CN114657088B - 用于催化生产α-酮戊二酸的专用高温菌及催化生产方法 - Google Patents
用于催化生产α-酮戊二酸的专用高温菌及催化生产方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114657088B CN114657088B CN202210151384.1A CN202210151384A CN114657088B CN 114657088 B CN114657088 B CN 114657088B CN 202210151384 A CN202210151384 A CN 202210151384A CN 114657088 B CN114657088 B CN 114657088B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- catalysis
- hours
- temperature
- fermentation
- reaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 44
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 32
- HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxyglutaric acid Natural products OC(=O)C(O)CCC(O)=O HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 22
- 229940009533 alpha-ketoglutaric acid Drugs 0.000 title claims abstract description 22
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 20
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 title abstract description 12
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 68
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 68
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 33
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims abstract description 29
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 14
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 claims abstract description 13
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims abstract description 7
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 48
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 36
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 27
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 27
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 24
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 19
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 10
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 9
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 9
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 claims description 9
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 claims description 9
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 claims description 9
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 9
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 8
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 8
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 7
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 7
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 7
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 claims description 7
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 7
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 7
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 claims description 6
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 claims description 6
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 17
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 abstract description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 8
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 2-oxoglutarate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC(=O)C([O-])=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 11
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 9
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 8
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 8
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 8
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 3
- 241001147825 Actinomyces sp. Species 0.000 description 3
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 239000000498 cooling water Substances 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000336985 Streptomyces thermospinosisporus Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 231100000481 chemical toxicant Toxicity 0.000 description 1
- -1 gravel Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003864 humus Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 241001446247 uncultured actinomycete Species 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
- C12P7/50—Polycarboxylic acids having keto groups, e.g. 2-ketoglutaric acid
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于催化生产α‑酮戊二酸的专用高温菌及催化生产方法。该菌是Streptomyces sp.TC2303，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年12月27日，保藏编号为CCTCC NO：M20211682。本发明提供的菌株Streptomyces sp.TC2303的培养及发酵条件均在45℃左右，发酵时间仅为24小时，发酵时间较短；利用其发酵液能在45℃～56℃下催化L‑谷氨酸生产α‑酮戊二酸，转化过程温度均在45℃以上，催化温度远高于现有技术，总反应时间仅为18小时，催化过程不易发生杂菌污染，针对设备简陋、容易发生杂菌污染的企业，本发明具有特殊的优势。
Description
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种用于催化生产α-酮戊二酸的专用高温菌及催化生产方法。
背景技术
α-酮戊二酸在食品、化工等领域有着广泛的应用。目前工业化生产α-酮戊二酸的方法均为化学合成法，由于该方法生产过程涉及到一些有毒化学品，因此其产品在食品领域的应用有一定的困难。
我国是谷氨酸生产大国，目前谷氨酸的生产能力过剩。有关利用酶催化法将谷氨酸转化α-酮戊二酸的方法，在国内外均有一定的报道。生物催化过程一般首先要培养微生物菌种，培养菌体的过程是一个大量产能过程，需要用冷却水进行降温，在夏天的南方地区往往由于室外水温过高导致无法生存；并且由于生物来源的酶，一般作用温度均与微生物生长的温度相当，因此生产过程需要防止发生杂菌污染。一般微生物发酵类型的企业在防止杂菌污染方面有一定的技术防范，但从事生物催化的企业往往注重于化学方法，因此杂菌污染往往成为其技术瓶颈。
目前利用酶催化法将谷氨酸转化为α-酮戊二酸的生产工艺，普遍存在催化生产工艺温度低、容易发生杂菌污染的问题，微生物菌种、微生物菌种产谷氨酸氧化酶(LGOX)的能力、以及谷氨酸氧化酶(LGOX)催化谷氨酸形成α- 酮戊二酸的能力是催化生产工艺的关键。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种在45℃下快速生长、其发酵液能在45℃～56℃下催化谷氨酸生产α-酮戊二酸的专用高温菌及利用该菌进行α-酮戊二酸生产的方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：提供用于催化生产α-酮戊二酸的专用高温菌，该菌是一种高温放线菌，Streptomyces sp.TC2303，简称TC2303，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为 2021年12月27日，保藏编号为CCTCC NO：M20211682。
高温放线菌TC2303的获得方法如下：
(1)耐高温放线菌的自然界筛选：首先在云南省腾冲火山地热国家地质各温泉口大量采集土壤、砂砾及腐殖质等，带回实验室将上腐材料在50～60℃下进行液体摇瓶培养，一般为24小时。培养基如下：葡萄糖200g，酵母粉1 g，玉米浆5g，加水至1L，121℃灭菌15min。随后将培养液适当稀释后涂布于固体培养基上，在55℃培养3天。上述固体培养基如下：谷氨酸钠：10g，蛋白胨2g，酵母氮基3g，琼脂粉15g，加水至1L，用氢氧化钠或盐酸调整pH至7.5左右。收集平板上形成的菌落，点种到新的固体培养基上，培养 24小时后采用Trinder试剂检测法，将试剂喷洒在平板上，静止培养几小时后，菌落本身及周围出现紫红色的为产生LGOX的菌种，操作方法同文献(刘佳,徐继嗣,罗秋玲,陈修来,刘立民.谷氨酸氧化酶高产菌株的筛选鉴定及催化生产α-酮戊二酸.生物加工过程,2017,15(3):18-24)。一共点种了约10万个菌落，获得2000个在菌落周围形成较大紫红色圈的菌落。将上述菌落划线分离后进行摇瓶发酵。摇瓶发酵培养基如下：葡萄糖10g，酵母粉5g，硝酸铵3g，磷酸二氢钾1g，氯化钙0.1g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.01g，谷氨酸钠10g，用盐酸或氢氧化钠调整pH到7.5左右，加水至1L，110℃灭菌10min。一般是采用500mL三角瓶加入100mL上述发酵培养基。在45℃摇瓶培养，24小时后间隔12小时检测发酵液中高端LGOX酶活，检测方法为Trinder反应法，同文献(刘佳,徐继嗣,罗秋玲,陈修来,刘立民.谷氨酸氧化酶高产菌株的筛选鉴定及催化生产α-酮戊二酸.生物加工过程,2017,15(3):18-24)。经摇瓶发酵共计获得179株发酵酶活在1U/mL以上的菌种。
(2)催化工艺的建立：初始转化体系如下：30g谷氨酸钠，1mmol/L硫酸锰，1mmol/L硫酸镁，pH6.5，加入上述179株发酵液及水，根据发酵液酶活控制LGOX酶活在0.3U/L，45℃反应24小时。间隔6小时用HPLC法检测反应液中α-酮戊二酸的量。结果显示，反应液中α-酮戊二酸在0.5-5.3g/L。最高点均出现在18小时或24小时的时候，其中一株编号为TC1181的菌株的产量最高为5.3g/L。进一步通过温度变化、反应液调整等方法优化反应条件，发现其中一株编号为TC2303的菌株的发酵液，在特定条件下其催化的反应液中α-酮戊二酸的量达到19g/L，远超其他菌株，其他菌株在所试验的各种条件下，其α-酮戊二酸的产量均未超过10g/L。上述发现的针对TC2303的反应条件如下：初始反应液为：30g谷氨酸钠，0.1mmol/L硫酸锰，0.1mmol/L硫酸镁，加入发酵液及水，用氢氧化钠或盐酸调整pH为6.5。根据发酵液酶活控制 LGOX酶活在0.3U/L。上述初始反应体系在45℃反应5小时，随后将温度提升到56℃，并再添加硫酸镁至终浓度为2mmol/L，维持5小时，再将温度降低到49℃，反应至终点，总计反应18小时。
(3)菌株TC2303发酵条件的优化：初始发酵条件下，TC2303的发酵酶活较低，一般为1.2U/L左右。为了获得更多的酶以有利于后期催化，对发酵培养基及发酵温度进行了一定的调整，调整后的发酵培养基如下：葡萄糖20g，酵母粉5g，硝酸铵3g，磷酸二氢钾1g，氯化钙0.1g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.01g，玉米浆1g，用盐酸或氢氧化钠调整pH到7.5左右，加水至1L， 110℃灭菌10min。一般是采用500mL三角瓶加入100mL上述发酵培养基，发酵温度依然为45℃。在上述新的发酵条件下，发酵24小时后发酵液中 LGOX的酶活可以达到3.6U/L。
(4)转化工艺的建立：以步骤(2)建立的针对TC2303的转化工艺为基础，采用步骤(3)工艺发酵得到的发酵液进行催化，对酶活和底物进行适当调整后建立以下转化工艺：初始反应液为：100g谷氨酸钠，0.1mmol/L硫酸锰，0.1mmol/L硫酸镁，加入发酵液及水，用氢氧化钠或盐酸调整pH为6.5。根据发酵液酶活控制LGOX酶活在1.5U/L，用氢氧化钠或盐酸调整pH为6.5。上述初始反应体系在45℃反应5小时，随后将温度提升到56℃，并再添加硫酸镁至终浓度为2mmol/L，维持5小时，再将温度降低到49℃。从这一步开始，间隔4h检测反应液pH，低于5.5或高于7.5则用氢氧化钠或盐酸调整至6.5左右，反应至终点。在上述条件下反应18小时后，反应液中α-酮戊二酸达到75g/L。
(5)生物材料的保藏：上述筛选得到的菌种放线菌TC2303已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年12月27日，保藏编号为CCTCC NO：M20211682。
(6)菌种的鉴定：菌种采用常规的16srDNA基因序列法进行鉴定鉴定。序列比对显示，TC2303的16srDNA基因序列与美国国家生物技术信息中心 (www.NCBI.nlm.nih.gov)核苷酸序列库中收录的登录号为：AF333113的序列同源性最高，达到99.2％，该菌株为Streptomyces sp.AT10，据此本发明获得的菌种TC2303命名为：Streptomyces sp.TC2303，简称TC2303，该命名得到了中国典型培养物保藏中心的认可，并获得保藏编号CCTCC NO：M20211682。
本发明提供了利用以上所述的专用高温菌催化生产α-酮戊二酸的方法，以菌种Streptomyces sp.TC2303的发酵液对谷氨酸或其盐进行催化，前期催化温度控制在44.5～45.5℃，催化4.5～5.5小时后，将催化温度提升至55.5～ 56.5℃，并添加硫酸镁，再催化4.5～5.5小时后，将催化温度降低至48.5～ 49.5℃，催化生产至终点，反应液中α-酮戊二酸可达到70～80g/L。
具体包括如下步骤：
S1、制备发酵液：
取菌种Streptomyces sp.TC2303单菌落于摇瓶发酵培养基中，44.5～45.5℃摇瓶培养24～48小时，离心获得上清液，即发酵液；
摇瓶发酵培养基如下：葡萄糖18～23g/L，酵母粉3～7g/L，硝酸铵2～4 g/L，磷酸二氢钾0.5～1.5g/L，氯化钙0.05～0.15g/L，硫酸镁0.2～0.4g/L，硫酸亚铁0.005～0.015g/L，玉米浆0.5～1.5g/L，用盐酸或氢氧化钠调整pH 到7～8，灭菌处理。
S2、制备初始反应液：谷氨酸或其盐80～120g/L，硫酸锰0.05～0.15 mmol/L，硫酸镁0.05～0.15mmol/L；
S3、将发酵液加入初始反应液中，控制谷氨酸氧化酶的最终酶活为1.3～ 1.7U/L，并调整反应液pH至6～7，温度控制在44.5～45.5℃，反应4.5～5.5 小时；随后将温度提升至55.5～56.5℃，并添加硫酸镁至终浓度为1.5～2 mmol/L，反应4.5～5.5小时后，再将温度降低至48.5～49.5℃，反应生产至终点。从初始反应至反应终点的总反应时间一般不超过18小时。
本发明具有至少以下有益效果：
(1)本发明提供的菌株Streptomyces sp.TC2303的培养及发酵条件均在 45℃左右，发酵时间仅为24小时，发酵时间较短、不易发生染菌的问题。利用其发酵液能在45℃～56℃下催化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸，转化过程温度均在45℃以上，催化温度远高于现有技术，总反应时间仅为18小时，催化过程不易发生杂菌污染，针对设备简陋、容易发生杂菌污染的企业，本方法具有特殊的优势。
(2)将该菌株应用于催化法生产α-酮戊二酸，通过对催化温度等条件的调控可以大幅度提高α-酮戊二酸的产量。
(3)本发明提供的菌株Streptomyces sp.TC2303发酵温度高，一方面可以节约大量冷却水，另一方面避免了在夏天尤其是南方地区由于室外水温过高导致菌株无法生存的问题，操作简单，适于工业化生产，具有极大的工业应用价值。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明。在下面的详细描述中，只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例。毋庸置疑，本领域的普通技术人员可以认识到，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，以下描述在本质上是说明性的，而不是用于限制权利要求的保护范围。
实施例1
利用高温放线菌Streptomyces sp.TC2303催化生产α-酮戊二酸的方法，包括如下步骤：
S1、制备发酵液：
取平板上划线分离得到的菌种Streptomyces sp.TC2303单菌落1个于摇瓶发酵培养基中，45℃摇瓶培养24小时，采用500mL三角瓶，装液量为100mL，离心获得上清液，即为发酵液(酶液)。
上述摇瓶发酵培养基配方如下：葡萄糖20g，酵母粉5g，硝酸铵3g，磷酸二氢钾1g，氯化钙0.1g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.01g，玉米浆1g，用盐酸或氢氧化钠调整pH到7.5左右，加水至1L，110℃灭菌10min。
S2、制备初始反应液：
以1L反应液为例，取100g谷氨酸钠，0.1mmol/L硫酸锰，0.1mmol/L硫酸镁，加入适量水溶解上述成分；
S3、根据发酵液酶活将发酵液加入初始反应液中，控制谷氨酸氧化酶 (LGOX)的最终酶活为1.5U/L，并调整反应液pH至6.5，温度控制在45℃，反应5小时；随后将温度提升至56℃，并添加硫酸镁至终浓度为2mmol/L，反应5小时后，再将温度降低至49℃，反应生产至终点,从初始反应至反应终点的总反应时间为18小时，反应液中α-酮戊二酸达到75g/L。
实施例2
利用高温放线菌Streptomyces sp.TC2303催化生产α-酮戊二酸的方法，包括如下步骤：
S1、制备发酵液：
取平板上划线分离得到的菌种Streptomyces sp.TC2303单菌落1个于摇瓶发酵培养基中，45℃摇瓶培养24小时，采用500mL三角瓶，装液量为100mL，离心获得上清液，即为发酵液(酶液)。
上述摇瓶发酵培养基配方如下：葡萄糖18g，酵母粉4g，硝酸铵3g，磷酸二氢钾1g，氯化钙0.05g，硫酸镁0.2g，硫酸亚铁0.01g，玉米浆0.8g，用盐酸或氢氧化钠调整pH到7.5左右，加水至1L，110℃灭菌10min。
S2、制备初始反应液：
以1L反应液为例，取100g谷氨酸钠，0.1mmol/L硫酸锰，0.1mmol/L硫酸镁，加入适量水溶解上述成分；
S3、根据发酵液酶活将发酵液加入初始反应液中，控制谷氨酸氧化酶 (LGOX)的最终酶活为1.4U/L，并调整反应液pH至6.5，温度控制在45℃，反应5小时；随后将温度提升至56℃，并添加硫酸镁至终浓度为2mmol/L，反应5小时后，再将温度降低至49℃，反应生产至终点,从初始反应至反应终点的总反应时间为18小时，反应液中α-酮戊二酸达到73g/L。
实施例3
利用高温放线菌Streptomyces sp.TC2303催化生产α-酮戊二酸的方法，包括如下步骤：
S1、制备发酵液：
取平板上划线分离得到的菌种Streptomyces sp.TC2303单菌落1个于摇瓶发酵培养基中，45℃摇瓶培养24小时，采用500mL三角瓶，装液量为100mL，离心获得上清液，即为发酵液(酶液)。
上述摇瓶发酵培养基配方如下：葡萄糖23g，酵母粉6g，硝酸铵4g，磷酸二氢钾1.3g，氯化钙0.15g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.01g，玉米浆1.5g，用盐酸或氢氧化钠调整pH到7.5左右，加水至1L，110℃灭菌10min。
S2、制备初始反应液：
以1L反应液为例，取100g谷氨酸钠，0.1mmol/L硫酸锰，0.1mmol/L硫酸镁，加入适量水溶解上述成分；
S3、根据发酵液酶活将发酵液加入初始反应液中，控制谷氨酸氧化酶 (LGOX)的最终酶活为1.6U/L，并调整反应液pH至6.5，温度控制在45℃，反应5小时；随后将温度提升至56℃，并添加硫酸镁至终浓度为2mmol/L，反应5小时后，再将温度降低至49℃，反应生产至终点,从初始反应至反应终点的总反应时间为18小时，反应液中α-酮戊二酸达到78g/L。
另外，通过采用筛选获得的其他菌株做对比试验，其他菌株虽然很大一部分的初始转化能力高于TC2303，但上述工艺用于这些菌株时其α-酮戊二酸的产量均很低，反应液中α-酮戊二酸不超过8g/L。因此，本催化方法是专门针对TC2303的有效方法。
综上所述，本发明采用的菌种的培养及发酵条件均在45℃，发酵时间仅为24小时，时间较短不易发生染菌的问题。本发明的转化过程温度均在45℃以上，时间仅为18小时，针对设备简陋、容易发生杂菌污染的企业，本方法有特殊的优势。
另外发酵培养菌体的过程是一个大量产能过程，需要用冷却水进行降温，在夏天在南方地区往往由于室外水温过高导致无法生存，本发明采用的菌种发酵温度高，因此可以大量节约冷却水，有利于节能减排。
以上所述仅为本发明示意性的具体实施方式，并非用以限定本发明的范围。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的构思和原则的前提下所作出的等同变化与修改，均应属于本发明保护的范围。
Claims (6)
1.用于催化生产α-酮戊二酸的专用高温菌，其特征在于：该菌是Streptomycessp.TC2303，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年12月27日，保藏编号为CCTCC NO：M20211682。
2.利用权利要求1所述的专用高温菌催化生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于：以菌种Streptomyces sp.TC2303的发酵液对谷氨酸或其盐进行催化，前期催化温度控制在44.5～45.5℃，催化4.5～5.5小时后，将催化温度提升至55.5～56.5℃，并添加硫酸镁，再催化4.5～5.5小时后，将催化温度降低至48.5～49.5℃，催化生产至终点。
3.如权利要求2所述的利用专用高温菌催化生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、制备发酵液：
取菌种Streptomyces sp.TC2303单菌落于摇瓶发酵培养基中，44.5～45.5℃摇瓶培养，离心获得上清液，即发酵液；
S2、制备初始反应液：谷氨酸或其盐80～120g/L，硫酸锰0.05～0.15mmol/L，硫酸镁0.05～0.15mmol/L；
S3、将发酵液加入初始反应液中，控制谷氨酸氧化酶的最终酶活为1.3～1.7U/L，并调整反应液pH至6～7，温度控制在44.5～45.5℃，反应4.5～5.5小时；随后将温度提升至55.5～56.5℃，并添加硫酸镁至终浓度为1.5～2mmol/L，反应4.5～5.5小时后，再将温度降低至48.5～49.5℃，反应生产至终点。
4.如权利要求3所述的利用专用高温菌催化生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于，步骤S1中，摇瓶发酵培养基如下：葡萄糖18～23g/L，酵母粉3～7g/L，硝酸铵2～4g/L，磷酸二氢钾0.5～1.5g/L，氯化钙0.05～0.15g/L，硫酸镁0.2～0.4g/L，硫酸亚铁0.005～0.015g/L，玉米浆0.5～1.5g/L，用盐酸或氢氧化钠调整pH到7～8，灭菌处理。
5.如权利要求3所述的利用专用高温菌催化生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于，步骤S1中，44.5～45.5℃摇瓶培养24～48小时。
6.如权利要求3所述的利用专用高温菌催化生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于：步骤S3中，从初始反应至反应终点的总反应时间不超过18小时。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210151384.1A CN114657088B (zh) | 2022-02-17 | 2022-02-17 | 用于催化生产α-酮戊二酸的专用高温菌及催化生产方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210151384.1A CN114657088B (zh) | 2022-02-17 | 2022-02-17 | 用于催化生产α-酮戊二酸的专用高温菌及催化生产方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114657088A CN114657088A (zh) | 2022-06-24 |
| CN114657088B true CN114657088B (zh) | 2023-10-13 |
Family
ID=82028240
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210151384.1A Active CN114657088B (zh) | 2022-02-17 | 2022-02-17 | 用于催化生产α-酮戊二酸的专用高温菌及催化生产方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114657088B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58149677A (ja) * | 1982-03-02 | 1983-09-06 | Toyo Jozo Co Ltd | Ｌ−グルタミン酸オキシダ−ゼ（ｈ↓２ｏ↓２・ジエネレイテイング）およびその製造法、ならびに分析方法 |
| CN106318888A (zh) * | 2016-08-27 | 2017-01-11 | 山东民强生物科技股份有限公司 | 一株产l‑谷氨酸氧化酶的菌株 mqo‑160及其应用 |
| CN106337039A (zh) * | 2016-08-27 | 2017-01-18 | 山东民强生物科技股份有限公司 | 利用菌株mqo‑160制备l‑谷氨酸氧化酶的方法 |
-
2022
- 2022-02-17 CN CN202210151384.1A patent/CN114657088B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58149677A (ja) * | 1982-03-02 | 1983-09-06 | Toyo Jozo Co Ltd | Ｌ−グルタミン酸オキシダ−ゼ（ｈ↓２ｏ↓２・ジエネレイテイング）およびその製造法、ならびに分析方法 |
| US4605615A (en) * | 1982-03-02 | 1986-08-12 | Toyo Jozo Kabushiki Kaisha | L-glutamic acid oxidase (H2 O2 -generating), its production and analytical method therefor |
| CN106318888A (zh) * | 2016-08-27 | 2017-01-11 | 山东民强生物科技股份有限公司 | 一株产l‑谷氨酸氧化酶的菌株 mqo‑160及其应用 |
| CN106337039A (zh) * | 2016-08-27 | 2017-01-18 | 山东民强生物科技股份有限公司 | 利用菌株mqo‑160制备l‑谷氨酸氧化酶的方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Enhanced AmB Production in Streptomyces nodosus by Fermentation Regulation and Rational Combined Feeding Strategy;Bo Zhang等;Front. Bioeng. Biotechnol.;第8卷;1-17 * |
| L-谷氨酸氧化酶发酵条件及分离纯化的研究;李玲;中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）工程科技Ⅰ辑;B018-95 * |
| L-谷氨酸氧化酶酶学性质及应用研究;马小倩;中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）工程科技Ⅰ辑;B024-341 * |
| Organic acids production byStreptomyces spp. isolated from soil, rhizosphere and mycorrhizosphere of pine (Pinus sylvestris L.);H. Rózycki等;Plant and Soil;第96卷;337-345 * |
| 犬瘟热发病期消化道细菌分离鉴定;张海燕;李建波;张斌恺;叶妍琳;代飞燕;杨玉艾;肖啸;;上海畜牧兽医通讯(02);63-65 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114657088A (zh) | 2022-06-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5827699A (en) | Strain of Rhodococcus rhodochrous as a producer of nitrile hydratase | |
| CN100451106C (zh) | 一株产结冷胶的少动鞘氨醇单孢菌及其应用 | |
| CN110699408A (zh) | 利用混菌发酵提高表面活性素产量的方法 | |
| JPH044887A (ja) | Ｌ―リジンの発酵的製造法 | |
| CN114657088B (zh) | 用于催化生产α-酮戊二酸的专用高温菌及催化生产方法 | |
| Shinke et al. | Isolation of β-amylase producing microorganisms | |
| CN110093302B (zh) | 一种乳杆菌突变菌株及其应用 | |
| CN108384730B (zh) | 一种副干酪乳杆菌及其在转化合成苯乳酸中的应用 | |
| HU216652B (hu) | Eljárás amidszármazékok előállítására mikroorganizmusok felhasználásával | |
| IL100819A (en) | Microbiological process for the preparation of 6-hydroxyclinic acid | |
| IE920669A1 (en) | Biotechnological process for the production of S-(+)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxamide and R-(-)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylic acid | |
| US20030036177A1 (en) | Single colonies of myxobacteria cells | |
| US7592164B2 (en) | Process for preparing unsaturated amides and carboxylic acids | |
| CN111139272A (zh) | 混菌二次发酵技术及其在l-丙氨酸工业化生产中的应用 | |
| RU2091483C1 (ru) | Способ получения бактериальных клеток рода clostridium, способных продуцировать споры и продукты метаболизма | |
| CN114410529B (zh) | 巨大芽胞杆菌固态高密度发酵的培养基及培养方法 | |
| CN103834600A (zh) | 一种催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的发酵方法 | |
| CN113969299B (zh) | 一种生物转化合成尿苷的方法 | |
| CN111909883B (zh) | 短乳杆菌的培养方法 | |
| CN114181859B (zh) | 一种嗜热脂肪地芽孢杆菌及其利用木质纤维素产乳酸的方法 | |
| CN116262904A (zh) | 一种有效改善水体底质环境的微生物菌剂生产方法 | |
| EP4174184A1 (en) | Pseudomonas strain for the manufacture of 1,5-dihydroxynaphthalene | |
| EP1255811B1 (en) | Single colonies of myxobacteria cells | |
| IL101256A (en) | Microbiological process for the production of 6-hydroxycycolic acid from 2-cyanopyridine | |
| CN116463237A (zh) | 一株蛋白质谷氨酰胺酶生产菌株及其生产方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Used for catalytic production a- Specialized high-temperature bacteria and catalytic production methods for ketoglutaric acid Effective date of registration: 20231215 Granted publication date: 20231013 Pledgee: Bank of Rizhao Co.,Ltd. Juxian sub branch Pledgor: DAZIRAN BIOLOGICAL GROUP Co.,Ltd. Registration number: Y2023980071960 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |