JPH0329399B2 - - Google Patents

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JPH0329399B2
JPH0329399B2 JP57033497A JP3349782A JPH0329399B2 JP H0329399 B2 JPH0329399 B2 JP H0329399B2 JP 57033497 A JP57033497 A JP 57033497A JP 3349782 A JP3349782 A JP 3349782A JP H0329399 B2 JPH0329399 B2 JP H0329399B2
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は、Ｌ−グルタミン酸を含有する液体
に、少なくともＬ−グルタミン酸に基質特異性を
有し、かつＬ−グルタミンに対する基質特異性の
相対活性を100％とした場合に実質的に全くＬ−
ヒスチジンに基質特異性を有せず、１モルのＬ−
グルタミン酸、１モルの酸素、１モルの水から、
１モルのα−ケトグルタル酸、１モルのアンモニ
アおよび１モルの過酸化水素を生成する反応を触
媒するＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（H2O2・
ジエネレイテイング）を作用せしめ、次いで消費
される酸素の量、または生成されるケトグルタル
酸、アンモニアまたは過酸化水素の量を定量する
ことを特徴とするＬ−グルタミン酸の分析方法に
関する。 従来より、Ｌ−グルタミン酸に基質特異性を有
する酸化酵素としては、２モルのＬ−グルタミン
酸、１モルの酸素および１モルの水から、２モル
のα−ケトグルタル酸、２モルのアンモニアおよ
び１モルの水を生成する反応を触媒する酵素作用
を有するＬ−（＋）−グルタミン酸オキシドレダク
ターゼが知られているにすぎない〔Biochimica.
et Biophisica.Acta.、368．（1974）158−172〕。 また従来より、Ｌ−アミノ酸に基質特異性を有
し、かつ１モルのアミノ酸、１モルの酸素および
１モルの水から、１モルのα−ケト酸、１モルの
アンモニアおよび１モルの過酸化水素を生成する
反応を触媒する酵素作用を有するＬ−アミノ酸オ
キシダーゼが知られている〔Methods in
Engymology、Volume、204−211（1955）等〕。 しかしながら、Ｌ−（＋）−グルタミン酸オキシ
ドレダクターゼは、前述の通り、２モルのＬ−グ
ルタミン酸に作用して、２モルのα−ケトグルタ
ミン酸、２モルのアンモニアおよび１モルの水を
生成する反応を触媒する酵素であり、過酸化水素
も発生しない。またＬ−アミノ酸オキシダーゼ
は、１モルのアミノ酸に作用して１モルのα−ケ
ト酸、１モルのアンモニアおよび１モルの過酸化
水素を生成する反応を触媒する酵素であるが、そ
の基質たるアミノ酸としてＬ−グルタミン酸に作
用する酵素については報告されておらず、従来の
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼはＬ−グルタミン酸に
対して作用しないと報告されている〔Methods
in Enymology.Volume、204−211（1955）〕。 さらに、Ｌ−グルタミン酸に作用して酸素、水
を消費して、α−ケトグルタル酸、アンモニアお
よび過酸化水素を生成する反応を触媒するＬ−グ
ルタミン酸オキシダーゼが存在する（特願昭55−
117783号、特開昭57−43685号公報）が、このＬ
−グルタミン酸オキシダーゼはＬ−グルタミン酸
に基質特異性を有するのみならず、Ｌ−ヒスチジ
ンに対しても6.8％（Ｌ−グルタミン酸を100％と
した相対活性）も作用するもので、このＬ−グル
タミン酸オキシダーゼを用いて被検液を分析する
場合、被検液中にＬ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチ
ジンなどの種々アミノ酸を含有していれば、少な
くともＬ−ヒスチジンに作用してＬ−グルタミン
酸の量を正確に測定できない欠点があり、さらに
被検液中のＬ−グルタミン酸とＬ−ヒスチジンと
の存在比率においてＬ−ヒスチジンが多く存在す
る場合にはその測定結果は何らＬ−グルタミン酸
の量を測定したものと言えない結果となる。 本発明者らは、長野県佐久市の畑土壌から分離
した放線菌A7700株および群馬県吾妻郡長野原町
のサツマイモ畑の土壌から分離した放線菌A8063
株が、少なくともＬ−グルタミン酸に基質特異性
を有し、かつＬ−グルタミン酸に対する基質特異
性の相対活性を100％とした場合に実質的に全く
Ｌ−ヒスチジンに基質特異性を有せず、かつ１モ
ルのＬ−グルタミン酸、１モルの酸素および１モ
ルの水から、１モルのα−ケトグルタル酸、１モ
ルのアンモニアおよび１モルの過酸化水素を生成
する反応を触媒する酵素作用を有する新規な酵素
蛋白を産生することを見い出し、かつこれを単一
な成分として精製、採取することを完成し、この
新規な酵素蛋白をＬ−グルタミン酸オキシダーゼ
（H2O2・ジエネレイテイング）と命名した。さら
にこれらの放線菌A7700株およびA8063株を培養
して得られたこのＬ−グルタミン酸オキシダーゼ
（H2O2 ジエネレイテイング）を用いることによ
り、種々のＬ−グルタミン酸を含有する液体の新
規な分析方法を確立した。 まず本発明における上記放線菌A7700株および
A8063株の肉眼的および顕微鏡的観察などに基く
各種培地上における培養の特徴は、次に記載する
通りである。 (A) 放線菌A7700株について： 顕微鏡的観察 スターチ・無機塩寒天培地上で、30℃、10
〜15日間培養し、観察した形態的所見は、次
の通りである。なお、オートミール寒天培地
およびイーストエキス、麦芽エキス寒天培地
上でもほぼ同様な形態が観察された。 基生菌糸は曲線状で、分岐を伴つて伸長
し、直径0.5〜0.6μで、菌糸の分裂や胞子の
着生はない。 基生菌糸より生じた気菌糸は、曲線状で単
純分岐をなして伸長し、直径0.6〜0.8μであ
り、多数の連鎖した胞子を形成する。 胞子の連鎖は螺旋を呈し、２〜３回巻いた
ものが多いが、ループ状あるいはフツク状の
ものもある。 胞子の形は楕円ないし短桿形で、大きさは
0.6〜0.8×0.8〜1.0μであり、その表面は平滑
である。 鞭毛胞子や胞子のうは形成しない。 ジアミノピメリン酸組成 全細胞を用いての分析で、Ｌ−型のジアミ
ノピメリン酸が検出され、meso−型は検出
されなかつた。 肉眼的観察 各種培地上で、30℃、14日間培養し、観察
した所見は、第１表に示す通りである。 また色の表示は、Color harmony
manual第４版1958年（Container
Corporation of America）によつた。
【表】 生理的性状 生育温度範囲：20〜40℃、 酸素の要求性：好気性、 ゼラチンの液化：陽性（極めて弱い）、 スターチの加水分解：陽性、 脱脂牛乳：ペプトン化；陽性（弱い）、
凝固；陰性、 メラニン様色素の生成： チロシン寒天培地上；陰性、 ペプトン イーストエキス・鉄寒天培地
上；陽性、 炭素源の利用性：Ｌ−アラビノース、Ｄ
−フラクトース、Ｄ−グルコース、イノシ
トール、Ｄ−アンニトール、ラフイノー
ス、Ｌ−ラムノース、シユクロースおよび
Ｄ−キシロースの全てを利用する。 以上の通り、本菌A7700株は、真性の基生菌
糸より、多数の胞子の連鎖を有する気菌糸を形
成し、ジアミノピメリン酸がＬ型であり、鞭毛
胞子や胞子のうを形成せず、好気条件で生育す
ることなどの特徴を有することから、ストレプ
トマイセス（Streptmyces）属に属するものと
認められ、よつて本菌A7700株をストレプトマ
イセス・エス・ピー・A7700（Streptmyces
sp・A7700）と称することとし、また工業技術
院微生物工業技術研究所に受託番号、微工研菌
寄第6241号（FERM Ｐ−6241）として寄託し
た。 (B) 放線菌A8063株について、 顕微鏡的観察 スターチ・無機塩寒天培地上で、30℃、10
〜15日間培養し、観察した形態的所見は、次
の通りである。なお、グリセリン・アスパラ
ギン寒天培地、チロシン寒天培地およびイー
ストエキス・麦芽エキス寒天培地上において
も、ほぼ同様な形態が観察された。 基生菌糸は曲線状で分岐を伴つて伸長し、
直径0.5〜0.6μであり、菌糸の分裂や胞子の
着生はない。 基生菌糸より生じた気菌糸は曲線状で単純
分岐をなして伸長し、直径0.6〜0.8μであり、
多数の連鎖した胞子を形成する。 胞子の連鎖は、ループ状、フツク状あるい
は２回巻いた螺旋を呈するものが多く、３回
以上巻いた螺旋も少数存在する。 胞子の形は球形で、大きさは直径0.6〜
0.8μであり、その表面はとげ状を呈してい
る。 鞭毛胞子や胞子のうは形成しない。 ジアミノピメリン酸組成 全細胞を用いての分析で、Ｌ型のジアミノ
ピメリン酸が検出され、meso−型は検出さ
れなかつた。 肉眼的観察 各種培地上で、30℃、14日間培養し、観察
した所見は、第２表に示す通りである。 また色の表示は、Colov harmony
manual第４版1958年によつた。
【表】
【表】 生理的性状 生育温度範囲：15〜43℃、 酸素の要求性：好気性、 ゼラチンの液化：陽性（弱い）、 スターチの加水分解：陽性 脱脂牛乳：ペプトン化；陽性、凝固 陰
性、 メラニン様色素の生成：チロシン寒天培
地およびペプトン・イーストエキス・鉄寒
天培地上で陽性、 炭素源の利用性： 利用するもの；Ｄ−フラクトース、Ｄ−
グルコース、Ｄ−マンニトール、Ｌ−ラム
ノースおよびシユクロース、 利用性の弱いもの；Ｌ−アラビノース、
イノシトール、ラフイノースおよびＤ−キ
シロース、 以上の通り、本菌A8063株は、真性の基性菌糸
より、多数の胞子の連鎖を有する気菌糸を形成
し、ジアミノピメリン酸がＬ型であり、鞭毛胞子
や胞子のうを形成せず、好気条件で生育すること
などの特徴を有することから、ストレプトマイセ
ス属に属するものと認められ、よつて本菌A8063
株をストレプトマイセス・エス・ピー・A8063
（Streptomyces sp・A8063）と称することとし、
また工業技術院微生物工業技術研究所に受託番
号、微工研菌寄第6242号（FERM Ｐ−6242）と
して寄託した。 またこの新規な酵素Ｌ−グルタミン酸オキシダ
ーゼ（H2O2・ジエネレイテイング）は少なくと
もＬ−グルタミン酸に基質特異性を有し、かつＬ
−グルタミン酸に対する基質特異性の相対活性を
100％とした場合に実質的に全くＬ−ヒスチジン
に基質特異性を有せず、１モルのＬ−グルタミン
酸、１モルの酸素および１モルの水から、１モル
のα−ケトグルタル酸、１モルのアンモニアおよ
び１モルの過酸化水素を生成する反応を触媒する
酵素であり、種々の定量手段を用いることによ
り、Ｌ−グルタミン酸を含有する液体にこのＬ−
グルタミン酸オキシターゼ（H2O2・ジエネレイ
テイング）を作用せしめ、次いで反応系における
Ｌ−グルタミン酸の量に基いて消費された酸素の
量の定量、または、生成された過酸化水素の定
量、アンモニアの定量またはα−ケトグルタル酸
の定量を行なうことによりＬ−グルタミン酸と含
有する液体のＬ−グルタミン酸の定量分析方法を
見い出した。 本発明は以上の知見に基いて完成されたもの
で、Ｌ−グルタミン酸を含有する液体に、少なく
ともＬ−グルタミン酸に基質特異性を有し、かつ
Ｌ−グルタミン酸に対する基質特異性の相対活性
を100％とした場合に実質的に全くＬ−ヒスチジ
ンに基質特異性を有せず、１モルのＬ−グルタミ
ン酸、１モルの酸素、１モルの水から、１モルの
α−ケトグルタル酸、１モルのアンモニアおよび
１モルの過酸化水素を生成する反応を触媒するＬ
−グルタミン酸オキシダーゼ（H2O2・ジエネレ
イテイング）を作用せしめ、次いで消費される酸
素の量、または生成されるケトグルタル酸、アン
モニアまたは過酸化水素の量を定量することを特
徴とするＬ−グルタミン酸の分析方法である。 本発明における新規なＬ−グルタミン酸オキシ
ダーゼ（H2O2・ジエネレイテイング〔以下単に
Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（H2O2）と称す〕
としては、前記の基質特異性および酵素作用を特
徴として有するものであればよく、等電点、Km
値、至適PH、熱安定性、PH安定性、添加物による
阻害、活性化などにおいて相異を示すものであつ
ても、上記の特徴を有するものは本発明に包含さ
れるものであり、またこの新規なＬ−グルタミン
酸オキシダーゼ（H2O2）を得るための使用菌と
しては前記の菌はその例である。 また本発明の製造法における使用菌としては、
前記の菌はその例であつて、ストレプトマイセス
属に属するＬ−グルタミン酸オキシダーゼ
（H2O2）生産能力を有するものであればすべて本
発明において使用できる。もちろん、微生物は、
自然的、人工的に変異を起しやすく、これらの変
異株であつてもＬ−グルタミン酸オキシダーゼの
生産能力を失わない限り本発明に使用し得ること
はいうまでもないことであり、さらにこのＬ−グ
ルタミン酸オキシダーゼ（H2O2）の生産遺伝子
を細胞工学や遺伝子組み換え操作にて他の細胞へ
と形質転換せしめてＬ−グルタミン酸オキシダー
ゼ（H2O2）を製造することも本発明に包含され
るものである。 本発明を実施するに当つて、ストレプトマイセ
ス属に属するＬ−グルタミン酸オキシダーゼ
（H2O2）生産菌による製造法について例示すれ
ば、次の如くである。例れば、ストレプトマイセ
ス属に属するＬ−グルタミン酸オキシダーゼ
（H2O2）生産菌を、抗生物質、酵素などを生産す
る通常の方法で培養する。培養の形態は液体培養
でも固体培養でもよく、工業的にはＬ−グルタミ
ン酸オキシダーゼ（H2O2）生産菌の細胞をその
生産用培地に接種し、深部通気撹拌培養を行なう
のが有利である。 培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用
いられるものが広く使用される。窒素源としては
利用可能な窒素化合物であればよく、例えばコー
ン・スチープ・リカー、大豆粉、ペプトン、種々
の肉エキス、酵母エキス、硫安、塩化アンモニウ
ムやＬ−グルタミン酸などの各種アミノ酸などが
使用される。炭素源としては、同化可能な炭素化
合物であればよく、例えばシクロース、グルコー
ス、フラクトース、糖蜜、マルトエキス、スター
チ加水分解物などが使用される。その他、食塩、
塩化カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸第一カ
リウム、リン酸第二カリウムなどの種々の無機塩
や消泡剤が必要に応じて使用される。 培養温度は菌が発育し、Ｌ−グルタミン酸オキ
シダーゼ（H2O2）を生産する範囲内で適宜変更
し得るが、通常20〜35℃、好ましくは26℃近辺で
ある。培養時間は、条件によつて多少異なるが、
通常50〜120時間程度であつて、Ｌ−グルタミン
酸オキシダーゼ（H2O2）が最高力価に達する時
期をみはからつて適当な時期に培養を終了すれば
よい。 このようにして得られた培養物において、Ｌ−
グルタミン酸オキシダーゼ（H2O2）はその菌体
内に含有されている。 さらにこのようにして得られた培養物からＬ−
グルタミン酸オキシダーゼ（H2O2）を抽出し、
粗製のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（H2O2）
を得るに当つて例示すれば、まず培養物を固液分
離し得られる湿菌体を、必要に応じてリン酸緩衝
液、トリス−HCl緩衝液、ジメチルグルタル酸−
NaOH緩衝液などの緩衝液に懸濁せしめ、次い
でフレンチプレス処理、超音波処理、ミル処理や
リゾチーム処理などの種々の菌体破砕処理手段を
適宜選択、組合せて処理して、粗製のＬ−グルタ
ミン酸オキシダーゼ（H2O2）含有液を得る。次
いでこの溶液を、さらに公知の蛋白質、酵素など
の単離、精製されたＬ−グルタミン酸オキシダー
ゼ（H2O2）を得ることができる。例えば、粗製
のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（H2O2）含有
液に、アセトン、メタノール、エタノールやイソ
プロパノールなどの有機溶剤による分別沈澱法、
硫安などによる塩析法などの手段を用いて沈澱せ
しめ、回収して粗製のＬ−グルタミン酸オキシダ
ーゼ（H2O2）含有物を得てもよい。さらにこれ
を、例えば電気泳動法などにて単一の帯を示すま
で精製してもよく、その精製手段としては、例え
ば上記の粗製のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ
（H2O2）含有物を前記の如くの緩衝液に溶解せし
め、透析手段やジエチルアミノエチルセルロー
ス、ジエチルアミノエチルセフアロースなどのイ
オン交換体、デキストランゲル、ポリアクリルア
マイドゲルなどのゲル過剤によるクロマトグラ
フ法を行なえばよい。またこれらの手段を適宜組
合せて精製すればよく、次いでこれを凍結乾燥手
段により乾燥してＬ−グルタミン酸オキシダーゼ
（H2O2）の精製粉末を得る。 本発明によつて得られるＬ−グルタミン酸オキ
シダーゼ（H2O2）の活性測定法および理化学的
性質は、次の通りである。 (1) 活性測定法 0.3％４−アミノアンチピリン 0.3ml ペルオキシダーゼ（50U／ml） 0.1ml 0.2M リン酸緩衝液（PH7.0） 0.6ml 0.2％N.N−ジメチル−ｍ−トルイジン 0.3ml 0.2M Ｌ−グルタミン酸（PH7.0に調製） 1.5ml 蒸留水 0.2ml 計3.0ml 上記の組成を有する反応液3.0mlを調製し、
37℃に加温して石英セルに加え、酵素液50μ
を加えてすばやく混合し、37℃に調整された恒
温セルホルダーを有する分光光度計に装着し、
混合後２分目から正確に５分間反応を行ない、
この間の545nｍにおける吸光度変化（ΔA545）
を測定する。 また活性測定の算出法は、次式に従う。 Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（H2O2）活性（単位／
ml）＝ΔA545／32×１／２×１／５×3.05／0.05×希釈
倍率 (2) 基質特異性 ストレプトマイセス・エス・ピー・A7700株
の産生したＬ−グルタミン酸オキシダーゼ
（H2O2）〔以下、A7700酵素と略す〕およびス
トレプトマイセス・エス・ピー・A8063株の産
生したＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（H2O2）
〔以下、A8063酵素と略す〕の各酵素を用いて、
前記の活性測定法を利用して、そのＬ−グルタ
ミン酸の代りに、第３表に記載の種々の基質を
用いて、Ｌ−グルタミン酸に対する相対活性
（％）を求めた。 その結果、第３表に示す通りで、両酵素とも
Ｌ−グルタミン酸に基質特異性を有し、このＬ
−グルタミン酸に対する基質特異性の相対活性
を100％とした場合Ｌ−チロシン、Ｌ−メチオ
ニン、Ｌ−フエニルアラニン−Ｌ−アルギニ
ン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アラニ
ン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−スレ
オニン、Ｌ−セリンに対する相対活性は０％で
あつて、これらのアミノ酸に実質的に全く基質
特異性を有さないものと認められた。
【表】
【表】 (3) 酵素作用 基質として0.5μmolesL−グルタミン酸を用
いて、両酵素の作用に基く、消費された酸素の
量、生成されたα−ケトグルタル酸の量、アン
モニアの量および過酸化水素の量を定量した。 その結果は、第４表の通りであつた。
【表】 なお、消費された酸素の量は酸素電極で定量
し、生成したα−ケトグルタル酸の量は2.4−
ジニトロフエニルヒドラジン法〔化学の領域、
増刊33第99〜104頁、「生化学領域における光電
比色法」〕で定量し、生成したアンモニアの量
はインドフエノール法〔J.Biol.Chem.、102、
499（1933）〕で定量し、生成した過酸化水素の
量はペルオキシダーゼ−４−アミノアンチピリ
ン−フエノール系の発色法で定量したものであ
る。 以上の結果、両酵素とも、１モルのＬ−グル
タミン酸、１モルの酸素および１モルの水か
ら、１モルのα−ケトグルタル酸、１モルのア
ンモニアおよび１モルの過酸化水素を生成する
反応（反応式〔〕）を触媒することが確認さ
れた。 (4) 等電点 A7700酵素およびA8063酵素の等電点を、キ
ヤリアー・アンフオライトPH3.5〜PH6.0（LKB
社製）を用いて等電点電気泳動法にて、両酵素
の等電点を求めた結果、A7700酵素はPH4.3付
近、A8063酵素はPH4.1付近であつた。 (5) Km値 両酵素のＬ−グルタミン酸に対するKm値は、
A7700酵素が約5.6×10-4M、A8063酵素が約
1.1×10-3Mと測定された。 (6) 至適PH 活性測定法における緩衝液の代りに、グリシ
ン−HCl緩衝液（PH2.5〜4.5）、ジメチルグルタ
ル酸−NaOH緩衝液（PH４〜７）、リン酸緩衝
液（PH６〜８）、トリス−HCl緩衝液（PH７〜
９）、グリシン−NaOH緩衝液（PH９〜9.5）の
各緩衝液を用いて、両酵素の活性測定を行なつ
てその至適PHを測定した。 その結果、第１図はA7700酵素の至適PH曲線
を示し、図中、●はグリシン−HCl緩衝液、×
はジメチルグルタル酸−NaOH緩衝液、▲は
リン酸緩衝液、■はトリス−HCl緩衝液、◆は
グリシン−NaOH緩衝液の場合を示し、第２
図はA8063酵素の至適PH曲線を示し、図中〇は
グリシン−HCl緩衝液、×はジメチルグルタル
酸−NaOH緩衝液、△はリン酸緩衝液、□は
トリス−HCl緩衝液、◇はグリシン−NaOH緩
衝液の場合を示すもので、両酵素ともPH５〜
7.5に至適PHを有するものと測定された。 (7) 熱安定性 20ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）に、各酵素
A7700酵素、A8063酵素を溶解し、種々の温度
で10分間加熱し、処理後直ちに氷浴に入れて冷
した後、各酵素の残存活性を活性測定法に基い
て測定した。 その結果、第３図に示す通りで、図中、●は
A7700酵素の場合を示し、〇はA8063酵素の場
合を示し、両酵素とも55℃までは安定であり、
70℃では完全に失活した。 (8) PH安定性 種々の緩衝液を用いて、A7700酵素のPH安定
性曲線（第４図に示す）およびA8063酵素のPH
安定性曲線（第５図に示す）を求めた。 用いた緩衝液としては濃度40ｍＭで、グリシ
ン−HCl緩衝液（PH2.5〜4.5）（第４図および第
５図中〇にて示す）、ジメチルグルタル酸−
NaOH緩衝液（PH４〜7.5）（第４図および第５
図中●にて示す）、リン酸緩衝液（PH６〜８）
（第４図および第５図中▲にて示す）、トリス−
HCl緩衝液（PH７〜９）（第４図および第５図
中△にて示す）、グリシン−NaOH緩衝液（PH
９〜9.5）（第４図および第５図中□にて示す）
を用い、各種緩衝液にそれぞれの酵素を溶解
し、37℃で60分間加温した後、直ちに氷冷し、
それぞれのPHにおける残存活性を活性測定法に
基いて測定した。 その結果、A7700酵素の場合は第４図に示す
通りでPH4.5〜7.5で安定と認められ、また
A8063酵素の場合は第５図に示す通りでPH４〜
7.5で安定と認められた。 (9) 金属塩の影響 A7700酵素およびA8063酵素の活性に対する
金属イオンの影響を測定した結果、第５表に示
す。Cu2+イオン以外ほとんど影響はなかつた。
【表】
【表】 (10) 界面活性剤およびその他の物質の阻害、活性
化、 種々の界面活性剤およびその他の物質の阻
害、活性化の結果について、第６表に示す。 その結果、EDTAによる影響が認められな
いことから、両酵素とも金属酵素でないと推定
される。また両酵素とも、NaN3やKCNによ
つても阻害されず、FAD、FMNによつても大
きく影響されなかつた。
〔試薬〕
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジ
ン ３ｍＭ ペルオキシダーゼ ５単位／ml Ｌ−アラニン 200ｍＭ α−ケトグルタル酸 10ｍＭ トリス−HCl緩衝液 50ｍＭ Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（H2O2）
５単位／ml アスコルビン酸オキシダーゼ ５単位／ml 〔試薬〕 ４−アミノアンチピリン 15ｍＭ 上記の組成を有する試薬の1.0mlを石英セル
に分取し、これに血清50μを添加し、37℃で５
分間反応せしめた後、37℃に加温した試薬0.1
mlをさらに添加し、37℃で種々の時間反応せし
め、次いで波長550nｍにおける吸光度変化を測
定した。 その結果、第９図に示す通りで、血清中GPT
活性測定においてラグタイムが認められず、原点
を通る良好な直線性が得られた。また本発明方法
で測定することにより第一段反応で非特異的反応
およびラグタイムを改善、除去しているために盲
検を必要としない良好な測定法である。 実施例 ５ 〔血清中GOT活性測定〕 〔試薬〕 Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジ
ン ３ｍＭ ペルオキシダーゼ ５単位／ml Ｌ−アスパラギン酸 200ｍＭ α−ケトグルタル酸 10ｍＭ トリス−HCl緩衝液 50ｍＭ Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（H2O2）
５単位／ml アスコルビン酸オキシダーゼ ５単位／ml 〔試薬〕 ４−アミノアンチピリン 15ｍＭ 上記の組成を有する試薬の1.0mlを石英セル
に分取し、これに血清50μを添加し、37℃で５
分間反応せしめた後、37℃に加温した試薬0.1
mlをさらに添加し、37℃で種々の時間反応せし
め、次いで波長550nｍにおける吸光度変化を測
定した。 その結果、第１０図に示す通りで、測定におい
てラグタイムが認められず、かつ盲検を必要とし
ない、原点を通る良好な直線性を与えるGOT活
性の測定をなし得たものであつた。 実施例 ６ 実施例４と同一の試薬および試薬を用い
て、血清40サンプルを被検液（各50μ）とし
て、実施例４と同様に行なつて各血清中GPT活
性を測定した。 また同一サンプルを用いて、従来のGPT活性
測定法〔UV法：和光純薬(株)キツト、GPT−UV
ワコー〕にて測定した。 両方法の結果に基いて相凾を求めた結果、 γ＝0.998 ｙ＝1.03x＋1.6 で、非常に良好な相凾を示した。またその相凾図
は第１１図に示す通りであつた。 実施例 ７ 実施例５と同一の試薬および試薬を用い
て、血清40サンプルを被検液（各50μ）とし
て、実施例５と同様に行なつて各血清中のGOT
活性を測定した。 また同一サンプルを用いて、従来のGOT活性
測定法〔UV法：和光純薬(株)キツト、GOT−UV
ワコー〕にて測定した。 両方法の結果に基いて相凾を求めた結果、 γ＝0.997 ｙ＝1.01x＋1.1 で非常に良好な相凾を示した。またその相凾図は
第１２図に示す通りであつた。
【図面の簡単な説明】
第１図はＬ−グルタミン酸オキシダーゼ
（H2O2）であるA7700酵素の至適PH曲線を示し、
第２図はＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（H2O2）
であるA8063酵素の至適PH曲線を示し、第３図は
そのA7700酵素およびA8063酵素の熱安定性曲線
を示し、第４図はそのA7700酵素のPH安定性曲線
を示し、第５図はそのA8063酵素のPH安定性曲線
を示し、第６図はそのA7700酵素およびA8063酵
素を用いるＬ−グルタミン酸の定量曲線を示し、
第７図は血清中GPT活性測定曲線を示し、第８
図は血清中GOT活性測定曲線を示し、第９図は
血清中GPT活性測定曲線を示し、第１０図は血
清中GOT活性測定曲線を示し、第１１図はGPT
活性測定における相函図を示し、第１２図は
GOT活性測定における相函図を示す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ Ｌ−グルタミン酸を含有する液体に、少なく
    ともＬ−グルタミン酸に基質特異性を有し、かつ
    Ｌ−グルタミン酸に対する基質特異性の相対活性
    を100％とした場合に実質的に全くＬ−ヒスチジ
    ンに基質特異性を有せず、１モルのＬ−グルタミ
    ン酸、１モルの酸素、１モルの水から、１モルの
    α−ケトグルタル酸、１モルのアンモニアおよび
    １モルの過酸化水素を生成する反応を触媒するＬ
    −グルタミン酸オキシダーゼ（H2O2・ジエネレ
    イテイング）を作用せしめ、次いで消費される酸
    素の量、または生成されるケトグルタル酸、アン
    モニアまたは過酸化水素の量を定量することを特
    徴とするＬ−グルタミン酸の分析方法。 ２ 過酸化水素の量の定量が、過酸化水素と反応
    して検出できる生成物に変化する指示薬組成物で
    ある特許請求の範囲第１項記載の分析方法。 ３ 指示薬組成物が、呈色試薬組成物、蛍光試薬
    組成物または発光試薬組成物である特許請求の範
    囲第２項記載の分析方法。 ４ Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（H2O2・ジ
    エネレイテイング）が、ストレプトマイセス属に
    属するＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（H2O2・
    ジエネレイテイング）生産菌から得られた酵素で
    ある特許請求の範囲第１項記載の分析方法。 ５ Ｌ−グルタミン酸を含有する液体が、Ｌ−グ
    ルタミン酸を遊離、生成する酵素反応系の被検液
    である特許請求の範囲第１項記載の分析方法。 ６ 酵素反応系の被検液が、グルタメイト・ピル
    ベイト・トランスアミナーゼ活性測定系被検液で
    ある特許請求の範囲第５項記載の分析方法。 ７ 酵素反応系の被検液が、グルタメイト・オキ
    ザロアセテート・トランスアミナーゼ活性測定系
    被検液である特許請求の範囲第５項記載の分析方
    法。 ８ 酵素反応系の被検液が、ペプチダーゼ活性測
    定系被検液である特許請求の範囲第５項記載の分
    析方法。
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5942896A (ja) * 1982-08-21 1984-03-09 Yamasa Shoyu Co Ltd Ｌ−グルタミン酸の分析法、分析用試薬および分析用キット
AU565635B2 (en) * 1982-06-29 1987-09-24 Yamasa Shoyu K.K. L-glutamic acid oxidase
JPS6041500A (ja) * 1983-08-12 1985-03-05 Yamasa Shoyu Co Ltd アンモニアの定量法
DE3333453A1 (de) * 1983-09-16 1985-04-11 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt L-aminosaeure-oxidase aus hefen der gattung cryptococcus, ihre herstellung und verwendung
US5464775A (en) * 1991-09-16 1995-11-07 Chimera Research And Chemical, Inc. Method of detecting adulterant in urine
CA2406130C (en) * 2000-04-19 2009-07-07 Yamasa Corporation L-glutamate oxidase
US7297800B2 (en) * 2001-12-27 2007-11-20 Ajinomoto Co., Inc. Process of producing glutamate derivatives
WO2004018672A1 (ja) 2002-08-26 2004-03-04 Ajinomoto Co., Inc. 新規アルドラーゼおよび置換α−ケト酸の製造方法
EP1580268B1 (en) 2002-12-09 2013-10-02 Ajinomoto Co., Inc. Mutant d-aminotransferase and process for producing optically active glutamic acid derivative using the same
US7180370B2 (en) * 2004-09-01 2007-02-20 Micron Technology, Inc. CMOS amplifiers with frequency compensating capacitors
US8426213B2 (en) * 2007-03-05 2013-04-23 Advanced Liquid Logic Inc Hydrogen peroxide droplet-based assays
CN114657088B (zh) * 2022-02-17 2023-10-13 大自然生物集团有限公司 用于催化生产α-酮戊二酸的专用高温菌及催化生产方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5743685A (en) * 1980-08-28 1982-03-11 Banyu Pharmaceut Co Ltd L-glutamic oxidase

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU565635B2 (en) * 1982-06-29 1987-09-24 Yamasa Shoyu K.K. L-glutamic acid oxidase

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5743685A (en) * 1980-08-28 1982-03-11 Banyu Pharmaceut Co Ltd L-glutamic oxidase

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