水
溶液中でフェニル無性ブドウ酸又は、−ヒドロキシフェ
ニル熱性ブドウ酸もしくはＴＪ −フェニルアラニン又
はＬ−チロシンの濃度を測定するために使用することも
できる。この測定は非常に簡単に実施することができる
：ＮＡＤＨの吸光度の変化を３４０ ｎｍで追跡し、相
応する検量線から濃度を読み取る。 次に、本発明を実施例により詳説する。特に記載のない
限１１」は「重量％」を表わす。 例１ ： Ｔ、−フェニルアラニンーデヒドロケナーゼ
生産菌のスクリーニング ブラウンシュヴアイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ ）
地方の異なる場所からの１４種の土壌試料を滅菌塩
溶液（Ｎａ（Ｍ Ｏ，９係）で懸濁し、その水性の上澄
みのアリコートを固体培地を含むＫ） ＋Ｊ皿上に塗抹
しかつペトリ皿を２７℃で２〜３日間恒温保持した。培
地は次のように調製した：Ｌ−フェニルアラニン１０２
、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２０４，８ｔ 、 Ｋ２ＨＰＯ４
１，５Ｓ’、Ｍ２ＳＯ４・７Ｈ２００，２？、０ａＯｚ
２−２）Ｔ２Ｏ２＋ｖ、ＺｎＳＯ４−７Ｈ２００，４Ｗ
、Ｆｅ０１５ ’ ６Ｈ２００，２Ｗ及び寒天２０．を
脱イオン水に溶解してｉｚとし。 、Ｈ値を７．２に調節しかつ滅菌する。冷却後、シュレ
ーゲル（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ ）による滅菌ビタミン溶液
１ｒｎｔを加えかつこの培地を滅菌ペトリ皿中に注いだ
。順調な成長を示す細菌を数回の稀釈塗抹を介して精製
した。顕微鏡で均一に観察される菌株を１０ Ｏｒｐｍ
の回転振盪機上、２７′Ｃでシカーネ（５ｃｈｉｋａｎ
ｅ ） ２個を備えた５００−一三角フラスコ中の液
体培地１ｏｏ−中で成長させた。液体培地は寒天を含ま
ないことを除いて前記の組成を有していた。２〜３日後
に振盪フラスコの内容物を遠心しかつ沈殿をリン酸カリ
ウム緩衝剤０．０５モル（、Ｈ７，４） で洗浄した
。細胞の上澄みと沈殿を超音波で５分間で砕解した。不
溶細胞成分を遠心分離しかつ上澄みを酵素源として試験
した。１４個の土壌試料から、唯一の炭素−窒素源とし
てのＬ−フェニルアラニン上で成長しｆｃ菌株５７個を
単離した。 そのうちの１つの菌株（ブレビバクテリウム種ＤＳＭ２
４４Ｂ）が所望の酵素活性を示した。光度測定試験を酵
素の検出に利用した。試験−々ツチトシて０．７モル塩
化アンモニウム／アンモニア緩衝液（ｐＨ８，５）、Ｎ
ＡＤＨ０，１ミリモル、フェニルピルベート１０ミリモ
ル及ヒ限定量の（２工） 酵素（１試験当り蛋白質１０〜２０μ、）を使用した。 ３４０ ｎｍでＮＡＤ）Ｉの吸光度の低下を測定した。 得られた数値から、試験をフェニルピルベートを添加せ
ずに行なった場合に得られたゼロ値を差引い７’ｊ、酵
素活性は国際単位で表わし、１０はＮＡＤＨ１μモル／
分の減少を表わす。 プレビー々クテリウム種Ｄ８Ｍ２４４８は時間と共にコ
ツコイド形（ｋｏｋｋｏｉｄｅ Ｆｏｒｍ ）に変化す
るダラム陽性の短稈に成長する。細胞は非運動性で、胞
子を形成しない。成長は全く好気性である。グルコース
からは酸は形成されない。カタラーゼ−及びニトレート
還元は正、尿素分解は正、ゼラチン−、カゼイン−及び
殿粉分解は負、Ｈ２Ｓ形成は負、４１℃の成長は負であ
る細胞壁はメン−ジアミノピメリン酸を含有する細胞壁
の糖としてアラビノース、マンノース及びガラクトース
が見出される。 ９１４２ ： Ｔ、 −フェニルアラニン−デヒドロゲ
ナーゼの製造 （２２） 酵素を製造するために、ブレビ／々クテリウム種ＤＳＭ
２４．４８を次の培地中で増殖し７？１．ニゲルコース
５．酵母エキスｓ、麦芽エキス１０２、Ｌ−フェニルア
ラニン１０２、ＫＨ２ＰＯ４３、。固体培地を脱イオン
水に溶解して１ｔとし、この溶液の、Ｈ値を７．２
に調節しかつそれを１２１℃、過圧１−々−ルで１５分
間滅菌した。 培養は培地ｌｏｏｍ／を装入したシツカーネ２個を有す
る５００−一三角フラスコ中で行なった。 滅菌培地に、■白金耳借のブレビバクテリウム種ＤＳＭ
２４４８を斜面寒天試験管から採シ、接種した。この培
養培地を２０〜２３時間１２０ｒｐｍの回転振盪機上２
７℃で培養した。成長した培養培地を遠心しく ５ｏｏ
ｏ、で工５分間）、沈殿をリン酸カリウム緩衝液（、Ｈ
７，４） ０．０５モルで懸濁させた。再度遠心分離し
、このようにして得られた洗浄沈殿をリン酸カリウム緩
衝剤（，８７，４） ０．０５モル中で懸濁させ、その
故細胞湿潤物雀１．当り緩衝液４−を使用した。 この懸濁液を３藺−チップ（５ｐｌｔｃｅ ）を備えた
超音波機（ＭＳＢ、１５０ワツト、ＭＫ２）で、水浴中
で冷却しながら１分間曝射を５回行ない、この際に懸濁
液を冷却するために小力くとも１分間休憩した。遠心分
離（１０分間、１２０００、で）後に、一般に蛋白質１
〜２１ｎ９／１ｎ！、及びＬ−フェニルアラニン−デヒ
ドロゲナーゼ３〜６Ｕ ／−を含有する粗製抽出物が得
られた。これは＝１８℃で貯蔵することができ、１ｔ月
後でも活性の低下は認められガい。所望の場合には、低
分子成分を粗製抽出物から透析沖過又はセファデックス
Ｇ−２５カラムを介してゲルクロマトグラフィにより常
用の作業法により除去することもできる。生育する間の
酵素形成の進行は１．５を一醗酵槽（Ｂｉｏｌａｆｉｔ
ｔｅ）中で追跡した。 菌株は生成培地中で生育し、接種には２４時間経過した
前培培養培地３０−を使用した。 生育条件＝３０℃、通気量６０ｔ／ｈ、４００ｒｐｍの
タービン形攪拌機 試料中で、 ａ）培養物の光学密度（混濁〕を５７８ ｎｍで生育の
尺度として測定し、 １１）細胞の遠心分離後に培地中のＬ−フェニルアラニ
ン含量をアミノ酸分析器で測定し、Ｃ）遠心分離した細
胞を砕解しかつ懸濁液（粗製抽出物）中でＰｈｅＤＨの
活性（Ｕ／ｍ／）及び蛋白質含量（■／−）を測定し、
それにより比酵素活性（Ｕ／Ｗｑ）及び培養物ＩＬ当り
のＰｈｅ Ｄ Ｈの容量活性を計算した。 この結果を第１図に記載する。 酵素は早い成長期に形成され、活性の発生と共に培養物
中のＬ−Ｐｈｅ含量は低下する。最大活性はこの成長条
件下に３０〜３５時間後に達成され、更に進行すると酵
素含量は約５０幅に低下する（６５時間〕。 例３ニア０を規模での製造 例２による製造培地６８１を醗酵槽（容量１００ ｔ％
Ｆａｂｒｉｋａｔ Ｇｉｏｖａｎｏｌａ Ｆｒｅｒｅｓ
ＳＡＭｏｎｔｈｅｙ ）中１２０℃で滅菌しかつ冷却
後に前培養培地（２４時間成長させたもの）２１を接種
した。培養を３０℃で、通気量１ ｖｖｍ及びり（２５
） 一ビン形攪拌機の回転数２０ Ｏｒｐｍで行なった。 ２４時間の生育後、細胞を遠心処理によシ採取した。合
計して、全酵素含−１％１−７７０００単位の細菌湿潤
物質５．９Ｋｇが得られた。この細胞のアリコートヲ例
２によシ砕解しかつＬ−フェニルアラニン−デヒドロゲ
ナーゼの活性を測定した。 砕解した試料は和製抽出物中で死活Ｑ１．６［Ｊ／ｍ９
を示した。 例４：Ｌ−フェニルアラニンーデヒドロケナーゼの誘導 ブレビ／々クテリウム種Ｄ ５Ｍ２４４８を麦芽エキス
１％、グルコース０．５係、チアミン２μｔ／ｌ、ＫＨ
２ＰＯ４０，３％及びそれぞれ＃度１憾の種々のアミノ
酸を含む培地中で生育した。更に、Ｌ−フェニルアラニ
ン−メチルエステル（培地中の濃度０．５％）を誘導質
として試験した。培養開始前の培地の、Ｈは７．４であ
った。回転式振盪機（１２０ｒｐｍ ）上、３０℃で２
４時間生育させた後で、細胞を遠心し、超音波で砕解し
かつそれぞれの抽出物を用いて光学試験でα−（２６） ケトカルデン酸５種の還元的アミノ化を試験した。 更に、インドリルピルベートからのＬ−トリプトファン
の形成をアミノ酸分析器で追跡した。 供給可能な品質のインドリルピルペー） （Ｆｉ −ｒ
ｍａ ８ｉｇｍａ ）は３４０ ｎｍ で非常に高い吸
収性を有しておシ、それ放光学的試験を適用することは
できガかった。 結果は前記の表１に掲載されている。結果から、プレビ
ー々クテリウム種ＤＳＭ２４４８には誘導可能なアミノ
酸−デヒドロゲナーゼ２種が存在することが明らかであ
る。Ｌ−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼはフェニ
ルビルヘート、ｐ−ヒドロキシフェニルピルベート、イ
ンドリルピルベート及び２−ケト−４−（メチルメルカ
プト）−ブチレートを相応するＬ−アミノ酸のフェニル
アラニン、チロシン、トリプトファン及ヒメチオニンに
変換する。このＬ−フェニＡ／ ７５ニンーデヒドロゲ
ナーゼはＬ−フェニルアラニン、Ｄ−フェニルアラニン
、ラセミ体のり、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニル
アラニン−メチルエステル及びＬ−ヒスチジンヲ通して
誘導される。Ｄ−フェニルアラニンが非常に良好な誘導
質であることが注目される。更に、Ｌ−ヒスチジンｌｄ
、Ｔ、−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼがイミダ
ゾリル弾性ブドウ酸を実際には基質として変換しないが
、誘導質として作用することが認められる。 例５ ： Ｌ−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼの
精製 ブレビ−々クテリウム種Ｄ Ｓ Ｍ ２４４８４．の超
音波砕解、次の遠心により得られた粗製抽出物２０ｍ１
に攪拌下に硫酸アンモニウムを４０１飽和まで加えかつ
４℃で１時間攪拌した。沈殿した蛋白質を１５０００９
で３０分間遠心分離した。 上澄み（１７，５ｒＪ）を４０％硫酸アンモニウム溶液
で平衡化したセファクリル−８３００カラム（２，５Ｘ
８５ｃｒｎ）上に注いだ。この条件下でアミノ酸−デ
ヒドロゲナーゼはセファクリルカラムに結合する。億酸
アンモニウムａ度ｔ４０係飽和から１０％への傾斜を適
用して低下させる際に、デヒドロゲナーゼも溶離する。 まず初めに約３２％の硫酸アンモニウムでＬ−ロイシン
−デヒドロゲナーゼが溶離する。明らかにそれとは別に
硫酸アンモニウム約２６憾でＩ、−フェニルアラニン−
デヒドロゲナーゼが溶離する。 その溶出液は３．６−の両分で捕集される。Ｌ −フェ
ニルアラニン−デヒドロゲナーゼを含有スる両分を一緒
にし、ＹＭ５膜を介して限外沖過によシ濃縮する。その
精製を表２に掲載する。 この酵素は硫酸アンモニウム２０％の存在で４Ｌで長時
間安定に貯蔵することができる。 （２９〕 例６：Ｌ−フェニルアラニンーデヒドロケナーゼの精製 例５の別法によシブレビー々クテリウム種ＤＢＭ２４４
８を工業的規模でガラスピーズミル中で砕解することが
できる。例として細胞２７０ｔをダイノミルＫＤＬ型（
Ｄｙｎｅ−Ｍ目１ ’ｒＶｐＫＤＩ、）中で砕解しかつ
細胞残分を水性の２相系によシ分離した（西ドイツ国特
許第２６３９１２９号明細書）。使用した系は、細胞２
０％ン、ポリエチレングリコール１５４０ １８％シ
及びリン酸カリウム（ｐＨ８，０） ７％ｌの組成を有
していた。Ｄ−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼを
完全にポリエチレングリコール分の多い上層（１０７３
ｄ）中に抽出することができた。 酵素含有上層を、硫酸アンモニウム３０％を添加したリ
ン酸カリウム緩衝物質（ｐＨ７，５） ５０ミリモルで
稀釈しかつアミコン中空繊維ノぞトローネ（Ｈ２Ｐ５０
）によシ透析濾過し、その際異種蛋白質及びポリエチ
レングリコール１５４０を除去した。透析炉液（２５０
ｆｎｔ）を、硫酸アンモニウム４０％を飽和させたリン
酸カリウム緩衝物質（ｐＨ７，５） ５０ミリモルで平
衡化したセファロース４Ｂカラム（５Ｘ２０α〕に加え
た。 この緩衝液（１ｔ）で洗浄することによシ蛋白質の主要
量がこのカラムから溶出し、この条件下でＴ、 −フェ
ニルアラニン−デヒドロゲナーゼはカラムに結合した。 この酵素を例５に相応して傾斜法を適用して溶離し、次
いで濃縮した。この方法による精製について表３に掲載
する。 例７：反応速度とｐＨとの相関関係 フェニルピルベートをＬ−フェニルアラニンーデヒドロ
ゲナーぜの存在においてＬ−フェニルアラニンに還元的
にアミノ化する際の反応速度を反応溶液の、Ｈ値との関
係で試験した。試験−々ツチは次の組成を有していた： 異なるｐＨ値で塩化アンモニウム溶液中のＮ Ａ Ｄ
Ｈ０，１ミリモル、フェニルピルベート１０ミリモル及
び制限量の酵素（例２による粗裏抽出物、■試験当シ蛋
白質２０μ、）。選択した。Ｈ値６．７５〜９．０は試
験−々ツチを一緒にする前に塩化アンモニウム溶液０．
７モルにアンモニアもしくは塩酸を添加することにより
調節した。 第２図・に反応速度を、Ｈ値の関数としてプロットした
。至適、Ｈは８．５である。 Ｌ−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼによシ触媒し
ｇＬ−フェニルアラニンの酸化的脱アミノの反応速度も
同様に、Ｈ値との相関関係で試験した。試験Ｉ々ラッチ
次の組成を有してい７２：： （３４） 異なる。Ｈ値でグリシン／ Ｎ ａ ０１．−ｅｌｌ（
ｌｉＨｌｔｏ、１モル中のＬ−フェニルアラニン４．０
ミ９モル及びＮＡＤ＋３ミリモル。範囲６．０〜１０
．５の、Ｈ値は試験２々ツチを一緒に混合する前にグリ
シン／Ｎａ１ｌ緩衝液に塩酸又はカセイソーダを添加し
て調節した。 この結果も同様に第２図に記載した。 逆反応はｐＨ１０，５まで上昇する。 例８：反応速度と基質濃度の相関関係 フェニルピルベートをＬ−フェニルアラニンに還元的に
アミノ化する際に、ＮＡＤＨに対するその反応速度の相
関関係を次の試験−々ツチで試験し部 塩化アンモニウム／アンモニア緩衝液（、Ｈ８，５）
０．７モル、フェニルピルベート１０ミリモル、制限量
の酵素（例２による粗製抽出物。 １試験肖り蛋白質２０μ？）。試験／−！′ツテ中のＮ
ＡＤＨ濃度は範囲０．０２５〜０．３５ミリモルで変動
させた。 最適匁反応速度は０．３ミリモルで達成されることが明
らかになった。ＮＡＤＨＯＫＭ値は０．０６４ミリモル
である。 フェニルピルベートＱＬ−フェニルアラニンに還元的に
アミノ化する際にその反応速度とアンモニウムイオン濃
度の相関関係を次の試験−々ツテで試験した： フェニルビルベ−）ｔｏミｌＪモル、ＮＡＤＨＯ０２ミ
リモル、限定量の酵素（例２による粗製抽出物、■試験
当シ蛋白質２０μ、）。、Ｈ値をアンモニアで８．５に
調節した塩化アンモニウム緩衝液を使用した。試験中の
塩化アンモニウムモル濃度は範囲０．０９５〜０．７モ
ルで変化させた。 反応速度が塩化アンモニウム少なくとも０．５モルまで
上昇したことが明らかになった。塩化アンモニウム０．
７モルは阻害作用せず、それ故酵素試験に最適である。 種々のα−ケトカルゼン酸の還元的アミノ化をケト酸濃
度との相関関係において試験した。 そのため次の試験−々ツチを使用した：塩化アンモニウ
ム／アンモニア緩衝ｉ（、Ｈ８，５） ０．７モル、Ｎ
ＡＤＨｏ、２ミリモル、限定量の酵素（例５により精製
した蛋白質ｌμ？）。 ケト酸濃度はその都度範囲０．０１〜３０ミリモルで変
化させた。 開始反応速度（Δ吸光度３４．０ ｎｍ ７分）をミバ
エリス・メンテンにより評価する。得られたＫＭ−及び
Ｖｍａｘ−値を表４に記載した。基質インドリルピルベ
ートの場合には光学的試験が妨害されるので、インドリ
ルピルベートをＬ−トリシト７アンに還元的にアミノ化
する際に形成されたＬ−トリシト７アンを時間の関数と
してアミノ酸分析器で測定した（ Ｂｉｏｔｒｏｎｉｋ
ＢＯ６０００％積分器Ｂｉｏｔｒｏｎｉｋを具備、Ｓｙ
ｓｔ−ｅｍｌ、１カラムプログラムで、標準溶液として
Ｆｉｒｍａ Ｐｉｅｒｃｅ のアミノ酸標準■を使用
した）。 （３７） 表 ４ 精製ＰｈｅＤＨ（蛋白質０．０５５１１９／ｍ／ ）で
のＫＭ値及びＶｍａｘ値 フェニルピルベート ０．１１
１．８２Ｐ−ヒドロキシフェニル ０．２４
１．７５ぎルペート ２−ケト−４−（メチル ３．０
１．０８メルカプト）−ブチレート インドリルピルベート ８．０
０．４４Ｌ−フェニルアラニンの酸化的脱アミノ反応の
反応速度とＮＡＤ十濃度との相関関係を次の試験／々ラ
ッチ試験し７？１．： グリシｙ−ＮａＯ２／Ｎａ０Ｈ（、Ｈｌ Ｏ，７）０．
１モル、Ｌ−フェニルアラニン４ ミリモル、限定量の
酵素（例６により精製した蛋白質２０μ？）。 （３８） ＮＡＤ十濃度は範囲０．１〜５．０ミリモルで変化させ
た。濃度３ミリモルで至適変換率が達成されることが明
らかである。 酸化的脱アミノの反応速度とＬ−フェニルアラニン濃度
との相関関係は次の試験／々マツチ試験し九ニ ゲリシンーＮａＯ１／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０，３）
０．１モル、ＮＡＤ＋３ミリモル、限定量の酵素（例６
により精製し次蛋白質２０ ｆｉｇ ）。フェニルアラ
ニン濃度は範囲０．３〜１５ミリモルで変化させた。 反応で生じるＮ Ａ、 Ｄ Ｈを３４０皿 で測定した
。開始反応速度をミバエリス・メンテンによす評価した
。フェニルアラニンのＫＭ値は０．８ミリモルであシ、
最大反応速度は１．０２Ｕ／ＩＮｉである。 例９：類縁α−ケトカルゼン酸の還元的アミノ化による
’ｌ、−ｌニールアラニン、Ｌ−チロシン％Ｌ−トリプ
トファン及びＬ−メチオニンの製造 還元的アミノ化で消費したＮＡＤＨを再生するため、反
応？マツチに過剰量の蟻酸アンモニウム及び酵素の蟻酸
デヒドロゲナーゼ（Ｅ、０゜１．２．１．２）を添加し
、これがホルミエートをＣＯ２に酸化する際にＮＡＤ＋
をＮＡＤＨに還元する。 一連のα−ケトカルボン酸の還元的アミノ化を比較条件
下に試験した。その際、試験／々マツチ均一に蟻酸アン
モニウム（ｐＨ８，５） ４００ ミリモル、ＮＡＤＨ
ｏ、３ミリモル、蟻酸デヒドロゲナーゼ［Ｋｒｏｎｅｒ
及びその他による製剤（１９８２）、”Ｊ 、 Ｏ
ｈｅｍ、 Ｔｅｅｈ、 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、’３２
巻、１３０〜１３７頁）０．６０／ｍ／、Ｌ−フェニル
アラニン−デヒドロゲナーゼｏ、ｓｏ／ゴ、α−ケトカ
ルゼン酸２５ミリモルを含有していた。全容量は３−で
あった。アミノ酸分析器で生成物の形成を追跡した。そ
の結果を表５ｖｃ ｍ 括した。フェニルピルベート、
ｐ−ヒドロキシフェニルピルベート、インドリルビルヘ
ート及び２−ケト−４−（メチルメルカプト）−ブチレ
ートは良好に変換される。これに対して、イミダゾリル
ピルベートは冥際に基質として有用ではない。 （４１） 例１０ ： Ｔ、−フェニルアラニンの連続的製造フェ
ニルビルヘ−）７５．うのフェニルアラニンの連続合成
は１分子量を拡大した、ポリエチレンｆ リコール（Ｐ
ＥＧ）に結合したＮＡＤＨの使用下に酵素膜反応器中で
可能である。ＰＥＧ−ＮＡＤＨは西ドイツ国特許第２８
４１４１４号明細書によシ製造する。変性した補酵素並
びに使用した酵素の蟻酸デヒドロゲナーゼ及びＬ−フェ
ニルアラニン−デヒドロゲナーゼは限外濾過膜Ｙ Ｍ５
（Ｆｉｒｍａ Ａｍ１ｃｏｎ の製品、Ｗｉｔｔｅ
ｎ在）によシ反応器中に残シ、反応溶液の低分子成分、
未反応基質及び形成しｆｃＬ−フェニルアラニンは連続
的に溶液から除去される。限外炉液が反応器から流出す
るのと同じ量で溜めからフェニルピルベートと蟻酸アン
モニウムを後配量して、反応器の容量を一定に保持する
。反応器の容量はｌＯ−であシ、ＰＥＧ−ＮＡＤＨの濃
度０．３ミリモル、蟻酸デヒドロゲナーゼ２０単位及び
Ｌ−フェニルアラニンーデヒドロゲナーゼ２０単位を反
応器中に注加した。基質溶液は蟻酸アンモニウム（ｐＨ
８，３） ４００ ミｌＪモル及びフェニルピルベート
（ナトリウム塩）２０ミリモルを含有していた。 反応溶液をチューブポンプによ多連続的に３０−７時間
で膜を介してポンプ処理した。限外炉液約４−／時間が
得られた。これは滞留時間２．５時間に相当する。この
実験構成で１１０時間テフェニル♂ルピン酸ナトリウム
９．８ミリモル（１，８３、）を処理した。限外ろ液を
分画捕集し、Ｌ−フェニルアラニン含量をアミノ酸分析
器で測定した。１１０時間で平均して装入シタフェニル
ピルベートの７０係がＬ−フェニルアラニンに変換され
、−緒にした限外ろ液中ＫＬ−フェニルアラニン６．９
ミリモル（１，１４ｆ）が測定された。この例で得られ
た反応生成物は比較的簡単にｎ裂することができる。そ
れというのもその溶液は未反応のフェニルピルベートと
蟻酸アンモニウムで不純化されているに過ぎないからで
ある。限外ろ液（４５０＊ｔｌ ｈ Ｌ−フェニルアラ
ニン１．１４９ ）を凍結乾燥し。 ０．５モル蟻酸５ｏ−で採シ、その１２．５−を身オン
交換体力うＡ （Ｂｊｏｒａｄ ＡＧ ５０ＷＸ８、
メツシュ２００〜４００．Ｈ十型＊ｌＸ１０ｃｒｎ）
上に注いだ。カラムを０．５モル蟻酸１００ｍ７！で洗
った。この条件下に７工ニルピルペートカ結合した。塩
化鉄（Ｉ［）溶液（７，５憾、、Ｈ２，５，４３６ｎｍ
で吸収を測定）との呈色反応にょシ、洗浄溶液２０〜２
５−の通過後にフェニルピルベートがカラムから除去さ
れたことを明らかにすることができた。Ｌ−フェニルア
ラニンを５％−ピリジン溶液を用いてイオン交換体から
溶離した。 この条件下ではアンモニウムイオンはイオン交換体に結
合して残シ、それ故溶出液中のＬ−フェニルアラニンの
検出はニンヒドリンで可能である。交換体は４Ｎ−塩酸
で処理することにょシ再生しかつ脱イオン水で洗浄技に
再び使用する。フェニルアラニンを含有する溶出液を合
しかつ真空中回転式蒸発器で濃縮乾固した。ピリジンを
完全に除去するために数回水で採った。 このようにしてＬ−フェニルアラニン１．１２ 。 （４５〕 が単離し、これを更に分析的測定に使用した。 アミノ酸分析ニアミノ酸分析器から５例１゜からの生成
物がＴ−−フェニルアラニン以外に他のアミノ酸を含有
していないことが明らかとなった。 旋光性：測定にパーキン・エルマー・ボラリメータ（Ｐ
ｅｒｋｉｎ −Ｅｌｍｅｒ Ｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ
） 型２４１を使用した。測定は４３６ ｎｍでｐＨ
２，１及び３０℃で実施した。Ｌ−フェニルアラニンに
よる標準曲線は旋光度とｍ度５〜１ｏｏミリモルとの直
線的関係を示す。例１０で合成した試料の旋光度は７１
ミリモル溶液（濃度測定はアミノ酸分析器を介する）中
で−０，３７１’であった。標準曲線との比較によシ、
光学的に純粋なＬ−フェニルアラニンが得られたことが
明らかである。 Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（Ｄ−ＡＯＤ ）にょるＤ−
アミノ酸に関する試験：豚の腎からのＤ−Ａ ＯＤ （
Ｂｏｅｈｒｌｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｇｍｂ Ｈ
社の製品）はＤ−アミノ酸に対して特異的である。Ｄ（
４６） アミノ酸のＤ−ＡＯＤ［よる酸化で生成する過酸化水素
は酵素ペルオキシダーゼによシ白色色素に変化する。Ｄ
−フェニルアラニンによる標率列を作成する。これは範
囲０．０１〜０．３５ミリモルで吸光度差とＤ−フェニ
ルアラニンの濃度との間に直線関係を示す。検出限界は
０．００５ミリモルである。使用した試料（例１０によ
るＬ−フェニルアラニン５５ミリモル）ハこの試験では
不活性であった。それ故、Ｄ−フェニルアラニンによる
不純化は０．０１ ％より低い。
第１図は培養物の光学密度、Ｌ−フェニルアラニン含量
並びにＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼの容量活
性及びその比酵素活性を時間に対する関数としてプロッ
トして示すグラフ、第２図１ｄＬ−フェニルアラニンデ
ヒドロゲナーゼの存在においてフェニルビルペー）をＬ
−フェニルアラニンにもしくはその逆方向に反応させた
際の反応速度をｐＨ値の関数としてプロットして示すグ
ラフである。 （４７ン 第１頁の続き ０発 明 者 ヴオルフガング・ロイヒテンベルガー ドイツ連邦共和国ブルーフケ− ベル・ゲシュヴイスターーショ ルーシュトラーセ１ ■出 願 人 ゲゼルシャフト・フユア・ビオテヒノロ
ギツシエ・フォルシュ ング・ミツト・ベシュレンクテ ル・ハフラング（ゲー・ベー・ エフ） ドイツ連邦共和国ブラウンシュ ヴアイク・シュテツクハイム・ マツシエローダー・ヴ工−り１
並びにＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼの容量活
性及びその比酵素活性を時間に対する関数としてプロッ
トして示すグラフ、第２図１ｄＬ−フェニルアラニンデ
ヒドロゲナーゼの存在においてフェニルビルペー）をＬ
−フェニルアラニンにもしくはその逆方向に反応させた
際の反応速度をｐＨ値の関数としてプロットして示すグ
ラフである。 （４７ン 第１頁の続き ０発 明 者 ヴオルフガング・ロイヒテンベルガー ドイツ連邦共和国ブルーフケ− ベル・ゲシュヴイスターーショ ルーシュトラーセ１ ■出 願 人 ゲゼルシャフト・フユア・ビオテヒノロ
ギツシエ・フォルシュ ング・ミツト・ベシュレンクテ ル・ハフラング（ゲー・ベー・ エフ） ドイツ連邦共和国ブラウンシュ ヴアイク・シュテツクハイム・ マツシエローダー・ヴ工−り１
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ａ）フェニル帰性ブドウ酸をアンモニウムイオンの
存在でかつ補酵素としてのＮＡＤＨと共にＬ−フェニル
アラニンに還元的にアミノ化するのを触媒し、 ｂ）他のケトカルビン酸を相応するα−アミノカルゼン
酸に、特にｐ−ヒドロキシフェニル然性ブドウ酸をＬ−
チロシンに、インドリル焦性ブドウ酸をＬ−）リプドア
アンに及び２−ケト−４−１（メチルメルカプト）−酪
酸をＬ−メチオニンにアンモニウムイオンの存在でかつ
補酵素としてのＮＡＤＨと共に還元的にアミノ化するの
を触媒し、ｃ）Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、
Ｌ−トリプトファン及びＬ−メチオニンを（１〕 補酵素としてのＮＡＤ＋ と酸化的に脱アミノ反応する
のを触媒し、 ｄ）還元的アミノ化の至適、Ｈ範囲が８．５±１であシ
、及び ｅ）酸化的脱アミノ反応の至適、Ｈ範囲が１０±１であ
る という性質を特徴とする微生物学的に製造し＊ ＴＪ
−フェニルアラニンーデヒドロケナーセ。 ２、 、 ） フェニル焦性フドウ酸をアンモニウムイ
オンの存在でかつ補酵素としてのＮＡＤＨと共ＧＣＬ−
フェニルアラニンに還元的にアミノ化するのを触媒し、 ｂ）他のケトカルビン酸を相応するｄ−アミノカルヂン
酸にアンモニウムイオンの存在でかつ補酵素としてのＮ
ＡＤＨと共に還元的にアミノ化するのを触媒し、 ｃ）Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン。 Ｔ、 −）リプドアアン及びＬ−メチオニンを補酵素と
してのＮＡＤ＋と酸化的に脱アミノ反応するのを触媒し
、 （２） ｄ）還元的アミノ化の至適、Ｈ範囲が８．５±１であシ
、及び ｅ）酸化的脱アミノ反応の至適、Ｈ範囲が１０±１であ
る という性質を有するＬ−７エニルアラニンーデヒドロゲ
ナーゼを取得する方法において、ブレビ／々クテリウム
種ＤＳＭ２４４８を炭素及び窒素の供給源、チアミン、
鉱物塩並びに誘導質を含有する水性培地中で、Ｈ６，５
〜７．５及び温度２５〜３２℃で好気培養し、細胞物質
を分離しかつ酵素を細胞から単離することを特徴とする
Ｌ−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼの取得法。 ３、 誘導質としてＬ−７エニルアラニン、Ｄ−フェニ
ルアラニン、Ｄ、Ｌ−７エニルアラニン、Ｄ、Ｌ−フェ
ニルアラニンエステル又はＬ−ヒスチジンを使用する特
許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、細胞を機械的に砕解し、不溶の細胞砕片を分離しか
つ更に酵素を公知方法で富化する特（３〕 許請求の範囲第２項又は第３項記載の方法。 ５、 酵素の富化を分画塩析により行なう特許請求の範
囲第４項記載の方法。 ６、 酵素の富化をクロマトグラフィ分離法によシ行力
う特許請求の範囲第４項記載の方法。 ７、 ａ ） フェニル伸性ブドウ酸をアンモニウムイ
オンの存在でかつ補酵素としてのＮＡＤＨト共にＬ−フ
ェニルアラニンに還元的にアミン化するのを触媒し、 ｂ）他のケトカルゼン酸を相応するα−アミノカルゼン
酸にアンモニウムイオンの存在でかつ補酵素としてのＮ
ＡＤＨと共に還元的にアミノ化するのを触媒し、 ｃ）Ｔ、−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｔ、 −
）リプドアアン及びＬ−メチオニンを補酵素としてのＮ
ｋＤ＋と酸化的に脱アミノ反応するのを触媒し、 ｄ）還元的アミノ化の至適、Ｈ範囲が８．５±１であシ
、及び ｅ）酸化的脱アミノ反応の至適、Ｈ範囲が（４） １０±１である という性質を有するＬ−フェニルアラニン−デヒドロゲ
ナーゼを用いてフェニル伸性ブドウ酸、ｐ−ヒドロキシ
フェニル照性ブドウ酸、インドリル弾性ブドウ酸又は２
−ケト−４−（メチルメルカプト）−酪酸を相応するＬ
−α−アミノカルゼン酸に酵素的に変換することを特徴
とするＬ−α−アミノヵルヂン酸の製法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19833307095 DE3307095A1 (de) | 1983-03-01 | 1983-03-01 | Mikrobiologisch hergestellte l-phenylalanin-dehydrogenase, verfahren zu ihrer gewinnung und ihre verwendung |
| DE33070954 | 1983-03-01 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59198972A true JPS59198972A (ja) | 1984-11-10 |
Family
ID=6192136
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59037384A Pending JPS59198972A (ja) | 1983-03-01 | 1984-03-01 | 微生物学的に製造したＬ−フエニルアラニン−デヒドロゲナ−ゼ、その取得法及びＬ−α−アミノカルボン酸の製法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4590161A (ja) |
| EP (1) | EP0120208B1 (ja) |
| JP (1) | JPS59198972A (ja) |
| CA (1) | CA1209933A (ja) |
| DE (2) | DE3307095A1 (ja) |
| DK (1) | DK142184A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4849345A (en) * | 1985-04-17 | 1989-07-18 | Sagami Chemical Research Center | L-phenylalanine dehydrogenase and use thereof |
| US4970157A (en) * | 1986-08-12 | 1990-11-13 | Sagami Chemical Research Center | Isolated phenylalanine dehydrogenase gene and process for production of phenylalanine dehydrogenase |
| WO2010067578A1 (ja) | 2008-12-09 | 2010-06-17 | 株式会社カネカ | 新規なアミノ酸脱水素酵素、およびｌ－アミノ酸、２－オキソ酸、又はｄ－アミノ酸の製造方法 |
| JP2015512381A (ja) * | 2012-03-23 | 2015-04-27 | ノバルティス アーゲー | スピロインドロンおよびこれらの中間体を調製するための化学プロセス |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3446304A1 (de) * | 1984-12-19 | 1986-07-10 | Degussa Ag, 6000 Frankfurt | Verfahren zur gewinnung von phenylalanin-dehydrogenase enthaltenden mikroorganismen, mikroorganismen, die in ihnen enthaltene phenylalanin-dehydrogenase und deren verwendung zur herstellung von l-(alpha)-aminosaeuren |
| JPS62151191A (ja) * | 1985-09-09 | 1987-07-06 | Kuraray Co Ltd | Ｌ−フエニルアラニンの製法 |
| DE3621839A1 (de) * | 1986-06-28 | 1988-01-07 | Degussa | Mikrobiologisch hergestellte (alpha)-acetylaminozimtsaeure-acylase, verfahren zu ihrer gewinnung und ihre verwendung |
| US5139943A (en) * | 1989-06-13 | 1992-08-18 | Genencor International, Inc. | Processes for the recovery of microbially produced chymosin |
| US5151358A (en) * | 1989-06-13 | 1992-09-29 | Genencor International, Inc. | Processes for the recovery of naturally produced chymosin |
| DE4127648C1 (ja) * | 1991-08-21 | 1993-01-14 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De | |
| DE4141351A1 (de) * | 1991-12-14 | 1993-06-17 | Basf Ag | Stabile pulverfoermige vitamin- und/oder carotinoid-praeparate und verfahren zu deren herstellung |
| CN113429238A (zh) * | 2021-07-23 | 2021-09-24 | 甘肃省农业科学院旱地农业研究所 | 一种有机肥及其制备方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3036958A (en) * | 1959-03-17 | 1962-05-29 | Ajinomoto Kk | Process for producing l-tryptophan from 3-indolepyruvic acid |
| CH537904A (de) * | 1969-08-16 | 1973-06-15 | Sankyo Co | Verfahren zur Herstellung von L-3,4-Dihydroxyphenylalaninderivaten |
| DE2930070A1 (de) * | 1979-07-25 | 1981-02-19 | Biotechnolog Forschung Gmbh | Verfahren zur kontinuierlichen enzymatischen umwandlung von wasserloeslichen alpha -ketocarbonsaeuren in die entsprechenden aminosaeuren |
| JPS5814199B2 (ja) * | 1979-10-31 | 1983-03-17 | 味の素株式会社 | Ｌ−フエニルアラニンの製造法 |
-
1983
- 1983-03-01 DE DE19833307095 patent/DE3307095A1/de not_active Withdrawn
-
1984
- 1984-01-24 DE DE8484100707T patent/DE3477400D1/de not_active Expired
- 1984-01-24 EP EP84100707A patent/EP0120208B1/de not_active Expired
- 1984-02-24 US US06/583,325 patent/US4590161A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-02-29 DK DK142184A patent/DK142184A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-03-01 JP JP59037384A patent/JPS59198972A/ja active Pending
- 1984-03-01 CA CA000448621A patent/CA1209933A/en not_active Expired
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4849345A (en) * | 1985-04-17 | 1989-07-18 | Sagami Chemical Research Center | L-phenylalanine dehydrogenase and use thereof |
| US4970157A (en) * | 1986-08-12 | 1990-11-13 | Sagami Chemical Research Center | Isolated phenylalanine dehydrogenase gene and process for production of phenylalanine dehydrogenase |
| WO2010067578A1 (ja) | 2008-12-09 | 2010-06-17 | 株式会社カネカ | 新規なアミノ酸脱水素酵素、およびｌ－アミノ酸、２－オキソ酸、又はｄ－アミノ酸の製造方法 |
| US9267116B2 (en) | 2008-12-09 | 2016-02-23 | Kaneka Corporation | Amino acid dehydrogenase, and process for producing L-amino acid, 2-oxo acid or D-amino acid |
| JP2015512381A (ja) * | 2012-03-23 | 2015-04-27 | ノバルティス アーゲー | スピロインドロンおよびこれらの中間体を調製するための化学プロセス |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK142184A (da) | 1984-09-02 |
| DE3307095A1 (de) | 1984-09-06 |
| CA1209933A (en) | 1986-08-19 |
| DE3477400D1 (en) | 1989-04-27 |
| EP0120208B1 (de) | 1989-03-22 |
| US4590161A (en) | 1986-05-20 |
| EP0120208A3 (en) | 1986-07-02 |
| EP0120208A2 (de) | 1984-10-03 |
| DK142184D0 (da) | 1984-02-29 |
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