IT8319856A1 - Acido L-glutammico ossidasi (generatore di H2O2), sua produzione e saggio analitico che lo utilizza - Google Patents
Acido L-glutammico ossidasi (generatore di H2O2), sua produzione e saggio analitico che lo utilizza Download PDFInfo
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Description
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda acido L-glutammico ossidasi (generatore di H2O2) dotato di una attivit? del substrato per acido L-glutammico o L-glutammato (d'ora in avanti generalmente indicato in modo semplice con "acido L-glutammico" o come "L-glutammato") ed una azione enzimatica che catalizza una reazione che forma una molecola di acido ? -chetoglutarico, una molecola di ammoniaca ed una molecola di acqua ossigenata da una molecola di acido L-glutammico, una molecola di ossigeno ed una molecola di acqua, il procedimento per la produzione di acido L-glutammico ossidasi (generatore di H2O2) ed Un metodo analitico che utilizza acido L-glutammido ossidasi (generatore di
L'ossidasi fino ad ora nota avente specificit? del substrato su acido L-glutammico ? solamente L-(+)-glutammato ossido riduttasi avente una azione enzimatica che catalizza una reazione che forma due molecole di acido -chetoglutarico, due molecole di ammoniaca ed una molecola di acqua da due molecole di acido L-glutammico, una molecola di ossigeno ed una molecola di acqua /Biochim. Biophis . Acta, 368, 158-172 (1974) .
Inoltre era fin ad ora nota L-ammino ossidasi avente una specificit? del substrato su acido L-ammino ed una azione enzimatica catalizzante una reazione che forma una molecola di -chetoacido, una molecola di ammoniaca ed una molecola di acqua ossigenata da una molecola di ammino acido, una molecola di ossigeno ed una molecola di acqua. /Tfethods in Enzymology volume II, 204-211 (1955) ed altrij.
In detta tecnica nota L-(+)-glutammato ossido riduttasi catalizza la reazione sopra indicata e non produce acqua ossigenata. Inoltre L-ammino acido ossidasi ? un enzima che catalizza una reazione come sopra indicato e viene quindi prodotta acqua ossigenata. Tuttavia tra L-ammino acido ossidasi della tecnica nota, non ? stato riportato alcun enzima che opera su un substrato di acido L-glutammico. /Methods. in Enzymology volume II, pagg. 204211 (1955)7?
Noi abbiamo trovato che il ceppo Streptomyces A7700 isolato da un campione di suolo di un campo in Saku-shi , Nagano-ken, ed il ceppo Streptomyces A8063 isolato da un campione di suolo in un campo si patate dolci in Naganoaracho, Azuma-gun, Gunma-ken, Giappone, produce l'enzima avente specificit? del substrato su acido L-glutammico e catalizza una reazione che forma una molecola di acido ? -chetoglutarico, una molecola di ammoniaca ed una molecola di acqua ossigenata da una molecola di acido L-glutammico, una molecola di ossigeno ed una molecola di acqua e si ? purificato detto enzima quale singola proteina. Si ? indicato detto enzima come acido L-glutammico ossidasi (generatore di H2O2). E' stato anche messo a punto un nuovo metodo di determinazione di un campione liquido contenente acido L-glutammico utilizzando detto nuvo enzima.
Le caratteristiche tassonomiche del ceppo Streptomyces A7700 e A8063 sono come segue. (A) Ceppo Streptomyces A7700:
I. Osservazione microscopica:
Le osservazioni morfologiche su coltura coltivata su mezzo agar amido-sale inorganico a 30?C per 10-15 giorni, sono come segue.
Furono fatte circa le stesse osservazioni su mezzo agar di farina d'avena ed in mezzo agar estratto di lievito-estratto di malto.
Il micelio del substrato ? curvato, crescita con ramificazione di diametro 0,5-0,6 micron e non presenta alcun oidio di micelio n? supporto di spore.
Il micelio aereo sviluppato sul micelio di substrato ? curvato, sviluppato con ramificazioni semplici, con diametro di 0,6-0,8 micron e forma molte spore di catena. Le catene di spore sono a spirale con 2-3 cerchi e talvolta sono annodate oppure agganciate.
La spora ? ellittica oppure in forma di bastoncino corto con grandezza 0,6-0, 8 x 0,8-1,0 micron con superficie liscia.
Non si ha formazione di spore con flagello e di sporangia.
II. Composizione di acido diamminopimelico:
Viene determinato l'acido L-diamminopimelico e non viene determinato alcun tipo meso nell'analisi completa della cella.
III. Osservazione macroscopica:
Nella tabella I ? riportata l'osservazione in vari mezzi a 30?C per 14 giorni.
Le indicazioni di colore vengono eseguite consultando il "Color Harmony Manual, 4a Edizione, 1958 (.Container Corp. of America)". IV. Caratteristiche fisiologiche:
(1) Temperatura di crescita: 20-40?C
(2) Richiesta di ossigeno: aerobica.
(,3) Liquefazione della gelatina: positiva (molto debole).
(4) Idrolisi dell'amido: positiva.
(.5) Latte scremato: peptoni zzazione : positiva
(.debole).
Coagulazione: negativa.
(6) Formazione del pigmento di melanina: agar Tirosina:
negativo
agar Peptone-estratto di lievito-ferro positivo.
(7) Utilizzazione delle sorgenti di carbonio:
Positiva: L-arabinosio, D-fruttosio, D-glucosio, inositolo, D-mannitolo, raffinosio,
L-ramnosio, saccarosio e D-xilosio.
Come illustrato in precedenza, il ceppo A7700 presenta le caratteristiche tassonomiche di formare micelio aereo con molte catene di spore da vero micelio di substrato, acido diamminopimel ico di tipo L, nessuna formazione di spore flagellari e di sporangia e crescita aerobica ed ? stato cosi assegnato al genere Streptomyces . Questo ceppo viene indicato con Streptomyces sp. A7700 ed ? stato depositato presso il Fermentation Institute, Agency of Industriai Science and Technology, Giappone, con numero di deposito FERM P-6241.
Il ceppo ? stato anche depositato presso 1 'Agricultural Research Service, con il numero di deposito NRRL 15267.
(B) Ceppo Streptomyces A8063:
I. Osservazione microscopica:
L'osservazione morfologica su colture coltivate in agar amido-sale inorganico a 30?C per 10-15 giorni ? come segue. Si osservano circa gli stessi risultati su agar glicerolo-asparagina, su agar di tirosina e su mezzo agar estratto di lievito-estratto di malto.
Il micelio del substrato ? curvato e mostra una crescita con ramificazione, diametro ,5-0,6 micron e non presenta alcun oidio di micelio ne supporti di spore.
Il micelio aereo che cresce sul micelio del substrato ? curvato, e cresce con ramificazioni semplici, diametro 0,6-0,8 micron e porta molte spore di catena.
Le catene delle spore sono abbondanti con andamento a cappio, a gancio o con spirali doppie, mentre pochi presentano spirali triple o superiori.
Le spore sono globose con diametro 0,6-0,8 micron con superficie spinosa. Nessuna formazione di spore flagellari e di sporalgia.
II. Composizione dell'acido diamminopimelico:
Si ? trovato l'acido L-diamminopimelico e non ? stato determinato alcun tipo meso nell'intera analisi della cella.
III. Osservazione macroscopica:
Le osservazioni in vari mezzi a 30?C per 14 giorni sono riportati nella tabella 2. Le indicazioni di colore sono state fatte consultando il "Color Harmony Manual, 4a Edizione, 1958".
IV. Caratteristiche fisiologiche:
(, 1 ) Temperatura di crescita : 15-43 ?C .
( 2 ) Richiesta di ossigeno : aerobico .
( 3 ) Liquefazione della gelatina : positiva (debole ) . ( 4 ) Idrolisi del l ' amido : positiva.
( 5 ) Latte scremato : peptoni zzazione : positiva coagulazione : negativa.
( 6 ) Formazione del pigmento di tipo melanina :
mezzo agar tiolosia e mezzo agar peptone-estratto di lievito-ferro: positiva.
(7) Utilizzazione delle sorgenti di carbonio:
positiva D-fruttosio, D-glucosio, D-mannitolo, L-ramnosio e saccarosio. Debolmente positiva: L-arabinosio, inositolo, raffinosio e D-xilosio. Come precedentemente illustrato, il ceppo A8063 presenta le caratteristiche tassonomiche relative alla formazione di micelio aereo con molte catene di spore da micelio vero di substrato; acido diamminopimel ico di tipo L, nessuna, formazione di spore flagellari e di sporaggio e ' crescita aerobica e si ? pertanto concluso che esso appartiene al genere Streptomyces . Questo ceppo viene indicato con Streptomyces sp. A8063 ed ? stato depositato presso il Fermentation Institute, Agency of Industriai Science and Technology, M.I.T.I., Giappone, numero di deposito FERM P-6242.
Il ceppo ? stato anche depositato presso l 'Agriculturai Research Service, U.S.A., con il numero di deposito NRRL 15268.
Il nuovo enzima acido L-glutammico ossidasi (generatore di H2O2) della presente invenzione ? un enzima che catalizza una reazione che forma una molecola di acido -chetoglutarico, una molecola di ammoniaca ed una molecola di acqua ossigenata da una molecola di acido L-glutammico, una molecola di ossigeno ed una molecola di acqua. Si ? trovato il metodo per determinare e/o quantificare l'acido L-glutammico in un campione contenente acido L-glutammico mediante contatto di un campione liquido contenente acido L-glutammico con acido L-glutammico ossidasi (generatore di H2O2) e misurando Quantitativamente l'ossigeno consumato, o l'acqua ossigenata generata, oppure l'ammoniaca o ? -chetoglutarato corrispondente alla quantit? di L-glutammato in questo sistema di reazione enzimatica.
Uno scopo della presente invenzione consiste nel provvedere un nuovo enzima acido L-glutammico ossidasi (generatore di ?2?2) avente almeno le seguenti caratteristiche biochimiche:
Specificit? del substrato: acido L-glutammico. Azione dell'enzima: catalizza- una reazione che forma una molecola di acido ? -chetoglutarico una molecola di ammoniaca ed una molecola di acqua ossigenata da una molecola di acido L-glutammico , una molecola di ossigeno ed una molecola di acqua,
con la seguente formula (,1)
Un altro scopo della presente invenzione consiste nel provvedere un procedimento per
la produzione di acido L-glutammico ossidasi (generatore di H2O2) che comprende il coltivare
un microorganismo che produce acido L-glutammico ossidasi (generatore di H2O2) appartenente al
genere Streptomyces in un mezzo nutritivo e l'isolare l'acido L-glutammico ossidasi (generatore di H2O2) cos? prodotto?
Un ulteriore scopo della presente invenzione consiste nel provvedere un metodo
di saggio dell'acido L-glutammico che comprende
il porre a contatto un campione liquido contenente acido L-glutammico con acido L-glutammico ossidasi (generatore di H2O2) avehte specificit? del substrato su acido L-glutammico e catalizzare una reazione che genera una molecola di acido ? -chetoglutarico, una molecola di ammoniaca ed una molecola di acqua ossigenata da una molecola di acido L-glutammico, una molecola di ossigeno ed una molecola di acqua e determinare quantitativamente l'ossigeno consumato o l'acido? -chetoglutarico, l'ammoniaca o l'acqua ossigenata generati.
Come per il nuovo acido L-glutammico ossidasi (generatore di H2O2) /? ' ora in avanti indicato con acido L-glutammico ossidasi (?2?2) della presente invenzione, ? sufficiente un enzima caratterizzato dal fatto di presentare una specificit? del substrato ed una azione enzimatica come qui descritto e qualsiasi enzima avente le stesse caratteristiche e propriet? diverse come il punto isoelettrico, il valore di Km, il pH ottimale, la stabilit? al calore, la stabilit? al pH e l'inibizione o l'attivazione da parte di additivi, deve ovviamente essere ? incluso nella presente invenzione.
I microorganismi qui descritti sono solamente illustrativi dei microorganismi che producono il nuovo acido L-glutammico ossidasi ed i microorganismi che producono acido L-glutammico ossidasi H2O2) appartenenti al genere Streptomyces possono essere inclusi nei microorganismi utilizzati secondo la presente invenzione. Generalmente i ceppi dei microorganismi sono facilmente sottoposti a mutazione naturale o artificiale e quindi questi mutanti che presentano attivit? nella produzione di acido L-glutammico ossidasi Possono essere utilizzati secondo la presente invenzione. Inoltre il ceppo che ? stato migliorato mediante la tecnologia della DNA ricombinante per detta produzione dell'enzima pu? essere incluso nella presente invenzione.
L'attuazione del procedimento per la produzione di acido L-glutammico ossidasi (H2O2) mediante detti microorganismi che producono l'enzima appartenente al genere Streptomyces ? come segue.
I microorganismi che producono acido L-glutammico ossidasi (H2O2) appartenenti al genere Streptomyces vengono convenientemente coltivati in un mezzo nutritivo per la produzione degli antibiotici o degli enzimi. Si pu? applicare la coltura solida o liquida, tuttavia ? preferita la coltura con aerazione sommersa per la produzione industriale dell'enzima.
Le sorgenti nutritive per i microorganismi sono mezzi convenzionali per la coltivazione di microorganismi, quali sorgenti di azoto si possono utilizzare sorgenti assimilabili di azoto, ad esempio liquido di macerazione del grano, polvere di soia, peptone, vari estratti di carne, estratti di lievito, solfato di ammonio, cloruro di ammonio, o ammino- acidi come acido L-glutammico . Quali sorgenti di azoto si possono utilizzare sorgenti assimilabili di azoto come saccarosio, glucosio, fruttosio, melassi, estratto di malto o idrolizzato di amido. Inoltre si possono utilizzare vari sali inorganici come cloruro di sodio, cloruro di potassio, solfato di magnesio, fosfato di potassio o diidrogeno fosfatodi potassio o eventualmente agenti antischiuma.
La temperatura di coltura pu? essere variata nell'ambito della produzione di acido L-glutammico ossidasi (H2O2) e crescita del microorganismo ed ? generalmente di 20-35?C e preferibilmente pari a circa 26?C.
Il tempo di coltura pu? variare a seconda delle condizioni ed ? usualmente di 50-120 ore e la coltivazione viene naturalmente bloccata al momento della massima produzione dell 'enzima.
L'acido L-glutammico ossidasi (H2O2) della presente invenzione ? un endo-enzima ed ? incluso nelle cellule.
L'acido L-glutammico ossidasi (?2O2 ) della presente invenzione pu? essere isolato separando le cellule coltivate dal brodo di coltura, sospendendo le cellule umide in soluzione tampone come tampone fosfato, tampone tri-HCl o tampone dimet ilglutarato -NaOH e trattandole per mezzo della pressa di French, mediante ultrasonicazione, mediante trattamento in molino di macinazione o mediante trattamento con l'isozima per ottenere una soluzione greggia dell'acido L-glutammico ossidasi (?2?2). La soluzione viene ulteriormente trattata mediante i metodi noti di isolamento e di purificazione per la proteina e l'enzima per ottenere acido L-glutammico ossidasi
2 2) purificato. Ad esempio la soluzione dell'enzima viene sottoposta a precipitazione con solvente organico mediante aggiunta di un solvente organico come acetone, metanolo, etanolo isopropanolo, oppure a spostamento salino mediante aggiunta di solfato di ammonio ed a cromatografia utilizzando uno scambiatore di ioni come dietil amminoetil cellulosa o dietil amminoetil Sepharose cromatografia di filtrazione di gel, utilizzando gel destrano o gel di poiiacrilammide. L'enzima in polvere purificata pu? essere ottenuto mediante combinazione delle procedure sopra indicate e liofilizzando infine la soluzione dell'enzima.
Il metodo di saggio e le caratteristiche biochimiche dell'acido L-glutammico ossidasi (H2O2) della presente invenzione sono come segue. Il) Metodo di saggio:
La miscela sopra descritta (3,0 mi) fu posta in una cella di quarzo a 37?C, si aggiunse immediatamente e si mescol? con la soluzione dell'enzima 150 ul), fissata nel contenitore della cella a temperatura costante (37?C) dello spettro fotometro, quindi si sottopose ad incubazione per 5 minuti esatti dopo 2 minuti di miscelazione con la soluzione dell'enzima e furono misurate le variazioni nell'assorbimento (.densit? otticaA545 ) a 545 nm.
Attivit? di acido L-glutammico ossidasi (H2O2) (unit?/ml)
rapporto di diluizione
(2) Specificit? del substrato:
Vengono misurate le attivit? relative (%) degli enzimi acido L-glutammico ossidasi (H202) prodotti da Streptomyces sp. A7700 (di seguito indicato come enzima A7700) e mediante Streptomyces sp. A8063 (di seguito indicato come enzima A8063) rispettivamente, su vari substrati in confronto con acido L-glutammico I risultati sono riportati nella Tabella 3. Entrambi gli enzimi presentano attivit? specifica sull?acido L-glutammico e non presentano attivit? su altri amminoacidi come illustrato nella Tabella 3.
Viene utilizzato acido L-glutammico (.0,5 ?moli) quale substrato,
Viene misurata la quantit? di ossigeno consumato, di acido -chetoglutarico generato, di ammoniaca e di acqua ossigenata. Il risultato viene riportato nella tabella 4.
L'ossigeno consumato viene misura tramite un elettrodo ad ossigeno. L'acido? -chetoglutarico generato viene misurato con il metodo al 2,4-dinitrofenilidrazina (,KAGAKU NO RYOIKI, suppl. 33, pagg. 99-104, "Spectofotometria in biochimica", in giapponese). L'ammoniaca viene misurata mediante il metodo all 1indofenolo /J. Biol. Chem., 102, 499 11933)/. L?acqua ossigenata viene misurata mediante metodo di saggio colorimetrico con perossidasi-4-amminoantipirina-fenolo .
Entrambi gli enzimi catalizzano la reazione che forma una molecola di acido ?. -chetoglutarico, una molecola di ammoniaca ed una molecola di acqua ossigenata da una molecola di acido L-glutammico, una molecola di ossigeno ed una molecola di acqua (.formula di reazione /I/).
acido L-glutammico acido ? -chetoglutarico (4) Punto isoelettrico:
Il punto isoelettrico dell'enzima A7700 e dell'enzima A8063 viene determinato mediante il metodo di determinazione isoelettrica
che utilizza l'anfolita di supporto pH 3,5-6,0
(LKB Ine.)? Il punto isoelettrico dell'enzima A7700 ? pari a circa pH 4,3 e quello dell'enzima A8063 ? pari a circa pH 4,1.
(5) Valore Km:
Il valore Km di entrambi gli enzimi contro l'acido L-glutammico ? pari a circa
per enzima A7700 e circa
per l'enzima A8063.
(6) pH ottimale:
Vengono utilizzati tampone glicina
HC1 (pH 2 ,5-4,5), tampone dimetilgutarato-NaOH (.pH 4-7), tampone fosfato IpH 6-8), tampone tris-HCl tpH 7-9) e tampone glicina-NaOH CpH 9-9,5) per la determinazione del pH dell'enzima.
I risultati sono riportati nella fig. 1 per l'enzima A7700 ed in fig. 2 per l'enzima A8063. Nella figura 1: tampone glicina-HCl, x: tampone dimetilglutarato-NaOH, : tampone fosfato, : tampone tris-HCl e : tampone glicina-NaOH. In fig- 2: o: tampone glieina HC1 , x: tampone dimetilglutarato-NaOH, : tampone fosfato, : tampone tris-HCl e : tampone glicina-NaOH. Il pH ottimale di entrambi gli enzimi ? pH 5-7,5.
(.7) Stabilit? al calore:
Gli enzimi A7700 e A8063 disciolti in tampone fosfato 20 mM (pH 7,0) vengono sottoposti ad incubazione a varie temperature per 10 minuti e vengono immediatamente raffreddati in ghiaccio-acqua fredda, quindi viene saggiata l'attivit? residua.
I risultati sono riportati nella fig. 3, nella quale : enzima A7700 e o: enzima A8063. Entrambi gli enzimi sono stabili fino a 45?C e vengono denaturati a 70?C.
( 8 ) Stabil it? al pH :
Viene misurata la stabilit? al pH dell'enzima A7700 (fig. 4) e dell'enzima A8063 (fig. 5) in diverse soluzioni tampone.
Gli enzimi vengono disciolti in concentrazione di 40 mM ih ciascuna soluzione tampone, sottoposti ad incubazione a 37?C per 60 minuti ed immediatamente raffreddati e viene misurata l'attivit? residua a ciascun pH.
La soluzione tampone per ciascun pH ?: tampone glicina-HCl (pH 2,5-4,5, o in fig. 4 e 5), tampone dimetilglutarato-NaOH (pH 4-7,5, in fig. 4 e 5), tampone fosfato (pH 6-8, in fig. 4 e 5), tampone tri-HCl (pH 7-9, in fig. 4 e 5) e tampone glicina-NaOH (pH 9-9,5, in fig. 4 e 5).
L'enzima A7700 ? stabile a pH 4,5-7,5 (fig. 4) e l'enzima A8063 ? stabile a pH 47,5 (fig- 5).
(.9) Effetto degli ioni metallici:
L'effetto degli ioni metallici viene riportato nella Tabella 5, nella quale ioni diversi da non mostrano effetto sugli enzimi.
L'effetto di varie sostanze sulla attivit? enzimatica viene riportato nella Tabella 6. Non viene evidenziato alcun effetto di EDTA in quanto entrambi gli enzimi non sono metanoenzimi. Inoltre entrambi gli enzimi non vengono inibiti da e non vengono influenzati da FAD e FMN.
Come sopra illustrato l'enzima A7700 e l?enzima A8063 presentano specificit? del substrato su acido L-glutammico e catalizzano una reazione che forma 'una molecola di acido ?? -chetoglutarico, ed una molecola di acqua ossigenata da una molecola di acido L-glutammico, una molecola di ossigeno ed una molecola di acqua e costituiscono nuovi enzimi acido L-glutammico ossidasi (generatore di H2O2).
Il nuovo enzima acido L-glutammico
ossidasi Pu? essere utilizzato per l'analisi di campioni liquidi contenenti acido L-glutammico quantificato, la quantit? di ossigeno consumato, di acido di ammoniaca
0 di acqua ossigenata generati.
Un campione liquido da saggiare secondo il procedimento della presente invenzione
pu? essere un campione liquido contenente acido
L-glutammico. Si possono ad esempio menzionare
campioni di reagente acido L-glutammico, liquido
di fermentazione di acido L-glutammico, bevande contenenti acido L-glutammico e campioni per
il saggio dell'attivit? enzimatica o la determinazione del substrato in un sistema di reazione
enzimatica che forma o genera acido L-glutammico
o che consuma acido L-glutammico quale substrato.
Esempi di sistemi di reazione enzimatica sono come segue, in cui ? acido -chetoglutarico e L-GA ? acido L-glutammico.
* Glutammato-piruvato transaminasi (.GPT):
* Glutammato-ossalo acetato transaminasi (.GOT):
* Cisteina-amminotransf erasi (.CAT ase )
* Tirosina-amminotransf erasi ( TATase ) :
* Leucina amminotransferasi (.LATase):
* Chinureina amminotrasferasi (KATase):
* Amminobutilato amminotransferasi (AATase):
*? -glutammiltranspeptidasi ( -GPT):
(.X) : gruppo di trasferimento come acido glutammilaramino)
* Glutammato racemasi IGRase):
Questi sistemi di reazione enzimatici sono illustrativi solamente e non sono
da considerarsi limitativi per il metodo di
saggio della presente invenzione. Inoltre il
saggio dell'attivit? dell'enzima o della quantit?
di substrato pu? essere determianto quantificando
l'acido L-glutammico generato o liberato.
* Amminoacido acetil transferasi tAAATase):
* Glieina amminotransferasi (.GLATase):
* Glutammato decarbossilasi (.GDase):
* ? -glutammilcisteina sintetasi (. -GLCSase):
I sistemi di reazione enzimatici sopra riportati sono solamente illustrativi e non
limitativi per il campione da saggiare. In
questa reazione enzimatica l'acido L-glutammico consumato quale substrato viene misurato
saggiando l'attivit? enzimatica.
Nel metodo di saggio della presente
invenzione l'acido L-glutammico ossidasi (H2O2
viene sottoposto a reazione con il campione
liquido contenente acido L-glutammico. Acido
L-glutammico ossidasi (H2O2) pu? essere una
soluzione dell'enzima disciolta in un tampone
a pH stabile, un enzima intrappolato o microincapsulato che conserva l'enzima senza denaturazione oppure un enzima immobilizzato per mezzo
ad esempio di un legame co-valente con una resina
un polisaccaride o un vetro inorganico.
La quantit? di acido L-glutammico
ossidasi (H2O2) pu? essere variata in dipendenza
della quantit? del campione liquido e del tempo
di reazione ed ? preferibilmente di 2-10 unit?.
Maggiore attivit? specifica dell'enzima utilizzato ? preferibile, tuttavia, non sempre ? richiesta la purezza pi? elevata per 1'enzima.
La quantit? di campione liquido contenente acido L-glutammico non ? limitativa ed il campione viene eventualmente preparato con o senza diluizione.
Mediante questa procedura l'acido L-glutammico ossidasi (H2O2 ) viene sottoposto a reazione con detto campione liquido e la miscela di reazione viene sottoposta ad incubazione per un tempo ed una temperatura costanti, ad esempio per da 5 a 10 minuti a circa 37?C per consumare una molecola di ossigeno e generare una molecola di acido -chetoglutarico , una molecola di ammoniaca ed una molecola di acqua ossigenata per ogni molecola di acido L-glutammico .
Viene quantificata la quantit? di detti ossigeno, acido^-chetoglutarico , ammoniaca o acqua ossigenata. L'ossigeno viene preferibilmente determinato quale valore elettrico mediante l'elettrodo ad ossigeno. L'acido^ -chetoglutarico viene preferibilmente determinato mediante saggio colorimetrico con il metodo dell1idrazina con 2,4-dinitrofenilidrazina (assorbimento a 415 mM o 530 mM). L'ammoniaca pu? essere determinata quali valori elettrici mediante l'elettrodo ad ammoniaca oppure l'elettrodo ad ioni dopo conversione in ioni ammonio o mediante il metodo dell'indofenolo. L?acqua ossigenata viene misurata mediante l'elettrodo ad acqua ossigenata o mediante indicatore che reagisce con l'acqua ossigenata per formare una composizione determinabile. Attuazioni dell'indicatore sono indicatori di colore che producono variazioni visibili, indicatori di fluorescenza che formano fluorescenza mediante raggi ultravioletti , o composizioni luminescenti. Esempi di indicatore di colore ? una composizione che comprende una sostanza per ossidasi attiva ed un precursore del pigmento. Viene preferibilmente utilizzato per ossidasi di rafano e la combinazione di un elettron accettore, derivato del fenolo e derivato dell'anilina. Esempi di accettori di elettroni sono 4-amminoantipirina, 4-ammino-3-idrazino-5-mercapto-l ,2,4-triazolo , 2--idrazinobenzotiazolo , 3-metil-2-benzot iazolon idrazone e 2-amminobenzotiazolo. Esempi di derivati del fenolo o dei derivati dell'anilina sono fenolo, sale sodico dell'acido p-idrossibenzoico, p-clorofenolo , 2,4-diclorofenolo, 4,6-dicloro-o-cresolo , 2,4-dibromofenolo , N,N--dimetilani lina, ?,?-dietilanilina, N,N-dimetil--m-toluidina, N,N-dieti1-m-toluidina , N,N-dimeti1-m-metossi toluidina, N,N-dietano1~m-toluidina, 3-metil-N-etil-N-idrossietilanil ina, N-etil--N- (3-metilfenil)-N-acetiletilendiammina, sodio N-etil-N-idrossietil-m- toluidina, N-etil-N-solfopropil-m-toluidina , sodio N-etil-N-(2-idrossi-3-solfopropil )-m-toluidina o m-acetoammino-N , N-dietilanilina. Il complesso di colori di 4-amminoantipirina e derivato del fenolo pu? essere misurato a 500-520 nM ed il complesso di 4-amminoantipirina e del derivato dell'anilina pu? essere misurato a 535-580 nm. Esempi di substrato fluorescente in fluorometria e luminometria sono bis(2,4,6-triclorofenol )ossalato, feniltioidantuina, acido ovovanillico, acido 4-idrossifenilacetico , vanillil-ammina, 3-metossitirammina, fluoretina, ordenina, luminolmonoanione , lucigenina o "waffin". Queste sostanze, possono eventualmente essere utilizzate unitamente ad un accettore di elettroni e una sostanza attiva perossidasi per la determinazione di acqua ossigenata. Nel reattivo indicatore che si trasforma nella sostanza determinabile mediante reazione con acqua ossigenata, la quantit? di perossidasi utilizzato ? ad esempio superiore a 0,1 unit? per un saggio, preferibilmente 1-10 unit?.
Poich? l'acettore di elettroni come 4-amminoant ipirina o derivati del fenolo o derivati dell'anilina reagiscono e consumano rispettivamente una molecola, in confronto con due rapporti molecolari dell'acqua ossigenata, queste sostanze devono essere utilizzate in una quantit? in eccesso rispetto all'acqua ossigenata generata e preferibilmente in eccesso oltre 5 molare rispetto alla quantit? di acqua ossigenata.
Questi reagenti vengono preferibilmente mescolati e preparati in soluzioni, oppure mescolati con una soluzione di acido L-glutammico ossidasi (H2O2) oppure possono essere preparati in forma di fase solida che viene posta sotto forma di strato su film di resine sintetica o su carta da filtro. Inoltre l'elettrodo con l'enzima collegato all'acido L-glutammico ossidasi (H2O22) immobilizzato viene preferibilmente utilizzato nel caso di determinazione mediante mezzi elettrici .
La quantit? di acido L-glutammico in un campione pu? essere calcolata dalla curva di taratura della quantit? cos? quantificata di ossigeno, acido ? -chetoglutarico, ammoniaca ed acqua ossigenata.
Gli esempi che seguono sono illustrativi per la presente invenzione ma non devono essere intesi limitativi.
Esempio 1
Un mezzo (100 mi, pH 7,0) comprendente 0,5% di peptone, 0,3% di estratto di carne, 0,1% di estratto di lievito e 0,5% di estratto di malto in un pallone da 500 mi di Erlenmeyer fu sterilizzato a 120?C per 20 minuti. Una coltura di 4 giorni di Streptomyces sp. A7700 FERM P-6241 fu inocculata e coltivata a 26?C per 4 giorni . Le cellule coltivate ottenute mediante centrifuga furono macinate con sabbia di quarzo in un mortaio. L'enzima fu estratto aggiungendo tampone fosfato 20 mM (pH 7,0) e l'estratto fu raccolto. L'acido L-glutammico ossidasi (H2O2) nel brodo di coltura fu calcola to pari a 0,13 U/ml.
Esempio 2
Nell'esempio 1 lo Streptomyces sp. A7700 FERM P-6241 fu sostituito da Streptomyces sp. A8063 FERM P-6242. L'acido L-glutammico ossidasi (H2O2) ne* br?do di coltura fu calcolato pari a 0,59 U/ml.
Esempio 3
Due palloni da 500 mi di Erlenmeyer contenenti ciascuno 100 mi del mezzo comprendente 0,5% di peptone , 0,3% di estratto di carne, 0,1% di estratto di lievito e 0,5% di estratto di malto, furono sterilizzati a 120?C per 20 minuti. Streptomyces sp. A8063 FERM P-6242 fu inocculato in detto mezzo e coltivato a 26?C per 3 giorni.
Queste colture di semina 1200 mi) furono inocculate in un mezzo (.20 1, pH 7,0) comprendenti 0,5% di peptone, 0,3% di estratto di carne, 0,1% di estratto di lievito e 0,5% di estratto di malto, in un fermentatore da 30 1 che ? stato precedentemente sterilizzato a 120?C per 20 minuti e furono coltivate a 26?C con aerazione 20 l/minuto a 300 giri per minuto quale agitazione per 96 ore. Il brodo coltivato fu centrifugato a 5000 giri/minuto per 5 minuti per ottenere le cellule coltivate. Le cellule furono sospese in tampone fosfato 20 mM 131, pH 7,0) e macinate mediante un Dyno-Mill (nome commerciale Dyno-Mill).
Willy A. Bachofen Manufact. Engineers, Svizzera). Le cellule macinate furono centrifugate a 5000 giri per minuto per 15 minuti per ottenere la soluzione della supernatante di 2,82 litri (11.200 unit?).
Fu aggiunto solfato di ammonio alla soluzione del supernatante e furono raccolte le frazioni precipitate a saturazione 0,4-0,53. Il precipitato disciolto in tampone fosfato 20 mM
(pH 7,0) fu posto in un tubo di cellophane e dializzato contro tampone fosfato 20 mM (pH 7,0, 12 litri) per 20 Minuti. Il dializzato fu caricato in una colonna (50x400 m/m) riempita con DEAE-sepharose CL-6B ed eluito con gradiente lineare di KC1 0 - 0,7 M in tampone fosfato 20 mM (pH 7,0). Le frazioni eluite con KC1 0,5 M (130 mi, 6690 uni-. t?) furono dializzate con tubo di cellophane contro 6 litri di tampone fosfato 20 mM per 18 ore. Il dializzato fu concentrato sotto vuoto (fino a 15 mi). Il concentrato fu caricato in una colonna di sepha rose CL-6B e fu eluito con tampone fosfato 10 mM (pH 7,0) per ottenere 11eluito (80 mi, 5900 unit?).
L'eluito fu concentrato mediante ultrafiltrazione fino a 8 mi e fu ancora caricato in una colonna di Sepharose CL-6B, quindi eluito mediante la stessa soluzione tampone per ottenere 1'eluito (60 mi, 4890 unit?). L'eluito fu liofilizzato per dare acido L-glutammico ossidasi (H2O2) (78,9 mg, 58,2 U/mg, 4595 unit?).
Esempio 4
Un mezzo (pH 7,0, 20 litri) comprendente o,5% di peptone, 0,3% di estratto di carne, 0,1% di estratto di lievito e 0,5% di estratto di malto, fu inoculato in una camera di fermentatore da 30 Litri e sterilizzato a 120?C per 20 minuti. La coltura di semina (200 mi) di Streptomyces sp. A7700 FERM P-6241 coltivata per tre giorni nello stesso mezzo, fu inoculata nel mezzo sopradescritto e coltivata con coltura sommersa a 26?C per 96 ore, con aerazione asettica di 20 lt/minu to e con agitazione 300 giri per minuto. Il brodo coltivato fu separato con centrifuga a 5000 giri per minuto per 5 minuti e le cellule ottenute furono sospese in tampone fosfato 20 mM (pH 7,0, 3 Litri), quindi rotte mediante Dyno-Mill. Le cellule rotte furono centrifugate a 5000 giri/minuto per 15 Minuti per ottenere la soluzione del supernatante (2,84 litri, 2950 unit?). Fu aggiunto solfato di ammonio ed il precipitato fu raccolto a saturazione di 0,47-0,61. Il precipitato fu disdiolto in tampone fosfato 20 mM (pH 7,0) e dializzato in tubo di cellophane contro tampone fosfato mM (pH 7,0) per 20 ore. Il dializzato fu caricato in una colonna di DEAE-sepharose CL--6B ed eluito con gradiente lineare di eluizione con KC10 - 0,7 M in tampone fosfato 20 mM (pH 7,0). Fu raccolto l'eluito a circa 0,5 M di KG1, fu dializzato attraverso tubo di cellophane contro..tampone fosfato 10 mM (pH 7,0) per 18 ore e fu concentrato. Quindi il dializzato fu caricato in una colonna di Sepharose CL-6B e 1'eluito fu concentrato. Fu ripetuta la cromatografia in colonna di Sepharose CL-6B e l'eluito fu liofilizzato per ottenere polvere di acido L--glutammico ossidasi (H2O2) (22,0 mg, 49,5 unit?/ /mg, 1080 unit?).
Esempio 5
(Determinazione quantitativa di acido L-glutammico) : tampone fosfato 40 mM (pH 6 , 5 )
4-amminoantipirina 0,03%
N,N-dimetil-m-toluidina 0,04%
perossidasi 2 U/ml
acido L-glutammico ossidasi (H2O2 )2U/ml
La miscela di reazione (3,0 mi) che prece de fu miscelata in quantit? 1/1, 3/4, 1/2, 1/4, 1/5 e 1/10 con soluzione diluita di acido L-glutammico 10 mM (50 ?l) rispettivamente e fu sottoposta ad incubazione a 37?C per 120 minuti. Dopo incubazione la miscela di reazione fu misurata colorimetrica a 545 nm.
I risultati sono riportati nella figura 6. Nella figura, o mostra l'acido L-glutammico ossidasi (H2O2) ottenuto nell'esempio 3 e mostra l'acido L-glutammico ossidasi (H2O2) ottenuto nell'esempio 4.
I risultati di entrambi gli enzimi sono del tutto identici l'uno rispetto all'altro e si ottiene una buona linearit? tra la quantit? di acido L-glutammico ed il rapporto di assorbimento.
Gli esempi che seguono vengono condotti utilizzando acido L-glutammico ossidasi (H2O2) ottenuto nell'esempio 3.
Esempio 6
(saggio di siero GPT):
acido L-glutammico ossidasi (H2O2) ? unit?/ml La miscela di reazione che precede (1,0 mi) fu raccolta in piccoli tubi di saggio e fu sottoposta a pre-incubazione a 37?C. Fu aggiun to siero (50 ul,.con:diluizione rispettivamente 1/1, 3/4, 1/2; 1/4, 1/10) e fu sottoposta ad incubazione per 20 minuti esatti a 37?C. Fu aggiunto il tampone di Mcllvain 0,1 M (pH 5,5, 2,0 mi), e fu eseguita la misura colorimetrica a 545 nm. Quale controllo fu utilizzata detta miscela di reazione dalla quale era stata allontanata L-alanina. I risultati sono riportati nella figura 7 nella quale il siero GPT pu? essere esattamente saggiato.
Esempio 7
(saggio del siero G0T):
' La miscela di reazione (1,0 mi) consistente della composizione sopra indicata fu racco! ta in piccoli tubi da saggio e fu sottoposta a preincubazione a 37?C. Fu aggiunto siero (diluizione 1/1, 3/4, 1/2, 1/4, 1/10) (50 ul) e si sottopose ad incubazione a 37?C esattamente per 20 minuti. Fu aggiunto il tampone di Mcllvain 0,1 M (pH 5,5, 2,0 mi) e si esegui la determinazione colorimetrica a 545 nm. Fu usato quale controllo una miscela,-di reazione derivante dalla miscela sopra indicata priva dell'acido L-aspartico.
I risultati sono riportati nella tabella 8 secondo la quale il siero G0T pu? essere saggia to in modo esatto.
Esempio 8
(saggio del siero GPT):
(reagente I)
Il reagente I (1 mi) fu introdotto
in una .cella di quarzo. Fu aggiunto siero (50 ?l ) e si sottopose ad incubazione a 37?C per 5 minuti. Fu aggiunto il reagente II (0,1 mi), sottoposto a pre-incubazione a 37?C e si sottopose ad incubazione a 37?C per tempi variabili, quindi fu eseguita la determinazione colorimetrica a 550 mn.
I risultati sono riportati nella figura 9, nella quale non si rileva alcun ritardo del.tempo nel saggio del siero GPT ed una buona curva di calibrazione lineare che incrocia il punto 0.
In questo metodo di saggio la reazione non specifica ed il tempo di induzione vengono elimi^ nati nel primo stadio della reazione e quindi non ? richiesto nessun saggio di controllo.
Esempio 9
(saggio del siero GOT)
(reagente I)
(reagente II)
4-amminoantipirina 15 mM
Il reagente I (1,0 mi) fu introdotto in una cella di quarzo e fu aggiunto siero (50 pi) si sottopose quindi ad incubazione a 37?C per 5 minuti. Il reagente II (0,1 mi), sottoposto a pre-incubazione a 37?C, fu aggiunto alla miscela di reazione e si sottopose ad incubazione a 37fiC a varie temperature, si misur? quindi colorimetricamente a 550 nm.
I risultati sono riportati snella figura 10 nella quale non si osserva alcun tempo di induzione e non ? richiesto alcun esperimento di controllo. Come illustrato nella figura 10, si ottiene una buona curva di calibrazione lineare per il saggio di G0T che incrocia il punto zero.
Esempio 10
Nell'esempio 8 furono utilizzati gli stessi reagenti I e II ed il campione di siero fu sostituito con 40 campioni di siero (ciascuno di 50 pi) per saggiare l'attivit? del siero GPT.
Inoltre gli stessi campioni furono saggiati utilizzando il metodo della tecnica nota (metodo -UV, Wako Pure Chem. Co., kit di saggio GPT-UV WAKO).
La correlazione calcolata dai risultati di entrambi 1 metodi ? come segue:
in cui viene ottenuta una buona linearit?. La curva di correlazione viene riportata nella figura 11.
Esempio 11
L'attivit? del siero GOT viene saggiata in accordo con il metodo dell'esempio 9, con 40 campioni di siero (ciascuno di 50 ?l).
Gli stessi campioni furono saggiati utilizzando il metodo di saggio GOT della tecnica no ta (metodo-UV, Wako Pure Chem. Co., Kit GOT-UV WAKO)
La correlazione da entrambi i risultati ?:
in cui una buona curva di correlazione viene ottenuta come illustrato nella figura 12.
Breve descrizione dei disegni:
Fig. 1: curva del pH ottimale dell'enzima A7700, Fig. 2: curva del pH ottimale dell'enzima A8063, Fig. 3: curva di stabilit? al calore dell'enzima A7700 e A8063,
Fig. 4: curva di stabilit? al pH dell'enzima A7700, Fig. 5: curva di stabilit? al pH dell'enzima A8063, Fig. 6: curva di calibrazione dell'acido L-glutammi co utilizzando l'enzima A7700 a A8063,
Fig. 7: curva di calibrazione del siero GPT,
Fig. 8: curva di calibrazione del siero GOT,
Fig. 9: curva di calibrazione del siero GPT,
Fig.10: curva di calibrazione del siero GOT,
Fig.11: curva di correlazione nella attivit? del sie ro GPT, e
Fig.12: curva di correlazione nella attivit? del sie ro GOT
Claims (14)
1. - Nuovo acido L-glutammico ossidasi (generatore di H2O2) avente almeno le seguenti ca ratteristiche biochimiche:
1) Specificit? del substrato: acido L-glutammico 2) Azione dell'enzima: catalizza una reazione che forma una molecola di acido alfa-chetoglutarico, una mo lecola di ammoniaca e una molecola di acqua ossigenata da una molecola di acido L-glutammico, una molecola di ossigeno ed una molecola di acqua, con la formula che segue (I)
2. - Acido L-glutammico ossidasi (generatore di H2O2) secondo la rivendicazione 1, in cui detto enzima presenta:
(i) un punto isoelettrico pari a circa pH 4,3 (misurato mediante anfolita di supporto pH 3,5-6,0), (i i) un Km per L-glutammato pari a circa 5,6x10?4 M, (iii) un pH ottimale pari a circa pH 5 - 7,5, (iv) una stabilit? al calore fino a circa 55?C, e (v) una stabilit? al pH pari a circa pH 4,5-7,5.
3. - Acido L-glutammico ossidasi (generatroe di H2O2) secondo la rivendicazione IV in cui detto enzima presenta:
(i) un punto isoelettrico pari a circa pH 4,1 (misurato mediante anfolita di supporto pH 3,5-6,0), (ii) un Km per L-glutammato pari a circa 1,1x10-3M, (iii) un pH ottimale pari a circa pH 5 - 7,5,
(iv) una stabilit? al calore fino a circa 55?C, e (v) una stabilit? al pH pari a circa pH 4 ? 7,5.
4. - Procedimento per la produzione di un nuovo acido L-glutammico ossidasi (generatore di H2O2) che comprende il coltivare i microorganismi che producono acido L-gl?tammico ossidasi (generatore di H2O2) appartenenti al genere Streptomyces in un mezzo nutritivo e l'isolare l'acido L--glutammico ossidasi (generatore di H2O2) cos? prodotto.
5. - Procedimento secondo la rivendicazione 4, in cui il microorganismo che produce acido L-glutammmico ossidasi (generatore di ) appartenente al genere Streptomyces ? Streptomyces sp.
A77O0 FERM P-6241.
6. - Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui il mieroorganismo che produce acido L-glutammico ossidasi (generatore di H2O2) appartenente al genere Streptomyces ? Streptomyces A8063 FERM P-6242.
7. - Metodo per determinare acido L-glu--.' tammico o L-glutammato, detto metodo comprendendo: il porre a contatto in un mezzo acquoso un campione contenente acido L-glutammico per l'analisi ed acido L-glutammico ossidasi (generatore di H2O2) che presenta specificit? del substrato per acido L-glutammico e che catalizza una reazione che for=? ma una molecola di acido alfa-chetoglutarico, una molecola di ammoniaca ed una molecola di acqua ossigenata da una molecola di acido glutammico, una molecola di ossigeno ed una molecola di acqua, ed il determinare quantitativamente l'ossigeno consumato, oppure l'acido alfa-chetoglutarico, l'ammonia ca o l'acqua ossigenata generati.
8. - Metodorsecondo la rivendicazione 7, in cui la determinazione quantitativa dell'acqua ossigenata viene condotta mediante indicatore che dimostra una variazione determinabile per reazione con l'acqua ossigenata.
9. - Metodo secondo la rivendicazione 8, in cui detto indicatore ? una composizione di reagente colorante, reagente fluorescente o reagente luminescente.
10. - Metodo secondo la rivendicazione 7, in cui l'acido L-glutammico ossidasi (generatore di ?2O2) ? un enzima ottenuto dal microor-2 2
ganismo che produce acido L-glutammico ossidasi (generatore di H2O2) appartenente al genere Streptomyces/
11. - Metodo secondo la riv?ndic?zione 7, in cui il campione liquido contenente L--glutammico ? un campione liquido del sistema di reazione dell'enzima che libera o genera acido L-glutammico . .
12. - Metodo seoondo la rivendicazione 11, in cui detto campione liquido del siste ma di reazione d?li'enzima ? un campione per il saggio dell'attivit? di glutammato-piruvato transaminasi .
13. - Metodo secondo la rivendicazione 11, in cui detto campione liquido del siste ma di reazione dell'enzima ? un campione per il saggio dell'attivit? di glutammato-ossaloaceta ? to transaminasi.
14. - Metodo secondo la rivendicazione 11, in cui detto campione liquido del sistema di reazione dell'enzima ? un campione per il saggio dell'attivit? di peptidasi.
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